Laboratorio de bioquímica vegetalPractica N°1 y N°2 Relaciones de color de aminoácidos e identificación de aminoácidos en extractos vegetales por cromatografía de capa fina Presentado a: Luz Adriana Ordoñez Presento: Diego Rincón Dueñas (111002830) Alberto Ramírez (111002723) Universidad de los llanos Facultad de ciencias agropecuarias y recursos naturales Ingeniería agronómica Erlich. un hidrogeno y a una cadena radical. . Conocer cómo se trabaja la cromatografía de capa fina. Demostrar que el grupo indolico del triptófano reacciona con el ácido glioxilico en presencia del ácido sulfúrico. xantoproteica. Todos los aminoácidos componentes de las proteínas son considerados alfa aminoácidos que están formados por un carbono alfa o quiral y este a su vez está unido a un grupo amino. sakaguchi) podemos demostrar la existencia de un aminoácido específico por su coloración de reacción. Objetivos específicos: Demostrar que la ninhidrina es una agente oxidante que reacciona con todos los alfa aminoácidos. Lograr la separación de mezclas con una coloración bastante clara y evidente. ácido glioxilico. Calcular los valores de Rfs de los patrones ubicados en la placa. pauly. existen alrededor de 20 aminoácidos en la naturaleza. nitroprusiano. estos componen a las proteínas que son componentes esenciales que necesitan los seres vivos. millon.Introducción Los aminoácidos son moléculas orgánicas con un grupo amino y un grupo carboxílico. Objetivos generales Poder demostrar que por las diferentes reacciones (ninhidrina. un grupo carboxilo. trazado de líneas de orientación y ubicación de los patrones para así lograr una separación de aminoácidos provenientes de un extracto vegetal y soluciones puras. 5% (C6H14N4O2) Cisteína 0.5% (C6H13NO2) Arginina 0.5% (C3H7NO2S) Alanina 0.5% ( C3H7NO2) Reactivos: Solución de ninhidrina 1% (C9H6O4) Ácido nítrico concentrado (HNO3) .5% (C6H14N2O2) Metionina 0.5% (C5H11NO2S) Triptófano 0.5%( C11H12N2O2) Leucina 0.Materiales y reactivos: Materiales: 10 tubos de ensayo 1 pipeta graduada de 5 ml 1 pipeta graduada de 1 ml 1 Erlenmeyer de 250 ml 1 mortero y pistilo 2 vasos precipitados de 250 ml Guantes de látex Placas de vidrio con silica gel Capilares Gasa Beaker 50ml Cubas para cromatografía Horno Muestra vegetal (arazá) Muestra problema (soya) Centrifuga Tubos de centrifuga Embudo buchner Hielo Aminoácidos: Tirosina 0.5% (C9H11N1O3) Lisina 0. Se dejaron enfriar los tubos y después se agregó NaOH hasta que hubo reacción. cisteína. cisteína. . Enseguida se agregó 0. metionina. lisina). leucina. Reacción xantoproteica: En 5 tubos de ensayo se agregó 1 ml de los siguientes aminoácidos a cada tubo (triptófano. arginina).2 H2O) Hidróxido de amonio (NH4OH) Alfa-naftol (C10H8O) Agua de bromo ( Acido aspártico (C4H7NO4) Procedimiento Reacciones de coloración de los aminoácidos Reacción de la ninhidrina: En 5 tubos de ensayo se agregaron 1 ml de los siguientes aminoácidosa cada tubo (Alanina. lisina). metionina. leucina. Reacción de millón: En 5 tubos de ensayo se agregó 1 ml de los siguientes aminoácidos a cada tubo (tirosina.5 ml de ácido nítrico concentrado a cada tubo. leucina. Cuando estaban fríos agregamos 5 gotas de solución de nitrito de sodio y mezclamos. Solución de hidróxido de sodio (NaOH) 10M Solución de nitrito de sodio (NaNO2) Reactivo de millón (Hg2(NO3)2) Acido glacial (CH3-COOH) Ácido sulfúrico (H2SO4) Ácido sulfanilico (C6H7NO3S) Carbonato de sodio (Na2CO3) Reactivo de Erlich ( Solución de nitroprusiano de sodio (C5FeN6Na2O.enseguida se agregó a cada tubo 5 gotas de reactivo de millon y se depositaron en un baño de maría durante 15 minutos. Transcurridos el tiempo se sacaron