Universidad politécnica de Tlaxcala¨Producción de pectinasas¨ Ingeniería en biotecnología Materia: Biotecnología Industrial Profesor: Erick Ortega Sánchez Alumnos: Vianey Chamorro Ramírez Erika Cerón Delgado Beatriz Camacho Sánchez Leticia Fernández Romero Yobani Ibáñez Reyes 9to D vespertino Fecha de entrega: 06/08/2013 INDICE INTRODUCCIÓN: .................................................................................................................................. 3 FUETES Y MÉTODOS ............................................................................................................................ 4 LOS SISTEMAS DE CULTIVO ............................................................................................................. 6 APLICACIONES INDUSTRIALES DE PECTINASAS ................................................................................... 6 IMPORTANCIA ECONÓMICA ............................................................................................................... 7 PERSPECTIVAS ..................................................................................................................................... 9 CLASIFICACIÓN: ................................................................................................................................. 11 MECANISMO DE ACCION: ................................................................................................................. 12 POLIGALACTURONASAS ................................................................................................................ 12 PECTIN Y PECTATO LIASAS ............................................................................................................ 13 PARÁMETROS CINÉTICOS: ................................................................................................................. 15 PRODUCCIÓN DE PECTINASA FÚNGICA EN MEDIO SÓLIDO UTILIZANDO POMAZA DE LIMÓN. ...... 17 INMOVILIZACION DE PECTINASAS Y EFECTOS EN EL JUGO DE GUAYABA ........................................ 18 INMOVILIZACION DE PECTINASAS EN GEL DE ALGINATO DE SODIO. ............................................... 20 CONCLUSIÓN ..................................................................................................................................... 21 BIBLIOGRAFÍA: ................................................................................................................................... 22 2 Viikari et al. 1999). 1998. 2003). especialmente en las áreas de genética molecular e ingeniería de proteínas. 2002). 2001)... Los enzimas fueron descubiertos en la segunda mitad del siglo XIX y desde entonces han sido progresivamente utilizados en diversos procesos industriales. Kashyap et al ... sino que además permiten el desarrollo de tecnologías respetuosas con el medio ambiente. 2001). la identificación de microorganismos con potenciales metabólicos que puedan ser utilizados para aplicaciones industriales. a que su uso no daña el medio ambiente y a su alta rentabilidad económica (Cherry y Fidantsef. Con los avances en biotecnología en las últimas tres décadas. 2002).. amilasas (Gupta et al 2003. celulasas (Bhat. 3 .. mananasas (Montiel et al. los enzimas han encontrado campo de aplicación en muchos de los nuevos procesos industriales. Por este motivo existe un renovado interés en sustituir los procesos productivos convencionales por procesos biotecnológicos en los que están involucrados microorganismos y enzimas microbianos tales como pectinasas (Alkorta et al. Los enzimas microbianos presentan aplicación industrial debido a su elevada eficiencia catalítica. los cuales no sólo proporcionan alternativas económicas viables. Van der Maarel et al. 2000).INTRODUCCIÓN: La biotecnología microbiana utiliza diversas herramientas metodológicas para explorar y explotar la biodiversidad natural de los microorganismos y sus enormes capacidades metabólicas. Son biocatalizadores extremadamente eficientes y altamente específicos. y la presión pública ha influido tanto en la industria como en los gobiernos para su disminución. y el uso de métodos moleculares para valorar la distribución natural de los microorganismos en el medio ambiente y las funciones ecológicas que ellos realizan. lacasas y ligninasas (Bajpai. En el siglo pasado ha habido una preocupación creciente por los efectos de la contaminación ambiental. 