La Extracción de Los Taninos Hidrolizables 2

La extracción de los taninos hidrolizables de Phyllanthus niruri Linn.: Efectos de disolventes y métodos de extracción  Masturah Markom un , b ,, ,  Masitah Hasan una ,  Wan Wan Ramli Daud b ,  Harcharan Singh c ,  Jamaliah Md Jahim b Mostrar más DOI: 10.1016 / j.seppur.2006.06.003 Obtener los derechos y contenidos Resumen Efectos de los tipos de disolventes y métodos de extracción (extracción por solvente (SE), la extracción de fluido supercrítico (SFE) y la extracción de agua a presión (PWE)) se investigaron para la recuperación eficaz de taninos hidrolizables bioactivos a partir de Phyllanthus niruri Linn. Diversos disolventes orgánicos y acuosos seleccionados por el método de Soxhlet mostraron que el ácido gálico y ácido elágico contenido aumentaron con el contenido de agua, mientras que el rendimiento corilagin alcanzó un valor máximo en 30% (v / v) de etanol en agua. A una temperatura fija, extracción con disolventes por Soxhlet es el mejor método para la extracción de ácido gálico y elágico, mientras que los métodos presurizados son mejores para la extracción corilagin. A pesar de que la extracción exhaustiva se logra más rápido por PWE, SFE con la adición de co-disolvente etanol-agua es superior en términos de consumo de disolvente líquido de baja y fraccionamiento componente producido. Polaridad del disolvente, sin disolvente a sólido-relación y tiempo de contacto juega un papel importante en determinar el método más eficiente para la extracción de tanino. Palabras clave  Niruri de Phyllanthus ;  La extracción por solvente ;  Extracción con fluido supercrítico ;  Agua Sub-crítico;  Elagitaninos 1. Introducción Phyllanthus niruri (Euphorbiacea) es una planta herbácea originaria de Malasia y es conocida localmente como 'Anak dukung'. Se encuentra comúnmente en las regiones tropicales y en otros países, es conocido como "chanca piedra" (español), 'paraparai mi' (Paraguay), 'pedra quebra' (Brasil) o 'punarnava' (India). P.niruri es una medicina popular popular para el tratamiento de cálculos renales y de vesícula biliar, enfermedades relacionadas con el hígado como la ictericia y cáncer de hígado, infecciones virales como la hepatitis y la tuberculosis, la malaria, la diabetes y la fiebre [1] . En estudios científicos, P. niruri se encontró a exhibir antiespasmódico, hipotensor, analgésico, antihepatotóxica, antihepatitis, anti-mutagénica, antivirales y antibacterianas. Se encontró que los extractos acuosos y / o alcohol para inhibir la actividad del virus de la hepatitis B in vitro y in vivo [2] , [3] y [4] , VIH-1 del virus de la transcriptasa inversa [5] , [6] y [7] , enzimas procesos propios de la replicación de las células cancerosas y de crecimiento [8] y la formación de cálculos renales [9] , reducir los niveles de glucosa en la sangre [10] , tienen los (antihepatotoxic) propiedades protectoras del hígado in vivo e in vitro[11] y producir efectos analgésicos en ratones [12] . Otras propiedades documentadas son antimalárica[13] y de los lípidos actividad reductora [14] . Los efectos medicinales se atribuyen a los componentes activos presentes en P. niruri tales como los lignanos, flavonoides, glicósidos, alcaloides, elagitaninos, terpenos y fenilpropanoides [1] . Lípidos comunes, esteroles, y flavonoles también se producen en la planta. Dos grupos de tanino identificado enP. niruri son taninos hidrolizables (ácido gálico) y taninos condensados (flavonoides). La hidrólisis final de los elagitaninos se transforma en ácido elágico y ácido gálico [15] . Las estructuras químicas de los taninos hidrolizables activos, a saber, Geraniin y corilagin, ácido gálico y ácido elágico y taninos condensados tales como flavon-3-ol y flavonol en P. niruri son como se muestra en la fig. 1 y fig. 2 , respectivamente [5] ,[16] y [17] . Higo. 1. Las estructuras químicas y los pesos moleculares de los taninos hidrolizables. Opciones Figura Higo. 2. Estructuras químicas básicas de: (a) flavon-3-ol y (b) de flavonoles. Opciones Figura La mayoría de la investigación sobre P. niruri estaba en la detección química, la identificación y el aislamiento, y el ensayo biológico y estudios farmacológicos [10] , [18] y [19] . Sin embargo, no mucho estudio sobre los efectos de los solventes tienen en la extracción de los componentes activos de P. niruriha sido reportado. Notka et al. informado de los efectos de tres disolventes (agua, metanol, etanol al 50%) para el estudio farmacológico sobre anti- VIH [5] . Los investigadores encontraron que el extracto de etanol al 50% fue el más activo en la inhibición de la replicación del virus de la transcriptasa inversa. El extracto de etanol al 50% se ensayó para consistir en 1,10% Geraniin y 2,28% (w / w) corilagin. De Souza et al.había informado sobre la cantidad de ácido gálico activo en el extracto de agua usando la cromatografía líquida de alto rendimiento técnica (HPLC), pero ningún estudio en otro disolvente o el análisis de otros componentes además de ácido gálico se llevaron a cabo [20] . Por lo tanto, el estudio de los efectos del disolvente es muy importante para el cribado y la selección de disolvente de las etapas de extracción, de fraccionamiento y de purificación en el procesamiento de hierbas. Mediante la comprensión de las propiedades de solvente, componente (soluto) propiedades y disolvente-soluto interacción, fraccionamiento rápida y el aislamiento de los componentes deseados se puede lograr. Este trabajo presenta los resultados sobre los efectos de diversos disolventes orgánicos y acuosos con diferentes polaridades en el rendimiento de la extracción y el contenido de taninos hidrolizables tres, a saber, el ácido gálico, ácido elágico y corilagin. Se investigaron los efectos cualitativos y cuantitativos de disolventes utilizando diferentes métodos de extracción. Los métodos de extracción utilizados son la extracción con disolvente y la extracción de alta presión (extracción con fluido supercrítico y la extracción de agua a presión). 2. método experimental 2.1. Productos químicos y normas Los estándares de referencia (ácido gálico y ácido elágico) fueron ambos comprados de Sigma Chemicals (Estados Unidos) en pureza de 98%. Geraniin aislada (pureza desconocida) fue suministrada por el Prof. H. Wagner (Universidad de Munich, Alemania). Análisis de corilagin se llevó a cabo por Nova Laboratorios Sdn. Bhd. (Malasia) con su nivel aislado y patentado (pureza del 98%). El comercial de P. niruri producto, HEPAR-P ™ (estandarizado al 4% corilagin y 18% de contenido total de flavonoides) se obtuvo de la misma empresa. Todos los reactivos químicos para el análisis de extracción y el componente ( n -hexano, éter de petróleo, diclorometano (DCM), cloroformo, acetona, metanol, etanol, acetonitrilo y ácido fosfórico) eran de la calidad analítica. Agua ultra-pura obtenida usando el sistema de ultra- filtración (USF ELGA, Reino Unido) se utilizó como disolvente de extracción, mezclas de disolventes y la fase móvil de HPLC. Pura y grado industrial líquido CO 2 (99,8%) se adquirió de Gas Pantai Timur (Malasia). 2.2. El material vegetal Seca y se muele P. niruri muestras se obtuvieron de Nova Laboratorios Sdn. Bhd. (Malasia). La muestra contiene tallos y partes aéreas de la planta y se ha utilizado para la producción comercial de P. niruriproducto de HEPAR-P ™. La distribución del tamaño de partícula (% w / w) determinado por tamizado estaba en el intervalo de 45 a 212 micras (8%), 212 a 600 micras (35%), 600 m-1,18 mm (43%) y 1,18 a 3,35 mm (14%). 2.3. La extracción con disolventes 2.3.1. Extracción Soxhlet (SE) Cinco gramos (± 0,05) de muestra de la planta se colocó en un Whatman 25 mm × 100 mm dedal de celulosa. La extracción utilizando el método estándar Sohxlet (BÜCHI Laboratechnik, modelo B-811, Suiza) se llevó a cabo utilizando 150 ml de disolvente. La potencia de calentamiento se establece en dos (2) ciclos por hora de manera que seis (6) ciclos de extracción se lograron dentro de 3 h de tiempo de extracción. Diversos disolventes orgánicos (7) y-orgánico acuoso (6) con diferentes polaridades se investigaron como se indica en la Tabla 1 . Para una mezcla de disolvente orgánico acuoso, el porcentaje indica el porcentaje en volumen del disolvente orgánico en la mezcla (% de volumen / volumen o v / v). Tabla 1. Efectos solventes en el rendimiento de Phyllanthus niruri extracción por el método de Soxhlet Disolvente de extracción Disolvente índice de polaridad de Snyder un Punto de ebullición (° C) Rendimiento de extracto (% de la muestra g / g) Referencia Este trabajo (± DE) b Literatura Orgánica n -hexano 0,1 69 1,8 (± 0,1) 0.9 c [21] 5.5 d [22] Éter de petróleo 0,1 60 2.2 El diclorometano 3.4 40 4.0 Cloroformo 4.1 61 9.7 Acetona 5.4 56 3.9 Etanol 5.2 78 11.6 Metanol 6.6 65 14,6 (± 1,1) 17.1 c [18] Acuoso 70% de acetona (70:30 v / v de acetona-agua) 6.5 84 18.5 70% de etanol (70:30 v / v de etanol-agua) 8.2 90 20.8 [19] Etanol al 50% (50:50 v / v de etanol-agua) 7.9 94 22.5 [12] 30% de etanol (30:70 v / v de etanol-agua) 7.1 97 26,4 (± 1,9) 7-9 c 20% de etanol (20:80 v / v de etanol-agua) 6.3 98 27.1 21.6 Agua 9,0 100 26,2 (± 1,6) Agua (previo de la muestra extraída por n - hexano) 100 23.5 un Índice de polaridad de Snyder disolvente citado de [23] . Los índices acuosas de mezclas de disolventes se calcularon a partir de la ecuación ( I A / 100 × P A ) + ( I B / 100 × P B ) donde I A y I B son índice de polaridad de los disolventes A y B, respectivamente, y P A y P B son porcentaje de disolventes A y B, respectivamente, en la mezcla de disolventes. b La desviación estándar de dos o tres repeticiones. c La extracción se a temperatura ambiente. d Maceración dinámico. Opciones de la tabla Las soluciones de extracto bruto obtenido se concentraron y se secaron usando un evaporador rotatorio de vacío (BÜCHI Laboratechnik, Modelo R-144, Suiza) a temperatura 80 ° C o menos para eliminar los disolventes. Las temperaturas más altas se evitaron para minimizar la degradación de los componentes.Todos los extractos se colocaron en una condición de temperatura ambiente antes de pesar gravimétricamente para determinar los rendimientos. 2.4. Extracción de alta presión 2.4.1. Extracción con fluidos supercríticos (SFE) Una unidad de SFE a escala de laboratorio fue diseñado y montado para la extracción de P. niruri . La configuración de aparato se muestra esquemáticamente en la fig. 3 . El sistema de suministro incluye dos bombas de pistones accionados por motor: bomba 1 es para el CO 2 (Jasco, Modelo PU 1580, Japón) y la bomba 2 es para co-disolvente (Labtech, Jones Chromatography, Reino Unido). El CO 2 se enfrió a 2 ° C, usando un enfriador para mantener su estado líquido antes de que se bombeó al extractor. El extractor consiste en una longitud de 14 cm × 1,5 cm de diámetro interno de alta presión recipiente de acero inoxidable lleno de la muestra de la planta. Los dos extremos se conectan con lana de vidrio para sostener la muestra y para eliminar el volumen muerto del buque. El recipiente de extracción está cerrado y controlado por la temperatura en un horno de circulación de aire de usos múltiples (Shel Lab, EE.UU.). El CO bombeado 2 y codisolvente fueron pre-mezclados antes de entrar en el recipiente de extracción. El precalentador se coloca antes de la extractora para asegurar que la mezcla de disolventes ha alcanzado la temperatura deseada antes de entrar en contacto con la muestra. Un filtro de 7 micras en línea fue instalado antes de la recipiente de extracción de la muestra para evitar el flujo de retorno. Un regulador de contrapresión (Jasco, Modelo BP-1580- 1581, Japón) se emplea para mantener la presión del sistema. Es consistió de un releva- válvula automatizada, que se calentó a 70 ° C para evitar la precipitación extracto.Válvula V5 reduce la presión a la presión atmosférica y se libera el extracto a un coleccionista, que se sumerge en una trampa fría (2 ° C). Válvulas V1 a V5 controlaba el flujo del proceso de extracción con fluido supercrítico. Higo. 3. Esquema del sistema de SFE. Opciones Figura En este estudio, 5 g (± 0,05) P. niruri se utilizaron muestras. Las temperaturas de funcionamiento de 60 ° y 100 ° C, y la presión de 200 bar se investigaron con (10%, v / v) y sin co-disolvente. Una extracción estática horas se dejó a la temperatura y la presión estudiado, seguido de una extracción dinámica con un caudal de disolvente de 1,5 ml / min durante 4 h. Las fracciones del extracto se recogieron cada 30 min y luego se colocan en un horno de aire (Shel Lab, EE.UU.) a 70 ° C durante aproximadamente 15-30 h para eliminar el codisolvente restante. Cuando no hay codisolvente estaba presente, los extractos no se calentaron para evitar la evaporación de los componentes volátiles. Todos los extractos se colocaron entonces en una condición de temperatura ambiente antes de gravimétricamente de pesaje para determinar los rendimientos de extracción. 2.4.2. Extracción de agua a presión (PWE) Configuración experimental similar al sistema de SFE como se muestra en la fig. 3 fue empleado para el PWE. En este método, sólo la bomba 2 (codisolvente) fue utilizado como un dispositivo de bombeo. Cinco gramos (± 0,05) de muestra de la planta se extrajo usando agua como disolvente. Se estudiaron las temperaturas de funcionamiento de 60 y 100 ° C y presiones de 100 y 150 bar. Antes de iniciar el experimento, 30 min de extracción estática se dejó a la temperatura y la presión estudiado, seguido de una extracción dinámica hasta el agotamiento a una tasa de flujo de agua de 1,5 y 3,0 ml / min. Las fracciones del extracto se recogieron cada 10 min, se filtró usando un papel de filtro Whatman (. No 1) y después se secó en un horno de aire (Shel Lab, EE.UU.) a 70 ° C durante aproximadamente 15-30 h. Los extractos se enfriaron entonces hasta una temperatura ambiente antes de la determinación de los rendimientos. 2.5. El análisis por HPLC 2.5.1. Preparación de la muestra Soluciones estándar de referencia para el ácido gálico y ácido elágico se prepararon en primer lugar. El ácido gálico en agua se prepara con una concentración que oscila entre 0,75 g / ml y 1,2 mg / mL. El ácido elágico se disolvió en etanol al 50% con concentraciones de 2,5 mg / ml a 1 mg / ml. HEPAR-P ™ y P. niruritodos los extractos se disolvieron en 50% de etanol en concentraciones de 1-5 mg / ml. Solución corilagin fue preparado por el Nova Laboratorios Sdn. Bhd. (Malasia) en solvente de dilución apropiado a 0,5 mg / ml de concentración. Todas estas soluciones eran ultra-sonicado a 60 ° C durante 30 min para eliminar burbujas de aire y para asegurar que todos los sólidos se disolvieron por completo antes del análisis por HPLC. Antes de la inyección, todas las soluciones de muestra se filtraron a través de un filtro de jeringa de 0,45 micras PVDF. 2.5.2. Detección e identificación Análisis de los componentes se llevó a cabo utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento técnica (HPLC) equipado con un muestreador automático y un / vis detector de UV (Agilent Technologies, Alemania). La columna utilizada para el análisis fue una fase inversa C18 con Genesis 250 mm × 4,6 mm id y 4 m de diámetro de partícula (Jones Chromatography, Reino Unido). La separación cromatográfica se desarrolló utilizando una fase móvil de ácido fosfórico 0,1% en agua (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B) con un gradiente de disolvente B: 8-22% (35 min), 22-8% (10 min) a un caudal de 1 ml / min.El volumen de inyección se fijó en 20 l y la detección era de la absorbancia UV a 270 nm. Picos cromatográficos se identificaron mediante la comparación con los tiempos de retención de ácido elágico, ácido gálico y normas corilagin. Debido a la falta de disponibilidad de la norma corilagin, algunas muestras fueron analizadas inicialmente por Nova Laboratorios Sdn. Bhd. (Malasia) usando su nivel corilagin purificada (98%) y el área del pico se identificó y se calibra a la obtenida por nuestro método HPLC. Para las otras soluciones estándar de referencia, se les inyectó (por triplicado) a diferentes concentraciones y análisis de regresión lineal de los datos de área de pico frente a la concentración se llevó a cabo. Calibraciones lineales con una precisión de más del 99,5% se obtuvieron para todos los estándares. Se hizo una sola inyección del disolvente (en blanco) para determinar el tiempo de retención de disolvente.El contenido de ácido gálico, ácido elágico y corilagin en los extractos se calculan en base a las áreas de los picos correspondientes y se inyectaron concentraciones. 3. Resultados y discusión 3.1. Efectos disolventes sobre rendimiento de extracto Los efectos de disolventes orgánicos y acuosos sobre el rendimiento de extracción y el contenido de ácido gálico bioactivo, ácido elágico y corilagin en P. niruri fueron estudiados usando el método de extracción Soxhlet estándar. La cantidad de extracto después de la retirada del disolvente se enumera en la Tabla 1 . Los resultados indican que la P. niruri es más soluble en disolventes polares a saber, agua (26,2%) y etanol acuoso (20,8-27,1%). Esto demuestra que la mayoría de los componentes en P. niruri son hidrófilo o soluble en agua. El color de los extractos eran de color marrón oscuro en agua y de color marrón-verde en etanol acuoso o acetona acuosa. Bajos rendimientos de extracto se obtuvieron en el disolvente no polar tal como n -hexano (1,8%) y éter de petróleo (2,2%), y el color se observó a ser amarillento con un tinte de color verde. Los rendimientos de extracción de otros solventes fueron en el medio (4,0 a 14,6%) y se observaron los extractos a ser verde (intensidad diferente para diferentes extractos de disolventes). El color verde podría haber sido causado por la presencia de clorofilas. Se muestra que la polaridad del disolvente juega un papel importante. Las polaridades moleculares netas de disolventes se miden por sus momentos dipolares. Las polaridades y puntos de ebullición de los disolventes utilizados se enumeran en la Tabla 1 y los momentos dipolares para algunos de los disolventes se enumeran en la Tabla 2 . Otras propiedades de disolventes (excepto por éter de petróleo) utilizados en este estudio, como la constante dieléctrica, cohesiva También se les da la energía, la viscosidad y la tensión superficial. Con la excepción de acetona, el rendimiento aumenta con el extracto de la polaridad del disolvente. La adición de agua en acetona y etanol aumenta enormemente el rendimiento de extracto. También se encontró que el rendimiento más alto se puede lograr en etanol al 20%. Es significativamente más altos que mediante el uso de etanol puro y es ligeramente más alto que mediante el uso de agua, ya que tanto los compuestos polares y polares menos se extrajeron de co juntos. Extracción de P. niruri mediante el uso de dos disolventes inmiscibles, no polar n -hexano (rendimiento 1,8%) seguido de agua muy polar (rendimiento 23,6%), indica que cada disolvente extrae diferentes grupos de compuestos. El rendimiento total del proceso de dos pasos es muy cerca del rendimiento utilizando sólo agua (26,2%) en un proceso de un solo paso. Por lo tanto, se puede concluir que el agua extrae los componentes tanto no polares y polares en su punto de ebullición. Tabla 1 también muestra que los rendimientos obtenidos para otros disolventes no son muy diferentes de los rendimientos obtenidos por otros investigadores, siempre que las condiciones de extracción son relativamente similar. Tabla 2. Propiedades de los disolventes [24] Nombre Solvente Tabla 2. Propiedades de los disolventes [24] Nombre Solvente Momento dipolar (Debye) Constante dieléctrica Cohesivo densidad de energía un (J mol / ml) Viscosidad (mPa) Tensión superficial (cal / mol A 2 ) Acetona 2.88 20.49 362.07 0.31 33.77 Cloroformo 1.04 4,71 332.00 0.54 38.39 DCM 1.60 8.93 400.22 0.41 39.15 Etanol 1.69 24.85 618.87 1.07 31.62 n -hexano 0.00 1.88 200.76 0.30 25.75 Metanol 1.70 32.61 808.26 0.54 31.77 Agua 1.87 78.36 2095.93 0.89 104.70 un Es igual a la plaza del parámetro de solubilidad Hildebrandt-Scott. Opciones de la tabla La separación de los componentes mediante un disolvente depende de la polaridad de ambos disolvente y el componente [21] . Según Barwick, un único disolvente podría o no ser selectivo para la separación de dos componentes como se muestra en la fig. 4 . Por ejemplo, si el compuesto deseado x es no polar, se puede extraer selectivamente usando disolvente con la polaridad P ' 1 . Por otro lado, si el compuesto más polar y se desea, P ' x disolvente se puede utilizar para eliminar compuesto x Se primero, seguido por el disolvente P ' 2 para extraer compuesto y . Sin embargo, para materiales vegetales que constan de múltiples componentes con interacciones complejas, 100% de recuperación de componente individual está probablemente no logra desde un único disolvente puede no ser selectivo para un único compuesto. Higo. 4. La separación de compuesto x y y como una función de la polaridad del disolvente. P ' x = polaridad del compuesto x , P ' y = polaridad del compuesto y [21] . Opciones Figura Cabe señalar que la extracción Soxhlet sólo funciona en los puntos de ebullición de los disolventes. En el punto de ebullición del disolvente, su tensión superficial y la viscosidad se reducen considerablemente en comparación con a una temperatura inferior, por lo tanto, el disolvente puede llegar a los sitios activos dentro de la matriz mucho más fácilmente. Los efectos de la temperatura de disolvente habían sido estudiados por Xu y Godber para la extracción de γ-orizanol del salvado de arroz usando hexano, acetato de etilo, isopropanol y diferentes combinaciones de disolventes [22] . Ellos descubrieron que la temperatura fue significativa para el disolvente que modifica la matriz pero no para el disolvente que regula la extracción de soluto. Por lo tanto, siempre que la base de (tiempo de residencia)-disolvente- sólida relación y tiempo de contacto son la misma comparación, el disolvente y efectos en la extracción de taninos hidrolizables utilizando Soxhlet se puede atribuir más significativamente a la polaridad del disolvente que a la temperatura. 