y dejaron enfriar. tirosina. después se agregaron 5 gotas de solución de ninhidrina a cada tubo y se llevó este resultado a un baño de maría durante 3 minutos. triptófano. tirosina. Transcurridos los 10 minutos se agregó a cada tubo 1 ml de solución de nitrito de sodio. tirosina). Prueba de Erlich: En 5 tubos de ensayo se agregó 0. metionina). después se agregó a cada tubo 1 ml de hidróxido de amonio. lisina. cisteína). Prueba de nitroprusiano: En 5 tubos de ensayo se agregó 2 ml de los siguientes aminoácidos a cada tubo (tirosina. triptófano. lisina. Reacción de sakaguchi: En 5 tubos de ensayo se agregó 3 ml de los siguientes aminoácidosa cada tubo (tirosina.5 ml de solución de nitroprusiano de sodio y se mezcló bien. Transcurrido el tiempo se agregó a cada tubo 2 ml de solución de carbonato de sodio y se mezcló bien esperando los cambios. se mezcló bien y se esperaron los resultados. lisina. leucina. Prueba de pauly: En 5 tubos de ensayo se agregó 2 ml de los siguientes aminoácidos a cada tubo (tirosina. inmediatamente se agregaron 2 ml de ácido sulfúrico cuidadosamente por las paredes de los tubos para que así se formaran dos capas con un anillo violeta en la mitad cuando la reacción fuera positiva. Enseguida se agregó a cada tubo 1 ml de hidróxido de sodio y se mezcló bien. leucina. después de agrego 3 gotas de alfa-naftol a cada tubo y se volvió a mezclar vigorosamente. leucina.5 ml de los siguientes aminoácidos a cada tubo(triptófano. inmediatamente se agregó 5 gotas de agua de bromo a cada tubo y se observaron los resultados. cisteína. arginina. lisina). . Enseguida se agregó 0. arginina. metionina. se mezcló bien y se lo volvieron a dejar los tubos en hielo durante 5 minutos más. triptófano. triptófano. Enseguida se agregó a cada tubo de ensayo 2 ml de ácido glacial y se mezcló bien. arginina). leucina.Reacción de ácido glioxilico: En 5 tubos de ensayo se agregó 2 ml de los siguientes aminoácidos a cada tubo (triptófano.enseguida se agregó a cada tubo 1 ml de ácido sulfanilico se mezcló bien y se dejaron en hielo durante 10 minutos. Enseguida se agregó 2 ml de reactivo de Erlich cuidadosamente por las paredes de los tubos y se observaron los cambios. Esta reacción dio negativo puesto que la ninhidrina reacciona con todos los aminoácidos que tienen un pH entre 4 y 8. Esta reacción dio negativo puesto que la ninhidrina reacciona con todos los aminoácidos que tienen un pH entre 4 y 8. Negativo Arginina Negativo Cisteína Negativo Alanina negativo negativo Leucina Reacción xantoproteica Triptófano La reacción da positiva porque el triptófano tiene un núcleo aromático y este es el que hace reaccionar en un estado positivo de color amarillo. ( no es alcalino) positiva . Esta reacción dio negativo puesto que la ninhidrina reacciona con todos los aminoácidos que tienen un pH entre 4 y 8. Esta reacción dio negativo puesto que la ninhidrina reacciona con todos los aminoácidos que tienen un pH entre 4 y 8.Resultados Reacción de la ninhidrina: Compuestos vegetales y aminoácidos. pero el pH de nuestra muestra no estaba entre este rango. Triptófano Observaciones Resultado Esta reacción dio negativo puesto que la ninhidrina reacciona con todos los aminoácidos que tienen un pH entre 4 y 8. pero el pH de nuestra muestra no estaba entre este rango. pero el pH de nuestra muestra no estaba entre este rango. después se le agrego NaOH y su coloración cambio a un color naranja. Por eso esta coloración. pero el pH de nuestra muestra no estaba entre este rango. pero el pH de nuestra muestra no estaba entre este rango. dándonos como resultado una coloración traslucida (transparente) positiva Metionina negativa