RESUMENLa presente practica tiene como finalidad e estudio de la acción de enzimas, pues las enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza proteica, que hace posible que las reacciones biológicas se llevan a cabo a velocidad útil apreciable, por lo cual se pretende hacer una comparación de la a-amilasa de la saliva y del ácido clorhídrico sobre la reacción de hidrolisis del almidón y evaluar los resultados obtenidos. 1 INTRODUCCIÓN Enzima Con excepción de un pequeño grupo de moléculas de RNA catalítico, todos los enzimas son proteínas. Su actividad catalítica depende de la integridad de su conformación proteica nativa. Si se desnaturaliza o disocia un enzima en sus subunidades, se suele perder la actividad catalítica. Si se descompone un enzima en sus aminoácidos constituyentes, siempre se destruye su actividad catalítica. Así, las estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas enzimáticas son esenciales para su actividad catalítica. Los enzimas al igual que otras proteínas, tienen masas moleculares que van desde unos 12.000 hasta más de 1 millón. Algunos enzimas no requieren para su actividad más grupos químicos que sus residuos aminoácidos. Otros requieren un componente químico adicional llamado cofactor. El cofactor puede ser uno o varios iones inorgánicos o una molécula orgánica metalo-orgánica compleja denominada coenzima, tal y como se muestran en la siguiente tabla Algunos elementos inorgánica que actúan como cofactores por enzimáticos Cu2+ Citocromo oxidasa Fe2+ o Fe3+ Citocromo oxidasa, catalasa, peroxidasa, K+ Piruvato quinasa Mg 2+ Hexoquinasa, glucosa 6-fosfatasa, piruvato quinasa Mn2+ Arginasa, ribonucleótido reductasa Mo2+ Dinitrogenasa Ni 2+ Ureasa Se Glutatión peroxidasa Zn2+ Carbónica anhidrasa, alcohol deshidrogenasa, carboxipeptidasas A y B Algunos coenzimas que actúan como portadores transitorios de átomos o grupos funcionales Coenzima Ejemplos de grupos Precursor en la dieta para los químicos transferidos mamíferos Biocitina CO2 Biotina Coenzima A Grupos acilo Ácido pantoténico y otras moléculas 5’-Desoxiadenosilcobalamina Átomo de H y grupos Vitamina B12 (coenzima B12) alquilo Flavina adenina dinucleótico Electrones Riboflavina (Vitamina B2) (FAD) Lipoato Electrones y grupos No se requiere en la dieta acilo Nicotinamida adenina Ión hidruro (:H-) Ácido nicotínico (niacina) dinucleótido (NAD) Piridoxal fosfato Grupos amino Piridoxina (Vitamina B6) Tatrahidrofolato Grupos Folato monocarbonados Tiamina pirofosfato Aldehidos Tiamina (Vitamina B1) 2 Algunos enzimas requieren tanto una coenzima como uno o más iones metálicos para su actividad. Un coenzima o ión metálico unido covalentemente o de manera muy fuerte a la proteína enzimática se denomina grupo prostético. Un enzima completo catalíticamente activo junto con su coenzima y/o iones metálicos se denomina holoenzima. La parte proteica de tal enzima se denomina apoenzima o apoproteina. Los coenzimas actúan como transportadores transitorios de grupos funcionales específicos. La mayoría de ellos son derivados de las vitaminas, nutrientes orgánicos requeridos en pequeñas cantidades en la dieta. Finalmente, algunos enzimas son modificados covalentemente por fosforilación, glucosilación y otros procesos. Gran parte de estas alteraciones intervienen en la regulación de la actividad enzimática. La característica más sobresaliente de los enzimas es su elevada especificidad. Esta es doble y explica que no se formen subproductos: 1. Especificidad de sustrato. El sustrato (S) es la molécula sobre la que el enzima ejerce su acción catalítica. 2. Especificidad de acción. Cada reacción está catalizada por un enzima específico. La acción enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que representa el estado de transición. El sustrato se une al enzima a través de numerosas interacciones débiles como son: puentes de hidrógeno, electrostáticos, hidrófobos, etc., en un lugar específico, el centro activo. Este centro es una pequeña porción del enzima, constituido por una serie de aminoácidos que interaccionan con el sustrato. Algunas enzimas actúan con la ayuda de estructuras no proteicas. En función de su naturaleza se denominan: 1. Cofactor. Cuando se trata de iones o moléculas inorgánicas. 