3.2. Efectos disolventes sobre el contenido de componente La presencia de cuatro picos principales componentes se detectó consistentemente en los cromatogramas de HPLC de HEPAR-P ™ y algunos de los P. niruri extractos. El cromatograma de extracto estandarizado HEPAR-P ™ se muestra en la fig. 5 . El ácido gálico (1), corilagin (3) y ácido elágico (4) se identificaron en la muestra por comparación con los estándares externos. El ácido gálico, ácido elágico corilagin y tienen un tiempo de retención de 5,4, 18,9 y 31,2 min, respectivamente. Por comparación con la huella digital química estándar de HEPAR-P ™ [25] , el cromatograma obtenido en este estudio muestra perfil químico similar, con el pico más alto identificado como corilagin. Componente A, sin embargo, no se identificó en este estudio. Higo. 5. HPLC cromatograma de HEPAR-P ™. La columna utilizada fue una fase inversa C18 Génesis Identificación 250 mm × 4,6 mm, 4 m de diámetro de partícula. Una fase móvil de ácido fosfórico 0,1% en agua (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B) con un gradiente de disolvente B: 8-22% (35 min), 22-8% (10 min) a un caudal de 1 ml / min. El volumen de inyección se fijó en 20 l y la detección era de la absorbancia UV a 270 nm. Componentes detectados son el ácido gálico (1), el componente A (2), corilagin (3) y ácido elágico (4). Opciones Figura A pesar de que Geraniin ha sido identificado como el tanino hidrolizable más activo en P. niruri , la presencia de Geraniin no pudo ser verificada en este estudio basado en el método de HPLC desarrollado.Es posible que el método de HPLC utilizado no es adecuado para la detección Geraniin o que el Geraniin obtenido podría haber sido hidrolizado y por lo tanto, podría resultar en una menor pureza y producir varios artefactos. La hidrólisis y alcohólisis a los componentes más simples tales como corilagin brevifolin, ácido carboxílico, ácido gálico y ácido elágico podrían haber ocurrido en la presencia de agua y alcoholes a altas temperaturas [15] . La presencia de Geraniin fue confirmado previamente por el método de RMN [18] y [19] después de los procesos de múltiples etapas de fraccionamiento y aislamiento. Las concentraciones o contenidos (% w / w de extracto) de ácido elágico, ácido gálico y corilagin en los extractos utilizando el método de extracción de Soxhlet se muestran en la fig. 6 . No hay taninos se detectaron en n se detectaron cantidades extractos hexano y éter de petróleo, y trazan en cloroformo y los extractos de DCM. En la extracción de hierbas, n -hexano y éter de petróleo se utiliza principalmente para la eliminación de lípidos no polares y glicósidos no deseadas [26] y [27] mientras cloroformo y DCM se utilizan sobre todo para la extracción o aislamiento de lignanos de baja polaridad y glicósidos [28] . Higo. 6. Contenido de componentes en Phyllanthus niruri extraídos por diferentes disolventes en comparación con el extracto estandarizado HEPAR-P ™. Opciones Figura Al igual que el rendimiento de la extracción, los más altos contenidos de taninos totales se encontraron en extractos de agua y etanol acuoso. El aumento del contenido de agua en etanol dio lugar a un mayor contenido de ácido elágico y gálico como se ve en la fig. 6 . Los rendimientos más altos para ambos componentes se obtuvieron utilizando agua pura en la extracción Soxhlet. Por otro lado, se encontró contenido corilagin más alto de 30% (v / v) de etanol en agua. Se observó un mayor contenido de agua no aumentar aún más el rendimiento total de extracto pero un incremento adicional en el contenido de ácido gálico y elágico y la reducción en el contenido corilagin. Los resultados también mostraron que Soxhlet la composición de los componentes de HEPAR-P ™ era cercana a la de extracto de etanol al 70%. De la Tabla 2 , también es interesante observar que los componentes de tanino sólo pudieron extraerse mediante un disolvente con un valor de constante dieléctrica de más de 20 (acetona, etanol, metanol y agua). Disolvente con una constante dieléctrica inferior no podría extraer los taninos. Por ejemplo, a pesar de diclorometano y cloroformo tienen casi las mismas energías cohesivas y resultaron en rendimientos similares o más altas de extracto a la de acetona, el contenido de taninos obtenidos son mucho menos o indetectable ( Fig. 6 ). Por otro lado, el agua tiene mucho mayor viscosidad y la tensión superficial, que normalmente no se desean en la extracción ya que dificultan la absorción de disolvente en los sitios activos dentro de la matriz. Sin embargo, la constante dieléctrica y la energía cohesiva son significativamente más altas y por lo tanto, las moléculas de agua están fuertemente unidos a los componentes polares de tanino. El aumento de la temperatura del disolvente al punto de ebullición también podría reducir la viscosidad y la tensión superficial y aumenta aún más el rendimiento de la extracción. Para que un componente se disuelva en el disolvente, el parámetros de solubilidad de ambas sustancias deben ser similares. Parámetro de solubilidad de un soluto puede determinarse a partir de la ecuación de solubilidad original desarrollado por Hildebrandt y Scott [29] . La solubilidad del soluto en un disolvente no sólo depende de la polaridad (momento dipolar), sino también en el enlace de hidrógeno, unión electrostática y conformación (ángulo diedro). La preferencial de disolventes para donar / aceptar electrones (nucleófilo) y para donar / aceptar H + (electrófilo) con los componentes también es crucial.Todos estos factores son importantes para explicar el disolvente-soluto y las interacciones disolvente-disolvente. Por ejemplo, Saidman y colaboradores propusieron que flavona interactúa con el disolvente de etanol a través de la interacción de grupo carbonilo de la droga con dos moléculas de disolvente [30] . Se determinó que el átomo de oxígeno del carbonilo (grupo cetona) en el flavona contiene mayor densidad electrónica en comparación con el átomo de oxígeno intracíclica (grupo éter). La interacción entre el soluto y disolvente también resultó en el aumento global del momento dipolar para la solución. Propiedades de los taninos sin embargo, no son estudiados extensamente y están disponibles para geraniin o corilagin hasta el momento, no publicados datos termodinámicos y físicos. Siempre que el punto de ebullición, el peso molecular y el peso específico están disponibles, las propiedades críticas (es decir la temperatura crítica, presión y volumen) y el factor acéntrico pueden ser estimados por las correlaciones propuestas por Watanasiri et al. [31] . Estas propiedades son necesarias para calcular los momentos dipolares de los componentes. La solubilidad del soluto en el disolvente puede estimarse aproximadamente por los grupos funcionales presentes en la estructura química del tanino componente. Tabla 3 da el tipo y número de grupos funcionales en orden de polaridad decreciente. El ácido gálico contiene grupo ácido carboxílico y es más soluble en disolvente polar tal como agua. Otros componentes de tanino no tienen este grupo funcional y, por lo tanto, la polaridad se basa en el siguiente grupo polar (hidroxilo). Si no se toman en cuenta otros grupos funcionales menos polares, Geraniin es el siguiente compuesto polar seguido por corilagin y ácido elágico. Sin embargo, el número y la proporción de estos grupos en comparación con los grupos funcionales más polares podrían desempeñar un papel importante en el aumento o la disminución de la solubilidad en un disolvente. Por lo tanto, el ácido gálico es probablemente el más polar seguido por el ácido elágico, corilagin y finalmente Geraniin. Tabla 3. Número de grupos funcionales en taninos hidrolizables en polaridad decreciente Grupo funcional Estructura química de una Número de grupo funcional El ácido gálico El ácido elágico Corilagin Geraniin El ácido carboxílico 1 0 0 0 Hidroxilo 3 4 11 13 Cetona 0 0 0 1 Ester 0 2 3 5 Éter 0 0 1 2 un Adoptado de Ref. [33] . Opciones de la tabla En este estudio, se puede deducir que los componentes que contienen grupos de ácido carboxílico e hidroxilo se extraen preferentemente por agua a través de los enlaces de hidrógeno. Los grupos ácidos, cetonas y ésteres carboxílicos tienen la capacidad nucleófila (donador de electrones) en el grupo carbonilo y pueden reaccionar con el agua y el alcohol. Éter es el menos polar y requiere menos disolvente polar. Sin embargo, dado que los compuestos de tanino tienen más de un grupo funcional, cada compuesto es selectivamente soluble en diferente relación de agua a etanol. Por ejemplo, el agua es preferible para la extracción de ácidos fenólicos pero la adición de etanol (30%, v / v) se prefiere para la extracción de corilagin. Los resultados de este estudio confirman también el trabajo por otros que en la extracción de hierbas, agua y disolventes acuosos se utilizan preferentemente para la extracción de taninos y polifenoles [27] y [32] . El rendimiento de la extracción, sin embargo, no sólo es influenciada por el tipo de disolvente (características químicas), sino también por la fuerza de solvatación,-disolvente a sólido ratio y tiempo de contacto (características físicas) a diferentes condiciones de extracción. 3.3. Comparación de los métodos de extracción Un estudio de los diferentes métodos de extracción es especialmente importante para la determinación de la extracción eficiente de soluto a partir de las matrices complejas tales como plantas. La comparación se hizo entre el disolvente de extracción por Soxhlet (SE), y los métodos de extracción de alta presión por la extracción de agua a presión (PWE) y extracción con fluidos supercríticos (SFE). Se empleó agua como cosolvente en SFE pero actuó como disolvente principal en otros métodos de extracción. Del mismo modo, 30% - 50% - 70% etanol y se utilizaron también como codisolventes en SFE y como principales disolventes en SE. Las extracciones se llevaron a cabo durante 3 h en disolvente de extracción y hasta el agotamiento de las extracciones de alta presión. Muchas variables que intervienen en cada método, por lo tanto, la comparación directa entre los métodos no se pueden hacer. En este estudio, la comparación se realiza con base en los-solvente a sólido ratio, tiempo de contacto (tiempo de permanencia) y la hora de extracción de las condiciones de extracción comparables, los rendimientos y contenido de componentes como se muestra en la Tabla 4 Para SFE y PWE, los tiempos de residencia. se tuvieron en cuenta para extracciones tanto estáticos como dinámicos en el recipiente 25 ml. Extracciones semi-lotes se suponen para todos los métodos. El tiempo de residencia se determinó que era de 0,5 horas por ciclo o un total de 3 h para Sohxlet, 3,8 h para SFE y 0,6-0,8 h para PWE. En SFE, los no-taninos se fraccionaron inicialmente en los primeros 0,5-3 h seguido por una extracción de taninos en otro 1-3.5 h, dependiendo de las condiciones de extracción empleadas. -Solvente a sólido ratio (m 3 / kg) se calcula en base a la cantidad de disolvente / co-disolvente que está en contacto con la muestra de la planta. Tabla 4. Comparación de diferentes disolventes y métodos de extracción Métod o T ( ° C) P(ba r) Solvent e tipo / cosolve nte Tiempo de extracci ón (h) Volum en total de disolve nte / co- disolve nte (× 10 6 m 3 ) Solve nte a sólido líquid o ratio (× 10 3 m 3 / kg) El tiempo total de residen cia (h) El rendimie nto total (% de la muestra g / g) Contenido de componentes (% g / g de extracto) El ácid o gáli co Corila gin El ácido elági co SE pb 1 Agua 3.0 150 30 3.0 26.2 1.15 2.96 17.4 8 pb 1 30% de etanol 3.0 150 30 3.0 26.4 0.89 3.71 12.9 7 pb 1 Etanol al 50% 3.0 150 30 3.0 22.5 0.56 3.52 10.8 2 pb 1 70% de etanol 3.0 150 30 3.0 20.8 0.18 3.19 5.74 SFE un 60 200 Agua 4.0 36 7.2 3.8 17.8 0.48 2.42 6.48 60 200 30% de etanol 4.0 36 7.2 3.8 22.5 0.41 2.23 6.90 60 200 Etanol al 50% 4.0 36 7.2 3.8 20.6 0.38 3.45 5.52 60 200 70% de etanol 4.0 36 7.2 3.8 8.5 0.45 2.82 5.94 60 100 Etanol al 50% 4.0 36 7.2 3.8 17.5 0.34 3.67 6.75 10 0 200 Etanol al 50% 4.0 36 7.2 3.8 26.6 0.84 4.09 7.31 PWE 60 150 Agua 1.0 180 36 0,6 19.7 0.27 2.45 5.10 10 0 100 Agua 1.0 180 36 0,6 23.2 0.33 2.35 6.22 10 0 100 Agua 1.0 90 18 0.8 27.0 0.65 4.11 8.91 HEPA R-P ™ - - - - - - - - 0.21 2,64 (4) 4.17 -: No hay información disponible. Número de soporte es el contenido corilagin estandarizada reportado por Nova Laboratorios Sdn. Bhd. (Sin fecha). un Disolvente líquido se utilizó como co-disolvente mezclado con dióxido de carbono supercrítico a 10% (v / v). Opciones de la tabla A una temperatura fija de 100 ° C, PWE a presión de 100 bar es mejor en comparación con SE utilizando agua en términos de menos tiempo de contacto y el tiempo total de extracción para una proporción similar o menos disolvente a sólido. En PWE, la reducción en la tasa de flujo (3,0 a 1,5 ml / min) causó el tiempo de contacto para aumentar y por lo tanto, el aumento de la eficiencia de la extracción. Debido a una menor tasa de transferencia de flujo de agua, el equilibrio y la masa se logra mejor en un tiempo de residencia más largo. Por lo tanto, aunque el rendimiento de extracto es aproximadamente igual, el contenido corilagin (4,11%) en PWE es 39% mayor que en el SE (2,96%). También es posible que la polaridad de agua se reduce a la condición sub-crítico, por lo tanto, el parámetro de solubilidad similar a la de corilagin podría lograrse. También se ha encontrado que el agua subcrítica para aumentar la solubilidad de solutos relativamente polares en la extracción de productos naturales tales como catequina y epicatequina [34] .En PWE, diferentes fuerzas de solvatación se puede lograr cambiando las propiedades del agua de normal a sub-crítico al agua supercrítica [35] . En SE, mayor contenido de corilagin sólo podría lograrse mediante la adición de etanol en agua. El ácido gálico y ácido elágico contenido se encontraron también más alta en comparación con SE PWE.Mayor grado de proceso de hidrólisis podría haber ocurrido, posiblemente debido al contacto directo del colector extracto (depósito de disolvente) con la placa caliente durante la extracción. Por otra parte, el extracto se recogió a temperatura ambiente en el proceso de PWE. Así, aunque la hidrólisis podría haber ocurrido en el extractor, la mayor parte de la energía se utilizó para liberar a los solutos de la matriz de la planta. Re-extracción de la muestra de la planta utilizada en PWE por Soxhlet no extraer cualquier ácido elágico o más gálico, lo que confirma que los altos contenidos de ácidos fenólicos en la SE fueron el resultado de el proceso de hidrólisis. A pesar de que se prefiere a alta temperatura para romper los lazos de interacción soluto-matriz y aumentar la volatilidad soluto, también puede causar la degradación térmica de los componentes que son sensibles al calor y se deben evitar si es posible. Por lo tanto, las extracciones de alta presión a temperatura más baja (60 ° C) fueron también investigados ( Tabla 4 ). SFE a 200 bar y PWE a 150 bar se comparan. Presión superior a 150 bar en PWE produce ningún aumento adicional en rendimiento y componentes contenidos. Casi resultados similares se obtienen para ambos métodos indican que codisolvente de agua al 10% (v / v) en SFE, que tiene una menor solvente líquido-sólido a la proporción de 0,0072 m 3 / kg en comparación con 0,036 m 3 / kg en PWE, podría dar el mismo rendimiento que el PWE.Sin embargo, PWE es cuatro veces más rápido que el SFE debido al mayor volumen de agua que entra y menor tiempo de residencia. Del mismo modo, se requieren tiempos de extracción muy corta (5- 20 min) para la extracción de líquido a presión de otras hierbas medicinales [36] . Como se mencionó anteriormente, la adición de etanol en agua podría aumentar el contenido corilagin en el método SE. Por lo tanto, 30% - 50% - 70% y etanol como co-disolventes (10%, v / v) en SFE se investigaron, así tanto en 60 ° y 100 ° C. El rendimiento de extracto se encontró a aumentar con una concentración reducida de etanol en el codisolvente y fue más alta a 30% de etanol. En contraste con etanol al 30% en SE, en SFE se encontró que el contenido corilagin más alta usando 50% de codisolvente etanol. A 60 ° C, con el fin de obtener la misma cantidad de extracto obtenido utilizando codisolvente de agua, la adición de 50% (v / v) de etanol en agua podría reducir la presión de funcionamiento requerida de 200 bar a 100 bar. Además, el rendimiento de extracto (20,6%) y el contenido corilagin (3,45%) de SFE con etanol al 50% a una presión de 200 bar y a una temperatura inferior (60 ° C) es comparable a SE utilizando etanol al 50% (22,5%, 3,52 %) en el punto de ebullición del disolvente. Por lo tanto, la temperatura de funcionamiento se podría reducir en el SFE. A 200 bar y un 10% (v / v) de 50% co-disolvente etanol, aumentando a mayor temperatura (100 ° C) condujo a un aumento en el rendimiento de extracto (26,6%), que es similar al rendimiento de SE el uso de agua ( 26,2%). A esta temperatura, todo el contenido de componentes son superiores a la SFE a 60 ° C. A pesar de que se logró temperatura similar a la SE, el contenido de ácido fenólico similares o más altos que los de SE no podrían alcanzarse debido a las mismas razones que se han mencionado anteriormente para PWE. Contenido corilagin Superior (4,09%) que SE, sin embargo se podría obtener, que es comparable a la de PWE. Tabla 4 muestra que el tiempo de residencia en SFE (3,8 h) es ligeramente mayor en comparación con SE (3 h), pero el disolvente a sólido proporción requerida es mucho menos en SFE. Otra ventaja de SFE con cosolventes de agua y de etanol-agua investigados es que la extracción de los componentes menos polares (volátiles, lípidos, flavonoides y las clorofilas) se podría mejorar y se fraccionó antes de los taninos hidrolizables en comparación con SFE sin cosolvente o SFE con sólo cosolventes orgánicos tal como (metanol o etanol . Fig 7 ). El aumento del rendimiento podría haber sido causado por la modificación de la matriz de la planta y la mayor desorción de los compuestos menos polares con la presencia de agua. Debido a la baja solubilidad de agua en CO 2 , dos fases pueden coexistir juntos y dar lugar a un fraccionamiento, con la fase de vapor rige principalmente por CO 2 que extrae los compuestos menos polares y la fase líquida rige principalmente por agua, que se extrajo los taninos hidrolizables. Higo. 7. Efecto de tipo co-disolvente en SFE a 200 bar y 60 ° C. Las líneas de puntos indican el fraccionamiento de los taninos hidrolizables. Opciones Figura Se puede concluir que SFE con cosolvente etanol-agua tiene la utilización de disolvente líquido más eficiente para la extracción de taninos hidrolizables. Sin embargo, si el tiempo es el factor de control y no el volumen de disolvente, PWE se recomienda debido a los tiempos de extracción y de residencia más cortos. 4. Conclusiones La proyección por varios disolventes de extracción mostró que la mayoría de los componentes en P. nirurison hidrófilo o soluble en agua. Los taninos hidrolizables activos (ácido gálico, ácido elágico y corilagin) se extrajeron preferiblemente usando agua o mezclas de etanol-agua. Debido a la naturaleza del agua en condiciones sub-crítico, se encontró que la extracción de agua a presión (PWE) tenía el extracto y corilagin rendimiento global más alta en el tiempo más corto en comparación con la extracción Soxhlet o SFE método. Sin embargo, SFE con co-disolventes de agua y etanol-agua dio un resultado interesante desde el fraccionamiento entre los compuestos menos polares y los taninos hidrolizables era posible. SFE también fue superior en términos de mínimo consumo de disolvente líquido. Por lo tanto, la optimización de los parámetros de funcionamiento, tanto en PWE y SFE con la mezcla cosolvente seleccionado debe estudiarse más a fondo para la extracción más eficiente de P. niruri con pasos de procesamiento reducidos. Agradecimientos La investigación fue financiada por Malasia Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación (MOSTI) en Investigación La intensificación en el Área Prioritaria (IRPA) concesión no. 09-02-02-0091-EA234 y por la Universidad de Malaya en Voto F (0168 / 2003A). El autor principal también las gracias al Sr. NL Phang (Nova Laboratorios Sdn. Bhd., Malasia) y el Prof. H. Wagner (Universidad de Munich, Alemania) para proporcionar cápsulas ™ HEPAR-P libres y estándar geraniin, respectivamente. Referencias 1. o [1] o Base de datos para Chanca Piedra ( Phyllanthus niruri ). Disponible en línea desde http://www.rain- tree.com/chanca.htm (consultado en agosto de 2003). o 2. o [2] o SP Thyagarajan, S. Subramanian, T. 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Copyright © 2006 Elsevier BV Todos los derechos reservados.  Acerca de ScienceDirect  Contacto y soporte  Información para anunciantes  Términos y condiciones  Política de privacidad Copyright © 2014 Elsevier BV excepto determinados contenidos facilitados por terceros. ScienceDirect® es una marca comercial registrada de Elsevier BV Las cookies son utilizados por este sitio. Para rechazar o aprender más, visite nuestro Galletas página Cambiar de sitio móvil Artículos recomendados 1. 1. La extracción de los taninos condensados del guisante de playa ( Lathyrus maritimus L.) como afectada por diferentes disolventes 2. 2001, Química de los Alimentos más 2. 1. Análisis de los taninos hidrolizables 2. 2001, La alimentación animal Ciencia y Tecnología más 3. 1. La clasificación de Phyllanthus niruri Linn. de acuerdo a la ubicación por espectroscopia infrarroja 2. 2006, Espectroscopía Vibracional más 4. Ver más artículos » Citando los artículos ( 52 ) Sistema de inyección de flujo para la determinación de taninos hidrolizables  Carla M. Bossu un , b ,  Edilene C. Ferreira un , b ,, ,  Fernanda S. Chaves a , b ,  Eveline A. Menezes a , b ,  Ana Rita A. Nogueira b Mostrar más DOI: 10.1016 / j.microc.2006.04.022 Obtener los derechos y contenidos Resumen Se propuso un sistema de inyección de flujo para evaluar el producto transitoria de una reacción colorimétrica entre tanino hidrolizable y yodato de potasio (KIO 3 solución). La optimización del sistema se llevó a cabo mediante el uso de métodos estadísticos basados en el diseño experimental. Velocidad de flujo de KIO 3 solución, volumen de la muestra, la tasa de flujo de gas portador, y la bobina de reacción fueron los factores seleccionados para su evaluación. El cribado de paso, factorial completo 2 4 se utilizó y se estudiaron dos niveles para cada factor seleccionado. Para la fase de optimización, un rostro compuesto diseño centrado 2 2 fue empleado + estrellas para evaluar el volumen de muestra y la tasa de flujo de KIO 3 solución, que fueron los factores identificados en la fase de selección como tener más influencia en la señal de absorbancia. Después de la optimización, el sistema propuesto se comparó con la determinación de lotes. Algunas características, tales como la frecuencia de análisis, el consumo de reactivos y química generación de residuos presentan mejores resultados por el uso del sistema propuesto si se compara con el método de lotes. El sistema presenta una buena repetibilidad con una desviación estándar inferior al 3%, para n = 10, linealidad ( R 2 = 0,9974) para el estándar de ácido tánico, la frecuencia de análisis de 15 inyecciones h - 1 y límite de cuantificación de 24 mg L - 1 de tánico ácido. Se obtuvieron buenos resultados cuando el sistema propuesto se aplicó a la determinación de tanino hidrolizable in barbatimão Stryphnodendron , Eucalyptus citriodora y Phyllanthus niruri , muestras de plantas usadas comúnmente en la medicina popular. Palabras clave  Tanino hidrolizable ;  Yodato de potasio ;  Flow Injection Analysis ;  Diseño experimental 1. Introducción Los taninos son compuestos polifenólicos de alto peso molecular producidos por el metabolismo secundario de la planta. Se dividen en dos clases principales: condensados y taninos hidrolizables [1] y [2] . Taninos hidrolizables están formados por un núcleo de hidratos de carbono, por lo general D glucosa, cuyos grupos hidroxilo pueden presentar enlaces éster con grupos fenólicos [3] . Taninos hidrolizables naturales pueden ser nombrados como elagitaninos, cuando sólo los ácidos elágico son los grupos fenólicos unidos al núcleo de hidratos de carbono. Galotaninos se producen cuando sólo ácidos gálico están unidos al núcleo de hidratos de carbono, y el tanino mixta cuando ambos, ácidos gálico y elágico están unidos al mismo núcleo de hidratos de carbono [4] . Taninos hidrolizables naturales ocurren en madera, corteza, hojas, frutos y agallas [4] , [5] y [6] y muestran diferentes efectos nutricionales, ecológicos y medicinales [7] y [8] . Teniendo en cuenta que los estudios ecológicos y nutricionales pueden requerir análisis de cientos de muestras, no es práctico para caracterizar cada compuesto individual como ellagitannin o galotanino [9] . Por otro lado, la determinación total de tanino hidrolizable puede ser muy útil y proporcionar suficiente información para situaciones tales como nutricional, planta evaluación potencial medicinal y estudios ecológicos. Por lo tanto, la evolución de los métodos simples para la determinación de taninos hidrolizables pueden ser muy útiles. En 1965, Haslam describe que la reacción entre el tanino hidrolizable y KIO 3 resultó en un producto coloreado [10] . De lo contrario, esta reacción sólo apareció para las determinaciones analíticas en 1977, reportado por Bate-Smith [11] . A partir de este informe, se han propuesto muchas otras modificaciones en un intento de aplicar esta reacción como dispositivo analítico para tanino hidrolizable determinación colorimétrica [12] . La reacción entre taninos hidrolizables y KIO 3 produce un compuesto coloreado transitoria ( Fig. 1 ). Cuando los reactivos se mezclan entre sí, un producto de color rojo se desarrolla. El color alcanza su máximo en un espacio de tiempo y luego comienza a desaparecer para generar un producto amarillo. Higo. 1. La reacción entre el tanino hidrolizable y KIO 3 . Opciones Figura El método tradicional anterior para la determinación de tanino hidrolizable basada en el KIO 3 reacción recomienda para relajarse mezcla de los reactivos antes de la medición del producto de color, a 550 nm[13] . Sin embargo, la investigación adicional en esta área ha indicado que, frente a la refrigeración, las temperaturas altas aumentan la velocidad de reacción [11] y [12] . Los sistemas de flujo presentan una característica cinética intrínseca [14] . Todas las mediciones se realizan a las mismas condiciones de tiempo y de dispersión para los estándares de análisis y muestras, sin necesidad de completar la reacción. Además, el sistema de flujo puede ser considerado como un sistema cerrado "cuasi", reducir la exposición a soluciones químicas y problemas de contaminación ambiental, debido a una reducción en los residuos generados [14] . Cada sistema de flujo propuesto para la sustitución de un método analítico lote debe ser optimizado.Diseño experimental para la optimización es una herramienta estadística utilizada para examinar sistemáticamente los problemas que surgen en la investigación, desarrollo y producción. Con un diseño experimental información interesante se puede conseguir, ya que el experimento no se realiza al azar, pero se planea [15] . Técnicas quimiométricas se introdujeron en la química analítica casi al mismo tiempo que el análisis por inyección en flujo, y el aumento del uso de tanto ha revelado tendencias similares [16] .Diseño experimental es una estrategia quimiométrico que trabaja con muchos factores de forma simultánea, lo que puede influir en una respuesta del sistema. Por lo tanto, es posible evaluar los factores que han presentado influencias significativas en la respuesta del sistema, y si estas influencias son negativos o positivos [17] y [18] . El objetivo de este trabajo fue construir y evaluar un ensayo adecuado para la determinación del nivel de tanino hidrolizable en las plantas de uso común como aplicación de medicamentos dispositivos quimiométricos a la optimización del ensayo propuesto. 