MÓDULO 5CROMATOGRAFÍA PROFESOR ELISEO AVELLA MORENO GRUPO 4 Lady Viviana Carreño 25151537 Jessika Andrea Arguello 1052397301 UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA LABORATORIO DE QUÍMICA ORGÁNICA I BOGOTA D.C 2014 OBJETIVOS - Separar los componentes de mezclas binarias o ternarias de compuestos coloreados o de compuestos incoloros, mediante cromatografía en capa delgada de fase normal y analizar el comportamiento de separación, en función de las características de los solutos y de las fases móvil y estacionaria. - Calcular valores de Rf de varias sustancias y correlacionarlo a la selección adecuada del eluyente y deducir la relación que existe entre la polaridad de las sustancias que se analizan y la de los eluyentes utilizados. - Comprender el funcionamiento y características de una cromatografía en columna mediante la separación de los componentes de una mezcla binaria. INTRODUCCIÓN La técnica de cromatografía se basa en el principio general de distribución de un compuesto entre dos fases, una fase fija y la otra móvil. Se le puede ver como la remoción selectiva de los componentes de una mezcla por acción de la fase móvil que fluye a través de la fase estacionaria donde se encuentran. Esta técnica se emplea no solo para separar los componentes de una mezcla, sino también como criterio de pureza e identificación bajo ciertas circunstancias. MARCO TEÓRICO SECCIÓN EXPERIMENTAL Cromatografía en capa delgada (CCD) En este caso se utiliza una placa recubierta con fase estacionaria manteniendo un pequeño espesor constante a lo largo de la placa. El solvente ascenderá, por capilaridad, por la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta produciendo "manchas" de los componentes de una mezcla. En la cromatografía en capa delgada, el grado de elución de las sustancias depende tanto de su propia polaridad como de la polaridad del solvente utilizado y de las características de la fase estacionaria. Para la preparación de una placa cromatográfica, en una fina placa de cristal o portaobjetos se gotearon 10 gotas de silica gel disuelta en agua y se extendió a lo largo de esta, procurando cubrir muy bien toda la placa, y que sea uniforme el grosor de la capa de silica gel. Ensayos para la selección de la fase móvil Se realizaron algunas siembras en la placa, y posterior a esto se le aplicaron diferentes disolventes, como fue éter de petróleo, metanol, acetato de etilo, con el fin de observar a grandes rasgos el poder de elusión de cada uno de estos, en estado puro. Fig 1. Ensayos de selección de la fase móvil. Luego de observar que el éter de petróleo no presentaba poder de elusión alguno, y que por el contrario el acetato de etilo tenía un poder de elusión muy alto, se procedió a realizar mezclas de estos dos, en diferentes proporciones, con el objetivo de encontrar una proporción adecuada, y con esto obtener una resolución óptima de los componentes de la mezcla. Fig.2 Cromatografía en capa delgada e inactiva de con diferentes proporciones de la fase móvil. El montaje, como se observa en la imagen, se realizó mediante los componentes del sistema cromatográfico, estos son la cámara cromatografica, la fase móvil (disolvente), la fase estacionaria (la placa); una vez se realizaron las siembras de la muestra en la placa, con un capilar, y habiendo puesto a saturar de disolvente la cámara cromatografica (con anterioridad ), siendo de ayuda para esto un trozo de papel filtro y aislando este ambiente , se introdujo luego con cuidado la placa dentro de la cámara, que contenía la fase móvil y que estaba ya saturada, así con precaución de no mover el sistema y no perturbar el ascenso de la fase móvil por la fase estacionaria Según lo anterior, y como podemos observar en la figura #2 en la placa 2 se logró una mejor resolución, lo que fue evidenciado por la distancia entre las manchas , siendo la diferencia entre el Rf de la mancha roja y el Rf de la mancha amarilla apreciablemente grande, esta placa, tenía una proporción de 8:2 éter de petróleo, y acetato de etilo respectivamente; de esta manera, mediante