Pontificia Universidad Católica de ChileFacultad de Ciencias Biológicas Departamento de Genética Molecular y Microbiología Biología de Microorganismos BIO 151E-1 Informe n°1: Técnicas básicas de aislamiento, detección e identificación de microorganismos Nombre: Felipe Del Valle Batalla. Profesores: Dras. Beatriz Díez y Carolina Serrano. Jefe de Ayudantes: Daniela Ruiz. Ayudante: Isidora Suazo. Fecha de entrega: 1 de Octubre de 2014. 1 semisólido o líquido) existe una manera de sembrar particular que en el caso de las experiencias realizadas se trató de la siembra en cuadrantes. es necesario verificar y describir las características macro y microscópicas de los M. es necesario realizar una prueba de tinción para conocer más sobre sus características microscópicas.O. El propósito fundamental de los medios sólidos consiste en poder aislar un M. cabe recordar que para cada medio de cultivo (sólido.). y verificar sus características macro y microscópicas. composición y ventajas de los medios de cultivo que se utilizarán para sembrar distintos M.O.O. siempre es necesario asegurarse de trabajar en el radio cercano al mechero encendido para minimizar el riesgo de contaminación de los medios de cultivo o materiales en general. zona de trabajo y seguridad en el ambiente del laboratorio (1). De acuerdo al propósito experimental y características del M.O. Luego de haberse realizado la siembra e incubación de la placa.O. estos medios pueden ser selectivos y contener indicadores que reflejen propiedades exclusivas para cada M. Deben eliminarse los factores de riesgo comunitarios y personales procediendo cuidadosamente con los implementos y utilizando indumentaria de vestimenta adecuada. es necesario comprender la utilidad. Cuando se tiene conocimiento y pericia sobre el manejo correcto de los utensilios del laboratorio.O. Cuando ya se ha descrito el M. sembrado de manera macroscópica. que se encuentran en ella. Para conseguir este objetivo es necesario manejar conceptos de esterilización de material. se subdividen en medios sólidos. Para este propósito primero se observó distintas placas de preparados previos y se describió su forma y características macroscópicas. que se alojarán en ellos.O. semisólidos y líquidos (3). Para lograr lo anterior se debe seguir un método de siembra que permita conseguir este objetivo.Introducción y objetivos Los procedimientos en el laboratorio de microbiología deben ser realizados con precaución y rigurosidad para que se obtengan resultados experimentales confiables.O. En su generalidad. 2 . los medios de cultivos contienen sustancias que son nutritivas para los M. Con respecto al manejo de los materiales de laboratorio. También debe esterilizarse el material (2) mediante procedimientos como el flameado de las tapas y bordes de tubos de ensayo además de las asas metálicas utilizadas para la inoculación y siembra de los microorganismos (M. a cultivar. desde una población heterogénea. O. Para complementar el conocimiento sobre la microbiota normal y ambiental. entender y aplicar conceptos de esterilización de materiales. y poder emplear pruebas para determinar características macro y microscópicas de los M. Los objetivos que se han propuesto para estas tres experiencias de laboratorio fueron en orden de realización los siguientes.Las pruebas de tinción (4) permiten diferenciar a las bacterias según su clasificación Gram (positivo o negativo). aislar y sembrar M. su formación de esporas o su presencia de cápsula bacteriana. 3 . Poder familiarizarse con el material de laboratorio de microbiología y comprender sus aplicaciones. En el caso de las experiencias prácticas realizadas. se tomaron muestras de distintas partes inclusive del cuerpo.O. Se sembraron e incubaron para luego poder describir sus características con los métodos aprendidos en los pasos prácticos 1 y 2. el trabajo fue enfocado hacia la diferenciación por carácter Gram. (b) siembra de medio líquido a sólido en agar MacConkey de E.Asas de platino para siembra. coli y (c) siembra de medio líquido a sólido en agar sangre de S.Tubo de ensayo con caldo corriente. . cereus.Tubo de ensayo con cultivo de B.Placas de agar MacConkey. coli. .Microscopio. aureus.Set de placas Petri con cultivos bacterianos.Placas de agar sangre.Placas de agar corriente.Tubo de ensayo con agar semitendido. Métodos: 1) Se realizó una esterilización de los materiales de laboratorio que se utilizaron de acuerdo a las indicaciones de la guía de laboratorio.Mechero bunsen. . 