2. Materiales y métodos Todas las soluciones se prepararon a partir de reactivos de grado analítico y agua destilada- desionizada se utilizan en todo. El reactivo de KIO 3 de solución (2,5% w / v) se preparó por disolución de 25 g de KIO 3 en 1000 ml de agua. La solución de extracción, que se utiliza para la preparación de la muestra, fue acetona 70% (v / v), que se preparó diluyendo 70 ml de acetona pura en 100 ml de agua. La solución analítica de stock de 5000 mg L - 1 fue preparado por solubilización de 0,25 g de ácido tánico en 50 ml de solución de extracción. Las soluciones analíticas estándar que contenían 0, 100, 200, 400, 600, 800 y 1000 mg L - 1 de ácido tánico se prepararon por dilución acuosa de la solución analítica de stock. Las muestras evaluadas fueron las especies de plantas que tienen propiedades medicinales: barbatimão Stryphnodendron , Eucalyptus citriodora y Phyllanthus niruri . Las plantas se cosecharon y se lavaron inmediatamente en el flujo de agua común para eliminar las partículas de polvo. Después, las muestras se enjuagaron con agua destilada-desionizada, se congeló en nitrógeno líquido (- 196 ° C) y se liofilizó en un liofilizador (modelo Savant Novalyphe NL 150). Además, las muestras secas se molieron en un molino criogénico (modelo Spex Certiprep 6750). Por otra parte, una masa de 0,25 g de muestras de suelo (materia seca) se mezcló con 15 ml de solución de extracción (acetona al 70% v / v) y la mezcla se agitó durante 10 min en un baño ultrasónico (Unique, modelo USC 1400, 81 W de potencia y 40 KHz de la frecuencia), seguido por 10 min de centrifugación a 2000 rpm. Los extractos finales fueron diluidas cinco veces con agua, antes de la determinación. Un sistema de flujo básico fue desarrollado para permitir la reacción en línea entre el tanino hidrolizable y KIO 3 solución. La configuración de flujo consta de un modelo ISM 761 bomba peristáltica (Ismatec, Suiza) con tubos de bombeo viton, inyectores conmutar [19] , un espectrofotómetro modelo 432 (Femto, S. Paulo, Brasil) con una celda de flujo tubular (volumen interno ca 80 l , camino óptico 12 mm), una grabadora Stripchart modelo BD111 (Kipp y Zonen, Delft Holanda), y un baño de agua (Fanem, Brasil). El colector se construyó con 0,8 mm tubo de polietileno Identificación de un tipo de muro no plegable y plexiglás conectores en forma de Y. El rendimiento básico del sistema de flujo propuesto, representado en la fig. 2 , se optimizó el uso de un diseño experimental. Higo. 2. Sistema propuesto flujo: S, Muestra; SL, Sample Loop (350 l); CF, Flow Carrier (agua, 0,30 ml min - 1 ); RF, Flujo Reactivo (KIO 32,5% (m / v), 0,88 mL min - 1 ); RC, serpentín de reacción (500 l); WB, Baño de agua ( T = 30 ° C); SD, detector espectrofotométrico ( λ = 550 nm); W, de Residuos; PR, potenciométrica Recorder. Opciones Figura Para la optimización del sistema una solución de ácido tánico de 500 mg L - 1 se utilizó. En la fase de selección, a 2 4 diseño factorial se aplicó a explorar el KIO 3 y corriente portadora fluye factores de tasa, volumen de la muestra y de la bobina de reacción. Los dos niveles estudiados para cada factor se muestran en la Tabla 1 . Tabla 1. Niveles de factores estudiados en fase de selección (2 4 factorial design) Factores Nivel bajo (- 1) Alto nivel (+ 1) Unidad KIO 3 caudal 0.88 6.0 mL min - 1 Velocidad de flujo Carrier 0.30 3.4 mL min - 1 Volumen de la muestra 50 250 l Reacción bobina 500 1500 l Opciones de la tabla Durante la fase de optimización, un rostro compuesto diseño centrado 2 2 + estrellas se aplicó para evaluar el volumen de la muestra y KIO 3 soluciones factores de caudal. Los niveles estudiados se muestran en laTabla 2 . Tabla 2. Niveles de factores estudiados en fase de optimización (2 de 2 diseño + estrellas) Factores Nivel bajo (- 1) Nivel central (0) Alto nivel (+ 1) Unidad KIO 3 caudal 0.62 0.88 1.14 mL min - 1 Volumen de la muestra 150 250 350 l Opciones de la tabla Los Statgraphics plus software para Windows 3.0 se utilizó para analizar los datos de los diseños experimentales. Los mismos estándares de análisis y soluciones de muestras presentadas al sistema de flujo optimizado también se presentaron al método discontinuo Willis y Allen, sólo modificar la temperatura propuesta por ellos [12] . El método de lote consistió en el calentamiento de 5 ml de KIO 3 de solución (2,5% w / v) durante 7 min a 30 ° C, seguido por la adición de 1 ml de solución de muestra. La solución mezclada después se sometió a 2 min más de calentamiento a 30 ° C, antes de la determinación espectrofotométrica a 550 nm. 3. Resultados y discusiones El objetivo principal de este trabajo fue desarrollar un método de costo fácil, simple y de bajo para la determinación de taninos hidrolizables, que podría ser útil en estudios nutricionales, medicinales y ecológicas. La reacción colorimétrica entre tanino hidrolizable y KIO 3 solución, ya utilizada por Willis y Allen [12] en un procedimiento discontinuo, parecía ser perfecto para este objetivo. Por otra parte, la reacción entre el tanino hidrolizable y yodato de potasio se considera el método más adecuado para las determinaciones de elagitanina y galotanino [8] . La automatización de la reacción se determinó como la primera etapa de estos estudios. En el paso preliminar, se evaluó la temperatura de reacción. Según Willis y Allen [12] , temperaturas superiores a 25 ° C podría ser ventajoso si se utiliza un sistema automatizado. Por lo tanto, 30 ° C se aplicó como el punto de partida de este estudio, como ya fue utilizado por Hartzfeld et al. [9] . Otras temperaturas más se evaluaron 30 ° C, pero durante los experimentos temperaturas superiores a 30 ° C producen burbujas en los tubos de polietileno, especialmente en el serpentín de reacción. En consecuencia, se observa como una perturbación en la estabilidad de la señal analítica. Por lo tanto, la temperatura se fijó a 30 ° C. Por otra parte, los otros factores considerados en el estudio, lo que podría interferir con la intensidad del color rojo del producto de reacción fueron la tasa de soporte de muestra de flujo (A), KIO 3 caudal de la solución (B), volumen de la muestra (C), y el volumen de la bobina de reacción (D). Para la optimización de estos parámetros, se utilizó la metodología multivariado porque este tipo de metodología de optimización permite la evaluación de los cuales factores presentes influencias significativas en la respuesta del sistema, y si la influencia es negativo o positivo. La variación simultánea de factores que también permite la evaluación de los efectos de interacción entre los factores estudiados. Es imposible evaluar los factores que interactúan utilizando la metodología de un factor-en-un-tiempo para una optimización del sistema[17] y [18] . De esta manera, los parámetros fueron simultáneamente variados, en un total de 16 experimentos llevados a cabo por triplicado, teniendo en cuenta dos niveles para cada uno. El valor de la absorbancia fue el parámetro monitorizado como respuesta del sistema. El diagrama de Pareto ( Fig. 3 ) muestra que al 95% de nivel de confianza del factores individuales volumen de la muestra (C), KIO 3caudal (B) y la tasa de flujo de gas portador (A), fueron, en este orden, los factores más importantes en respuesta del sistema. Higo. 3. Diagrama de Pareto para determinar los valores de absorbancia después de la reacción entre KIO 3 y 500 mg L - 1 de ácido tánico. Opciones Figura También está claro que las interacciones entre el volumen de la muestra y KIO 3 caudal (AB), KIO 3 tasa de flujo y velocidad de flujo portador (BC), la tasa de flujo de gas portador y el volumen de la muestra (AC) y la tasa de flujo de gas portador y el volumen de reacción de la bobina (AD ), fueron las interacciones de los factores más influyentes en la respuesta del sistema. Para evaluar la influencia de factores individuales y las interacciones, la trama de los efectos principales y la trama interacciones fueron consideradas ( Fig. 4 y fig. 5 , respectivamente). Higo. 4. Gráfica de efectos principales para el valor de absorbancia determinado después de la reacción entre KIO 3 y 500 mg L - 1 de ácido tánico. Opciones Figura Higo. 5. Parcela de Interacción para el valor de absorbancia determinado después de la reacción entre KIO 3 y 500 mg L - 1 de ácido tánico (A: caudal portador, B: KIO 3 caudal, C: volumen de la muestra, D: volumen de la bobina). Opciones Figura En la gráfica de efectos principales ( Fig. 4 ) se puede observar que, sin embargo caudal portador (A) y KIO3 caudal (B) tuvieron un efecto considerable en el valor de la extinción, estas son las influencias negativas, es decir, en la lejos a medida que aumenta A o B, el valor de absorbancia disminuye. A medida que el nivel mínimo estudió por un era pequeña (0,30 ml min - 1 ), se consideró apropiado para estudiar la tasa de caudales más bajos, teniendo en cuenta los daños a la frecuencia analítica. De esta manera, la condición óptima para el factor A se fija en su nivel mínimo estudiado (0,30 ml min - 1 ). Sin embargo, se consideró muy importante para evaluar el factor B (KIO 3 caudal) de nuevo. La trama de interacción ( Fig. 5 ) muestra las interacciones entre los dos factores cuando el primero se fija en el centro de los niveles estudiados. La barra negativo representa el nivel mínimo, mientras que el bar positivo representa el nivel máximo estudiado para el segundo factor interactuar. En la interacción AB, el factor A se fijó en 1,85 mL min - 1 , en el centro de 3,4 y 0,30, niveles máximos y mínimos estudiado respectivamente. Como se puede observar, en esta situación, el factor B (KIO 3 caudal) tiene una gran influencia en el valor de absorbancia, en su nivel mínimo, debido la barra negativa es mayor que el positivo. Se confirma la influencia negativa del factor B con respecto al valor de absorbancia observada en los principales efectos parcela ( . Fig 4 ). Como se discutió anteriormente, el factor B necesita ser evaluado de nuevo, de modo que esta nueva evaluación puede considerar niveles más bajos, en lugar del mínimo estudiado en este diseño experimental. La interacción BC ( Fig. 5 ), representa para el factor B (KIO 3 caudal) fijado en 3,44 ml min - 1 , demostrado que las influencias del factor C (volumen de muestra) en gran medida el aumento del valor de la absorbancia, en su nivel máximo estudiado (el bar positivo es mayor que el negativo). Por lo tanto, el factor C también necesitaba ser evaluado de nuevo. Para la interacción de CA, se puede observar que cuando el factor A se fijó en 1,85 ml min - 1 , factor de C (volumen de muestra) influencia es mayor para el nivel máximo de C (250 l). Se confirma una vez más la necesidad de evaluar el factor C en niveles superiores a la máxima estudiada aquí. La última interacción destacó como relevante a nivel de confianza del 95% fue AD. Cuando A (caudal portadora) se fijó en 1,85 mL min - 1 , el factor D (volumen bobina de reacción) no presentó una gran influencia en su nivel máximo (1.500 l). Sin embargo factor A se estudió de nuevo y, como el factor D no reveló influencia como factor individual, se fija en su nivel mínimo, con el objetivo de aumentar la frecuencia de análisis del sistema. Con base en los resultados anteriores, los factores B (KIO 3 caudal) y C (volumen de muestra) se optimizaron. Una metodología de superficie de respuesta, sobre la base de cara centrada diseño compuesto 2 2 + estrellas se utilizó para este fin. En la fig. 6 , una superficie de respuesta obtenida por valores de absorbancia a partir de 10 experimentos realizados por triplicado se representa. Higo. 6. Superficie de respuesta estimado para el valor de absorbancia determinado después de la reacción entre KIO 3 y 500 mg L - 1 de ácido tánico. Opciones Figura Los resultados muestran las mejores condiciones para los factores evaluados. Estos se obtienen mediante la fijación como 0,88 ml min - 1 KIO 3 tasa de flujo (B) y 350 l el volumen de muestra introducida en el sistema (C). Por lo tanto, con estos experimentos era posible establecer la configuración del sistema, que se describe en la leyenda de la figura. 2 . A continuación, se evaluó el sistema de flujo optimizado, y parecía adecuado para ser aplicado para la determinación de taninos hidrolizables en las plantas. Este sistema presenta una frecuencia de análisis de 15 inyecciones por hora, un intervalo lineal de hasta 1000 mg L - 1 de ácido tánico ( R 2 = 0,9974), buena reproducibilidad y repetibilidad (RSD 3%, n = 10) y sin efectos de memoria ( figura . 7 ), y un límite de cuantificación de 24 mg L - 1 de ácido tánico. Higo. 7. (A) de salida del registrador para la curva analítica: desde la derecha a izquierda por triplicado inyección de solución, 0, 100, 200, 400, 600, 800 y 1000 mg de ácido tánico por litro de solución. (B) Curva parcela analítica y su ajuste lineal. Opciones Figura Además de las características comunes de los sistemas de flujo esbozados por Ruzicka y Hansen [14] , tales como la economía de reactivos y menor generación de residuos, la capacidad de obtener todas las mediciones en el mismo período de tiempo después de la reacción, fue el punto clave de este método.Como KIO 3 y la reacción de tanino hidrolizable presenta un producto de color transitoria [12] , en el método por lotes es muy difícil de controlar el tiempo de cada medición. Por lo tanto, siempre se introducen errores [20] . Estos errores pueden causar disminución del rango lineal y repetibilidad debido a las diferencias de tiempo mínimo entre cada determinación. La validación del método propuesto se realizó mediante el uso de la suma y procedimiento de recuperación. Con una adición de 200 mg L - 1 de ácido tánico a una muestra, se obtuvo 97% de recuperación, después de la determinación en el sistema de flujo propuesto. Después de la optimización y caracterización, el sistema de flujo propuesto se aplicó para determinar la concentración de tanino hidrolizable en tres especies de plantas, que se utiliza comúnmente en la medicina popular, S. barbatimão , E. citriodora y P. niruri . Los resultados obtenidos usando el sistema de flujo propuesto se compararon con los obtenidos por el método discontinuo, descrito por Willis y Allen [12] , donde la temperatura empleada fue de 30 ° C en lugar de 25 ° C. Esta modificación se realizó con el objetivo de mantener las mismas condiciones para las dos metodologías de comparación y los resultados obtenidos se describen en la Tabla 3 . Tabla 3. Contenido de tanino hidrolizable determinado en barbatimão Stryphnodendron , Eucalyptus citriodora y Phyllanthus niruriespecies de plantas por el método por lotes y sistema de flujo propuesto Muestra Taninos hidrolizables (g kg - 1 ) Taninos hidrolizables (g kg - 1 ) F -test t -test Método por lotes Método de flujo propuesto Eucalyptus citriodora (madera) 199 (± 21) un una 191 (± 17) 1.5 NS bb 0.42 NS Citriodora Eucalipto (hojas) 93 (± 22) 107 (± 24) 1.2 NS 0.61 NS Stryphnodendron barbatimão(madera) 70 (± 8,5) 46 (± 3,5) 5.9 NS 3.7 NS Phyllanthus niruri (hojas) 134 (± 1,6) 154 (± 2,6) 2.6 NS 9.1 NS un La desviación estándar para n = 2. b No significativo. Opciones de la tabla Como se puede observar, el emparejado F -test muestra que al nivel de confianza del 95%, hay acuerdo entre los resultados obtenidos por ambos, lote y método de flujo propuesto. Para comparar los resultados señalados como no significativas por F -test, la comparación medio t - test fue aplicado. Los t -valores también muestran que los resultados obtenidos por ambos métodos están de acuerdo en el nivel de confianza del 95%. 4. Conclusiones El sistema propuesto presenta buenas características para ser aplicado a la determinación de tanino hidrolizable en las plantas. La posibilidad de la determinación en línea aumenta la frecuencia de análisis y produce resultados libres de errores relacionados con el tiempo de las mediciones, característica de los métodos de proceso por lotes. El uso de enfoque quimiométrico para la optimización permite un mejor sistema de colector con número relativamente pequeño de experimentos. Reconocimiento Los autores desean agradecer a los CAPES y CNPq de apoyo financiero y becas proporcionado a los autores. Referencias 1. o [1] o CS McSneeney, B. Palmer, DM McNeill, HACER Krouse o Anim. Alimente Ciencia. Technol., 91 (2001), p. 83 o [SD-008] 2. o [2] o J.-P. Salminen, V. Ossipov, E. Haukioja, K. 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Acta, 179 (1983), p. 291 o [SD-008] 20. o [20] o CE Ferreira, ARA Nogueira o Talanta, 51 (2000), Alimentación Animal Ciencia y Tecnología Volume 91, Issues 1-2 , el 16 de mayo de 2001, páginas 3-20 Taninos: Análisis y los efectos biológicos en los alimentos para rumiantes Análisis de los taninos hidrolizables  Irene Mueller-Harvey , Mostrar más DOI: 10.1016 / S0377-8401 (01) 00227-9 Obtener los derechos y contenidos Resumen Esta crítica se ocupa de las principales cuestiones relacionadas con el análisis de los taninos hidrolizables (HTS). Cubre brevemente su distribución en el reino vegetal y se describen sus principales características estructurales. HTs menudo han sido ignoradas porque son aparentemente más difícil de analizar que los taninos condensados. Datos analíticos significativos dependen críticamente de las técnicas de preparación de muestras, almacenamiento y extracción apropiadas. Esto requiere una cierta comprensión de la reactividad de los taninos hidrolizables. Mezclas de HTs se han medido por ensayos de tanino generales, tales como precipitación con metales o proteínas, y por ensayos colorimétricos para fenoles totales. Algunos HTs también se pueden medir mediante ensayos colorimétricos más específicas. Aunque los ensayos colorimétricos son ampliamente utilizados para los análisis de tanino, por lo general, no proporcionan datos cuantitativos precisos. A lo sumo, que proporcionan datos a efectos comparativos.Cromatografía en capa fina (TLC) y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) son herramientas útiles para examinar muestras para los diferentes tipos de taninos, taninos hidrolizables o condensados.Además, hay técnicas fisicoquímicas, tales como la resonancia magnética nuclear (RMN) y espectrometría de masas (MS), que se utilizan para identificar compuestos de tanino puros. Más recientemente, otras técnicas de MS han sido desarrollados que son capaces de producir pesos moleculares de mezclas de taninos crudo. Palabras clave  Extracción ;  Estructuras ;  Colorimetría ;  TLC ;  HPLC ;  RMN ;  MS 1. Ocurrencia y estructuras de los taninos hidrolizables (HTS) Tabla 1 ilustra que los taninos hidrolizables son sintetizados por una amplia variedad de plantas y árboles (Haslam, 1981 ; Okuda et al, 1990. ; Kumar y Vaithiyanathan, 1990 ) y varias de éstas se han usado como alimentos para animales ( Le Houérou, 1980 ) . Pueden ocurrir en madera, corteza, hojas, frutos y agallas.Vale la pena señalar que algunas especies producen ya sea galotaninos o elagitaninos, mientras que otros producen mezclas complejas que contienen galo, ellagi- y taninos condensados. Por ejemploAcacia, Acer y Fagaceae son bien conocidos por tener ambos taninos condensados y hidrolizables ( Bate-Smith, 1977 ; . Mueller-Harvey et al, 1987 ; Ishimaru et al., 1987 ). Tabla 1. Ocurrencia de taninos hidrolizables en las plantas y árboles Familia Especies Tipos de taninos Anacardiaceae Rhus sp. Galotaninos, elagitaninos Leguminosae Caesalpinia sp. Galotaninos, elagitaninos Acacia sp. Galo, galatos de catequina Fagaceae Quercus sp. Galotaninos, elagitaninos Castanea sp. Elagitaninos Combretaceae Terminalia sp. Elagitaninos Myrtaceae Eucalyptus sp. Elagitaninos Opciones de la tabla Higo. 1 muestra las relaciones entre la biosíntesis de compuestos diferentes HTs. El compuesto central, pentagalloylglucose, es el punto de partida para muchas estructuras de taninos complejos. Este compuesto pertenece a los denominados galotaninos. Estos consisten en un poliol central, tal como la glucosa, que está rodeado por varias unidades de ácido gálico. Otras unidades de ácido gálico se pueden unir a través de un enlace depside ( . Fig 2 ). Galotaninos simples son relativamente raros en la naturaleza, pero tienden a ser los principales constituyentes de los ácidos tánicos disponibles comercialmente, por ejemplo, los taninos chinos de Rhus semialata ( Hagerman et al., 1997 ). Galotaninos ocurren en Acer ,Quercus , Rhus y Pelargonium especies ( Haslam, 1986 ; . auto y otros, 1986 ). Más taninos complejos, tales como los elagitaninos, también se derivan de biosintéticamente pentagalloylglucose por reacciones oxidativas entre las unidades de ácido gálico. Higo. 1. Metabolismo de ácido gálico (G) en taninos hidrolizables (después de Auto et al, 1986. ): pentagalloylglucose es el precursor de galotaninos (GT) y elagitaninos (ET). Opciones Figura Higo. 2. Ejemplo de un bono depside que se forma entre el grupo fenólico de la parte superior y el grupo ácido de las unidades de ácido gálico inferiores. Opciones Figura Un número muy grande de moléculas de HTs existe en la naturaleza. La variación estructural entre estos compuestos es causada por acoplamiento oxidativo de unidades de ácido gálico vecinos o por oxidación de los anillos aromáticos ( Nonaka, 1989 ; . Okuda et al, 1990 ). Fig. 3 y fig. 4 dar ejemplos de estos dos tipos de reacciones. Tales reacciones de acoplamiento oxidativo puede producir HTs grandes y complejos. Fig. 5 muestra una HTs diméricos formados por el acoplamiento oxidativo entre dos ácidos gálico, cada uno de los cuales está unido a un núcleo diferente de la glucosa. Cabe destacar en este punto que la mayoría de los ensayos colorimétricos HTs sólo detectan la galoil o hexahydroxydiphenoyl grupos (HHDP), pero no a los productos de reacción más complejos se representa en la figura. 