Leucina negativo Cisteína negativo Lisina negativo . Este resultado da negativo porque este aminoácido no contiene el radical hidroxibenceno. El color amarillo apareció después de agregado el NaOH (es alcalino) La reacción es negativa porque la leucina no posee núcleo aromático positiva negativo Metionina La reacción es negativa porque la metionina no posee núcleo aromático negativo Lisina La reacción es negativa porque la lisina no posee núcleo aromático negativo Reacción de millon Tirosina Este resultado da positivo porque es el único aminoácido que posee un radical hidroxibenceno que hace posible esta coloración Este resultado da negativo porque este aminoácido no contiene el radical hidroxibenceno. sin embargo la muestra tomo una tonalidad blanca. dándonos como resultado una coloración traslucida (transparente) Este resultado da negativo porque este aminoácido no contiene el radical hidroxibenceno. dándonos como resultado una coloración traslucida (transparente) Este resultado da negativo porque este aminoácido no contiene el radical hidroxibenceno.Tirosina Leucina La reacción da positiva porque el triptófano tiene un núcleo aromático y este es el que hace reaccionar en un estado positivo de color amarillo. Reacción del ácido glioxilico Triptófano Leucina Arginina Esta reacción da positiva porque el grupo indolico del triptófano reacciona en presencia del ácido sulfúrico. Esta reacción da negativa porque este aminoácido no tiene un grupo indolico. positiva Triptófano Esta reacción da positiva gracias a la amina que tiene el triptófano dando como resultado esta coloración. dando como resultado una coloración amarilla con tonos verdes. positiva Lisina positiva . Su resultado fue una coloración traslucida (transparente) Esta reacción da negativa porque este aminoácido no tiene un grupo indolico. dando una coloración violeta en medio de dos fases. Su resultado fue una coloración traslucida (transparente) Esta reacción da negativa porque este aminoácido no tiene un grupo indolico. en este caso observamos una coloración con una tonalidad verdosa clara en la parte superior y en la inferior un tono amarillo muy claro y en medio el anillo violeta. Su resultado fue una coloración traslucida (transparente) Esta reacción da negativa porque este aminoácido no tiene un grupo indolico. Esta reacción da positiva gracias a la amina con la que cuenta la lisina. por eso la coloración. Su resultado fue una coloración traslucida (transparente) positiva negativa negativo Cisteína negativo Tirosina negativo Prueba de pauly Tirosina Esta reacción da positiva porque la tirosina posee un fenol. Metionina Da negativa porque no posee grupos amino ni fenoles ni imidazoles que lo hagan reaccionar. negativa . negativa Triptófano Este aminoácido no reacciona con la prueba de nitroprusiano porque no posee grupo tiol. dando como resultado una coloración amarilla. positiva negativa Arginina Reactivo de Erlich: Triptófano Este aminoácido reacciona con el reactivo de Erlich gracias al grupo indol y aromático que posee positiva Arginina Este aminoácido reacciona con el reactivo de Erlich gracias a que posee un compuesto orgánico tal como lo es la amina Este aminoácido reacciona con el reactivo de Erlichgracias a que posee un compuesto orgánicotal como lo es la amina Este aminoácido reacciona con el reactivo de Erlichgracias a que posee un compuesto orgánico tal como lo es su anillo aromático Este aminoácido reacciona con el reactivo de Erlichgracias a que posee un compuesto orgánico positiva Lisina positiva Tirosina positiva Metionina positiva Prueba de nitroprusiano Tirosina Este aminoácido no reacciona con la prueba de