2001. xilanasas (Beg et al. Esta disciplina incluye en su área de estudio la aplicación de microorganismos para mejorar el medio ambiente. estructura de las pectinasas FUENTES Y MÉTODOS La pared celular de los materiales cítricos está conformada en su mayoría por tres polisacáridos: celulosa.Las pectinasas son un conjunto de enzimas capaces de hidrolizar a la pectina. 1997). Figura 1. 2001). la cual es un polisacárido formado principalmente por unidades de ácido Dgalacturónico.1-4. Es un heteropolisacárido de estructura compleja formada por una cadena lineal de unidades de ácido D-galacturónico unidas entre sí por enlaces α. que puede estar ono metilado. hemicelulosa y pectina (de Vries&Visser. así como a otros polímeros y proteínas (Annis&Goodwin. y su función es estabilizar a las microfibrillas de celulosa. misma que en ocasiones puede estar 4 . La pectina forma parte de la pared celular primaria. en la región del homogalacturonano. todavía no se ha profundizado en el estudio de tales procesos regulatorios para la producción de pectinasas por microorganismos saprófitos.. 5 . Esta región se caracteriza además por presentar ramificaciones de carbohidratos de diversos tipos. Las actividades enzimáticas que actúan sobre la cadena principal de la pectina comprenden a las hidrolasas. 2005). 2001. como A. como arabinosa. como A. galactosa.4-glicosídicos. niger. estas enzimas son importantes para proveer al microorganismo los nutrientes a partir de los materiales de su medio ambiente.intercaladas con unidades de L-ramnosa. si actúan sobre los finales no reductores de los oligogalacturónidos (Kashyap et al. Jayani et al. lo que conforma la región del ramnogalacturonano. ácido ferúlico. 2003). Así. o exo. Los microorganismos producen enzimas activas en amplios intervalos de pH como estrategia de supervivencia (Prusky&Yakobi. apiosa y fucosa. 2008). Las pectinasas son un grupo de enzimas de diversos tipos encargadas de degradar a la pectina hasta sus compuestos monoméricos elementales. flavus. entre otros (de Vries y Visser. Las pectinasas pueden tener distintas funciones. que actúan sobre los enlaces α-1. Aun cuando se ha documentado la secreción de enzimas y metabolitos de diversos tipos en dependencia del pH del cultivo. en dependencia del organismoque las produce. 2000). xilosa. Niture. mientras que en los hongos saprófitos. si actúan de manera aleatoria a lo largo de la cadena principal. Dado su modo de acción estas pueden ser del tipo endo. 2001. en el caso de los microorganismos fitopatógenos. intervienen en la degradación de la pared celular durante el proceso de invasión microbiana a las células vegetales (Parenicová. De igual manera. el valor de ciertas variables clave. 2004. Cuando se agregan pectinasas. cambian con el tiempo del proceso. A pesar del cambio en el volumen de operación. así como el estado fisiológico y metabólico celular. como las concentraciones del sustrato y biomasa pueden controlarse en valores relativamente constantes. Se caracteriza por el hecho de que la concentración de sustratos. a menos de que se establezcan estrategias adecuadas para su control (Ramírez Reivich. que es un polisacárido constituido principalmente de ácido 6 . o bien el sistema de producción es susceptible a represión por la concentración del sustrato. centrifugando el líquido o filtrándolo. una alternativa es el empleo del cultivo alimentado. parámetros como el pH y el oxígeno disuelto cambian. 2007). En este. El cultivo en lote es uno de los métodos más simples empleados para el desarrollo de cultivos líquidos. uno o varios de los nutrientes limitantes se suministran a lo largo del cultivo y la alimentación de los sustratos puede hacerse por pulsos. En los extractos comerciales de pectinasas usados para la fabricación de jugos de frutas coexisten tres enzimas: la pectinliasa.LOS SISTEMAS DE CULTIVO Dos de las técnicas más utilizadas para tal fin son el cultivo en lote y el cultivo en lote alimentado. debido a la pectina disuelta. Mediante el desarrollo del cultivo alimentado se puede además controlar la velocidad de crecimiento dentro de los intervalos que favorezcan una función objetivo particular (Ramírez Reivich. o de manera continua. Najafpour. por lo que el volumen del cultivo se incrementa. Estas enzimas en combinación hidrolizan a la pectina. la viscosidad disminuye y las partículas pueden eliminarse fácilmente. productos y células. Este mecanismo produce un líquido con una presentación más atractiva para el consumidor. Cuando la generación de productos y subproductos provoca efectos negativos sobre la formación de los metabolitos de interés. la poligalacturonasa y lapectinesterasa. 