3 y fig. 4 . Como resultado, muchos compuestos HTs pueden escapar cuantificación en pruebas colorimétricas diseñados para HTs! Higo. 3. Reacciones de acoplamiento oxidativo entre unidades de ácido gálico pueden dar lugar a residuos más grandes fenólicos en taninos hidrolizables (después de Nonaka, 1989 ). Opciones Figura Higo. 4. Las reacciones de oxidación de los anillos aromáticos en elagitaninos y otros taninos hidrolizables (después de Nonaka, 1989 ). Opciones Figura Higo. 5. Ejemplo de una llamada tanino hidrolizable dimérica, ya que contiene dos unidades de azúcar, cada uno de los cuales está rodeado por el ácido gálico o sus metabolitos (después de Yoshida et al., 1985 ). Opciones Figura 2. Extracción de HTs Ha habido mucho debate sobre si fresco, liofilizado o muestras secadas al aire se deben analizar. Las recomendaciones generales son que las muestras frescas son la opción preferida para la extracción de taninos. Sin embargo, esto a menudo no es práctico ni viable. La siguiente mejor opción es la de transportar las muestras en frío (por ejemplo, sobre hielo o dióxido de carbono) antes de la liofilización. Sin embargo, si las muestras son para ser secada al aire, se recomienda que se pueden secar a la sombra.Okuda et al. (1989) demostraron que algunos compuestos fenólicos se descomponen muy rápidamente en la luz solar directa o si se seca a temperaturas elevadas. El secado al horno a baja temperatura (<40 ° C) en un horno asistido por ventilador puede ser la única opción factible en ambientes húmedos.Claramente, no es posible recomendar un solo procedimiento óptimo para todos los tipos de muestras o taninos ( Hagerman, 1988 ; Hagerman et al, 1997. ). De extracción de taninos puede también dependerá de la madurez de temporada de los tejidos y del tipo de plantas o taninos. Torti et al. (1995) encontraron que un homogeneizador Polytron lograrse eficiencias de extracción más altos y más bajos coeficientes de variación de un baño de ultrasonidos. Okuda et al. (1989) comentó que HTs aislados tienden a ser bastante estable en el aire a temperatura ambiente (RT), mientras que los taninos condensados tienden a oxidar en las mismas condiciones. Varios disolventes se han utilizado para extraer HTs. Hexano o diclorometano pueden usarse inicialmente para eliminar los lípidos y la clorofila. Todas las extracciones de HTs deben hacerse en o por debajo RT pesar del hecho de que a menudo se han utilizado temperaturas más altas ( Okuda et al., 1990 ). HTs han sido extraídos con agua (RT o 90 ° C), 50% de metanol (RT o de ebullición) y acetona acuosa 50-70% (4 ° C o RT) ( Hagerman, 1988 ; Waterman y Mole, 1994 ). El metanol tiende a ser el mejor disolvente para taninos de bajo peso molecular o si los tejidos contienen grandes cantidades de enzimas (es decir, la corteza o frutas). Sin embargo, la acetona es a menudo el disolvente preferido ya que es menos susceptible de reaccionar con HTs que el agua o metanol (véase más adelante). La solubilidad de HTs es sorprendentemente variables; por ejemplo, castalagina y vescalagin son altamente solubles en agua, mientras que pentagalloylglucose es sólo escasamente soluble en agua, pero muy soluble en acetato de etilo ( Haslam, 1996 ). En una nota de advertencia: acetato de etilo se utiliza a menudo para eliminar los componentes no tanino de extractos de tanino crudo y por lo tanto puede causar pérdidas significativas de algunos HTs. 3. Estabilidad y reacciones de HTs HTs son más propensos a reaccionar con el disolvente de extracción de taninos condensados. Por ejemplo, rompe los lazos de metanol depside en galotaninos ( Figura 6. ) a pH neutro y RT ( Tedder y col, 1972. ; Porter, 1989 ), pero metanol acidificado (pH <3) no escindir estos bonos ( Haslam et al ., 1961 ).Taninos grandes y complejas se degradan fácilmente en taninos más pequeños por el agua o ácidos diluidos especialmente a temperaturas elevadas en tan sólo 30 min ( Beasley et al, 1977. ; Okuda et al, 1989. , y Okuda et al, 1990. ). De agua a 60 ° C es probable que liberar ácido gálico de la anomérico C-1 posición de glucosa ( Tedder y col., 1972 ). De agua a 100 ° C también puede liberar ácido elágico de elagitaninos ( Nishimura et al., 1986 ) y escindir el enlace éter (ver fig. 3 ) en el grupo valoneoyl ( Okuda et al., 1990 ). Extracción de A. nilotica con etanol producido ethylgallate caliente como un artefacto de galatos de catequina ( Lowry et al., 1996 ). Aunque algunas de las reacciones ocurren en condiciones bastante suaves, no todos los bonos en HTs se degradan fácilmente. Puede tomar hasta 26 horas para hidrolizar ácidos gálico o elágico de algunos HTs con ácidos diluidos ( Porter, 1989 ; Wilson y Hagerman, 1990 ). Algunos investigadores emplean la enzima tanasa para eliminar el ácido gálico o elágico de HTs (Yoshida et al, 1989a. , y Yoshida et al, 1989b. ; Okuda et al, 1989. ). Esta enzima está comercialmente disponible de ICN Biomedicals, (Basingstoke, Reino Unido), Juelich Enzyme Products GmbH, (Heidelberg, Alemania) o Wako BioProducts, (Neuss, Alemania). Higo. 6. La disolución de metanol, o metanolisis, de un bono depside. Opciones Figura Después de la extracción, los taninos están sometidos con frecuencia a purificación adicional con el fin de servir como un estándar de tanino «en bruto» en ensayos colorimétricos posteriores. Sephadex LH20, Toyopearl HW-40 o Diaion HP-20 ( Okuda et al., 1989 ) tienden a funcionar bien con la mayoría de los TC.Sin embargo, algunos HTs oligoméricos lábiles pueden ser degradados durante la purificación en Sephadex LH20 ( Yoshida et al, 1989a. , y Yoshida et al, 1989b. ; . Okuda et al, 1990 ). Es bien sabido, sin embargo, rara vez se menciona, que Sephadex LH20 tiende a absorber gran peso molecular CTs, y posiblemente algunos grandes HTs, tan fuertemente que no pueden ser eluidos posteriormente ( Okuda et al., 1989 ). 4. Los ensayos para la determinación de fenoles totales Hay varios métodos para medir el contenido de fenoles totales en materiales vegetales ( Hagerman y Butler, 1989 ). La mayoría de estos ensayos sufren un defecto importante a pesar del hecho de que están muy ampliamente utilizados: cada compuesto fenólico produce un rendimiento de color diferente por unidad de masa en los ensayos colorimétricos. Como la composición cuantitativa de una mezcla desconocida de compuestos fenólicos es, por definición, no se conoce, es claramente imposible utilizar un solo 'fenol estándar "en el que basar tales ensayos. Por lo tanto, la determinación colorimétrica se deben utilizar solamente para las comparaciones semi-cuantitativos. El Folin-Ciocalteu (1927) ensayo es una modificación del reactivo de Folin-Denis, ya que produce menos precipitados de interferencia que puede ser problemático si las muestras son altos en K + -iones (Waterman y Mole, 1994 ). El reactivo de Folin-Ciocalteu también tiene la ventaja de estar disponible comercialmente (Sigma Chemicals, Poole, UK). El ensayo de Folin- Ciocalteu y el precio y Butler (1977)ensayo, modificado por Graham (1992) , son la determinación colorimétrica recomiendan para fenoles totales ( Waterman y Mole, 1994 ). Un procedimiento alternativo fue desarrollado por Reed et al. (1985) en el que los compuestos fenólicos se precipitan por el acetato de iterbio. El hecho de que los compuestos fenólicos se pesan es una clara ventaja de este método y que no requiere un compuesto fenólico "estándar". En nuestro laboratorio, este procedimiento se precipitó por completo todos los compuestos fenólicos si representaron más del 15% de la DM. A concentraciones más bajas fenólicos, las precipitaciones fueron incompletos. Este ensayo, por lo tanto, se muestra prometedor para la determinación de compuestos fenólicos totales, pero se beneficiarían de una mejora adicional. En efecto, las condiciones de precipitación se han modificado ligeramente en una publicación más reciente de este grupo ( Krueger et al., 2000 ). 5. ensayos colorimétricos para HTs 5.1. KIO 3 -reagent para galo y elagitaninos Bate-Smith (1977) describe un procedimiento para medir galo y elagitaninos en Acer especies, que producen un producto de reacción de color rosa con el KIO 3 -reagent. Hagerman et al. (1997) observó, sin embargo, que este ensayo no era adecuado para mezclas complejas de taninos, ya que tendían a dar a los productos de color marrón en lugar de color rosa. Además, esto no es un ensayo robusto como el desarrollo del color es críticamente dependiente de la temperatura y la duración de la reacción. Hagerman et al. (1997) sugiere que pentagalloylglucose ser utilizado como el tanino estándar (ver fig. 1 ) Hagerman (2001) describe un método para aislarla de ácido tánico comercial. Este sitio es muy recomendable para este fin. Más recientemente, Willis y Allen (1998) re-examinaron este ensayo en detalle y sugirieron un protocolo mejorado para la determinación de galo y elagitaninos. 5.2. Rodanina reactivo para galotaninos Galotaninos se pueden detectar muy específicamente por la prueba rodanina que fue desarrollado porInoue y Hagerman (1988) . El éxito de este ensayo depende críticamente de la ausencia de oxígeno y se realiza o bien en atmósfera de nitrógeno o al vacío en un tubo de ensayo se selló a TA. Rodanina sólo reacciona con ácido gálico y no con ésteres galoil, ácido elágico, elagitaninos u otros compuestos fenólicos ( Porter, 1989 ). Galotaninos se miden mediante la determinación de la cantidad de ácido gálico antes y después de la hidrólisis de los taninos. Es importante reconocer que este ensayo no puede proporcionar una cuantificación absoluta de galotaninos como el número de unidades de ácido gálico difiere entre las diversas moléculas galotanino que se producen en la naturaleza ( Inoue y Hagerman, 1988 ). Otra complicación surge del hecho de que muchos de los llamados elagitaninos también contienen ácido gálico, es decir, no hay una distinción clara entre el galo y elagitaninos. 5.3. De NaNO 2 -reagent de elagitaninos Wilson y Hagerman (1990) informaron de una mejora de NaNO 2 ensayo que fue descrita por primera vez por Bate-Smith (1972) para la medición de elagitaninos. El nuevo ensayo es selectivo para el ácido elágico sólo ( Fig 7. ); ácido gálico, galotaninos, elagitaninos, taninos condensados, los flavonoides no interfieren.Es conveniente analizar extractos y tejidos completos, como elagitaninos son a menudo muy insoluble.Desafortunadamente, este ensayo también es sensible al oxígeno y por lo tanto necesita ser llevado a cabo bajo nitrógeno. Además, los autores recomiendan que los nuevos tubos de vidrio pueden utilizar como residuos de lavado de vidrio pueden inhibir la reacción. Claramente, esta prueba se beneficiaría de un mayor desarrollo. Higo. 7. La formación de un producto de reacción coloreado derivado de elagitaninos por el Nano 2 -reagent (después de Wilson y Hagerman, 1990 ). Opciones Figura Se sugiere, por lo tanto, que el análisis de HPLC del ácido gálico o elágico podría ser más conveniente ya que estos pueden ser liberados por tanasa o ácidos de galo y elagitaninos diluido. Ninguno de los constituyentes fenólicos de HTs representados en la fig. 3 y fig. 4 que tienen pesos moleculares mayores que el ácido elágico reaccionan con los reactivos anteriores. Esto significa que no todos los HTs pueden ser detectados por estos ensayos colorimétricos. 6. Encuestas para HTs y taninos condensados (TC) por cromatografía en capa fina (TLC) TLC es una técnica relativamente barato, pero poderosa a la planta de pantalla de extractos para la presencia de diferentes tipos de taninos. Los extractos se manchas en capas de gel de celulosa o sílice que se unen a placas de vidrio o láminas de plástico. La parte inferior de la placa se coloca entonces en un disolvente. Como disolvente migra hasta la placa, los diversos compuestos fenólicos están separados.Cuando el disolvente ha alcanzado la parte superior, la placa se elimina y el disolvente se secó. La placa puede entonces ser girada por 90 ° y se coloca en un segundo disolvente con el fin de lograr la separación de HTs y CTS. Esta es una breve descripción del TLC bidimensional. Los disolventes típicos son butan-2-ol / ácido acético / agua (14: 1: 5, fase superior, v / v), t -butanol / ácido acético / agua (3: 1: 1, v / v) o butan- 1-ol / ácido acético / agua (60:15:25, v / v) para la primera dirección y ácido acético / agua (2:98 o 6:94, v / v) para la segunda dirección ( Porter, 1989 ; Mueller-Harvey et al., 1987 ). Las posiciones relativas, o R f -valores, de las manchas fenólicos se pueden utilizar como una primera indicación de la presencia de HTs o TC ( Fig. 8 ). Bajo luz UV, ésteres galoil y galotaninos aparecen manchas fluorescentes como violetas que se han mejorado en la fumigación de vapores de amoníaco. El ácido elágico produce una mancha violeta que oscurece cuando se expone a vapores de amoníaco. Higo. 8. TLC de condensados y taninos hidrolizables extraídos de Acacia bussei , A. nilotica , Euclea schimperi y Pterolobium stellatum (Mueller-Harvey et al., 1987) . 1: los taninos condensados, 2: ácido gálico, 3: ésteres de ácido gálico, 4: ésteres de ácido elágico, 5: galatos de catequina, 7: catequina. Opciones Figura Las placas pueden entonces ser rociadas con diversos reactivos para detectar los compuestos de tanino (Haslam, 1965 ; Gupta et al, 1982. ; eglefino et al, 1982. ; Yazaki y Okuda, 1990 ). El FeCl 3 / K 3 Fe (CN) 6 -Pulverice revela todos los compuestos fenólicos, incluyendo taninos, como manchas azules (nota: todos los taninos son compuestos fenólicos, pero no todos los compuestos fenólicos son taninos!). El fondo azul de las placas de celulosa puede ser minimizado por remojo las placas inmediatamente después de aplicar la FE-aerosoles primero en HCl diluido (0,2-2 M) y luego en agua. La vainillina aerosol / HCl da puntos rojos / rosados con flavan-3-oles y TC. El KIO 3 -Pulverice da rosa naranja o manchas marrones con ácido gálico y galotaninos y, por último, el Nano 2 también produce manchas de color naranja-marrón con ácido elágico y elagitaninos. Parecería que los taninos de alto peso molecular tienden a absorber fuertemente a la origen de placas de celulosa o aparecer como una banda ancha cerca del origen (no publicado). Por último, también es posible separar y aislar los taninos de placas de TLC mediante el uso de capas más gruesas de celulosa ligeramente (0,5-1 mm), la llamada CCF preparativa. Si dichas capas se han impregnado con un indicador fluorescente (excitación a 254 nm), los taninos aparecen como manchas oscuras bajo una lámpara UV de onda corta. Tales placas son particularmente útiles para el trabajo preparativa porque no requieren aerosoles de visualización destructivas. Las áreas oscuras son simplemente raspan y los taninos se eluyen con disolventes apropiados. 7. Encuestas para HTs y TC por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Mezclas de taninos pueden separarse en dos tipos de columnas de HPLC. En HPLC en fase normal, las columnas de acero inoxidable están más apretadas con partículas de sílice polar (<5 micras). En HPLC de fase inversa, las partículas de sílice se recubren con no polares, por ejemplo, cadenas de alcano C 8 o C 18cadenas. Como una primera aproximación en HPLC en fase inversa, los TC a menudo aparecen como mal resuelto elución 'humps' entre 10 y 20 minutos, mientras que las mezclas de HTs aparecieron en adelante elución 'humps' en las condiciones empleadas por Mueller-Harvey et al. (1987) (ver Fig. 9 ).Varios trabajadores ( Beasley et al, 1977. ; Tanaka et al, 1984. ; Okuda et al, 1989. ; . Hagerman et al, 1992) encontró que la HPLC en fase normal era una técnica útil para separar HTs por sus pesos moleculares (Fig. 10 A y B). Curiosamente, Tanaka et al. (1984) mostraron que si HTs se sometieron a cromatografía en columnas de fase inversa, los cromatogramas eran mucho más complicado ( Fig. 10 c). Esto se atribuyó a isómeros anoméricos y formación de acetal en los eluyentes de HPLC alcohólicas ( Okuda et al., 1989 ).También vale la pena señalar que un galotanino disponible comercialmente tenía pesos moleculares mucho más bajas que las que ocurren naturalmente en HTs flores fireweed ( Fig 10. b; Hagerman et al, 1992. ). Higo. 9. HPLC en fase reversa de condensados y taninos hidrolizables extraen de Acacia bussei , A. nilotica , Euclea schimperi yPterolobium stellatum ( Mueller-Harvey et al., 1987 ). 1: ácido gálico, 2: catequina, 3-7: galatos de catequina, 8: una catequina y galato quercitrina. Opciones Figura Higo. 10. HPLC en fase normal de los taninos hidrolizables de (a) Heterocentron roseum (después Okuda et al., 1989 ), (b) la parte superior: ácido tánico comercial (Mallinkrodt), inferior: taninos flores fireweed (después . Hagerman et al, 1992 ) y ( c) penta undecagalloylglucoses a partir de hojas de Mangifera indica (después de Tanaka et al., 1984 ). Opciones Figura 8. de resonancia magnética nuclear (RMN) para la identificación de los taninos NMR y espectrometría de masa es la principal técnica para la identificación de compuestos individuales y requiere ca. 1-5 mg de compuestos de tanino puros. El compuesto se disuelve entonces en 1-2 ml de un disolvente deuterado tal como agua, metanol, acetona o dimetilsulfóxido antes de que se registró el espectro de RMN. La absorción de protones ( 1 H RMN) o carbonos ( 13 C RMN) produce cambios químicos que proporcionan información detallada sobre el entorno químico de cada átomo individual. Esto permite el reconocimiento de los grupos químicos tales como ésteres, alcoholes, dobles enlaces, etc Fig.11 muestra un ejemplo de un tanino complejo (1), que se compone de dos subunidades, una hidrolizable (2) y un tanino condensado (3). El 13 espectro de RMN C de (3) es casi idéntica con los espectros de RMN combinado de (2) y (3) ( Ishimaru et al., 1988 ). Tales estudios químicos detallados han proporcionado ideas sobre la complejidad de la química de los taninos ( Ferreira y Bekker, 1996 ; Okuda et al., 1989 ) y es, por lo tanto, no es sorprendente que las pruebas colorimétricas simples son incapaces de diferenciar entre los taninos procedentes de diferentes plantas o para cuantificar 'taninos. Higo. 11. 13 espectroscopía de RMN de carbono de (1) monolicanin, (2) vescalagin y (3) procianidina taninos que se aislaron a partir de 3 B-Quercus mongolica (después de Ishimaru et al., 1988 ). Opciones Figura 9. espectrometría de masas (MS) de los TC y TC Existen varios tipos diferentes de técnicas de MS y se ha logrado un progreso significativo en los últimos 10-15 años en este campo ( Okuda et al., 1989 ). MS técnicas modernas pueden ser aplicables a las cantidades de microgramos de compuestos de peso molecular lábiles, polares y grandes sin derivatización previa. Brevemente, los compuestos de interés son ionizados y, a continuación proporcionan información estructural significativo tales como iones moleculares o los iones fragmentados característicos. Bombardeo con átomos rápidos MS en el modo de ion negativo fue particularmente exitoso en la identificación de una gama de HTs puras y CTs compuestos hasta 1900 Da ( Fig 12. ; . auto et al, 1986 ; Porter, 1989 ). Pérdidas característicos del ion molecular [M-H] - de 152 y 170 se atribuyeron a unidades de ácido gálico. Más recientemente, nuevas técnicas de EM se han utilizado para estudiar las mezclas de taninos crudo. Electropulverización de ionización MS tuvo éxito en la identificación de taninos en mezclas de hasta 2300 Da ( Guyot et al., 1997 ) y el trabajo reciente de Krueger et al. (2000) y Hedqvist et al. (2000) proporcionan información muy detallada sobre una serie de taninos crudo mediante MALDI-TOF MS. Estas dos técnicas son muy prometedores para el estudio de la química de los taninos, pero el éxito en esta etapa parece ser un arte. MS técnicas pueden proporcionar información sobre los componentes y pesos moleculares de los taninos. Sin embargo, los vínculos entre los componentes son los más estudiados por técnicas de RMN. Higo. 12. Bombardeo de átomos rápidos MS de dos taninos hidrolizables, sanguin H-6 y rugosin D ( Auto et al., 1986 ). El espectro revela los iones moleculares [M-H] - . Opciones Figura 10. método Que elegir para el análisis de tanino? Desafortunadamente esta pregunta no tiene una respuesta fácil - aún se necesitan respuestas con el fin de evaluar el valor nutricional de diferentes plantas o forrajes de árboles o para la detección de nuevas variedades en los programas de mejoramiento. Nuestra falta de comprensión en cuanto a estructura tánica / relaciones de actividad se refiere es un serio obstáculo para recomendar cualquier método de análisis en particular en la actualidad. Por lo tanto, se sugiere que siempre que sea posible una gran variedad de métodos se utiliza para caracterizar alimentaciones taniníferos ( Tabla 2 ). Además de estos ensayos químicos, ensayos bioquímicos y biológicos (ver otras contribuciones a este simposio) también deben ser consideradas siempre que sea posible, en relación con los ensayos de alimentación animal con el fin de desentrañar los efectos de los taninos en la nutrición animal. Sólo cuando los componentes o propiedades de los taninos activos son conocidos ¿será posible enfocar las técnicas analíticas más precisión. Tabla 2. Los métodos para la caracterización de los taninos en la alimentación animal Tipos de taninos / propiedades de tanino Reactivo / técnica Referencia Fenoles totales Ácido fosfomolíbdico Folin y Ciocalteu (1927) FeCl 3 / K 3 Fe (CN) 6 Precio y Butler (1977) , Graham (1992) Yb (acetato) 3 Reed et al. (1985) Los taninos condensados HCl / butanol Porter et al. (1986) Galotaninos Rodanina Inoue y Hagerman (1988) Galo y elagitaninos KIO 3 Willis y Allen (1998) Determinación por HPLC de los ácidos gálico y elágico después de la hidrólisis Mueller-Harvey et al. (1987) Todos los tipos de taninos TLC Mueller-Harvey et al. (1987) Los pesos moleculares ESI o MALDI-TOF MS para HTs y CTS; HPLC de fase normal para HTs Guyot et al. (1997) , Krueger et al. (2000) , Hedqvist et al.(2000) ; Tanaka et al. (1984) , Okuda et al. (1989) , Hagerman et al. 