nitroprusiano porque no posee grupo tiol. Da positiva gracias a la amina con la que cuenta este aminoácido. negativa negativa positiva Leucina Da negativa en esta reacción porque este aminoácido no tiene un grupo guanidino que le permita reaccionar. negativa Cisteína Leucina La cisteína reacciona positivamente en la prueba de nitroprusiano gracias al grupo tiol que posee. negativa . Esta reacción dio como resultado un color rojo ladrillo. Este aminoácido no reacciona con la prueba de nitroprusiano porque no posee grupo tiol. Arginina La arginina da positivo en la reacción de sakaguchi gracias al grupo guanidino de esta que reacciona con el alfa-naftol y un agente oxidante tal como el agua de bromo. Lisina .Da negativa en esta reacción porque este aminoácido no tiene un grupo guanidino que le permita reaccionar. Dando como resultado una coloración roja-violeta.Lisina Este aminoácido no reacciona con la prueba de nitroprusiano porque no posee grupo tiol. negativa Triptófano Da negativa en esta reacción porque este aminoácido no tiene un grupo guanidino que le permita reaccionar. positiva negativa Reacción de sakaguchi: Tirosina Da negativa en esta reacción porque este aminoácido no tiene un grupo guanidino que le permita reaccionar. Preparación de la Muestra problema: En un mortero depositamos el material o la muestra a trabajar en este caso fue una soya en harina. luego filtramos con la gaza para retirar la mayor cantidad de sólidos. La fase sobrenadante resulto con un pH de 7 y la ajustamos a un pH de 3 con una gota de ácido nítrico Preparación de la placa de cromatografía: a la placa que ya estaba preparada con el absorbente silica gel procedimos a trazar las líneas de medición.Procedimiento 2 Identificación de aminoácidos en extractos vegetales por cromatografía de capa fina Preparación de la muestra vegetal : En un mortero depositamos el material vegetal que en este caso fue una fruta conocida con el nombre de arazá a esta le agregamos 15 ml de agua y maceramos hasta obtener una especie de papilla. El líquido que nos quedó lo depositamos en tubo de centrifuga y procedemos a centrifugar para que haya una separación de fases solido-liquido. Luego que ya teníamos trazada la línea que estaba alejada del borde 2 cm procedimos a hacer la medición de los puntos donde iban a estar los patrones. inmediatamente de este resultado depositamos 10 ml en un tubo de centrifuga y procedemos a centrifugarlo hasta que haya una fase sólida y una fase sobrenadante. una línea en la parte superior e inferior con una medida de 2 cm desde el borde de cada lado. le agregamos 10 ml de agua y procedimos a macerar. la fase sobrenadante la retiramos y la ajustamos a un pH que este entre 2 y 4 en este caso no hubo necesidad porque el pH de nuestra muestra fue de 3. luego filtramos con una gaza para retirar la mayor cantidad de solidos que se pueda. Estos puntos fueron de 2 en 2cm en la recta horizontal hasta tener 8 puntos los cuales estarían dedicados a cada patrón . luego la volvimos a meter al horno otros 3 minutos para desarrollar la coloración.4 cm) Patrón 2: Acido aspártico (3.9 cm) Patrón 6: Alanina (3. luego la sacamos y medimos la medida que estaba desde los 2 cm hasta la parte donde se notara húmedo. luego llevamos la placa al horno donde la dejamos 3 minutos a una temperatura de 110°. esto se hizo con un capilar colocando la punta de este con mucha suavidad 3 veces en cada punto.5 cm) Patrón 4: Cisteína (2.0 cm) Patrón 8: Muestra problema (soya en polvo) (4.5 cm Patrón 5: leucina (1.Después que terminamos la placa y colocamos los patrones cada uno en un punto correspondiente. cuando transcurrió el tiempo la sacamos y