3) Se observó distintas placas Petri de preparados previos utilizando los microscopios disponibles en los mesones y empleando el objetivo 100x con el aceite de inmersión tal como se detalla en la guía de laboratorio para posteriormente anotar las características de forma y agrupación de cada una de ellas. grupo. . . sembrado. . . ayudante y M. . . aureus. . coli. . 4 .Aceite de inmersión. . Práctico 1: “Procedimientos básicos” Materiales y reactivos: .Tubo de ensayo con cultivo de E. Luego de sembradas.O.Pipetas Pasteur.Materiales y métodos Los materiales y métodos a continuación se detallan de acuerdo al práctico que correspondan de manera correlativa. operador. . las placas fueron etiquetadas con sus respectivos indicadores de fecha.Tubo de ensayo con cultivo de S.Marcador permanente. Las siembras se realizaron de acuerdo a los procedimientos indicados en la guía de laboratorio y se empleó el método de la siembra en zig-zag. 2) Se practicó la siembra de: (a) medio líquido a sólido en agar normal de E. . Las muestras fueron tomadas de acuerdo a los procedimientos detallados en la guía de laboratorio (9) y consistieron en las siguientes: (a) Nasofaríngea en agar sangre.Placa de agar normal con siembra de E. . (d) Boca en agar normal y (e) Nasofaríngea en agar normal. 2) Se realizó una descripción microscópica de las placas sembradas en el práctico 1. . se registraron sus características (forma.Práctico 2: “Morfología bacteriana: análisis macroscópico y microscópico” Materiales y reactivos: . . (b) Nasal en agar sangre.Aceite de inmersión.Placa de agar MacConkey con siembra de E. alcohol-acetona y safranina. lugol.Asas de platino. coli del práctico anterior. 4) Se tomaron muestras de microbiota normal y ambiental.Mechero Bunsen. sangre y MacConkey.Portaobjetos. . . coli del práctico anterior. Todas las muestras fueron etiquetadas correctamente e incubadas para su posterior análisis en el práctico n°3. aureus del práctico anterior.Cultivo S. . También se realizó una tinción de cápsula para S.Marcador permanente.Placas de agar normal. Métodos: 1) Se realizó una descripción macroscópica de las siembras realizadas en el práctico 1. pneumoniae.Microscopio. . agrupación y respuesta a la tinción). .Set para tinción Gram: cristal violeta. .Placa de agar Sangre con siembra de S. 5 . practicándoseles luego la técnica de tinción de Gram detallada en la guía de laboratorio. . . (c) Uña. ocular del microscopio y nasofaríngea en agar MacConkey. 3) Se practicó la tinción de espora a una muestra de B. Todas estas tinciones se realizaron de acuerdo a los procedimientos de la guía de laboratorio.Clips de madera.Set para tinción de cápsula: tinta china y safranina.Set para tinción de esporas: verde de malaquita y safranina.Set estéril de bastoncillos para toma de muestras. pneumoniae observándose luego en el microscopio. . . . cereus y se observó su detalle microscópico. . . alcohol-acetona. Esta prueba se practicó para la muestra Nasofaríngea en agar sangre.Microscopio. se está considerando lo indicado en el elemento bibliográfico que corresponde al ítem 1.Clip de madera.Set para prueba de coagulasa. Se describieron de manera detallada según los parámetros indicados en la guía de trabajos prácticos.Placas con siembra del práctico 2.Portaobjetos. 2) Se realizó test de identificación para M. 3) Se realizó test de identificación para M. .Muestras problema a identificar (8 y 9). Métodos: 1) Se realizó un análisis macroscópico de los cultivos realizados para la microbiota normal y ambiental previamente incubados del práctico n°2.Pipetas Pasteur.Práctico 3: “Microbiota normal y ambiental” Materiales y reactivos: . .O. . Nota importante: Cada vez que se hace referencia en la sección de materiales y métodos a los procedimientos realizados según la guía de laboratorio o prácticos. . . . Gram positivo con sus respectivas pruebas de catalasa y coagulasa tal como se especifica en la guía de procedimientos del laboratorio.O. Gram negativos sembrando la muestra problema 9 en la batería bioquímica estándar y en el test API 10S con cuidado de seguir las instrucciones de la guía de laboratorio.Aceite de inmersión. . .Mechero Bunsen.Set para tinción Gram: cristal violeta. . . .Asas de platino.Batería de identificación bioquímica estándar. 