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La hidrólisis con tanasa-asistida de ácidos galloylquinic contenidas en el polvo de tara permitió la determinación del valor de hidroxilo taninos (13,7 mmol / g de polvo). Entonces, los ácidos galloylquinic se hicieron reaccionar con epiclorhidrina y una solución acuosa de hidróxido de sodio en presencia de cloruro de benciltrietilamonio como catalizador de transferencia de fase (PTC). Los análisis de los productos glicidilado El 1D y 2D RMN reveló la hidrólisis ésteres galloylquinic y la dimerización de los moities gálico glicidilado. Los derivados glicidilado de taninos de tara ( GETT ) se curaron en polímero epoxi con isoforondiamina ( IPD ). La temperatura de transición vítrea ( T g = 129 ° C) y la resistencia térmica ( T d30 = 294 ° C) de la red resultante se determinaron. Los resultados preliminares mostraron que este nuevo polímero basado en epoxi GETT muestra propiedades interesantes que se acercan a las del polímero epoxi formulado con diglicidil éter de bisfenol A comercial ( DGEBA ). Resumen gráfico Opciones Figura Palabras clave  Vainas de Tara ;  Taninos hidrolizables ;  Funcionalización ;  Polímero epoxi 1. Introducción Los taninos son compuestos fenólicos de peso molecular relativo alto. Se clasifican como taninos condensados y hidrolizables. Los taninos hidrolizables se hidrolizan fácilmente por ácidos, álcalis o enzimas en un azúcar o un alcohol polihídrico relacionados (poliol) y un ácido carboxílico fenólico [1] .Dependiendo de la naturaleza del ácido carboxílico fenólico, taninos hidrolizables se subdividen en galotaninos y elagitaninos y [2] . Están biosintetizadas por galloyltransferases como compuestos de defensa (contra biliar Chino y Turquía biliar) y se acumulan en las paredes celulares de mesófilo [3] . Los taninos hidrolizables simples son galotaninos que se componen de ésteres gálico de glucosa, ácido shikímico, ácido quínico y quercitol entre otros [4] . Estos taninos se encuentran en diversas plantas y árboles como el castaño, el roble, el zumaque, y tara [5] . Tara ( Caesalpinia spinosa ) es un pequeño árbol nativo de leguminosas de Perú y ampliamente difundido en América Latina, desde Venezuela hasta el norte de Chile [6] . El fruto de tara contiene aproximadamente el 65% de las vainas [7] y el 32-38% de las semillas. De las vainas, el polvo de tara (malla 100-200) se obtiene simplemente moliendo mecánicamente y tamizar el polvo bruto. Después, este polvo se mezcla con agua (4- 5 partes de su peso) y se calentó a 65-70 ° C durante 30-40 min. Después de la decantación y filtración, el extracto de tara se obtiene por atomización. Este procedimiento ecológico y económico produce extracto de tara con alto contenido de taninos [8] . Se ha informado de que 40-65% de la composición de la fruta de C . spinosacorresponde a galotaninos [7] . Las estructuras químicas de estos galotaninos fueron ampliamente investigadas por Haslam et al. [9] y Horler et al. [10] que demostraron que los componentes principales de tanino de tara se basaron en la estructura del ácido quínico galloylated ( Esquema 1 ). Por lo tanto, se diferencian de los miembros del grupo de los taninos hidrolizables que se basan en una hexosa galloylated o ellagoylated. En los ácidos galloylquinic, no sólo puede restos de ácido gálico estar vinculados a cada uno de los cuatro hidroxilos realizadas por el ácido quínico pero éstos pueden formar éster de arilo (s) (depsides) con uno o más restos adicionales de ácido gálico y [11] . Se han reportado Cadenas de hasta tres restos de ácido gálico, de los cuales dos son depsidic, [9b] y un ácido quínico dado pueden tener más de una cadena depside [12] . En tales estructuras, los vínculos depsidic pueden ser meta o párr . Esquema 1. Taninos de tara supuestos estructura química. Opciones Figura Recientemente, Giovando et al. [13] informaron el análisis estructural MALDI-TOF de un extracto de taninos de tara. Se ha encontrado que este extracto se compone de una serie de oligómeros de ácido polygallic (bonos depsidic) unidos por un enlace éster a un grupo hidroxilo ácido quínico. Por otra parte, otras cadenas polygallic vinculados a una o dos unidades que se repiten, como el ácido cafeico y quínico metilado, gálico metilado y ácidos cafeico metilados se han encontrado en cantidades muy pequeñas [13] .El mismo grupo de investigación también ha demostrado que los taninos de tara están constituidos de una pequeña cantidad de una unidad de elágico que está rodeado por varias unidades de ácido gálico.Además, el ácido elágico contiene un grupo éster que puede ser generada a partir de reacciones de hidrólisis, durante el proceso de extracción [5] . Taninos Tara encuentran valiosas aplicaciones en las industrias de alimentos y bebidas para aclarar y dar la astringencia del vino, té, café, cacao y otros alimentos. Gracias a sus propiedades astringentes y color muy claro, taninos de tara son particularmente apreciadas en la industria de la curtiduría [14] . Por otra parte, la hidrólisis alcalina de las vainas de tara se obtiene casi el 25% de ácido gálico [15] . Este ácido fenólico y su forma descarboxilado (pirogalol) se utilizan ampliamente en el esfuerzo de piel y el cabello, y también como ingredientes de desarrollador en fotografía y las tintas de impresión [16] . Además, poseen una amplia gama de actividades biológicas, incluyendo, antioxidante, antibacteriano, antiviral, analgésico, etc [17] , lo que les permite actuar como precursores para la producción comercial de fármacos [18] . Sin embargo, se ha prestado poca atención a la explotación de estos galotaninos como sustitutos de compuestos fenólicos en la fabricación de polímeros termoestables. De hecho, en 1973, como consecuencia de la primera crisis del petróleo, Norsechem, una filial del grupo de la pintura noruega en Malasia que produce resinas de fenol formaldehído, se vio obligado a sustituir a 33% en peso de fenol con taninos de castaño extraen en sus formulaciones [19] . Una vez que la primera crisis del petróleo había pasado y el precio de fenol se hizo accesible de nuevo, se detuvo la producción de resina de fenol-formaldehído-tanino de castaño. Recientemente, la madera fenólica resina adhesiva del panel basado en taninos de castaño ha sido desarrollado por Spina et al. [20] . De la misma manera, Garro et al. han utilizado las vainas de tara como material para producir adhesivos de fenol formaldehído a partir [14a] .Nuestro laboratorio, interesado en el desarrollo de resinas epoxi termoestable de polifenoles de origen biológico [21] está considerando taninos de tara extraer como un sustituto potencial de los fenoles a base de petróleo en la formulación de polímeros epoxi. De hecho, las resinas epoxi son los constituyentes principales en muchos adhesivos, pinturas, recubrimientos, selladores y materiales electrónicos [22] . Sin embargo, casi el 90% de la producción mundial de resinas epoxi implica el uso de compuestos peligrosos no renovables, tales como bisfenol A. Mientras tanto, hay una falta en los estudios dedicados a la utilización de taninos en la producción de resinas epoxi. En nuestros trabajos anteriores, uno de los monómero constitutivo de taninos condensados, llamado catequina, se hizo reaccionar con epiclorhidrina para proporcionar el correspondiente derivado de éter de glicidilo. El curado de este prepolímero en presencia de diluyente reactivo condujo a una red de reticulación epoxi [21c] . Más recientemente, la alilación alcalina-asistida de ácido gálico (un bloque de construcción de galotaninos) seguido por la epoxidación de los dobles enlaces resultantes por meta ácido cloroperbenzoico, siempre que el derivado de éter de tri-glicidilo que participó en la formulación de una novela bio basado en epoxi termoendurecible [23] . Habiendo demostrado la viabilidad de la síntesis de polímeros epoxi de base biológica de estos modelos fenólicos; Se evaluó la capacidad de los extractos de taninos naturales (que se producen generalmente como polímeros con una gran diversidad estructural) para producir redes de epoxi. Para este propósito, se seleccionó el polvo de tara disponible comercialmente (amablemente suministrada por Silvateam) para reaccionar con epiclorhidrina. El objetivo del trabajo presentado en este documento era extrapolar los procesos de funcionalización desarrollados para los modelos fenólicos (dentro de nuestro trabajo anterior) para la síntesis de prepolímero epoxi de galotaninos tara. Entonces, el prepolímero basado en bio se formuló en polímero epoxi termoendurecible. Algunas propiedades térmicas y mecánicas de la red resultante se compararon con los de bisfenol A de polímero de epoxi basada. El uso de un extracto fenólico natural en la formulación de resinas epoxi allanará el camino para numerosas aplicaciones industriales. 2. Materiales y métodos 2.1. Materiales Tara en polvo: el polvo de tara de las vainas de tara ( C . spinosa ) fueron suministrados gentilmente por el spa Silvateam (Italia). Productos químicos: ácido gálico (97,5%), epiclorhidrina (99,0%), cloruro de benciltrietilamonio (⩾98.0%), hidróxido de sodio (⩾98.0%), tanasa de Aspergillus ficuum (⩾150 U / g), isoforona diamina (IPD, ⩾99.0 %), disolventes de grado HPLC (acetonitrilo y metanol), ácido fórmico (⩾95.0%) fueron adquiridos de Sigma Aldrich (Francia). DGEBA (DER352) (PEE = 5,66 mmol / g) (producto de reacción de epiclorhidrina con bisfenol A y bisfenol F) fue suministrado por Dow. Agua UPLC se preparó a partir de agua destilada usando un sistema Milli-Q (Merck-Millipore, Francia). β-glucogalin (1-galloylglucose) fue proporcionado amablemente por el Dr. G. Bruto (Universidad de Ulm, Alemania). El ácido gálico y β-glucogalin se utilizaron como estándares para la calibración. Estándar y taninos de tara soluciones: la solución de taninos de tara se preparó disolviendo 5 mg de extracto en 100 ml de agua destilada (0,05 mg / ml). Las soluciones estándar de ácido gálico y β-glucogalin se prepararon con la misma concentración de masa y se inyecta en UPLC 7 veces. Cada solución se preparó en 7 niveles de concentración (concentración inicial y se diluyó 1: 2, 1: 4, 1:10, 1:20, 1:40, y 1: 100) para proporcionar una gama de señales adecuado para determinar la relación molar factor de respuesta (MRRF). UPLC-MS: el LC-DAD-ESI / MS consistió en un ACQUITY UPLC (Waters, Milford, MA) acoplado con un DAD y un espectrómetro de masas de trampa de iones Daltonics Brucker. 2 l de estándar y galotaninos extraen soluciones se inyectaron a través del muestreador automático en un Nucleosil 120-3 C18 columna encaped (100 × 2.1 mm, 5 m de tamaño de partícula, Machery-Nagel, Suecia), que se celebró en 38 ° C, con un flujo constante tasa de 550 l / min. La fase móvil consistió de una combinación de A (H 2 O / HCOOH 99/1 v / v) y B (CH 3 CN / H 2 O / HCOOH 80/19/1 v / v / v); inicial 0,1% de B; 0-5 min, 40% B lineal; 5-8 min, 99% de B linear, 8-9 min 0,1% B lineal. El DAD se fijó en 280 nm ( λ max de los compuestos fenólicos). Los espectros de masas se adquirieron mediante ionización por electrospray en modo positivo y registraron en el rango 70 a 1500 uma. Se utilizó un flujo de gas de secado de 12 L / min, una temperatura del gas de secado de 200 ° C, una presión de 44 psi nebulizador, y los voltajes capilares de 5,500 V. Cálculo de la concentración por UPLC: es bien sabido que el área de un pico espectral es proporcional a la cantidad de la sustancia que alcanza el detector en el instrumento LC. Un factor de respuesta se obtiene experimentalmente mediante el análisis de una concentración conocida de la sustancia en el instrumento LC y midiendo el área bajo el pico correspondiente. El factor de respuesta relativa molar (MRRF x ) de cada estándar fenólica es igual al área del pico espectral (mAu) dividido por la concentración molar de este compuesto. Por lo tanto, para la cuantificación de compuestos fenólicos en el extracto de galotaninos, la concentración molar ( C x ) de ácido gálico y β-glucogalin puede calcularse como: C x = A x / MRRF x Gire MathJaxen donde A x es el área del pico de cada compuesto fenólico antes citada. Los análisis de RMN: espectros de RMN se adquirieron en Varian Unity-Inova 500 MHz y 600 MHz Bruker líquido. Todas las muestras se disolvieron en DMSO- d 6 . Los desplazamientos químicos se informaron en la de DMSO interna d 6 a 2,5 ppm para 1 H y 39,5 ppm para 13 C. Misiones de ambos protones y carbono resonancias, la identificación y caracterización de la estructura de los productos se realizaron con varios experimentos de RMN: homonuclear 1 H y 13 C 1D y 2D (ACOGEDOR) y heteronuclear 1 H- 13 C 2D (HSQC y HMBC). 2.2. La hidrólisis enzimática de los taninos de tara Los taninos de tara extracto (0,5 mg) se disolvió en 100 ml de solución tampón de acetato (200 mM, pH = 6,8). Entonces, 1 mg de tanasa de A . ficuum se disolvió en 1 ml de la solución tamponada galotaninos y la mezcla se incubó a 37 ° C durante 90 min. Los productos de reacción se analizaron por el sistema combinado UPLC-MS. 2.3. Procedimiento general para la glicidilación de extracto de ácido gálico y taninos de tara Un matraz de 250 ml de dos bocas equipado con un condensador, un tapón septum y una barra de agitación magnética se cargó con 3 g de taninos de ácido gálico o tara extraer en epiclorhidrina (4 M eq / OH), la suspensión se calentó a 100 ° C y se añadió cloruro de benciltrietilamonio (0,012 M eq / OH).Después de 1 h, la solución resultante se enfrió a 30 ° C y la solución acuosa de NaOH al 20% en peso (2 M eq / OH) con la misma cantidad anterior de catalizador de transferencia de fase (BNet 3 NCl) se añadieron. La mezcla se agitó vigorosamente durante 90 min. La capa orgánica se separó, se secó sobre MgSO 4 y se concentró a vacío. El producto bruto (5,8 g de ácido gálico y 4,7 g de extracto de taninos de tara) se purificó por cromatografía en gel de sílice usando éter de petróleo / acetato de etilo (PE / EA) sistema disolvente para producir productos siguientes: 3,4,5-Triglycidylether glicidil benzoato de 1 : (PE / EA, 30/70), aceite incoloro, rendimiento del 60% (10,6 mmol) de ácido gálico; 530 mg / g de prepolímero de taninos de tara extracto. 1 H RMN (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ = 2,62-2,86 (m, 8H, H1, H11 y H14), 3,29-3,38 (m, 4H, H2, H12 y H15), 3,90-3,94 (m, 3H, H13 ', H16'), 4,08 (dd, J = 12,4, 6,3 Hz, 1H, H3 '), 4,26 (qd, J = 11,7, 2,9 Hz, 1H, H16), 4,44 (dd, J = 11,3, 2,1 Hz, 2H, H13), 4,63 (dd, J = 12,4, 2,5 Hz, 1H, H3), 7,30 (s, 2H, H6 y H10) ppm. 13 C RMN (125 MHz, DMSO- d 6) δ = 43,4 (C1), 43.6 (2C, C11), 43,8 (C14), 49.0 (C2), 49.7 (2C, C12), 50,1 (C15), 65.5 (C3), 70,0 (2C, C13), 74,0 (C16), 108.4 (2C, C6 y C10), 124.6 (C5), 141.6 (C8), 151.8 (2C, C7 y C9), 165,0 (C4) ppm.HRMS calculado para C 19 H 23 O 9 [M + H] + : 395,1342, encontrado 395,1341. (PE / EA, 10/90 a 0/100), aceite de color amarillo pálido, rendimiento del 23% (2 mmol) de ácido gálico; 188 mg / g de prepolímero a partir de polvo de tara. 1 H RMN (600 MHz, DMSO- d 6 ) δ = 2,62 (dd, J = 4,5, 2,2 Hz, 1H, H4), 2,73 (m, 5H, H1, H4, H21 y H24), 2,83 (dt, J = 9,3, 4,5 Hz, 4H, H1, H21 y H24), 3,30 (m, 1H, H5), 3,31 (m, 1H, H20), 3,33 (m, 1H, H23 ), 3,35 (m, 2H, H2), 3,85 (dd, J = 11,0, 5,7 Hz, 1H, H22), 3,92 (dd,J = 11,5, 6,3 Hz, 2H, H3 y H6), 4,05 (dd, J = 12,3, 6,3 Hz, 1H, H19), 4,25 (dd, J = 11,7, 6,5 Hz, 1H, H6 '), 4,31 (dd, J = 11,5, 6,5 Hz, 1H, H25), 4,39 (m, 1H, H22 '), 4,42 (m, 1H, H3'), 4,56 (m, 1H, H25 '), 4,57 (d, J = 2,5 Hz, 2H, H27), 4,59 (m, 1H, H19 '), 4,65 ( bs, 1H, H26), 7,16 (s, 1H, H15), 7,17 (s, 1H, H17), 7,27 (s, 2H, H8). 13 C RMN (150 MHz, DMSO- d 6 ) δ = 43,4 ( C4), 43.5 (2C, C1), 43.6 (C24), 43,8 (C21), 49.0 (C5), 49,5 (C23), 49.6 (2C, C2), 50,1 (C20), 63.0 (C27), 64.7 (C25 ), 65.3 (C19), 70.0 (3C, C3 y C22), 70.7 (C26), 74.0 (C6), 106.6 (C15), 108.6 (2C, C8), 111.6 (C17), 121.2 (C16), 124.4 ( C7), 137.4 (C13), 141.7 (C10), 142.9 (C12), 147.5 (C14), 151.8 (2C, C9), 164,8 (2C, C18 y C11). HRMS calculado para C 32 H 36 O 16 [M + H] + : 677.2003, 677.1992 encontró. Oxiran-2-ilmetil (PE / EA, 10/90 a 0/100), aceite de color amarillo pálido, rendimiento del 2% (0,18 mmol) de ácido gálico; 209 mg / g de prepolímero a partir de polvo de tara. 1 H RMN (600 MHz, DMSO- d 6 ) δ = 2,62 (m, 1H, H4), 2,70-2,77 (m, 5H, H1, H21 y H25), 2,81 ( m, 1H, H4), 2,84 (dd, J = 9,8, 5,1 Hz, 5H, H1, H21 y H25), 3,33 (m, 5H, H2, H5 y H20), 3,34 (m, 1H, H24), 3,86 (m, 4H, H3 y H19), 3,91 (dd, J = 11,7, 6,1 Hz, 1H, H6), 4,06 (m, H, H23), 4,09 (sa, 2H, H13), 4,25 (m, 1H, H6 '), 4,33 (m, 4H, H3' y H19 '), 4,39 (m, 1H, H14), 4,44 (m, 1H, H14'), 4,60 (d, J = 12,3 Hz, 1H, H23 ') , 5,43 (m, 1H, H12), 7,14 (s, 1H, H8), 7,16 (s, 1H, H8 '), 7,22 (s, 1H, H17), 7,25 (s, 1H, H17'). 13 C RMN (150 MHz, DMSO- d 6 ) δ = 43,0 (C13), 43.4 (C25), 43.5 (C21), 43.6 (3C, C1 y C21), 43,8 (C4), 49.0 (C24), 49.6 (4C, C2 y C20), 50,1 (C5), 65,5 (C23), 70.1 (4C, C3 y C19), 71.2 (C14), 72.5 (C12), 74.0 (C6), 108.3 (2C, C17 y C17 '), 108.7 (2C, C8 y C8 '), 124.4 (C7), 124.5 (C18), 141.4 (C15), 141.9 (C10), 151.4 (2C, C16), 151.7 (2C, C9), 164,3 (C11), 164,8 ( C22).HRMS calculado para C 35 H 39 O 16 Cl [M + H] + : 751.2027, 751.2007 encontró. 2.4. Determinación del peso equivalente de epoxi (PEE) El equivalente epoxi de GETT prepolímero se determinó por ensayo químico basado en la reacción con una alícuota de clorhidrato de piridina estándar en exceso de piridina a reflujo y subsiguiente valoración por retroceso con hidróxido de sodio metanólico estándar utilizando fenolftaleína como indicador [24] .INIC (0,21 g) fue en un matraz de 100 mL. Se añadió un volumen de 25 ml de solución 0,2 N de ácido clorhídrico (37%) en piridina. La mezcla se calentó a reflujo (115 ° C) durante 20 min. Después de enfriar, la valoración del exceso de ácido se llevó a cabo por una solución de hidróxido de sodio 0,6 N en presencia de fenolftaleína (3 gotas). Un ensayo en blanco se realizó bajo las mismas condiciones en ausencia de pre- polímero. El peso equivalente de epoxi (PEE) se calculó mediante la siguiente ecuación: ecuación( 1 ) Gire MathJaxen donde p es el peso de prepolímero (g), A el volumen de NaOH (ml) para el blanco, y B es el volumen de NaOH (ml) durante prepolímero. 2.5. Procedimiento general para la formulación de GETT y DGEBA Los derivados glicidilo Gett y DGEBA son líquidos y se formularon a temperatura ambiente y se curaron en un molde de silicio a 100 ° C durante 12 h, seguido por 2 horas a 250 ° C para asegurar un curado completo de las redes. El agente de curado fue isoforondiamina ( IPD ), una diamina cicloalifático, con un peso equivalente de amina (AEW) de 43 g / eq (ficha técnica). GETT-IPD sistema se obtuvo mediante la formulación de 2 g (16,97 mmol) de glicidil éter de taninos de tara con 0,73 g (16,97 mmol) de IPD . La referencia DGEBA-IPD red se produce a partir del curado de 2 g (11,3 mmol) de DGEBA (DER352) (PEE = basado en la hoja de datos técnicos 5,66 mmol / g) por 0,5 g (11,3 mmol) de IPD . 2.6. El análisis termogravimétrico Mediciones de TGA se obtuvieron en un aparato de TA Instruments Q50. El peso inicial de cada muestra ensayada fue de aproximadamente 10 mg. Los datos fueron recolectados en atmósfera de nitrógeno usando un / min rampa 10 ° C 20 a 580 ° C. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Las temperaturas de 5% y 30% de pérdida de peso ( T d5 ) y ( T d30 ), respectivamente, estadística temperatura índice resistente al calor ( T s se determinaron) y el porcentaje de residuo a 575 ° C (% res). 2.7. Análisis mecánico dinámico DMA se realizó con un Metravib DMA 25 usando el modo de estiramiento uniaxial para determinar el almacenamiento ( E ') y de pérdida ( E ") módulos, así como de la fábrica de pérdida (tan δ ) como una función de la temperatura. Las muestras (30 × 10 × 2 mm) se calentaron desde -100 ° C a 250 ° C utilizando una velocidad de calentamiento de 3 ° C / min en un horno de convección forzada usando una corriente de nitrógeno. La muestra se deforma de forma sinusoidal con amplitud de deformación controlada de 6,3 × 10 -5 y 1,5 × 10 -4 para GETT-IPD y DGEBA-IPD , respectivamente, a una frecuencia fija de 1 Hz. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Las temperaturas de los procesos de relajación asociados con temperaturas de transición vítrea se determinaron por el punto de inflexión el módulo de almacenamiento E 'curva, así como el pico máximo en Tan δ curvas [25] . 2.8. La calorimetría diferencial de barrido Las mediciones de DSC se realizaron bajo atmósfera inerte con un calorimétrico NETZSCH DSC 200 F3 calibrado con un estándar de indio. El polímero se pesó en una bandeja de aluminio y consecutivamente hermético colocado en la célula de medición de calentamiento. Un recipiente vacío se utilizó como referencia. Todas las muestras se calentaron bajo atmósfera inerte -50 a 250 ° C a una velocidad de calentamiento de 10 ° C / min. Tres carreras fueron grabadas y la temperatura de transición vítrea ( T g ) se midieron los valores durante la segunda pasada y confirmados por un tercer plazo. T g s se calcularon en el momento del salto capacidad calorífica de inflexión. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. 3. Resultados y discusión Con el fin de determinar la composición de los taninos de la tara extraer las vainas, la tara en polvo se disolvió en agua destilada (0,05 mg / ml) y se analizó mediante UPLC-DAD-MS (cromatografía líquida de ultra-detector de diodos-Espectrómetro de Masas) sistema combinado . El DAD se fijó en λ max de compuestos fenólicos (280 nm) [26] y los espectros de masas se adquirieron en modo positivo. El perfil UV y el espectro de masa del polvo de tara se muestran en la fig. 1 . El polvo de tara produce un cromatograma UV relativamente complejo en el que seis grupos de oligómeros fueron identificados por sus iones pseudomoleculares. Ácidos Galloylquinic (QG, m / z 345), ácidos digalloylquinic (Q-2G, m / z497), ácidos trigalloylquinic (Q-3G, m / z 649), ácidos tetragalloylquinic (Q-4G, m / z 801), pentagalloylquininc ácidos (Q-5G, m / z 953) y ácidos finalmente hexagalloylquininc (Q-6G, m / z 1105).Todas las señales de masas se separan uno de otro por 152 amu correspondiente a una unidad de galoilo.Más allá de los derivados QG, el resto galoil adicional puede ser conectado directamente a una molécula de ácido quínico o involucrado en bonos depsidic. Higo. 1. (A) el perfil de UV a 280 nm de los taninos de tara extracto a 0,05 g / L en agua y (b) ESI-MS espectro modo de ión positivo de los taninos de tara extraer en agua en el intervalo de masas 300-1200 Da. Opciones Figura El objetivo de este trabajo fue funcionalizar estas galotaninos por reacción con epiclorhidrina. Por lo tanto, una caracterización más profunda de las estructuras de tanino de tara para definir con mayor precisión la relación de cada grupo galoil (enlace éster con ácido quínico o fianza depsidic) no es de gran importancia.Sin embargo, es importante para determinar el valor de hidroxilo (mmol de OH libre por gramo de polvo) de los taninos de tara. De hecho, durante el proceso de glicidilación, se observó la hidrólisis de enlaces éster y tanto depsidic. Además, la reacción de los productos de hidrólisis con epiclorhidrina implica sólo el carboxilo y grupos hidroxilo fenólicos. Los grupos hidroxilo menos ácidos del ácido quínico hidrolizada y otros componentes no fenólicos no son reactivos en el procedimiento de glicidilación (estos dos aspectos serán discutidos con más precisión en las secciones siguientes). Por lo tanto, para establecer la cantidad de epiclorhidrina necesario para la reacción, es necesario determinar la cantidad de hidroxilos fenólicos y carboxilo libres presentes en el polvo de tara. Para determinar el valor de hidroxilo, la hidrólisis enzimática de ácidos galloyquinic contenidos en el extracto se llevó a cabo. Por lo tanto, el polvo de tara se disolvió en una solución tampón de acetato (200 mM, pH = 6,8) y la reacción de hidrólisis se cataliza mediante tanasa de A. ficuum . De hecho, hidrolasa de acil tanino, comúnmente conocida como tanasa se utiliza ampliamente para catalizar la hidrólisis de éster y depside vínculos en taninos hidrolizables de liberación de ácido gálico y la estructura del núcleo [27] . Después de 90 min de incubación a 37 ° C (que corresponde a las condiciones de reacción optimizadas), los taninos de tara hidrolizadas producen un cromatograma sencillo a 280 nm en el que se identificó ácido gálico como un componente principal, junto con una pequeña cantidad de derivados QG ( Fig . 