la atomizamos con la solución de ninhidrina.0 cm) Patrón 3: Tirosina (3.2 cm) .1 cm) Patrón 7: Muestra vegetal (arazá) (3. Resultados Se midieron los desplazamientos de color que tuvieron los aminoácidos al entrar a la cámara de vidrio la cual contenía butanol-CH2COOH-agua y al ser atomizados con la solución de ninhidrina su desplazamiento fue: Patrón 1: Triptófano (3. Después procedimos a guardar la placa en la cuba de vidrio la cual contenía butanol-CH2COOH-agua durante aproximadamente 1 hora. 2647 0.25 0.Tras haber terminado todos los pasos de la cromatografía procedemos a calcular su Rfs utilizando las medidas que nos dieron en cada muestra patrón de aminoácidos.45 0.60 0.36 141.46 0.33 0.16 .38 0.41 0. Rfs resulta de la distancia recorrida por una sustancia (aminoácido) desde el origen (d) y la distancia del origen al frente del disolvente (h) Rfs= d/h Muestras Triptófano Acido aspártico Tirosina Cisteína Leucina Alanina Muestra vegetal (arazá) Muestra patrón( soya en harina) Rfs calculado 0.53 Rfs teórico 0.175 36.3529 Porcentaje de error 133.33 66.4 0.12 0. 3 ¿Por qué la prolina y la hidroxiprolina no producen el derivado de color violáceo o purpura cuando reaccionan con la ninhidrina? Rta: La prolina Y la hidroxiprolina al reaccionar con la ninhidrina no produce un color purpura debido a que estructuralmente no posee el grupo amino libre. dando una coloración que varía de azul a violeta intenso. La reacción con la ninhidrina produce colores que sirven como base para la cuantificación de todos los aminoácidos primarios se evalúa midiendo la absorción de la luz con la longitud de onda de 540 nm.2 ¿A qué se debe que cuando la ninhidrina reacciona con los aminoácidos haya desprendido de CO2? Rta: Esto se debe a que la ninhidrina es un agente oxidante poderoso liberando un oxígeno y reduciéndose y convierte al aminoácido en aldehído + CO2 + NH3.1 ¿Por qué razón se dice que la reacción de la ninhidrina permite la determinación cuantitativa de los aminoácidos? Rta: La Ninhidrina es utilizada con fines cuantitativos para la determinación de aminoácidos.Preguntas 4. desprendiendo del grupo carboxilo (COOH) un carbono y un oxígeno para unirse con el oxígeno de la ninhidrina así formando el CO2 y el hidrogeno pasa a formar parte de la molécula del amoniaco. sino un grupo imino dando como coloración final amarilla. 4. la coloración producida por la ninhidrina es independiente de la coloración original del aminoácido.4 ¿Cómo reacciona la prolina con la ninhidrina? La prolina da coloración amarilla. 4. 5. Este reactivo es útil para determinar la presencia de aminoácidos en algunas muestras o en las manchas que durante la cromatografía en papel de hidrolizados de proteínas 5. ocurre una reacción compleja y se produce un color azul brillante. Por su sensibilidad esta reacción se emplea para valoración cuantitativa de aminoácidos por colorimetría . 5.3 ¿Que reacción ocurre al aplicar a los aminoácidos la ninhidrina? Cuando los aminoácidos se calientan con un compuesto que se llama ninhidrina. Este producto colorido (llamado púrpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia.2 ¿Cómo se calcula el Rf de las muestras en ese tipo de cromatografía? Rta: Rfs resulta de la distancia recorrida por una sustancia (aminoácido) desde el origen (d) y la distancia del origen al frente del disolvente (h) Rfs= d/h. Reacciona con todos los aminoácidos alfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8. Cisteína. 