2004). APLICACIONES INDUSTRIALES DE PECTINASAS Existen diversas aplicaciones industriales de las enzimas pectinasas una de ellas. y turbio por los fragmentos de paredes celulares en suspensión. en el procesamiento de jugos de frutas en el cual el producto obtenido generalmente es viscoso. Del Carmen Montes.galacturónico que se encuentra parcialmente metoxilado. pulpa y papel y fabricación química (Business Communications. (Fuente: Kent y Riegel. producción de detergentes y limpiadores. 2002) IMPORTANCIA ECONÓMICA Los productos biotecnológicos están en todos los sectores de las drogas (genéricas y no-genéricas) productos de belleza procesamiento de alimentos para humanos y animales procesamiento textil y artículos de limpieza para producción masiva de alcohol y suplementos nutricionales de la vida diaria. en textiles.800 millones de dólares se estima el mercado para enzimas industriales. con aplicaciones en el procesamiento de alimentos. De tal manera que las pectinliasas actúan sobre la pectina. (Ma. En 1. 1994). las pectinesterasas eliminan los grupos metoxilo y la poligalacturonasa actúa sobre la pectina una vez que ésta ha sido desmetilada. 1998) Figura 2. 2007) 7 . es un aliciente para la creación de nuevas empresas nacionales o mixtas que produzcan enzimas a nivel nacional o subregional (lllanes. cueros y pieles. Es innegable que la expansión de mercado de enzimas observado en los últimos años en los países de latinoamerican. de acuerdo con los datos publicados por (Eveleigh y coL. 1991) obtenida a una concentración mayor y es relativamente más económico (Ghildyal et al. por la facilidad del control de las propiedades fisicoquímicas del sistema. por un lado.La producción industrial de estos complejos enzimáticos se lleva a cabo por FML.Pandey. se muestra Ia situación del mercado internacional.. el hecho de que más de 2000 enzimas registradas sólo 60 sean producidas comercialmente y de éstas sólo cinco cubran más deI 80% del mercado (García y col. 1993) En la tabla 1. o FMS.. 1981. Es impactante. 1993).. 8 .. El primer método es más usado en comparación con el segundo.. 1992) Tabla 1: (Fuente: producción mundial de enzimas Garcia y col.1990). el segundo método rinde mayor cantidad de enzima por gramo de sustrato (TrejoHernández et al. sin embargo. estimándose un crecimiento desde 2200 millones USD en el año 2006 a 3300 millones USD en el 2010. Figura 3: mercado mundial de las enzimas de uso industrial 9 . El mercado de las enzimas puede ser dividido según su rubro aplicación. en alimentación animal y en la industria de alimentos y bebidas (figura1). ya que ofrece varias ventajas sobre las tecnologías convencionales. Dentro de los que se destacan. la biotecnología está ganando terreno rápidamente. Esperándose que alcance $ 4400 millones USD para el año 2015.PERSPECTIVAS En la actualidad. los procesos químicos convencionales están siendo sometidos a un escrutinio considerable bajo consideraciones ambientales y económicas. En muchos rubros. La aplicación industrial ha aumentado significativamente en los últimos años. los segmentos de enzimas con aplicación técnica. Las enzimas industriales representan el corazón de la biotecnología. para el segmento de enzimas con aplicación en la industria de alimentos y bebidas se espera que crezca desde valor de $ 975 millones USD en 2010 a alrededor de $ 1300 USD millones en 2015. Dentro del segmento de este rubro. Por su parte. GistBrocades de Neatherlands y Rhom and Haas de Alemania. las dirigidas al mercado leche y sus derivados registran la mayor parte de las ventas. Japón y Estados Unidos. seguido por el mercado del bioetanol. creciendo a una tasa de crecimiento anual compuesta del 5. Argentina y Uruguay. El mercado de la producción de enzimas está abarcado por 20 compañías de Europa. Las ventas más significativas en este rubro han ocurrido en el mercado de enzimas dirigidas a la industria del cuero. Siendo el mercado de mayor crecimiento esperado.1%.6% anual para llegar a 1500 millones USD en el 2015. con $ 401.El mercado de enzimas técnicas se ha valorado en torno de 1000 millones USD en 2010 y se estima que este sector crecerá a una tasa de crecimiento compuesta del 6. Brasil. como la empresa Pfizer en México y Brasil y Novo en Brasil. Japón y Estados Unidos realizan la producción de enzimas. Unas 20 compañías de Europa. pero el mercado es dominado por 3 de ellas: Novo Nordisk (Dinamarca) con el 50% de las ventas a nivel mundial. principalmente por: Novo Nordisk de Dinamarca. En Latinoamérica hay empresas productoras de enzimas en México. Bacillusamyloliquefaciens y aspergillus Oryzae y la amiloglucosidasa de aspergillus Níger. que son subsidiadas por empresas internacionales. Entre las enzimas comercialmente importantes utilizadas destacan: la α-amilasa del Bacilluslicheniformis. seguida por GistBrocades (Neatherlands) y Rhom and Haas (Alemania). El mercado de las enzimas ha tenido gran crecimiento desde los años 70 y este ha sido paralelo con el desarrollo de un gran número de aplicaciones en la industria alimentaria.8 millones USD en 2009. 