2 ). Con base en este cromatograma, derivados del ácido gálico y QG se cuantificaron en nuestras taninos extraer utilizando estándares. Dado que el ácido quínico y la glucosa no absorben a 280 nm, la concentración de los derivados de QG se estimó con respecto a la sintetizado 1-galloylglucose. Higo. 2. (A) el perfil de UV a 280 nm de tanasa hidrolizado taninos de tara extracto a 0,05 g / L en agua y (b) el perfil de UV a 280 nm de ácido gálico a 0,05 g / L en agua. Opciones Figura Los resultados de la cuantificación expresados en mg de los derivados fenólicos por gramo de extracto de tanino se resumen en la Tabla 1 . Estos resultados indican que el contenido total de compuestos fenólicos presentes en el polvo de tara representó 706 mg / g, que es casi el 70% de los taninos. Tabla 1. La composición fenólica en polvo de tara. Compuesto fenólico [M + H] + ( m / z ) El contenido fenólico (mg / g) Índice de hidróxidos un (mmol OH / g de extracto) El ácido gálico 171.0 510.63 12.0 QG 345.0 195.11 1.7 Total 705.74 13.7 un Este valor se calcula en base a los pesos moleculares de ácido gálico y QG asociada al número de grupos hidroxilo reactivos unidos a cada derivado fenólico. Opciones de la tabla Además, el valor de hidroxilo correspondiente al número de OH reactiva se calculó por gramo de extracto de galotaninos y un valor de 13,7 mmol OH / se encontró g de polvo. Este valor incluye los hidroxilos carboxílicos y fenólicos de ácido gálico y QG. 3.1. La funcionalización de ácidos galloylquinic contenida en el polvo de tara Debido a la complejidad estructural de los ácidos galloylquinic contenidas en el polvo de tara, parece difícil de entender su reactividad hacia epiclorhidrina y para caracterizar sus productos funcionalizados. Por lo tanto, el ácido gálico se usó como un modelo representativo para la reacción con epiclorhidrina glicidilación. 3.1.1. Glicidilación ácido gálico La reacción glicidilación de ácido gálico se llevó a cabo de acuerdo con las condiciones experimentales descritas en la invención de Tomita [28] . El producto tetraglycidylated 1 se obtuvo en un rendimiento del 72%. La estructura química del compuesto 1 fue establecida fácilmente por HRMS y análisis de RMN (véase la sección experimental). De hecho, a partir de 1 H RMN espectro, se identifican varias señales alifáticos derivados de grupos oxirano. Las señales de metileno y metino anillo de protones aparecen en el rango de 2,73 a 3,37 ppm y los C H 2 -O protones dan resonancias señales en el rango espectral de 3,91 a 4,62 ppm. El número medio de grupos oxirano por anillo ácido gálico, calculada a partir de la relación de 1 H integraciones de señal superficie, era igual a 4. Los grupos hidroxilo sustitución (carboxílico y fenólico) se produjo a través de un mecanismo de dos pasos que implica la apertura del anillo de epiclorhidrina por el anión fenolato dando el derivado de clorhidrina. Este último se transformó posteriormente en derivado de glicidilo por el alcalina asistida ciclación intramolecular [21a] . 3.1.2. Ácidos Galloylquinic glicidilación Al basarse en el valor de hidroxilo calculado (13,7 mmol OH / g de polvo), el extracto de taninos se glicidilo de acuerdo con el procedimiento publicado [28] . La reacción de funcionalización produjo 3,4 g de producto bruto. Este último fue analizado por el sistema UPLC-DAD-MS (datos no mostrados) para dar un perfil complejo UV a 280 nm con compuestos principales de árboles en el 3,2 min ( m / z 395), 4,2 min ( m /z 659) y 4,6 min ( m / z 731). Después, el producto bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice con el fin de aislar (muy laboriosamente) compuestos principales 1 , 2 y 3 ( Esquema 2 ). Esta purificación no permitió el aislamiento de los productos presentes en pequeñas cantidades. Esquema 2. Glicidilación de ácido gálico y el polvo de tara en presencia de PTC seguido por tratamiento alcalino. Opciones Figura Caracterización de la estructura detallada de producto 2 se realizó mediante espectroscopia de RMN. La desaparición de los protones hidroxilo asociados a las señales de protones aromáticos que aparecen en la 1 H RMN espectro de 2 indican la presencia de un anillo aromático simétrico (singlete a 7,27 ppm, 2 protones) y un anillo aromático asimétrica (dos singletes a 7,17 y 7,16 ppm , 1 protón) ambos sustituidos en sus hidroxilos carboxílicos y fenólicos. Por otra parte, los 1 H integraciones superficie de señal contaron cinco grupos glicidilo. Las posiciones de vinculación de estos grupos en los anillos aromáticos A continuación, se determinan usando 1 H- 13 C correlaciones de largo alcance entre los átomos de H 2 -O- protones de los grupos glicidilo y carbonos cuaternarios de los anillos aromáticos como se muestra en la fig. 3 . Así, se encontró que los hidroxilos realizadas por C9, C10, C14 y C18 están sustituidos con grupos oxirano de metilo. Sin embargo, los átomos de H 2 -O- protones que se correlacionan con la C13 de carbono cuaternario están asociadas a una sin blindaje -C- H (H26). Esto sugiere la apertura del anillo oxirano de este sustituyente y la formación de un grupo dihidroxipropoxi. Sin embargo, este protón (H26) muestra un desplazamiento químico más alta (4,65 ppm) en comparación con los protones de los grupos metino dihidroxi clásicos. Este efecto unshielding es probablemente debido a la unión de hidrógeno intramolecular del grupo hidroxilo intercambiable vinculado a C26 [29] . Por último, no se observaron ni glicidilo dihydropropoxyl sustituciones en OH (11) y OH (12) que indica la relación de C11 y OH (12) por un enlace depside. La estructura postulada de compuesto 2 se propone en la fig. 3 fue apoyada por el análisis HRMS. Higo. 3. Una parte del espectro HMBC del compuesto 2 en DMSO- d 6 que muestra las correlaciones entre los protones de metileno de los grupos sustituyentes y carbonos cuaternarios de anillos aromáticos. Opciones Figura Usando las mismas herramientas analíticas, estructura detallada de producto 3 ha sido establecida. Los análisis de RMN reveló la presencia de dos anillos fenólicos simétricas sustituidos por grupos oxirano seis de metilo en hidroxilos OH (9), OH (10), OH (16) y OH (18) como se muestra en el espectro HMBC de 3 (Fig. 4 ) . Además, este método de RMN 2D mostró una correlación entre el carbono C11 y el protón metino H12 carboxílico que se correlacionaban con protones de metileno H13 y H14 (COSY está disponible en los datos de apoyo ). Entonces, la correlación heteronuclear entre C13 y H14 indica que los dos anillos fenólicos están unidos por un enlace éster como se muestra en la fig. 4 . Los desplazamientos químicos de H13 / C13 (4,09 ppm y 43,0 ppm respectivamente) sugieren que C13 está unido a un átomo de cloro. Higo. 4. Una parte del espectro HMBC del compuesto 3 en DMSO- d 6 que muestra las correlaciones entre los protones de metileno de los grupos sustituyentes y carbonos cuaternarios de anillos aromáticos. Opciones Figura Curiosamente, la formación del compuesto 1 como producto principal demuestra de forma inequívoca la hidrólisis de los ácidos galloylquinic iniciales durante la reacción de funcionalización, la liberación de ácido gálico libre que luego totalmente glicidilo. Por otro lado, el ácido gálico es una molécula tetrafuncional teniendo tres grupos hidroxilo de tipo fenol y un grupo carboxilo. Entonces, las reacciones de esterificación sería muy probable. Por lo tanto, el producto 3 podría ser generado por la reacción de ácido gálico glicidilo con un derivado de chlorohydrine como se muestra en el Esquema 3 . Esquema 3. Mecanismo probable de producto 3 formación. Opciones Figura En cuanto a producto 2 formación, dos hipótesis podrían formularse: (i) la glicidilación de los dímeros de ácido gálico restantes generados por la hidrólisis parcial de ácidos galloylquinic iniciales (mayor resistencia de los bonos depside) y (ii) la dimerización de ácidos gálico libre (liberado por la hidrólisis total de ácidos galloylquinic) a través de reacciones de esterificación, seguido de la glicidilación de los dímeros resultantes. Con el fin de verificar los supuestos citados anteriormente, la reacción glicidilación de extracto de taninos se repitió manteniendo epiclorhidrina, NaOH y PTC cantidades y sustitución de taninos de tara por el ácido gálico. Por lo tanto, un gran exceso de epiclorhidrina (13 M eq / OH) y cantidades más altas de catalizador (0,04 M eq / OH) y NaOH (6,5 M eq / OH) se utilizaron para llevar a cabo esta reacción.Sorprendentemente, bajo estas condiciones experimentales, ácido gálico dio lugar a los productos 1 , 2 y3 en 60%, 23% y 2% respectivamente rendimientos. En consecuencia, estos resultados apoyan la segunda hipótesis en el sentido de que la formación de productos 1 , 2 y 3 puede provenir de ácido gálico liberado por una hidrólisis completa. Por lo tanto, se puede deducir de estas observaciones experimentales que, tres reacciones tuvieron lugar durante la reacción de funcionalización: la hidrólisis de los ácidos galloylquinic, la dimerización de los ácidos gálico libre resultantes (de dos maneras) y la glicidilación de los derivados galoil. Sin embargo, la secuencia por la cual estas reacciones proceden no puede establecerse claramente ni el papel real que desempeña tanto catalizador de transferencia de fase y NaOH en el proceso. A pesar del aspecto muy interesante del mecanismo investigaciones, este trabajo dirigido principalmente a identificar los principales productos glicidilación de taninos de tara con el fin de explotarlas en la síntesis de polímeros epoxi. Por lo tanto, el prepolímero compuesto por la mezcla de 1 - 3 se formuló como resina epoxi usando isoforona diamina ( IPD ) como agente de curado. La resistencia térmica de la red resultante se evaluó y su temperatura de transición vítrea ( T g ) se determinó por DSC. El éter de diglicidilo de bisfenol A ( DGEBA ) curada bajo las mismas condiciones se consideró como referencia. 3.2. La formulación polímeros epoxi La mezcla de derivados de éter de glicidilo (sin purificación en gel de sílice) obtenido por reacción de taninos de tara se extrae con epiclorhidrina en medio alcalino se conoce como después para INIC . La red de epoxi fue construido por curado GETT con isoforona diamina ( IPD ) en 1: 1 M proporción de grupo epoxi de H activa de amina [30] . Para determinar la relación molar, el peso equivalente epoxi (PEE), expresada en mol de grupo epoxi por gramo de GETT se determinó primero por análisis químico. El valor PEE se estimó en 8,48 × 10 -3 mol / g. Basándose en estos resultados, INIC-IPD mezcla se curó a 100 ° C durante 12 h, seguido por 2 horas a 250 ° C y las propiedades termomecánicas de Se estudió la red resultante. DGEBA-IPD se utilizó polímero formulado bajo las mismas condiciones como referencia. 3.3. La estabilidad térmica de las redes La estabilidad térmica (bajo nitrógeno) de los INIC-IPD y DGEBA-IPD resinas epoxi curadas se investigó por análisis de termogravimetría (TGA) de temperatura ambiente a 580 ° C. Los termogramas obtenidos durante los análisis TGA muestran la pérdida de peso como una función de la temperatura ( Fig. 5 ). Las temperaturas en la pérdida de peso del 5% ( T d5 ) y 30% ( T d30 ); se enumeran en la Tabla 2 . Higo. 5. La descomposición térmica de GETT-IPD y DGEBA-IPD en atmósfera de nitrógeno. Opciones Figura Tabla 2. Temperaturas de pérdida de peso bajo N 2 y los datos DMA de GETT-IPD y DGEBA-IPD sistemas. Sistema T d5 (° C) T d30 (° C) Res% (575 ° C) T g (° C) una T β (° C) T α (° C) E '(MPa) A 30 ° C En T g + 30 ° C GETT-IPD 256 294 12 129 -50 139 5,28 × 10 3 116.0 DGEBA- IPD 328 353 9 149 -50 140 1,29 × 10 3 13.8 un La temperatura de transición vítrea ( T g ) se determinó por DSC. Opciones de la tabla Las dos resinas epoxi estudiados muestran un solo paso continuo de proceso de degradación que comienza alrededor de 256 ° C durante INIC-IPD y a 328 ° C durante DGEBA-IPD ( Tabla 2 ) con una pérdida de peso ligeramente alrededor de 100 ° C en el caso de la bio sistema basado. En comparación con el DGEBA-IPD red, la red de base biológica, presenta una menor estabilidad térmica.Tres supuestos pueden ser propuestos para explicar esta degradación relativamente rápida: (i) A diferencia de bisfenol A, el polvo de taninos de tara es un extracto natural que sin duda contiene otros componentes que los taninos. De hecho, el análisis UV a 280 nm permitió la identificación de compuestos fenólicos solamente (aproximadamente el 70% de la composición de polvo de tara). La presencia de otros componentes naturales tales como carbohidratos y lignocelulosa (~ 10%) [14a] , polialcoholes, proteínas, humedad e insoluble (que combina, representan 20% de la composición de polvo de tara) [8] y [31]necesariamente determina la dando como resultado un comportamiento polímero. (Ii) La descarboxilación térmica de los enlaces éster en el prepolímero también puede estar implicado [32] . (Iii) la evaporación del ácido quínico libre que no está implicado en la reacción glicidilación constituye otra posibilidad. Los porcentajes de residuos bajo nitrógeno a 575 ° C se presentan en la Tabla 2 . Se muestra que la descomposición térmica no oxidativo de los dos polímeros estudiados, aproximadamente, un rendimiento de carbón similar. De hecho, GETT-IPD red exhibe un aumento de sólo el 3% en la formación de carbón tras la descomposición si se compara con la DGEBA -basada polímero. En ambos casos, la presencia de estructuras aromáticas aumenta la resistencia al fuego de los polímeros epoxi. 3.4. Calorimetría de barrido diferencial (DSC) Higo. 6 muestra termogramas DSC de los dos sistemas estudiados obtenidos a 10 ° C / min velocidad de calentamiento. Con el fin de asegurar la reticulación completa de los polímeros, las temperaturas de transición vítrea se determinaron en la segunda pasada de DSC análisis. T g valores son 129 ° C y 149 ° C durante INIC-IPD y DGEBA-IPD respectivamente ( Tabla 2 ). Del mismo modo, la presencia de compuestos no fenólicos en el extracto puede influir en el polímero T g . A pesar de la INIC-IPD inferior T g , este polímero puede mantener estado vítreo a altas temperaturas. Higo. 6. Polímeros DSC del GETT-IPD y DGEBA-IPD. Opciones Figura 3.5. Propiedades termo-mecánicas de las redes Una trama de la módulo de almacenamiento E 'y tan δ como una función de la temperatura se presentan en la fig. 7 y fig. 8 , respectivamente, los valores de Tα y E 'se presentan en la Tabla 2 . Higo. 7. Tan δ frente a la temperatura de los sistemas DGEBA-IPD GETT-IPD y. Opciones Figura Higo. 8. Módulo de almacenamiento frente a la temperatura de los sistemas GETT-IPD y DGEBA-IPD. Opciones Figura La transición principal, α en la región de alta temperatura, está asociado con la transición vítrea. La estructura de la red muy heterogénea puede explicar la alta relajación Tα abarca del GETT-IPD sistema.El sub-β transición a baja temperatura (-50 ° C), asignado al movimiento molecular segmento corto, grupos éter hidroxilo en el caso particular de epoxi-amina no es muy obvio. Por el contrario, se observó una sub-pico en la temperatura desde 50 a 100 ° C en tanto E 'y tan δ así como en curvas de DSC que dejaron-trasladó a la gama de temperatura de 40 a 60 ° C. Esto podría explicarse por la presencia de polímeros naturales libres, que no están involucrados en la INIC-IPD red. De hecho, es importante recordar que, además de galotaninos, el polvo de tara contiene polisacáridos y lignocelulosa. Un estudio reciente [33] demostró que algunas paredes celulares lignocelulósicos presentan una temperatura de transición vítrea entre 65 y 71 ° C, que podría ser correlacionada con el GETT- IPD comportamiento bajo condiciones tanto DSC y DMA. El módulo E 'de GETT-IPD es mayor que la de DGEBA-IPD material. Esto puede explicarse por la multifuncionalidad de GETT prepolímero inducir un material más densamente reticulado en comparación con el DGEBA resina. Además, la presencia de anillos aromáticos procedentes de GETT , actuando como uniones de reticulación 4-funcionales con masa no despreciable, reduce en gran medida la movilidad de la red impartiendo así una rigidez significativa a la red en el estado relajado. Esta estructura de red restringida también podría contribuir a la mayor módulo vidriosos. Sin embargo, las interacciones intermoleculares entre compuestos aromáticos mejorado (anillos o enlaces de H entre los grupos OH procedentes del proceso de curado y grupos / éter de carbonilo) también pueden contribuir significativamente a la mayor módulo vítreo. Finalmente, es importante señalar que varios factores influyen en la composición de polifenoles en diferentes plantas. Aunque la estructura química de los componentes básicos de polímero no cambian, el grado de polimerización promedio, así como la concentración fenólica en polvo depende de las condiciones climáticas, el grado de madurez de las plantas, los procesos de extracción ... [34] . Por lo tanto, mediante el uso de otro lote de polvo de tara, la cantidad de ácido gálico (después de hidrólisis) puede cambiar. Esto sin duda afectará a la relación de los compuestos con glicidilo 1 , 2 y 3 . En consecuencia, se modificará el número de grupos aromáticos y grupos oxirano en la mezcla de prepolímero. Esto modificará las propiedades termo-mecánicas de las resinas resultantes que dependen fuertemente de la estructura química de los monómeros epoxi [35] . 4. Conclusiones En nuestro programa de investigación en curso, se estudia la posibilidad de utilizar compuestos fenólicos naturales en la síntesis de resinas epoxi de base biológica. Así, el primer paso fue funcionalizar modelos fenólicos tales como catequina y ácido gálico con el fin de evaluar su reactividad hacia glicidilación. Sin embargo, estos monómeros no reflejan con exactitud la complejidad estructural de los polifenoles naturales. De hecho, en el reino vegetal, compuestos fenólicos se producen principalmente como polímeros con una gran diversidad estructural. Para este fin, se determinó la glicidilación de los taninos de tara. Por lo tanto, la reacción del polvo de tara con epiclorhidrina en presencia de PTC y NaOH condujo a la hidrólisis de ácidos galloylquinic junto con la dimerización de los restos gálico glicidilo través de enlaces éster. Entonces, los derivados de glicidilo se formularon con IPD producir una red reticulada con buenas características mecánicas y una T g de 129 ° C. Se espera que estos materiales termoestables taninos de tara epoxi de base biológica a ser materiales favorables al medio ambiente para la sustitución de las resinas epoxi a base de petróleo. En perspectiva, una caracterización más profunda de GETT se realizará con base en el material, incluyendo resistencia al impacto y las pruebas de resistencia a tracción. A fin de comprobar la reproducibilidad funcionalización, se prevé el uso de diferentes lotes de polvo de tara. Agradecimientos Los autores agradecen a Samuele Giovando (Silvateam, Italia) para proporcionar el polvo de tara. Gracias también a Pr. Antonio Pizzi (LERMAB, Francia) útil para los debates. Amablemente reconocemos Aurélien Le Brun (UM2 Montpellier, Francia) y Christine Le Guernevé (INRA Montpellier, Francia) por su ayuda en los análisis de RMN. Gracias a G. Bruto (Universidad ULM), Alemania) y Nancy Terrier (INRA Montpellier, Francia) para la prestación de β-glucogalin. Apéndice A. Material suplementario Datos complementarios 1. Material complementario contiene figuras. 1-4. Ayuda con archivos DOCX Opciones Referencias 1. o [1] o (A) PW Hartzfeld, R. Forkner, MD Hunter, AE Hagerman o Determinación de los taninos hidrolizables (galotaninos y ácido gálico) después de la reacción con yoduro de potasio o J Agric Food Chem, 50 (7) (2002), pp. 1785-90 o [SD-008] o (B) C. Santos-Buelga, A. Scalbert o Las proantocianidinas y compuestos de tanino como - la naturaleza, la aparición, la ingesta alimentaria y los efectos sobre la nutrición y la salud o J Sci Food Agric, 80 (7) (2000), pp. 1194-17 o [SD-008] o (C) SG Sayago-Ayerdi, CL-Moreno Hernández, E. Montalvo-González, ML García- Magaña, M. Mata-Montes-de-Oca, JL Torres, et al. o Mexicana mango "Ataulfo" ( Mangifera indica L.) como una fuente de taninos hidrolizables. El análisis por MALDI-TOF / TOF MS o Food Res Int, 51 (1) (2013), pp. 188-194 o [SD-008] 2. o [2] o A. Schieber, W. Ullrich, R. 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Los objetivos de este estudio fueron: (1) describir el perfil de aminoácidos de la proteína de la saliva total de cabras adultas y pelo navegación ovejas / pastoreo vegetación nativa, (2) para medir la interacción de toda la saliva de las cabras y ovejas de pelo con ácido tánico, (3) para comparar la capacidad de unión de tanino de toda liofilizado saliva de cabras y ovejas para precipitar los taninos extraídos del forraje de TRP tropical ( Acacia pennatula , Lysiloma latisiliquum , Leucaena leucocephala y Piscidia piscipula ). Saliva entera fresca fue obtenida de 42 cabras adultas y ovinos de pelo 51 adultos. Un segundo lote de saliva (obtenida a partir de 75 cabras adultas y 93 adultos ovejas de pelo) se liofilizó toda la saliva. La proteína de la saliva completa en ambas especies animales tenía un patrón similar de la composición de aminoácidos. Se encontraron histidina y arginina, que representan el 30% y el 24% del contenido de aminoácidos, respectivamente.Toda la saliva de cabras y ovejas mostraron una respuesta lineal a la dosis a concentraciones crecientes de ácido tánico en cada punto de tiempo medido ( P <0,001). La saliva de las cabras fue capaz de precipitar las cantidades más altas de TRP extractos de A . pennatula y L . latisiliquum que de P . piscipulay L . leucocephala ( P <0,05). La saliva de ovejas precipitó mayores cantidades de L. latisiliquum y P.piscipula extractos ( P <0,01). Además, las proteínas salivales de cabras tenido mayor capacidad para precipitar los taninos de A . pennatula que las ovejas, mientras que la proteína salival de oveja tuvo una mayor capacidad para precipitar los taninos de P. piscipula que las cabras ( P <0,05). Los resultados proporcionan evidencia de las diferencias entre las cabras y ovejas en la capacidad de su saliva para interactuar con las fuentes locales de taninos, lo que podría explicar el diferente comportamiento de alimentación de cabras y ovejas. La presencia de histatinas puede ayudar a explicar los in vivo efectos AH de forraje TRP. Palabras clave  Cabras ;  Ovejas ;  Los taninos ;  Saliva ;  Prolina ;  Histatines 1. Introducción Los taninos pueden limitar la ingesta de forraje por los rumiantes debido a factores tales como la astringencia, la reducción de la digestibilidad y la posible toxicidad ( Makkar, 2003 ). Sin embargo, debido a sus propiedades biológicas y farmacológicas de ancho ( Okuda, 2005 ), taninos también pueden demostrar los efectos beneficiosos sobre la salud de algunos animales (es decir, antiparasitario) ( Hoste et al., 2006 ). El consumo de forraje a partir de plantas ricas en taninos (PRT) ha sido estudiado como un método alternativo para el control de nematodos gastrointestinales (GIN) que puede reducir la dependencia de antihelmíntico convencional (AH) drogas entre los agricultores. El efecto AH de taninos de TRP extrae contra GIN se ha confirmado en in vitro condiciones ( Alonso-Díaz et al., 2008a y Alonso-Díaz et al., 2008b ). Además, el efecto AH de forraje TRP de plantas tropicales se ha confirmado recientemente bajo in vivo condiciones ( Akkari et al., 2008 , Brunet et al., 2008 y Martínez- Ortiz de Montellano y col., 2010 ). Se necesitan dos condiciones previas para utilizar TRP como AH no convencional en vivo : (i) los animales deberán ingerir voluntariamente forraje suficiente para obtener los efectos biológicos esperados;(Ii) los compuestos bioactivos deben alcanzar el organismo objetivo (GIN) en el tracto gastrointestinal. Se ha sugerido que las adaptaciones fisiológicas a taninos, tales como la secreción / presencia de proteínas salivales de unión de tanino-(cucharadas) ( Bennick, 2002 y Shimada, 2006 ), son la respuesta a la presencia de taninos en la alimentación ( Iason, 2005 , Clauss et al., 2005 y Costa et al., 2008 ). El interés en cucharadas o el análisis del proteoma de la saliva de los pequeños rumiantes (cabras y / o ovejas), así como su interacción con taninos, ha aumentado en los últimos años, ( Austin et al., 1989 , Distel y Provenza, 1991 , Lamy et al., 2008 , Lamy et al., 2009 y Hanovice-Ziony et al., 2010 ). Aunque cucharadas, principalmente proteínas ricas en prolina, no se han encontrado en estudios anteriores con cabras y ovejas, no es una justificación para no descartar la idea de que ellas podrían tener algún otro tipo de cucharadas, como los histatinas y muchas proteínas multifuncionales ( Bennick, 2002 ). Su presencia podría desempeñar un papel importante en la explicación de por qué las cabras y las ovejas, alimentándose la misma vegetación nativa, tienen diferentes índices de comportamiento de alimentación y de preferencia frente a los forrajes TRP ( Alonso-Díaz et al., 2008c y Alonso-Díaz et al., 2009 ). Además, hay una falta de información sobre la especificidad de cucharadas a los taninos extraídos de TRP dietéticos que son normalmente parte de sus dietas ( Hanovice-Ziony et al., 2010 ). Por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron: (1) describir el perfil de aminoácidos de toda la saliva de cabras adultas y pelo navegación ovejas / tanino pastoreo rica vegetación, (2) para medir la interacción de toda la saliva de cabras y ovejas de pelo con ácido tánico, (3) para comparar la capacidad de unión de tanino de toda la saliva de cabras y ovejas para precipitar los taninos extraídos de TRP tropical. 