6 . lugol y safranina.Set API 10S. etiquetadas según su contenido. .Set para prueba de catalasa. coli Mezcla Gram (+) y (-) S. liso Ondulada Superficie Lisa Lisa Rugosa Otras caract. cereus K. aureus Forma Cocos-bacilos Streptococcus Resultado tinción gram Gram (-) Gram (+) (+ = positivo. con su clasificación. Tinción Observación microscópica Espora En su mayoría localización terminal Cápsula Difícil observación 7 . . Microorganismo E. aureus C. Para el práctico n°2. coli E. Tabla 3: análisis microscópico de las siembras del práctico n° analizadas en el práctico n°2. coli S. coli S. se resumen en la siguiente tabla las observaciones macroscópicas de los cultivos sembrados. aureus Medio de cultivo Agar normal Agar MacConkey Agar sangre Forma Circular Circular irregular Irregular. Tabla 1: análisis microscópico de las muestras proporcionadas en el práctico n°1.= características) Los resultados de la tinción de Gram para las colonias sembradas en el práctico n°1 y analizados a través del microscopio en el práctico n°2 se resumen en la siguiente tabla. Cepa E. Tabla 2: análisis macroscópico de las siembras del práctico n°1 analizadas en el práctico n°2. Lechosa Opaca Opaca Microorganismos analizados según sus características macroscópicas.= negativo). neumonae Morfología Bacilo Bacilo y cocáceas Staphylococcus Cocácea en tétrada Cocácea en cadena Bacilo Bacilo Otras características Gram (-) Gram (-) y (+) Gram (+) Gram (+). (caract. Tabla 4: análisis microscópico de visualización para tipo de tinciones específicas de cápsula bacteriana y esporas. violeta. glabrata Cocacea Strepto B. . fusiforme Elevación Levantada Plana Convexa Borde Liso Dentado.Resultados Los resultados para el práctico n°1 de análisis microscópico de muestras entregadas se encuentran resumidos en la siguiente tabla.= negativo) Para las pruebas de tinción de esporas y cápsulas del práctico n°1 los resultados fueron los siguientes para su observación macroscópica. (+ = positivo. N° de placa 102 103 105 106 107 109 110 Microorganismo E. Gram (+) Gram (+) Gram (-) Observaciones microscópicas de muestras preparadas. con su respectivo medio de cultivo. (N/C = no se aprecia cultivo o características).Los resultados del análisis macroscópico de las siembras de microbiota normal y corporal se resumen en la siguiente tabla. Cultivo Nasofaríngea Tipo de agar sangre Test realizado Catalasa Coagulasa Hemólisis Resultado Positivo Negativo Positivo tipo Beta Cultivo de la zona nasofaríngea en su medio de siembra y sus respectivos resultados para las pruebas de catalasa. Cultivo Boca Nasofaríngea Tipo de agar Normal Sangre Tinción gram Gram (-) Gram (+) (+ = positivo. . Tabla 7: Resultados de tests para muestra Gram positiva sometida a prueba de catalasa. con hemólisis N/C N/C N/C Color blanco translúcido Colo blanco opaco Cultivo realizado y sus características macroscópicas relevantes.= negativo) Para las pruebas de catalasa y coagulasa sobre la cepa Gram positivo se obtuvieron los siguientes resultados. Los resultados de tinción para las muestras de microbiota normal y ambiental según carácter Gram se verifican en la siguiente tabla. coagulasa y hemólisis. Tabla 5: Descripción macroscópica de características para los cultivos realizados en el práctico n°2 de microbiota ambiental y normal. observados en el práctico n°3. Tabla 6: carácter Gram para cultivos seleccionados de microbiota normal y ambiental. 