10 . . 11 . Clasificación de las enzimas pectinolíticas y su nombre de acuerdo con la Comisión de Enzimas (EC) (Recomendaciones de la IUPAC-IUB). 1997): Pectinesterasas Poligalacturonasas (endo y exo) Pectin y pectatoliasas Las pectinesterasas y poligalacturonasas pueden ser de origen vegetal o microbiano. mientras que las pectin y pectatoliasas son sintetizadas por microorganismos. Figura 4.CLASIFICACIÓN: Las pectinasas se pueden clasificar en tres grupos de acuerdo a su forma de actuar sobre el polisacárido (Taragano et al. ya que no son hidrolizados los enlaces éster metílicos de otros compuestos (Díaz. Figura 5. Acción de las pectinesterasas. Las pectinesterasas producidas por los hongos tienen un pH óptimo alrededor de 4.MECANISMO DE ACCION: Pectinesterasas Las pectinesterasas transforman a la pectina metoxilada en pectina de bajo metoxilo o pectato. Al actuar producen metanol a partir de los grupos carboxilos esterificados. Esto ocurre en muchas plantas y se presenta frecuentemente en cítricos y tomates. 1997). pero también son producidas en gran cantidad por hongos y bacterias. Todas las pectinesterasas son altamente específicas sobre el metil éster del ácido poligalaracturónico. las pectinas de alto metoxilo se hidrolizan muy lentamente. POLIGALACTURONASAS Las poligalacturonasas son enzimas que hidrolizan el enlace glucosídico contiguo al grupo carboxilo libre. mientras que las de bajo metoxilo son buen sustrato considerandose al pectato como el mejor. 12 .5 mientras que el de las enzimas de plantas y bacterias se encuentra cerca de la neutralidad. en consecuencia. endo y 4-α-D- galacturónido)glicano hidrolasa. trayendo como consecuencia una muy lenta disminución de la viscosidad. Al igual que las poligalacturonasas. 3.4-α-D-gaIacturónido) galacturono hidrolasa. 1. éstas actúan del lado donde se encuentra más cercano el grupo carboxilo libre. EC.Las poligalacturonasas son producidas por la mayoría de los hongos.67) atacan del lado no reductor del polímero formando mono ó dimeros. su acción produce dobles ligaduras entre los carbonos 4 y 5 de la molécula de ácido Dgalacturónico. Acción de las poligalacturonasas. y también se encuentran endo y 13 . 15) atacan a la cadena péctica al azar. 3.2. entre las 4.2. un pequeño incremento en grupos reductores se manifiesta con un fuerte descenso de la viscosidad de la solución que contiene el sustrato.5. Figura 6. PECTIN Y PECTATO LIASAS Las pectatoliasas rompen el enlace glucosldico por β-eliminación. 1980). por levaduras y también por algunas bacterias (Rombouts y Pilnik. Su pH óptimo se estima exopoligalacturonasas. Las exopoligalacturonasas (poli (1. EC.0 y 5. Se han reconocido endopoligalacturonasas(poli (1.1. su acción es similar a la de las pectatoliasas. el pectato es el mejor sustrato y generalmente se obtienen dímeros insaturados a partir del grupo reductor terminal. Para las tipoexo. El mejor sustrato para estas enzimas. pero con la adición de iones calcio se puede presentar un segundo pH óptimo en 8 (Díaz. Su pH óptimo está alrededor de 8-9.exopectatoliasas. Para las endo. su pH óptimo está entre 5-6. Las pectinliasas rompen el enlace glucosídico cercano al grupo metil éster por vía de la β-oxidación. las pectinas de bajo metoxilo son el mejor sustrato. Acción de las pectato y pectinliasas 14 . Figura 7. 1997).5 y por esta razón son de baja importancia para el procesamiento de frutas. 1:2 y 1:4 de pectina/sacarosa y en la figura 3. se muestran los resultados obtenidos con A. Velocidad especifica de crecimiento μ (en las cepas que se analizaron) VALORES DE Vmax y Km OBTENIDOS EN DIFERENTES ESTUDIOS: PRODUCCION DE PECTINASAS DE ASPERGILLUS NIGER POR FERMENTACION SOLIDA 1) Efecto de la relacion pectina /sacarosa en medio solido sobre soporte en esta parte. 15 . Velocidad especifica de crecimiento (μ). Constante de Michaelis-Menten (Km).PARÁMETROS CINÉTICOS: Velocidad Maxima (Vmáx). después de 76 h. La mejor relación pectina/sacarosa fue la 1:2. niger.5 U/g de substrato húmedo. con un máximo de producción de 672~0. Las relaciones utilizadas fueron en: 1:1. en este momento comienza la síntesis de enzimas pécticas. se observa después de 30 horas de fermentación. comparado con el cultivo sumergido. 