2. Materiales y métodos 2.1. Los animales y las muestras de saliva Experimental Adultos Criollo cabras y ovejas de pelo fueron muestreados por la saliva. Todos los animales de experimentación tenían 2-5 años de experiencia de navegación / pastoreo en la vegetación nativa del norte de la Península de Yucatán, México, que cuenta con más de 260 especies de leguminosas para la navegación ( Flores et al., 2006 ). La mayoría de las plantas contienen altos niveles de proteína cruda, fibra neutro detergente bajas (NDF) y los niveles variables de metabolitos secundarios de las plantas a moderada, principalmente taninos ( Ayala-Burgos et al., 2006 ). Los animales se limitan a consumir alimento durante aproximadamente 10 h antes de la recogida de saliva. El agua estaba disponible en todo momento. Cinco minutos antes de la recolección, se proporcionó una alimentación suculenta (maíz) y se ofreció para oler a cada animal con el fin de estimular la salivación (evitando cualquier contaminación de la saliva por contacto o ingestión). Toda la saliva se recogió de la boca de cada animal por aspiración directamente en un recipiente de cristal. El destinatario de la saliva se mantuvo en hielo durante el procedimiento de recolección y durante su transporte al laboratorio. Las muestras de saliva fueron centrifugadas a 3000 × g durante 10 min para eliminar los materiales insolubles y el sobrenadante se mantuvo a 4 ° C para ser utilizado como saliva fresca. Saliva entera fresca fue obtenida de 42 cabras adultas y ovinos de pelo 51 adultos. Un segundo lote de la saliva completa se obtuvo de 75 cabras adultas y ovejas de pelo 93 adulto. La saliva de la segunda colección se procesó como se describe anteriormente, excepto que se congeló a -20 ° C durante la liofilización. Saliva liofilizado se mantuvo refrigerado para su posterior análisis. 2.2. Los taninos y extractos de plantas Las hojas frescas de latisiliquum Lysiloma , Acacia pennatula , Piscidia piscipula y Leucaena leucocephalafueron cosechadas en la selva baja tropical caducifolio de Yucatán, México. Estas plantas fueron elegidos porque tienen un alto contenido de tanino, y anteriormente se utiliza en estudios de preferencia con experiencia cabras y ovejas ( Alonso-Díaz et al., 2008c y Alonso- Díaz et al., 2009 ). Además, estas plantas han sido seleccionadas para su vitro en efecto AH contra Haemonchus contortus ( Alonso-Díaz et al., 2008a ) y colubriformis Trichostrongylus ( Alonso-Díaz et al., 2008b ). Los extractos se obtuvieron anteriormente y caracterizados por taninos condensados (TC) y actividad biológica (BA) por Alonso-Díaz et al. (2008c) . Los extractos tuvieron 95,98 g CT / 100 g de extracto y 11.54 unidades BA ( A. pennatula ), 46,91 g CT / g de extracto de 100 y 7,00 unidades de BA ( L. latisiliquum ), 45,71 g CT / g de extracto de 100 y 5,80 unidades de BA ( L . leucocephala ) y 26,07 g CT / 100 g de extracto y 5,00 unidades de BA ( P. piscipula ) respectivamente. 2.3. El perfil de aminoácidos de toda la saliva de las cabras y ovejas Saliva liofilizada se utiliza para medir con precisión la cantidad de proteína para ser utilizado en la preparación de muestras para análisis de aminoácidos usando un HPLC con derivatización pre-columna con DABS-Cl ( Knecht y Chang, 1986 ). 2.3.1. Preparación de la muestra Las muestras de saliva, equivalente a 0,082 y 0,072 g de N, se re-suspendió en 10 ml de agua destilada y se sonicó durante 10 min. Cada muestra se dividió en dos tubos de centrífuga (5 ml en cada tubo) y ácido fosfotúngstico fue añadido para precipitar la proteína salivar (15 min) 5 ml. Luego, las muestras se centrifugaron durante 15 min para obtener un pellet de proteínas. El sobrenadante se descartó y el sedimento de proteína se lavó (resuspende) con 10 ml de agua destilada y se centrifuga de nuevo durante 15 min. Este procedimiento se repitió dos veces. Los sedimentos finales obtenidos para cada muestra se utilizaron para la hidrólisis ácida, la derivatización, y posteriormente amino determinación perfil de ácidos tal como se describe por Capetillo-Leal et al. (2010) . 2.3.2. El análisis cromatográfico Veinte microlitros de cualquiera de la muestra o una mezcla de aminoácidos estándar (Sigma Co., St. Louis, MO, EE.UU.) se inyectaron en un sistema de HPLC (GBC, LC 1150 con UV / VIS LC detector de 1205), con una columna Hypersyl ODS según lo descrito por (4,6 x 250 mm, 5 m) (# 7991618-584 Agilent Technologies, EE.UU.. Part.) Capetillo-Leal et al. (2010) . El estándar se midió cuatro veces.Concentración de aminoácidos se calculó mediante la integración de área y la proporción de cada aminoácido se calculó. 2.4. Desarrollo Haze con ácido tánico y toda la saliva obtenida de cabras y ovejas Ensayos de turbidez se utilizaron para medir las reacciones de proteínas salivales con taninos ( Lawless et al., 1999 , Siebert, 1999 , Siebert, 2006 y Horne et al., 2002 ). Cuatro mililitro de saliva fresca de cada especie animal se combinaron con 4 ml de una solución de ácido tánico en las siguientes concentraciones crecientes: 0, 0,25, 0,5, 1,0, 1,5 y 2,0 g / l. Soluciones y la saliva se combinan en 5 ml tubos de ensayo de vidrio claros y se mezclan dos veces por inversión. Dos repeticiones se realizaron para cada tratamiento.El nivel de reacción se midió cada 15 min durante 2 h utilizando un espectrofotómetro de diodos (Agilent 8453 ® Palo Alto, CA, EE.UU.) a 610 nm de la transmitancia. Las lecturas se corrigieron con un blanco adecuado (cada concentración de ácido tánico en agua destilada). 2.5. Método de compuestos fenólicos en proteínas precipitable usando taninos extraídos de TRP y re-suspendió saliva liofilizó a partir de cabras y ovejas El método fenólicos-proteína precipitable se utilizó para medir la cantidad de taninos precipitados por cabras liofilizadas y saliva ovejas y se midió como absorbancia de acuerdo a Hagerman y Butler (1978) .Brevemente, saliva liofilizó a partir de cabras y ovejas se ajustó a 1,0 mg / ml de proteína en una solución tampón. Luego, 2 ml de saliva liofilizada se combinaron con 1 ml de cada PRT extrae a dosis crecientes 1,0, 1,5 y 2,0 g / l, se mezcló de inmediato y se dejó reposar durante 24 horas a 4 ° C, luego se centrifuga durante 15 min a 3000 × g . El sedimento resultante se re-disolvió en 4 ml de detergente (lauril sulfato) y 1 ml de FeCl 3 se añadió. Después de 15 min, la absorbancia se leyó a 510 nm. Un espacio en blanco (FeCl 3en detergente) se restó. En este experimento, se utilizó saliva liofilizada con el fin de obtener una muestra representativa de la saliva y ajustar a una cantidad similar de proteínas salivales para ser usado con todas las dosis de extracto de TRP. De esta manera, las diferencias obtenidas serían atribuibles sólo a la diferencia de las especies y la especificidad de proteína salival hacia el extracto rico en taninos. Para evitar el sesgo debido a las diferencias en el contenido de CT de los diferentes extractos de plantas, los resultados se expresaron como las unidades de absorbancia por unidad de CT contenidas en las dosis de extracto de planta. Por lo tanto, las diferencias en los taninos precipitados (absorbancia) se pueden interpretar como la especificidad de la proteína salival hacia la CT contenida en cada extracto de la planta. 2.6. El análisis estadístico 2.6.1. Perfil de proteínas salivales de aminoácidos Con el fin de minimizar los costos de análisis, un muestreo aleatorio simple sin sustitución se utilizó el enfoque (SRSWOR) ( Yates et al., 2008 ) para la descripción del perfil de aminoácidos. Margen máximo de error (95%) y los valores de error estándar se han estimado teniendo en cuenta que los resultados de aminoácidos fueron la media de la muestra de 75 cabras y 93 ovejas. Además, se informó de la SEM de la norma de aminoácidos. No hay comparación estadística se intentó entre las especies. 2.6.2. Prueba de desarrollo Haze El desarrollo de turbidez (turbidez) en cada dosis de tanino se evaluó a través de la reducción ( b ) en la transmitancia ( y ) durante el 120 min ( x ) la incubación con el análisis de regresión lineal ( y = un + b × x) para toda la tánico dosis de ácido. Todas las mediciones de tiempo se incluyeron en la regresión (0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 y 120 min) para cada concentración de ácido tánico para obtener las ecuaciones de regresión. Las pendientes resultantes ( b ) se compararon dentro y entre las especies utilizando t -test comparaciones en cada dosis con GraphPad Prism 5.0 (2009) . 2.6.3. La especificidad de las proteínas salivales hacia los diferentes extractos de plantas ricas en tanino Los resultados de la prueba de proteína precipitable fenólicos se volvieron a calcular (unidades de absorbancia / [CT]) para obtener los valores ajustados para la concentración de tanino en los extractos del PRT. Por lo tanto, cualquier variación en la absorbancia mostraría especificidad de la proteína salivar a diferentes extractos de tanino y no ser atribuible a la concentración de taninos en el extracto respectivo.Los datos resultantes se analizaron mediante un diseño 2 × 4 × 3 factorial usando un procedimiento GLM.Los factores fueron: dos especies de rumiantes (ovejas y cabras), cuatro extractos vegetales ricos en taninos ( L. latisiliquum , A. pennatula , P. piscipula y L. leucocephala ) y tres niveles de taninos de extracto rico (1, 1,5 y 2 g / l) , con dos réplicas por tratamiento. El análisis preliminar mostró que sólo las especies de rumiantes × interacción extracto de la planta fue significativa. Por lo tanto, las interacciones adicionales no se incluyeron en el modelo final. Un valor de P <0,05 se tomó como estadísticamente significativo. El post-hoc se utilizó la prueba de Tukey para comparar las medias. Todos los cálculos estadísticos se realizaron en Minitab, 15 (2007) . 3. Resultados 3.1. El perfil de aminoácidos de toda la saliva de las cabras y ovejas Aunque ninguna comparación estadística se realizó entre cabras y ovejas, la saliva de ambas especies animales parecían tener un patrón similar de la composición de aminoácidos con los 15 aminoácidos en el estándar de referencia debidamente identificados ( Tabla 1 ). Un importante contenido de histidina y arginina se encuentra en cabras y ovejas que representaron el 30% y el 24% del contenido de aminoácidos de la proteína, respectivamente. El aminoácido prolina representó el 5,95% y el 5,09% para cabras y ovejas, respectivamente. Tabla 1. El perfil de aminoácidos de toda liofilizado saliva de cabras y ovejas (g g proteína / 100). Aminoácidos Ovejas SE un Cabras SE SEM b Aspartato 7.11 0.027 5.31 0.023 1.56 El glutamato 12.25 0.034 10.50 0.032 0.35 Treonina 0.50 0.007 0.00 0.0 0.30 Serina 7.42 0.027 9.27 0.030 9.97 Lisina 2.11 0.015 2.10 0.015 0.10 La histidina 11.86 0.034 15.09 0.037 0.06 Arginina 12.31 0.034 14.42 0.036 0.06 Glicina 9.41 0.030 9.80 0.031 0.06 La alanina 5.94 0.025 5.11 0.023 2.65 Tirosina 1.88 0.014 0.00 0.0 0.14 Proline 5.09 0.023 5.95 0.025 0.02 Valina 8.33 0.029 8.08 0.028 0.04 Isoleucina 4.00 0.020 3.47 0.019 0.04 La leucina 8.09 0.028 7.26 0.027 0.14 La fenilalanina 3.69 0.020 3.66 0.019 0.31 95% de margen de error de un 0.113 0.101 un Calculado el supuesto de muestreo aleatorio simple y un tamaño de muestra de 93 ovejas y 75 cabras. b Error para cada aminoácido individual como se mide en el estándar de aminoácidos ( n = 4). Cerrar acuerdo puede ser observado entre la SEM de la norma aminoácido y el error estándar estimado para los perfiles de aminoácidos de ovejas y cabras. Opciones de la tabla 3.2. Desarrollo Haze con ácido tánico y toda la saliva obtenida de cabras y ovejas La turbidez de las ovejas y la saliva de cabra (dosis 0) se mantuvo sin cambios durante todas las mediciones realizadas hasta 2 h. Al comienzo de cada ensayo, la turbidez fue diferente entre las especies animales ( P <0,001). La turbidez de las muestras de saliva de cabras y ovejas (respectivamente) aumentó linealmente como una respuesta al aumento de las concentraciones de ácido tánico en cada punto de tiempo ( P <0,001). La respuesta de proteínas salivales de cabra a las diferentes concentraciones de ácido tánico fue mayor que la de la proteína salivar ovejas en todas las dosis ( P <0,05) ( Tabla 2 ). Tabla 2. Efecto de dosis crecientes de ácido tánico en el desarrollo de neblina (transmitancia ± SE) de ovejas y cabras toda la saliva. Dosis de ácido tánico (g / l) 0 0.25 0,5 1.0 1.5 2.0 Ovejas Intercepción 36 ± 0.43A 32 ± 0.77a 28 ± 0.56A 24 ± 1.0a 22 ± 1.3a 21 ± 1.4a Pendiente de un 0.010 ± 0.0060a -0.092 ± 0.011b -0.13 ± 0.0078c -0.17 ± 0.014d -0.19 ± 0.019d -0.19 ± 0.020d R 2 0,16 0.82 0.94 0.90 0.86 0.85 P 0.10 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 Cabras Intercepción 80 ± 0.41a 74 ± 1.3b 70 ± 1.3b 67 ± 1.8b 62 ± 1.7c 69 ± 2.0b Pendiente de un 0.008 ± 0.0058a -0.22 ± 0.019b -0.33 ± 0.019c -0.46 ± 0.025d -0.41 ± 0.023d -0.52 ± 0.028d R 2 0.10 0.89 0.95 0.95 0.95 0.95 P 0.20 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 Cabras contra ovejas b > 0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 un La comparación de las pendientes en diferentes concentraciones de ácido tánico dentro de las especies (ovejas o cabras). Letras diferentes indican diferencias en P <0,05. b La comparación entre las laderas de las diferentes especies en cada concentración de ácido tánico. Opciones de la tabla 3.3. Método de compuestos fenólicos en proteínas precipitable usando taninos extraídos de TRP y re-suspendió saliva liofilizó a partir de cabras y ovejas No se detectaron diferencias en la especificidad de proteína salival en la saliva de ambas especies ( Tabla 3 ). La saliva liofilizada reconstituida a partir de ovejas precipitó cantidades similares de los taninos ( P > 0,05) extraído de P. Piscipula y L. latisiliquum que eran más altos que los de A. pennatula y L.leucocephala ( P <0,001). Sin embargo, la saliva liofilizada de cabras precipitó altas cantidades de taninos ( P <0,05) de A. pennatula y L. latisiliquum que de P. piscipula y L. leucocephala . Los dos primeros extractos de plantas se precipitaron en niveles similares ( P > 0,05) y los dos últimos extractos de plantas también fueron similares entre ellos. Tabla 3. Especificidad de las ovejas y las proteínas salivales de cabra hacia los taninos condensados de cuatro extractos diferentes de plantas ricas en taninos. Ovejas un Cabras Acacia pennatula 0.066a 0.118a Lysiloma latisiliquum 0.104b 0.112a Piscidia piscipula 0.109b 0.014b Leucaena leucocephala 0.069a 0.020b SEM 0.006 Especies animales significa b 0.086a 0.066b SEM 0.003 Las unidades se expresan como el valor de absorbancia obtenido a partir de la medición de los taninos precipitados por proteínas salivales. La absorbancia se pesó por la cantidad de taninos contenida en el extracto de dosis, es decir, unidades de absorbancia / [CT]. un Dentro de las especies de animales diferentes letras indican diferencias entre los extractos de tanino vegetal en P <0,001. b Letras distintas dentro de las especies animales significan indica diferencias en P <0,001. Opciones de la tabla Las diferencias entre las dosis de extracto del PRT eran sólo detectable entre 1 vs 1,5 y 2 ( P <0,018). Los valores de absorbancia respectivos fueron 0.068a, 0.084b y 0.077b (SEM 0,004). Además, no se observó interacción entre el nivel de CT en una fuente de especies animales o extracto y extracto de la planta. En general, este último indica que los taninos contenidos en cada extracto de precipitaciones causadas similares en todas las dosis y las diferencias son atribuibles a la especificidad de la proteína salival. 4. Discusión Tal vez, uno de los mecanismos fisiológicos más estudiados para hacer frente a los taninos de algunas especies de mamíferos es la secreción / presencia de cucharadas ( Bennick, 2002 y Shimada, 2006 ).Estas proteínas son consideradas como la primera línea de defensa contra los taninos en algunas especies de mamíferos. Hasta ahora, la información que rodea cucharadas ha sido motivo de controversia en cabras y ovejas, con resultados que apunta hacia la falta de cucharadas ricas en prolina ( Lamy et al., 2008 y Lamy et al., 2009 ). Sin embargo, la respuesta de los pequeños rumiantes a los taninos podría depender de factores tales como nicho ecológico y el fondo nutricional de los animales (es decir, la necesidad de utilizar la vegetación específico). Por lo tanto, la hipótesis de que las cabras adultas y ovinos de pelo navegación / pastoreo vegetación autóctona rica en proteínas y taninos podrían producir cucharadas distintos de proteínas ricas en prolina. En general, hay dos familias de proteínas que se clasifican como cucharadas (rico en prolina y la histatina-rica), pero la presencia de otros tipos también se ha informado ( Bennick, 2002 , Makkar, 2003 ). Brevemente, saliva rica en prolina se compone de un grupo de proteínas con alto peso molecular (5.000 hasta 25.000) y prolina representa entre el 20 y el 40% de su composición de aminoácidos ( Austin et al., 1989 y Mole et al., 1990 ). Por otro lado, histatinas, que es un grupo de proteínas con bajo MW (<5000), se componen de 31-38 aminoácidos prácticamente ausentes en prolina y altas en histidina ( Bennick, 2002 ). Histidina puede representar hasta el 25% de la composición de aminoácidos de histatinas, pero también se caracterizan por su alto contenido de aminoácidos esenciales (arginina y lisina) que junto con histidina podrían explicar 30-75% de los aminoácidos de proteínas ( Yan y Bennick, 1995 y Bennick, 2002 ). 4.1. El perfil de a minoácidos de proteínas salivales de ovejas y cabras (estudio 1) En los últimos años, el interés en el estudio de TBPSs o el análisis del proteoma de saliva de cabras y ovejas, así como su interacción con taninos ha aumentado. Austin et al. (1989) informaron de que la proteína rica en prolina está ausente en las ovejas. Del mismo modo, Lamy et al. (2008) , utilizando el método de SDS-PAGE, informó un patrón similar de proteínas en cabras y ovejas saliva parótida y que no identificaron cucharadas ricas en prolina. Informes recientes de Hanovice-Ziony et al. (2010) , utilizando un ensayo competitivo con taninos estándar (ácido tánico y quebracho), no informó cucharadas ya sea en mezcla o en la saliva de la glándula parótida, en dos razas de cabras. Sin embargo, los estudios dirigidos a la búsqueda de una respuesta adaptativa en la secreción cucharada herbívoro debido a los taninos de la exposición en otras especies de rumiantes han encontrado respuestas que no siempre han sido vinculados específicamente a la prolina-rica en proteínas salivales ( Clauss et al., 2005 y Makkar y Becker, 1998 ). En este marco, los resultados basados en el análisis de HPLC no apoyan la idea de que toda la saliva de cabras y ovejas navegando contiene proteína rica en prolina. Toda la saliva de ambas especies de rumiantes mostró un patrón de composición de aminoácidos con un contenido importante de histidina y arginina, que representó aproximadamente el 30% del contenido de aminoácidos de la proteína. Tales perfiles de aminoácidos son coherentes con el perfil de cucharadas ricos histatina ( Yan y Bennick, 1995 ). Esto puede ayudar a explicar la capacidad de unión de tanino observado en el ensayo de desarrollo de niebla y la unión entre la saliva y los taninos a partir de extractos de tanino del PRT reportados aquí. Proteoma análisis se llevó a cabo recientemente en cabras y ovejas saliva por Lamy et al.(2009) . Ellos encontraron que la concentración de proteína no fue diferente entre las especies, pero no se encontraron diferencias en las proteínas con bajo PM. Es posible que estas diferencias podrían estar involucrados en diferentes propiedades biológicas de la saliva, que debe ser investigado. No hemos intento de determinar el perfil de aminoácidos de una fracción específica de proteínas de la saliva. Sin embargo, la cantidad de histidina y arginina fue sorprendentemente alto. Este último nos lleva a la hipótesis de que la saliva debe tener al menos una fracción de proteína que sería aún más rica en los aminoácidos. Es necesario seguir desarrollando la investigación en este tema. 4.2. Prueba de desarrollo Haze Cuando se estudia la interacción de las proteínas salivales con polifenoles, es importante tener en cuenta la naturaleza de las proteínas, sino también la naturaleza de los taninos, debido a variaciones diferentes taninos presentan en su interacción con una proteína dada. La mayoría de los estudios en la saliva de las cabras y ovejas han utilizado taninos estándar (es decir, ácido tánico y / o tanino de quebracho). Los estudios que se ocupan de la relación entre la saliva y los taninos contenidos en el PRT que normalmente ingieren son escasos. Nuestros objetivos segundo y tercero experimentales exploran este tema tan complejo. El segundo objetivo de este estudio fue evaluar las interacciones entre frescos toda la saliva de cabras y ovejas y el tanino estándar utilizando un ensayo de turbidez. Nuestros resultados mostraron una fuerte relación dosis-dependencia entre el desarrollo de turbidez y la adición de taninos a la saliva ( P <0,001).Este último sugiere la presencia de cucharadas u otros compuestos que reaccionan con taninos. Ensayos de turbidez se han sugerido como un ensayo de unión proteína-útil para estudiar la asociación entre proteínas, taninos y la astringencia respuesta ( Lawless et al., 1999 , Siebert, 1999 , Siebert, 2006 y Horne et al., 2002 ). Según lo declarado por Horne et al. (2002) este tipo de estudio no ofrece evidencia directa de unión proteína-tanino. Sin embargo, existe un amplio cuerpo de literatura que apoya la idea de que la turbidez formada por la presencia de proteínas y polifenoles es una respuesta directa de taninos y rico en prolina cucharada de ( Asano et al., 1982 y Siebert, 1999 ). Para nuestro conocimiento, este es el primer informe usando el ensayo de turbidez para medir la interacción entre la saliva de los pequeños rumiantes y taninos. Los resultados indicaron que la prueba de desarrollo bruma que no tenga la especificidad previamente atribuido a la misma. Los estudios futuros deben incluir una fuente de proteína adicional, tal como la albúmina como un control con el fin de discriminar entre cucharadas y la formación del complejo proteína-tanino "normal". 