5.Hidroxiprolina.Lisina . Lisina. En reacción de Acido Glioxilico se identifican los aminoácidos que tienen en su estructura el grupo indolico como resultado un color purpura (Triptófano). enzimas. aminas. un hidrogeno y a una cadena radical. Triptófano. En la naturaleza existen alrededor de 20 aminoácidos que tienen como forma estructural un grupo carboxilo.Tirosina . Fenilalanina.Alanina .6 ¿ Conclusiones Los Aminoácidos son moléculas esenciales que necesitamos los seres vivos para la formación de proteínas. plátano y manzana? La naranja el plátano y la manzana son unos de los alimentos pertenecientes a la categoría de las frutas frescas los cuales contienes los siguientes aminoácidos Ácido aspártico . Arginina). como materiales de construcción. cada una las reacciones identificara que aminoácido se tiene dependiendo del grupo que se encuentre en su estructura dando como resultado un tipo de coloración final. como hormonas. Con la reacción de la Ninhidrina se identifican los aminoácidos que tienen en su estructura el grupo amino. Triptófano. aromáticos y ureicos dando como resultado complejos coloreados (Tirosina. . Histidina .Ácido glutámico . En la identificación de aminoácidos en el laboratorio es necesario realizar reacciones químicas que al momento de aplicar reactivos a las muestras patrón nos arrojaran resultados positivos o negativos. Glicina . Metionina). Prolina. En la reacción de Pauly identificamos los aminoácidos que contienen en su estructura aminas. En la reacción de Erlich se identifican los aminoácidos que contienen en su estructura grupos índoles. En la reacción de Nitroprusiato se identifican los aminoácidos que tienen en su estructura los grupos tioles como resultado un color rojo (cisteína) y en la reacción de Sakaguchi se identifico como aminoácido la Arginina por su grupo guanidino que forma su estructura como resultado un color rojo.Tirosina .Metionina. estas proteínas desempeñan funciones múltiples.Arginina . Los seres humanos debemos consumir alimentos para adquirirlos ya que nuestro organismo no es capaz de sintetizarlos. un grupo amino. En La reacción de millón se identifican los aminoácidos que contienen en su estructura el radical hidroxibenceno como resultado un color rojo (Tirosina).5 ¿Que aminoácidos contienen las frutas como la naranja.5. .Isoleucina Leucina . En la reacción Xantoproteica se identifican los aminoácidos que en su estructura poseen un núcleo aromático como resultado un color naranja (Triptófano y Tirosina). Lisina. como sustancias transportadoras. Estos aminoácidos se combinan para formar proteínas.Triptófano . componentes en la coagulación sanguínea y sustancias de defensa. fenoles e imidazoles como resultado colores azofuertemente coloreados (Tirosina. Arginina. aminas primarias y amoniaco dando como resultado un color amarillo. WALTER Wofgong. 1987. 19º edición alemana. se observaron varios puntos y varias manchas a las que realizamos mediciones y calculamos el Rfs de las Muestras patrones. Bioquímica Ilustrada. Manual de Química Orgánica. Hans. • BEYER.A. Masson S. con estos datos pudimos identificar el tipo de aminoácido que se encuentra presente en las respectivas muestras(teniendo como causas de error el instrumento de medición una regla ya que dependiendo de la inclinación no es muy precisa) Bibliografía • CAMPBELL. Versión española. Revere S. por medio de luz UV se puede visualizar los resultados obtenidos. Antony. Edit.A. muestra vegetal (Arazá) y muestra problema. SMITH. . se retira y se lleva al horno para realizar el respectivo secado. La cromatografía de capa fina es muy útil al momento de identificar aminoácidos en muestras vegetales con la ayuda de procesos en el laboratorio y después de ingresar la placa a una cámara durante una hora y dejando que el eluyente ascienda antes de unos 2cm del extremo superior. 2006. Petter N.