5.” (Viniegra. 1991). G. “La actividad pectinolítica obtenida fue más alta en cultivo en medio sólido. y col.En la Fig. 16 . una completa asimilación de la sacarosa presente en el medio y por otro lado. Las constantes de la ecuación de Michaelis-Menten fueron V max de 38.65 a 37. con un valor de 0. La producción de pectinasa fue de 2181.02 mg AT /100 mg pomaza de limón al final de la cinética (50%). Godinez et al (2) obtuvieron un productividad pectinasa de 1911 U/l.8 g/L (Fig. la humedad en el sistema fue de 30% durante toda la cinética.23 U/L a una concentración de ácido poligalacturónico (APG) de 0.PRODUCCIÓN DE PECTINASA FÚNGICA EN MEDIO SÓLIDO UTILIZANDO POMAZA DE LIMÓN. El consumo de sustrato vario de un valor inicial de 70.1269 h-1.4 g/L de APG la reacción fue de orden uno y a partir de 0. utilizando poliuretano como soporte y sacarosa como fuente de carbono.84 μmol/(L*min) y Km de 0. 1. La selección del microorganismo fue de 8 cepas. La cantidad de glucosamina como cuantificación de biomasa fue de 8.2 fue de orden cero. obtuvieron una actividad pectinasa de 790 U/mg de proteína en el bioreactorZymotis. 17 . El microorganismo que presentó un mayor crecimiento fue Aspergillus niger a-20h.0683 h-. 1b).6 y 3. Para 0.017 mg glucosamina/gr pomaza con una velocidad específica de crecimiento de 0. valores mayores a los obtenidos en estudios sobre bagazo de manzana (1).155 μmol/L.8. mientras que Huerta et al (3). Se monitoreo la producción de pectinasa cada 12 h por 96 h y se calcularon los parámetros cinéticos de la fermentación. 2004) INMOVILIZACION DE PECTINASAS Y EFECTOS EN EL JUGO DE GUAYABA Lineweaber-burkpara pectinasas libre e inmovilizada 18 . H. (Ruiz. y col.Actividad enzimática a diferentes concentraciones de sustrato. Una vez obtenida la relación entre el aumento de concentración de sustrato y actividad catalítica. En el caso de la constante de Michaelis-Menten para la pectinasa libre (0. lo cual muestra que la enzima libre actúa mucho más rápido que la enzima inmovilizada.0328673 g/mL) en comparación con la inmovilizada (0. el que se obtenga un valor más grande para la inmovilizada.00848896 UI/mg) es cien veces mayor.5751/mL). indica que para llegar a una velocidad de 19 .1071 (UI/mg) y comparada con la de la pectinasa inmovilizada (0. B) Gráfico de Lineweaber para la pectinasa inmovilizada En los gráficos A) y B) se determina que la velocidad máxima de reacción de la enzima libre encontrada es de 0. A) Curva de lineweaber para la pectinasa libre. se procede a la linealizacion de los graficos anteriores para obtener de estos los parámetros cinéticos. 2002) INMOVILIZACION DE PECTINASAS EN GEL DE ALGINATO DE SODIO.relación máxima se necesita una alta concentración de sustrato. en la cual se requiere solamente cantidades pequeñas de sustrato para ser saturada y el máximo de velocidad es alcanzado a bajas concentraciones de sustrato. L. 20 . (Díaz. comparado con el cultivo sumergido 21 . La actividad pectinolítica obtenida fue más alta en cultivo en medio sólido. su importancia económica va en aumento debido a la demanda y a los nuevos procesos que se inician dentro de las aplicaciones industriales.La enzima inmovilizada tiene menor afinidad por el sustrato que la enzima libre. por otra parte las pectinasas tienen un papel importante en la industria alimentaria ya que se utilizan en un sinfin de procesos que van desde clarificantes hasta la extracción de aceites esenciales. CONCLUSIÓN Las aplicaciones industriales de las enzimas a nivel mundial van en aumento ya que son de gran importancia en diversos sectores industriales. y esto se ve a través de Km. También hay una disminución de la velocidad máxima en la enzima inmovilizada respecto a la libre. I. 105-109. pág.F. J.S. 21.M.E. Industrial Applications of pectic enzymes: 21-28. (1997). (1998)... M. México D. Osorio Aguilar G.(2002) Produccion de enzimas pectinasas por actinomicetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cascaras de naranja. Utilization of orange peels for the production of multienzyme complexes by some fungal strains. “Exopectinases produced by Aspergillusniger in solid-state and submerged fermentation: a comparative study”. J.. (2003).. GARBISU.. 35. 19 (3): 233236. A. (2001). Journal of Industrial Microbiology and Biotecchnology.7 645-650 ALIXIS GERMAN. Augur C. del Carmen Montes Horcasitas e Ignacio Magaña Plaza. XXX Aniversario de Biotecnología y Bioingeniería.F. . 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