8 . Cultivo (zona) Tipo de agar Nasofaríngea Sangre Nasal Sangre Uña MacConkey Ocular microscopio MacConkey Boca MacConkey Boca Normal Nasofaríngea Normal Forma Irregular circular N/C N/C N/C Circular Circular Elevación levantada levantada N/C N/C N/C levantada / plana Plana borde ondulado liso N/C N/C N/C liso Liso superficie rugosa lisa N/C N/C N/C lisa lisa Otras características Brillante. resumidos en la tabla a continuación. coagulasa y hemólisis. con hemólisis Opaco. Discusión Con respecto a la primera parte del práctico n°1. Aquellas bacterias que presentan una capa gruesa de peptidoglicán y carecen de membrana externa se les llaman Gram positivas y a las que poseen membrana externa teniendo una delgada capa de peptidoglicán se les llama Gram negativas. y efectivamente resultaron coincidentes con lo presupuestado. esto se debe a que se tomó simplemente como propósito de análisis las placas que fueron sembradas por cada operario sin intervenir en las de los demás. ya que se observaron ciertos impedimentos que dificultaron la descripción morfológica de los preparados. por este motivo es que no se encuentran todas las que se utilizaron descritas en los procedimientos y metodología de los prácticos. aureus se puede aseverar que su crecimiento fue satisfactorio en agar sangre pues esta bacteria crece mejor en medios poco selectivos pero nutritivos (6) y en especial en este tipo de agar seleccionado. Si bien la cantidad de placas analizadas no corresponde al total de las que habían en la mesa. Para el S. coli pudo presentar una diferencia en cuanto a su caracterización debido a que el Agar de tipo MacConkey es más adecuado para cultivar este tipo de bacteria (5) en comparación con el agar normal. es necesario recalcar que el uso de los agares para E. es necesario recordar que para teñir esporas no se puede utilizar la tinción de Gram (9) y para este procedimiento se puede afirmar que la tinción de la cápsula fue muy poco afortunada ya que se utilizó demasiado verde de malaquita y esto derivó en una observación defectuosa. coli y S. Con relación al uso de la tinción de Gram. para la caracterización microscópica presentaba algunos problemas de visualización al momento de su observación. Para el procedimiento relacionado con la siembra descrita por la Tabla 2. se debe aclarar que se tomaron de forma arbitraria las cepas de E. aureus porque se conocía su caracterización Gram (8). Con respecto a los resultados proporcionados por la Tabla 4. El fundamento de la tinción Gram se basa en que no hay fijación del cristal violeta en la membrana de las Gram negativas. 9 . Lo anterior probablemente se debió a una incorrecta preparación de las tinciones. se puede decir que este método sirve para determinar la estructura y grosor de la pared bacteriana (7). se puede afirmar que el set de placas disponibles de la Tabla 1. En relación a los resultados obtenidos que son presentados en la Tabla 3. aureus (10). El test de la catalasa que se fundamenta en la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. Esto puede deberse principalmente a la características intrínsecas del agar MacConkey. El crecimiento de las bacterias en agar sangre de acuerdo a la Tabla 5. Con respecto a las bacterias Gram positivo de la zona nasofaríngea se puede respaldar esta observación con el hecho que un gran número de Streptococcus habitan esta zona y ellos son del tipo Gram positivo (18). tiene por objetivo diferenciar la familia de los Micrococos de los Streptococcus (19). al igual que las del género Neisserias que habitan este ambiente (17). Al interpretar los resultados de la Tabla 6. en particular S. ya que este agar es de tipo no selectivo y altamente nutritivo (15). En el caso de la Boca (orofaringe) y de la nasofaringe se pueden encontrar bacterias del género Streptococcus. Esto se puede relacionar con la flora microbiana de la boca que contiene un gran número de bacterias del género Fusobacterium que resultan ser Gram negativas (16). En el caso de la zona de la mucosa nasal se pueden encontrar en su mayoría bacterias del género Staphylococcus. que es un medio altamente selectivo y diferencial eficiente para bacterias fermentadoras de lactosa (14) que no se encontrarían presentes en las muestras que fueron seleccionadas para crecer en este medio. se puede apreciar que el contenido mayoritario de bacterias del cultivo bucal corresponde a la clasificación Gram negativo luego de su tinción. Neisserias comensales y Fusobacterias anaeróbicas (12). En las siembras realizadas en agar MacConkey se presencia un fenómeno particular: No hay crecimiento para ninguno de los cultivos realizados que se detallan en la Tabla 5. para la piel también se encuentran Staphylococcus. epidermidis (11). resulta satisfactorio pues se cultivaron zonas nasales y nasofaríngeas que contienen en su mayoría microorganismos del género Staphylococcus que crecen de manera favorable en este tipo de agar (13). 