4.3. Prueba fenólicos proteína precipitable En condiciones naturales los dos cabras y ovejas seleccionar varias plantas que contienen compuestos polifenólicos que varían ampliamente. Por lo tanto, podría ser posible que las proteínas salivales de los rumiantes se vincularán únicamente a los compuestos polifenólicos específicos contenidos en su dieta normal (plantas). Desde alimentos contienen diferentes tipos de taninos, mezclas de taninos se han señalado como una herramienta útil para la identificación (presencia) de cucharadas ( Bennick, 2002 ). Por lo tanto, el tercer objetivo de este estudio fue evaluar la especificidad de unión de tanino de las proteínas salivales en cabras y ovejas utilizando extractos liofilizados del forraje de PRT que se utilizan comúnmente como alimento. La especificidad de unión de tanino de las proteínas salivales se ha investigado en los mamíferos como una posible explicación a sus hábitos de alimentación ( Hagerman y Robbins, 1993 ).Nuestros resultados revelaron que, al mismo nivel de proteína de la saliva liofilizada, cabras producidos proteínas salivales con una capacidad superior para precipitar los taninos de A . pennatula (planta con mayor contenido de taninos y BA) que las ovejas. Proteínas salivales de ambas especies precipitan taninos de L. latisiliquum (con bajo contenido de taninos y de BA moderada) en niveles similares. Los presentes resultados son evidencia de que las cabras tienen cucharadas con alta especificidad lineal para bloquear los taninos que se relaciona con sus preferencias o la ingesta de carne de TRP ( Alonso-Díaz et al., 2009 ). Estos resultados son biológicamente relevante para explicar el comportamiento de alimentación de navegar sino que también podría ayudar a explicar el mecanismo de acción de los taninos en la dieta contra GIN. Si el perfil de aminoácido que se encuentra en toda la saliva de ganado ovino y caprino en el presente trabajo se corresponde con histatinas, la unión débil entre histatinas y CT (Wróblewski et al., 2001 ) podría ayudar a explicar por qué los CT son capaces de ejercer su efecto AH contra GIN cuando el forraje cabras y ovejas ingesta TRP ( Brunet et al., 2008 y Martínez-Ortiz de Montellano y col., 2010 ). Se ha encontrado que el tanino hidrolizable, pentagalloyl glucosa, forma complejos insolubles con fuertes y histatinas impidiendo de este modo su absorción de los intestinos y sus efectos biológicos potencialmente dañinos. Por otra parte, el galato de epigalocatequina, un flavan 3-ol éster relacionada con taninos condensados, tiene una interacción mucho más débil con histatinas que podrían permitir su liberación y absorción en el organismo y la explotación de sus efectos biológicos (tales como su efecto antioxidante en humanos ) ( Wróblewski et al., 2001 ) o el efecto AH de CT en los pequeños rumiantes. 5 Conclusiones La alta proporción de histidina y arginina en el perfil de aminoácidos de la proteína que se encuentra en toda la saliva de ganado ovino y caprino representa la primera evidencia de la cucharada del grupo histatina en animales con experiencia de navegación anterior. Se encontraron diferencias entre las dos especies de pequeños rumiantes en la capacidad de su saliva para interactuar con las fuentes locales de taninos. Este último podría explicar el diferente comportamiento de alimentación de las ovejas y las cabras. La presencia de histatinas puede ayudar a explicar los in vivo AH efectos cuando el suministro de carne de TRP. Conflicto de interés Los autores de este manuscrito no tienen relaciones financieras o personales con otras personas u organizaciones que puedan influir de forma inapropiada o sesgar el contenido del documento. Reconocimiento Los autores agradecen la financiación del Conacyt-México (Proyecto No. 106146 / CB-2008-01 relación herbívoro-tanino; adaptaciones fisiológicas de los pequeños rumiantes (ovejas y cabras) navegando tanino rica vegetación). Referencias 1. o Akkari et al., 2008 o H. Akkari, H. Ben Salem, M. Gharbi, S. Abidi, MA Darghouth o Alimentación Acacia cyanophylla Lindl. follaje para Barbarine corderos con o sin PEG: efecto sobre la excreción de huevos de nematodos gastrointestinales o Anim. Alimente Ciencia. Tecnol., 147 (2008), pp. 182-192 o [SD-008] 2. o Alonso-Díaz et al., 2008a o MA Alonso-Díaz, JFJ Torres-Acosta, CA Sandoval-Castro, AJ Aguilar-Caballero, H. 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Biochem., 268 (2001), pp. 4384-4397 o [SD-008] Química de los Alimentos Volumen 156 1 de agosto de 2014, Pages 301-304 Comunicación corta Potencial de Tara ( Caesalpinia spinosa) galotaninos e hidrolizados como compuestos antibacterianos naturales  Ana Aguilar-Galvez una ,  Giuliana Noratto b ,  Flor Chambi una , c ,  Frédéric Debaste c ,  David Campos una ,, Mostrar más DOI: 10.1016 / j.foodchem.2014.01.110 Obtener los derechos y contenidos Destacados • Evaluación de galotaninos e hidrolizados de galotanino como antimicrobianos. • Galotaninos Tara inhibieron S. aureus y P. fluorescens. • La hidrólisis de galotaninos tara aumento de la actividad antibacteriana contra S. aureus. • Potencial de galotaninos y sus hidrolizados como antimicrobianos naturales. Resumen Galotaninos obtenidos a partir de extractos de vainas de tara (EE) y de los productos de hidrólisis ácida para 4 y 9 h (HE-4 y HE-9) se caracteriza por su composición, actividad antioxidante, actividad antimicrobiana (AA) y la concentración mínima inhibitoria (MIC ). Los resultados de AA y EE MIC mostraron que ejerce la mayor actividad inhibidora frente a Staphylococcus aureus , seguido porPseudomonas fluorescens ; y entre estas bacterias, la potencia antibacteriana se mejoró después de la hidrólisis EE sólo contra S. aureus. La concentración inhibitoria (MIC) valor mínimo más bajo (0,13 mg equivalentes de ácido gálico (GAE) / ml) fue ejercida por HE-4 contra S. aureus . Estos resultados indican que galotaninos tara tienen el potencial para inhibir bacterias patógenas con potencial aplicación en alimentos como antimicrobianos y su AA puede ser mejorada por hidrólisis ácida. Palabras clave  Galotaninos ;  Staphylococcus aureus ;  Pseudomonas fluorescens 1. Introducción Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze conocida como tara, es un nativo de leguminosas para Perú ( Gálvez et al., 1997 y Marien y Delaunay, 2010 ) y ampliamente utilizado en la medicina tradicional desde tiempos prehispánicos, debido a sus efectos como un antibiótico para combatir infecciones y enfermedades de la piel relacionadas respiratorias ( De-la-Cruz, Vilcapoma, y Zevallos, 2007 ). Vainas y semillas de tara se han utilizado como fuente de taninos y de las encías ( De la Cruz, 2004 ).Vainas Tara representan el 62% del peso con un alto porcentaje de taninos (entre 40% y 60%), que son del tipo hidrolizable, con ácido gálico (GA) como el componente principal que puede ser aislado por hidrólisis ácida ( Mancero, 2008 ) . Los taninos en general son compuestos fenólicos con propiedades astringentes, antiviral, antibacteriana, antiparasitaria, y propiedades antioxidantes. Estudios previos han informado de que galotaninos extraídos de Galla chinensis ejercen actividad antimicrobiana (AA) e identificaron que 5-7 galloylglucopyranoses (GG) inhibieron Salmonella typhimurium , 6-7 GG inhibida Bacillus cereus , mientras 2GG ejerció una AA muy bajo contra las dos cepas ( Tian, Li, Ji, Zhang, y Luo, 2009 ). Taninos hidrolizables y derivados (GA y diversas galotaninos peso molecular) han demostrado que poseen actividades bacteriostáticos y bactericidas contra Aeromonas hydrophila , Enterobacter sakazakii ,Escherichia coli , Klebsiella pneumoniae , Listeria monocytogenes , Staphylococcus aureus , SalmonellaTyphi y Salmonella Typhimurium ( Kim, Silva, Kim, y Jung, 2010 ). Toxicidad de los compuestos fenólicos a los microorganismos implica varios mecanismos que incluyen la inhibición de enzimas por compuestos fenólicos oxidados ( Cowan, 1999 ). Tales compuestos fenólicos oxidados pueden reaccionar con los grupos de azufre de enzimas para producir enlaces covalentes, para aumentar la masa debido a la polimerización y a la formación de enlaces no covalentes ( Scalbert, 1991 ).Galotaninos ejercer su AA específicamente debido a su capacidad de quelar el hierro y para hacer que no esté disponible para los microorganismos ( Chung et al., 1998 y Scalbert, 1991 ). En general, la mayoría de los taninos pueden quelar iones metálicos tales como el hierro y el cobre, debido a sus o grupos -diphenol; esta característica permite la formación de complejos metal-tanino y disminuye actividades metalloenzymed ( Scalbert, 1991 ). Nuestro objetivo fue evaluar la AA de los taninos extraídos de las vainas de tara y los productos de su hidrólisis ácida contra bacterias gram positivas y gram negativas cepas bacterianas. 2. Materiales y métodos 2.1. El material vegetal, extracción e hidrólisis Tara se adquirió en un mercado local en Lima - Perú, producido en la región de Ancash y se cosecha cuando la humedad de las vainas de tara alcanzó aproximadamente el 8% e inmediatamente distribuido a los mercados locales. Aproximadamente 3 Kg de tara se adquirieron para el estudio y acondicionado de la siguiente manera: se utilizó un compuesto de aproximadamente 1 Kg y las vainas de tara se sometieron a extracción de semillas, lavado, secado a 55 ° C para alcanzar una humedad final de ~ 3%, molienda a 80 de malla, y se almacenaron a -20 ° C para su uso futuro. La extracción de taninos se realizó con agua destilada en una proporción de 1: 100 (w: v) a 55 ° C durante 30 min, seguido por centrifugación a 4000 gdurante 15 minutos para obtener el sobrenadante que se mantuvo a 4 ° C durante la noche y se centrifugó a 13.328 g durante 10 min para eliminar la fibra insoluble y polisacáridos y obtener el sobrenadante claro que se utilizó como extractos de vainas de tara (EE). La hidrólisis se realizó como se informó anteriormente ( Chambi et al., 2013 ). Brevemente, EE que contiene 20 mg GAE / ml se sometió a hidrólisis con H 2 SO 4 2N a 100 ° C durante 4 h (HE-4) o 9 h (HE-9). Todos los extractos (EE, HE-4, y HE-9) se somete después a extracción líquido: líquido con acetato de etilo (1: 2, v / v) durante dos veces consecutivas. El acetato de etilo se eliminó a vacío con un evaporador rotatorio a 38 ° C hasta que se seque y los sólidos se disolvieron con 5% de DMSO en Mueller Hinton Broth (HMB), se almacenaron a -80 ° C con N 2 gas para su posterior análisis. Galotaninos, libre y total GA se determinaron por el método rodanine ( Inoue y Hagerman, 1988 y Salminen, 2003 ), y compuestos fenólicos se determinó por el método de Folin Ciocalteu ( Singleton y Rossi, 1965 ). La actividad antioxidante se determinó mediante el ABTS ( Arnao, Cano, y Acosta, 2001 ), FRAP ( Benzie y Strain, 1996 ) y ORAC ( Ou, Hampsch-Woodill, y 2001, anteriores ) ensayos. El grado de hidrólisis (DH) se determinó después de la cuantificación de GA en el EE (GA EE ), cada uno de los hidrolizados de HE-4 y HE-9 (GA HE ), y el ee se sometieron para completar la hidrólisis (GA T ) , de la siguiente manera: DH (%) = [(GA HE - GA EE ) / (GA T - GA EE )] x 100 Todos los análisis de los extractos hidrolizados de tara y se realizaron al menos tres veces en diferentes días antes de su uso y los resultados fueron consistentes. 2.2. Microorganismos y medios de crecimiento Las cepas bacterianas gram-positivas ( Bacillus subtilis (NRRL B-3384), Enterococcus faecium (CWBI-B1430), Listeria innocua (NRRL B-33198), Listeria monocytogenes (CWBI-B2232), Micrococcus luteus(NRRL B-1018) y S . aureus (ATCC 25923)), y gram-negativas ( Escherichia coli (NRRL B-2073),Pseudomonas fluorescens (NRRL B-2641) y de Salmonella enteritidis se utilizaron para evaluar la AA - (Perú amablemente proporcionados por el Instituto Nacional de Salud) de EE, HE-4 y HE-9. El crecimiento de bacterias en el Hombre, Rogosa, y Sharpe (MRS) agar ( Enterococcus) , agar Palcam ( Listeria spp.), agar Manitol ( Staphylococcus) , agar McConkey ( Escherichia) , Brilliant agar verde ( Salmonella) , y agar Mueller Hinton (MHA) (para el resto de cepas bacterianas) se evaluó después de 24 h de incubación a 37 ° C. cepas bacterianas en placas de agar mantenido a 4 ° C se replicaron semanal. Todos los experimentos sobre la actividad antibacteriana de extractos de tara se llevaron a cabo tres veces de forma independiente en diferentes días, para evaluar la reproducibilidad y robustez de los ensayos. 2.3. La actividad antimicrobiana La actividad antimicrobiana se evaluó mediante la técnica de difusión en disco estándar como se informó anteriormente ( Bauer, Kirby, Sherris, y Turck, 1966 ). Brevemente, las cepas bacterianas se inocularon en tubos de ensayo que contienen Mueller Hinton Broth (MHB) y se incubaron durante 4 horas a 37 ° C.Discos de papel estéril (7,0 mm de diámetro, Whatman N ° 1) se impregnaron con 20 l de extractos (EE, HE-4, y HE-9) a una concentración de 35 mg GAE / ml y se colocaron en placas MHA inoculó con 100 l de la suspensión bacteriana ajustada a 10 6 unidades formadoras de colonias (CFU) / ml usando una solución salina estéril al 0,85%. Discos que contienen 5% de DMSO fueron utilizados como un control y los discos que contienen ciprofloxacina o vancomicina (1 mg / ml) se utilizaron como controles positivos negativo.Las placas se incubaron a 37 ° C durante 24 h y la actividad antimicrobiana se determina por el diámetro de la zona de inhibición. 2.4. Concentración inhibitoria mínima (MIC) El MIC se evaluó mediante el método de macro-dilución ( Zhu, Zhang, & Lo, 2004 ). Brevemente, 0,9 ml de diluciones seriadas al doble (0-50 mg GAE / ml de EE y 0-70 mg GAE / mL para HE-4) se prepararon en MHB, se inoculó con 0,1 ml de suspensión de bacterias (10 6 CFU / ml ), y se incubaron a 37 ° C durante 18 h. La MIC fue la dilución a la que no se observó crecimiento visible. 2.5. Concentración bactericida mínima (MBC) MBC se determinó mediante la inoculación de 100 l de caldo de cultivo de cada uno de la prueba de MIC en placas MHA y se incubó a 37 ° C durante 24 h. MBC fue la concentración (GAE / ml) a la que se inhibió el crecimiento de bacterias en el 99,9% ( Alade y Irobi, 1993 ). 2.6. El análisis estadístico Los datos cuantitativos representan valores medios de tres o más repeticiones con la respectiva desviación estándar (SD). A un solo sentido los análisis de varianza (ANOVA) seguido de una prueba de Duncan se realizaron con Stat Graphics Plus 5 (Estadísticos Gráficos Corp., Herndon, VA, EE.UU.). Un valor de p <0,05 fue considerado estadísticamente significativo. 3. Resultados y discusión 3.1. Caracterización Extracto Los resultados mostraron una DH de 46% y 95,4% después de 4 y 9 h de hidrólisis ácida, HE-4 y HE-9, respectivamente ( Tabla 1 ). Esto fue acompañado por un aumento en el contenido de GA libre en comparación con EE (2,4 a 17,3 y 36,4 mg GA / ml para HE-4 y HE-9, respectivamente) y una disminución en el contenido de galotaninos (34,4 a 19,4 y 1,7 mg GAE / ml para HE-4 y HE-9, respectivamente). El aumento de DH a 46% fue acompañado por un aumento en la actividad antioxidante en un 50% y 59% cuando se evaluó por los métodos FRAP y ABTS, respectivamente, mientras que el aumento fue de sólo el 16% cuando se evaluó por el método ORAC. Asimismo, un DH de 95,4% fue acompañado por un aumento en la actividad antioxidante en un 65%, 62% y 27% (ABTS, FRAP, y los métodos ORAC, respectivamente). Por otra parte, HE- 4 y HE-9 mostró actividades antioxidantes similares ( p <0,05) según la evaluación de la ABTS, FRAP y métodos ORAC. Resultados similares que muestran el aumento de la actividad antioxidante en el procesamiento de taninos se ha informado anteriormente ( Chambi et al., 2013 y Kim et al., 2010 ). Tabla 1. Los compuestos fenólicos y actividad antioxidante de extractos de vainas de tara (EE) y los productos de su hidrólisis ácida (HE-4 y HE-9). EE HE-4 HE-9 Grado de hidrólisis (DH) (%) 0 46,0 ± 0,8 95,4 ± 0,4 Ácido gálico libre (mg GA / ml) 2.4 ± 0.3 17.3 ± 4.8 36.4 ± 5.8 Galotaninos (mg GAE / ml) 34,4 ± 0,1 19,4 ± 0,2 1,7 ± 0,2 Fenoles totales (mg GAE / ml) 36,8 ± 3,2 39,7 ± 1,6 41.3 ± 4.1 La actividad antioxidante (TE mol / ml) : ABTS 647,2 ± 7,4 b A 1029.3 ± 23.8 a A 1066.7 ± 24.8 a A FRAP 632.5 ± 33.1 b A 945,9 ± 31,8 a A 1025.4 ± 70.3 a A ORAC 240.0 ± 15.8 b B 279,2 ± 22,0 un B 304,0 ± 18,8 a B Se obtuvieron extractos Tara vaina (EE) y sus hidrolizados para 4 y 9 h (HE-4 y HE-9) como se detalla en la sección de materiales y métodos. Los resultados son la media ( n ⩾ 3) ± SD. Diferentes superíndices dentro de una misma fila (en minúsculas) o la misma columna (letra mayúscula) indican diferencia significativa p <0,05. Opciones de la tabla 3.2. La actividad antimicrobiana (AA) Los resultados mostraron que entre las bacterias analizadas, 7 de los 9 cepas fueron inhibidas por EE, HE-4 y HE-9 a 35 mg GAE / ml ( Tabla 2 ). Sólo E. faecium y E. coli requiere una mayor concentración de EE y HE-4 (80 mg GAE / ml) para inhibir en un grado similar. Además, la AA de EE subió frente B. subtilis , M.luteus y P. fluorescens comparación con HE-4 y HE-9 ( p <0,05), mientras que L. innocua , L.monocytogenes , S. aureus y S. enteritidis eran más sensibles a la HE-4 y HE-9 que a EE ( Tabla 2 ). Sin embargo, a las concentraciones de EE utilizado, el pH bajo podría haber influido en el AA. Estos resultados están de acuerdo con un estudio anterior que demuestra que hidroliza el ácido tánico inhibidoS. aureus y L. monocytogenes en mayor extienden de tanino ácido ( Kim, Silva, y Jung, 2011 ). Además, los estudios anteriores han informado de que el origen, la concentración, la estructura química, y por lo tanto los productos obtenidos de la hidrólisis de taninos influyen en su AA ( Min et al., 2008 ). Asimismo, el tanino de ácido, pero no el ácido gálico inhibe el crecimiento de varias cepas bacterianas, incluyendo E.coli , S. aureus y S. typhimurium , y el ácido láctico las bacterias L. acidophilus y Bifidobacterium infantis (Chung et al., 1993 y Chung et al., 1998 ). E. coli sin embargo se encontró que era el más resistente a EE y sus hidrolizados que está de acuerdo con estudios previos ( Kloucek et al., 2005 , Min et al., 2008 y Taguri et al., 2004 ). Puesto que las bacterias gram-negativas son más resistentes a los antibióticos debido a su pared celular relativamente impermeable, la sensibilidad de cepas bacterianas podría estar influenciado por la estructura de la membrana celular y por el grado de hidroxilación de compuestos fenólicos ( Kim et al., 2011 ). Tabla 2. La actividad antibacteriana de los extractos de vainas de tara (EE) y los productos de su hidrólisis ácida para 4 y 9 h (HE-4 y HE-9). Cepas EE HE-4 HE-9 Ciprofloxacina Vancomicina (35 mg GAE / mL) (1 mg / mL) Bacterias Gram-positivas: Bacillus subtilis 11,7 ± 0,3 c 9.3 ± 0.6 d 9.7 ± 1.6 d 33,3 ± 1,2 un 21.3 ± 1.2 b Enterococcus faecium NA NA NA 30,3 ± 0,6 a 30.0 ± 0.0 a Listeria innocua 7.3 ± 0.6 d 8.8 ± 1.0 c, d 9,3 ± 0,6 c 38,7 ± 1,2 a 27.3 ± 1.2 b Listeria monocytogenes 15.3 ± 1.5 d 16.3 ± 1.2 c, d 19,3 ± 2,9 c 33,7 ± 1,5 un 29.3 ± 1.2 b Micrococcus luteus 11,0 ± 1,0 c 9,7 ± 0,6 c 9,8 ± 0,3 c 34,0 ± 2,0 un 29.3 ± 1.2 b Staphylococcus aureus 18,2 ± 0,3 d 26.3 ± 1.2 b 26,7 ± 0,6 b 35.0 ± 1.0 a 22,3 ± 0,6 c Bacterias Gram-negativas: Escherichia coli NA NA NA 50.0 ± 2.00 a 14.7 ± 1.2 b Pseudomonas fluorescens 12,0 ± 0,0 c 9.0 ± 0.0 d 9,2 ± 0,3 d 34,8 ± 0,8 a 23,2 ± 0,3 b Salmonella enteritidis 8,3 ± 1,5 c 10,3 ± 2,5 c 15.3 ± 2.1 b 47,3 ± 1,2 un NA EE HE-4 (80 mg GAE / ml) (80 mg GAE / ml) Enterococcus faecium 11.0 ± 0.85 a 11,0 ± 0,58 una Escherichia coli 9,0 ± 1,00 a 9,0 ± 0,90 a EE, HE-4, y HE-9 a dosis de 35 y 80 mg de equivalente de ácido gálico (GAE) / ml se utilizaron para evaluar la actividad antimicrobiana mediante el ensayo de difusión en disco estándar como se detalla en materiales y métodos. Los resultados son la media ( n = 3) ± SD. NA = No está activo. Diferentes superíndices dentro de una misma fila indican diferencia significativa p < 0,05. Opciones de la tabla En general, entre todas las bacterias probadas cepas S. aureus fue el más sensible a todo EE, HE-4, HE-9 (mayor halo de inhibición), sin embargo en comparación con los controles positivos (ciprofloxacina y vancomicina, antibióticos) su potencia se excede en aproximadamente 35 veces. 3.3. MIC y MBC de extractos de tara Los extractos que ejercen el mayor AA fueron seleccionados para evaluar el MIC y MBC, a excepción deS. enteritidis , que mostró ser más sensible a la EE de HE-9 en el medio de cultivo utilizado para probar MIC. Los resultados mostraron que P. fluorescens , B. subtilis y S. enteritidis fueron los más sensibles a EE con el MIC de 0,53, 1,06 y 4,25 mg GAE / ml, respectivamente; mientras que el MBC fueron 4,25, 8,5, y 17 mg GAE / ml, respectivamente ( Tabla 3 ). A concentraciones que EE y sus hidrolizados inhibieron el crecimiento de bacterias, el pH estaba dentro de 6-7; Por lo tanto, el pH no influyó en su actividad antibacteriana. M. luteus , L. innocua y L. monocytogenes no se inhibieron significativamente (MIC y MBC ⩾ 25 mg GAE / mL). HE-4 fue en cambio eficaz contra S. aureus , E. faecium y E. coli con el MIC de 0,13, 1,13, y 1,46 mg GAE / ml, respectivamente, con valores de MBC de 14 y 4,05 para el S. aureus y E. coli , respectivamente. El efecto de HE-4 contra E. faecium fue bactericida en vez de bacteriostática, ya que no creció en la placa de agar. Tabla 3. Concentraciones inhibitorias y bactericidas mínimas (MIC y MBC) de extractos de vainas de tara (EE) o los productos de su hidrólisis ácida para 4 (HE-4). MIC MBC (Mg GAE / ml) Gram positivo cepas Bacillus subtilis [EE] 1.06 ± 0.0 8.5 ± 0.0 Enterococcus faecium [HE-4] 1.13 ± 0.0 <0.56 Listeria innocua [EE] 50.0 ± 0.0 50.0 ± 0.0 Listeria monocytogenes [EE] 50.0 ± 0.0 50.0 ± 0.0 Micrococcus luteus [EE] 25.0 ± 0.0 25.0 ± 0.0 Staphylococcus aureus [HE-4] 0,13 ± 0,02 14,0 ± 0,2 Gram negativas cepas Escherichia coli [HE-4] 1,46 ± 0,3 4.05 ± 0.2 Pseudomonas fluorescens [EE] 0.53 ± 0.0 4,25 ± 0,0 Salmonella enteritidis [EE] 4,25 ± 2,0 17,0 ± 2,0 Tara EE o HE-4 se utilizaron para evaluar MIC y MBC como se detalla en materiales y métodos. Los resultados son la media ( n = 3) ± SD. Opciones de la tabla En general, nuestros resultados están de acuerdo con estudios previos que informaron los valores de CIM de S. aureus que van desde 0,16 hasta 16 mg de taninos de C. spinosa / ml y superiores a 1 mg GAE / ml (Kloucek et al., 2005 y Taguri et al., 2004 ). 4. Conclusiones Extractos de vaina Tara contienen galotaninos con actividades antioxidantes y antimicrobianas contra una amplia gama de bacterias gram positivas y gram negativas cepas bacterianas. La hidrólisis se extrae galotaninos ácido (EE) para 4 y 9 h producidos HE-4 y HE-9 con disminución del contenido de galotaninos y las concentraciones más altas de ácido gálico libre, que fue acompañada por un aumento en la actividad antioxidante. En general, EE ejerce la más alta actividad inhibidora del crecimiento evaluado por AA y MIC contra S. aureus y P. fluorescens , aunque EE hidrólisis aumentó el AA sólo contra S. aureus . La mayor actividad antimicrobiana de HE-4 y HE-9 frente a estas cepas podría atribuirse a un efecto inhibidor de crecimiento específico de la libre GA. La actividad antimicrobiana más alta de galotaninos y productos de su hidrólisis contra la vaina de tara S. aureus confirman su medicamento popular utiliza para tratar infecciones de la piel, enfermedades respiratorias, y para prevenir la intoxicación alimentaria. Estas aplicaciones deben ser investigados en un estudio siguiente. Agradecimientos Los autores agradecen a Ruth Jeenyfert HERALDEZ y Adelayda Pardo por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Proyecto PIC del belga Coopération au Développement Universitaire (CUD). Referencias 1. o Alade y Irobi, 1993 o PI Alade, EN Irobi o Las actividades antimicrobianas de los extractos de la hoja en bruto de Acalypha wilkesiana o Journai de Etnofarmacología, 39 (1993), pp. 171-174 o [SD-008] 2. o Arnao et al., 2001 o MB Arnao, A. Cano, M. Acosta o La contribución hidrofílica y lipofílica a la actividad antioxidante total o Food Chemistry, 73 (2) (2001), pp. 239-244 o [SD-008] 3. o Bauer et al., 1966 o AW Bauer, W. Kirby, J. 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