2. Coenzima. Cuando es una molécula orgánica. Aquí se puede señalar, que muchas vitaminas funcionan como coenzimas; y realmente las deficiencias producidas por la falta de vitaminas responde más bien a que no se puede sintetizar un determinado enzima en el que la 3 vitamina es el coenzima. Hidrólisis de polisacáridos Los polisacáridos en medio ácidos se descomponen en sus residuos de monosacáridos, los cuales pueden presentarse en diferentes formas y tamaños. La hidrólisis consiste en la ruptura de los enlaces glucosídicos. Prueba de Lugol o de almidón-yodo La prueba del yodo, es decir, la reacción entre el yodo y el almidón, es la que nos permite detectar la presencia de almidón en algunos alimentos. Esta reacción es el resultado de la formación de cadenas de poli yoduro (generalmente triyoduro, I3–) que se enlazan con el almidón en las hélices del polímero. En concreto, es la amilosa del almidón la que se une a las moléculas de yodo, formando un color azul oscuro, a veces prácticamente negro. La amilopectina no reacciona apenas con el yodo. 4 REACCION QUIMICA HIDROLISIS DEL ALMIDON USANDO AMILASA COMO CATALIZADOR PRUEBA DE FEHLING 5 DETALLES EXPERIMENTALES Se tomó tres tubos de ensayo; al primero agregar 1mL de agua, al segundo – 1mL de ácido clorhídrico, al tercero -1 mL de saliva diluida. Se añadió a todas las muestras 3mL de almidón, Se mezcló con bagueta y agua hirviendo. Después se 15 minutos se enfrió los tubos. De cada tubo de ensayo se toman 5 gotas y se colocan en otros tubos de ensayo, se les añaden 2 gotas de solución de yodo y se comparan la coloración de las muestras. Fig. : Se observa las diferentes tonalidades en los colores obtenidos por la reacción Para la determinación de la maltosa, se tomó 3 gotas de cada tubo de ensayo, se le agregan 1mL del reactivo de Fehling y se calentó la capa superior de la mezcla hasta la ebullición. 6 Fig. : Se observa el precipitado rojo de óxido de cobre (I) 7 RESULTADOS EXPERIMENTALES. SUSTRATO DE LA PRODUCTO DE LA CATALIZADOR RESULTADO REACCION REACCIÓN a-Amilasa Almidón Complejo color azul Se observó la con solución de Iodo coloración azul Discusión de resultados En el tubo que se agregó lugol que contenía la alfa-amilasa salió un color azul oscuro que explica que la hidrolisis del almidón no es tan rápida o debido a que la amilasa desdobla al almidón a alfa dextrinas y luego hasta maltosa (predominan más las alfa dextrinas), pero también puede ser debido a que en la saliva no había tanta concentración de esta. A diferencia del tubo que contenía alfa-amilasa en el tubo que contenía HCl ya no daba coloración azul del complejo yodo-almidón, debido a que la hidrolisis del almidón se dio en mayor proporción o casi en su totalidad. A la hora de usar el reactivo de fehling y calentarlos se notó en los tres tubos una precipitación oscura media rojiza, debido a la precipitación del óxido de cobre, que se da por la reducción del Cu +2 por la acción reductora de la maltosa producida por la hidrolisis del almidón. 8 CONCLUSIONES Las reacciones catalizadas por la enzima α-amilasa es mucho mas rápido,especifico y efectivo que las correspondientes reacciones catalizada por el acido clorhidrico. la α-amilasa cataliza la hidrólisis rápida y ordenada de enlaces internos α (1-4) y no hidroliza los enlaces α (1-6).,demostrando así su especificidad El producto final de la degradación por hidrólisis del almidónes la maltosa, el cual fue reconocido por le reactivo de fehling. La temperatura efectiva de la α-amilasa es de 37oC,su actividad catalitica es maxima en esa tenperatura. Recomendaciones La solución de fehing que se prepare, las dos soluciones de CuSO4 y tartrato de Na y K y NaOH deben estar separadas hasta que se realice la prueba. El almidón que se prepare debe ser colocado en el refrigerador No es necesario gastar mucho reactivo preparando las cantidades que dice la guía sino que se puede prepararlas en menor cantidad haciendo una simple proporción. Al momento de preparar la solución saliva, se debe evitar tener residuos de comida en la boca que pueden interferir en los resultados. 9 BIBLIOGRAFIA Lehninger. Principios de Bioquímica, 4ta Edición. David L. Nelson y Michael M. Cox. Ediciones Omega, S.A. 2006. Páginas 190 – 193 Enciclopedia de la Ciencia y la Técnica. Editorial Océano. 1982. Página 180. Química Orgánica. 5ta Edición.L.G. Wade, Jr. Editorial Pearson Prentice Hall. 2004. Páginas 1096 y 1097 Guía para el Análisis de los Compuestos del Carbono. S. Gibaja Oviedo. Editiorial UNMSM. 1977. Páginas 71 y 72. 10