10 .Para discutir los resultados relativos a la Tabla 5 es necesario considerar la población bacteriana de cada una de las zonas que se tomaron como representativas de flora bacteriana normal. Con relación a la Tabla 7 que representa los tests realizados al cultivo nasofaríngeo Gram positivo se puede hacer las siguientes observaciones. Para las muestras realizadas en agar normal no representa mayor sorpresa que se hayan desarrollado los cultivos que fueron sembrados. en especial S. Para el test de la coagulasa. que se condice con características de su género (21). Finalmente se pudieron realizar de manera efectiva baterías de pruebas bioquímicas y su comprensión mediante los fundamentos biológicos que las sustentan. Finalmente. La prueba fue realizada dos veces para evitar un falso positivo. También se pudo conseguir adquirir técnicas de esterilización de manera satisfactoria al igual que practicar la siembra y aislamiento de microorganismos. Esto podría evidenciar que realmente se trata de una bacteria del tipo Staphylococcus. Esto sugiere que se trataría de algún tipo de Staphylococcus coagulasa negativo. que se fundamenta en la capacidad de los microorganismos para coagular el plasma por acción de la enzima coagulasa (20) se observó que la muestra dio negativo. Conclusiones Con respecto a los objetivos se puede afirmar que se cumplieron a cabalidad en cuanto a la familiarización y comprensión de los materiales de laboratorio. no se evidenciaron sus resultados puesto que se completó la batería de pruebas para las muestras problema 8 y 9 pero se llevaron a incubar por los ayudantes. se observó que la placa mostraba hemólisis del tipo beta.En este caso dio positivo ya que se presenció la producción de burbujas y por lo tanto cabe pensar que la presencia de una bacteria del tipo Staphylococcus. En cuanto a la realización del test API 10S. 11 . Editorial Médica Panamericana.. 6) “Infecciones producidas por Staphylococcus aureus”. 3°Ed.. Pág. 273. Editorial Reverté S.. 79. Editorial Médica Panamericana. 20.. Pontificia Universidad Católica de Chile.168. II”. 10). Pág. Año 2002. A. 1°Ed. Pág. 2014. Pág. M. Año 2003. Pág. 64. 25. 13) Referencia 6... Editorial Elsevier Mosby. Pág. 5. 255. Pág. Pág. Prats. Dworkin. Pág. Año 2006. 11) Y 12) Referencia 5. 7) “Bacteriología general: Principios y prácticas de laboratorio”.. Año 2009. 4) Referencia 3. 20) “Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica”. 15) “Técnico especialista en laboratorio de atención primaria Vol. 276. 244. Winn. Pág. 9°Ed. 1°Ed.A. . Pág. 1383.. Editorial Médica Panamericana. 3) “Introducción a la microbiología”. Pág.”.. 2°Ed. P. Editorial Universidad Autónoma de Ciudad de Juárez. M. Pág. Editorial Médica Panamericana. Año 2007. Editorial Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. 2) “Microbiología médica”. H. R. Año 2009. Rodríguez. 3°Ed. 2°Ed. 292.. 14) Referencia 7. 1016. 63. 88. G. 17) “Laboratory diagnosis of infectious diseases: essentials of diagnostic microbiology”. Pág. Año 2006. 18) “Microbiología”. 9) “Diagnóstico Microbiológico: Texto y Atlas en color. Hernández-Chavarría F. Editorial Universidad Estatal a Distancia. Año 2004.. Pág.. Año 2006. Stanier.P. 16) “The Prokaryotes: Vol. Editorial Universidad de Costa Rica.. 20. 7: Proteobacteria: Delta and Epsilon Subclasses”.J. 6°Ed.. Editorial Mad SL. Editorial Springer NY. . 1°Ed. Pág. Engelkirk. 12 . pág.Bibliografía 1) “Guía de trabajos prácticos” Biología de Microorganismos. MacFaddin J. Tortora G. 6°Ed. Silva. Murray. 8)” Fundamentos de epidemiología: El arte detectivesco de la investigación epidemiológica”. Año 2007. 171. Olivas. 134. 1°Ed.. 21) “Manual de prácticas de Microbiología I y II y Parasitología”. pág. 19) Referencia 9. Año 2005. 1°Ed.. 1°Ed. Año 2007.. Pahissa. E. E.. 5) “Microbiología clínica”. Año 1992... Editorial Marge.