la pruebas con diferentes proporciones se escogió una, la cual se usaría posteriormente para cromatografía en columna. Cromatografía de mezcla incolora La cromatografía de mezcla incolora se realizó siguiendo el procedimiento descrito para colorantes activos con una mezcla de 3 componentes, con la única diferencia que luego de que el solvente llega al frente de solvente adecuado, fue necesario hacer un revelado con lámpara de luz ultravioleta y en cámara de Iodo. Luego como criterio de identificación del orden de los componentes, se comparó con la cromatografía de una muestra pura de uno de los colorantes. Placa activada La sílice activada, cuando se expone al aire adsorbe agua y de esta forma pierde gran parte de su actividad. Aunque esta sílice desactivada puede ser adecuada para solutos polares que tienden a sorberse fuertemente, en la mayoría de casos no es el sustrato cromatográfico más efectivo; por esto en la práctica se hizo un ensayo aparte, con la proporción que fue considerada conveniente, y teniendo la placa con anterioridad en una estufa, donde se activaría, el procedimiento fue muy parecido solo que con la precaución de realizar las siembras en el menor tiempo posible para introducir la placa en la cámara cromatografica, antes de que se adsorbiera agua del ambiente con la placa. Cromatografía en columna Luego de haber escogido la mezcla con la que se obtiene una mejor resolución de los componentes de la mezcla, con esta misma y sabiendo el poder de elusión con cada colorantes, se procede a realizar la cromatografía en columna Fig. 3. Cromatografía en capa delgada con placa activada. Preparación de la columna: Primero se pone una mota de algodón en la salida de la columna de cromatografía, para evitar el paso de residuos de Silica gel (fase estacionaria) hacia el robinete o llave de control de la salida del líquido. Con todos los materiales bien secos, medimos la cantidad de sílica con la que se llena la mitad la columna de cromatografía y la cantidad de mezcla de éter y acetato para cubrir la columna hasta un poco más de la mitad de su altura; En un vaso de precipitado se mezcló muy bien con ayuda de un agitador la silica y la mezcla de solventes, y rápidamente se procede a llenar la columna con la mezcla. Luego de eso se observó que en el vaso de precipitado quedan trazas de sílice con solvente y en las paredes de la columna, con un poco del mismo solvente utilizado para llenar la columna se arrastran estos residuos. Siembra de la muestra y se deja correr el solvente, a la columna lista se le agrega solvente hasta que quede 1 cm por encima de la arena, luego se agregó la mezcla en polvo a separar con cuidado, y se dejó correr el solvente hasta que los colorantes empezaron a verse sobre la sílica, se puso otra mota de algodón sobre la silica para evitar que la presión del solvente afecte la separación y se agregó solvente hasta llenar completamente la columna y se dejó correr ahora si la cromatografía, cuidando de mantener el nivel de solvente igual hasta el final de la cromatografía. Fig. 4 Montaje cromatografía en columna DATOS Y RESULTADOS Los colorantes que constituían la mezcla fueron: . Sudan III (rojo) m-nitroanilina (amarillo) Para la selección de la fase móvil se realizó la cromatografía para dicha mezcla con las siguientes mezclas de Éter de petróleo y acetato de etilo en las siguientes proporciones, a las que se les calculó su respectivo Rf para cada colorante, (mancha amarilla(A) y roja(R)) Mezcla Composición Índice de retención (Rf) 1 50:50 A 0,12 R 0,36 2 80:20 A 0,10 R 0,38 3 70:30 A 0,31 R 0,50 4 60:40 A 0.05 R 0,52 Tabla 1. Mezclas de Éter y acetato de etilo utilizadas en la selección de la fase móvil. Mezcla Incolora La mezcla estaba compuesta por ß - Naftol Benzoato de etilo Para aminoacetofenona El revelado con luz ultravioleta se realizó con dos longitudes de onda, una de mayor energía de 254 nm y otra de 360 nm obteniendo los siguientes valores de Rf. Placa Nº 1 Mancha 1: 0,21 2: 0,45 3: 0,63 Placa Nº 2 Mancha 1: 0,10 2: 0,33 3: 0,57 Fig. 5 Revelado cromatografía con mezcla incolora Placa Nº 1 7:3 Placa Nº 2 8:2 azul 360nm 2 2 verde 564nm 3 3 Tabla 2. Resultado revelado con luz ultravioleta. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA El resultado de la cromatografía en columna fueron 8 fracciones, a las cuales se les realizó CCD para corroborar si fue efectiva la separación de los colorantes. En la fracción N° 6 se encontró aún la presencia de ambos componentes de la mezcla inicial. Fig. 6 Fracciones resultantes de la cromatografía en columna ANÁLISIS - Como podemos ver en las placas se observó mejor resolución con la mezcla de éter de petróleo y acetato de etilo 7:3, ya que se separan de manera adecuada las manchas de los componentes y ninguna queda retenida, esta fue la mezcla escogida para separar en la columna, con una cromatografía isocrática. - La identificación del orden de los componentes en la cromatografía se realizó a partir de las estructuras y la manera en que podían interactuar con la fase estacionaria, con esto se propuso la siguiente hipótesis: Como la para aminoacetofenona tiene un grupo donor de puentes de hidrógeno (CH3 O) y uno aceptor de puentes de hidrógeno (NH2) se concluyó que teniendo dos extremos capaces de enlazarse mediante puentes de hidrógeno. Este podía ser retenido con más fuerza por la fase estacionaria. Enseguida se consideró la capacidad de hacer puentes de hidrógeno entre el b- naftol y el benzoato de etilo, y ya que el primero contiene un enlace O-H capaz de interaccionar fuertemente con la estructura de la silica a través de puentes de hidrogeno, se determina que este compuesto (B-naftol) será el segundo en retenerse más por la fase estacionaria, y por último, el benzoato de etilo el cual debe tener por lo tanto un Rf mayor. Fig. 7 Placa con muestra de la mezcla en paralelo con el patrón indicado. Como se puede observar en la figura 7 se realizaron dos siembra en la placa, una de la mezcla de compuestos, y la otra del patrón que se requirió, el cual fue B- naftol; según la hipótesis formulada, el patrón debía quedar continuo en la placa, con la segunda mancha, es decir sus Rf debían ser iguales; se comprobó efectivamente que, el desplazamiento de los compuestos en la placa obedecían a las interacciones entre estos dos componentes, la silica gel de carácter polar, y cada uno de los compuestos de la mezcla, según sus capacidades de formar puentes de hidrógeno con la sílica. Rf patrón: 0,292 Rf componente mezcla: 0,292 - La CCD de las fracciones resultantes de la cromatografía en columna mostraron pureza de las fracciones 2,3, 4 y 5 de Sudan III de color Rojo (Dato registrado en literatura) y 7 y 8 de m-nitroanilina de color amarillo, mientras que la fracción 6 aún contenia trazas de ambos compuestos. con esto se concluyo que una cromatografía isotropica no era la más conveniente para separar esta mezcla, volviendo a los resultados obtenidos en la CCD inicial, se observa que la mezcla 8:2 deja buena resolución de los componentes pero la m-nitroanilina es retenida por la fase estacionaria, con base en esto se propone una cromatografía en columna en gradiente, con una mezcla de éter de petróleo y acetato de etilo 8:2 hasta retirar completamente el Sudan III, luego agregar un disolvente más polar para retirar la m-nitroanilina pura. CONCLUSIONES -Se realizaron CCD con placa activa e inactiva exitosamente, llegando a una mejor comprensión del fenómeno con el que nos encontramos allí, lo que nos brinda herramientas en el diseño de separaciones de mezclas de compuestos coloreados mediante cromatografía en columna. - la separación de mezclas coloreadas puede llegar a ser más efectiva con una desarrollo cromatográfico en gradiente por pasos. - La CCD constituye un método sencillo, práctico y económico para la identificación del grado de pureza de sustancias trabajadas en el laboratorio. Bibliografía -GALAGOVSKY, L.R. (...) “Química Orgánica. Fundamentos Teórico Prácticos para el laboratorio”, 5ª.ed., Ediciones Zorro siglo XXI, Buenos Aires. - Techniques for Chemical Engineers (Schweitzer, Ed.), McGraw-Hill, New York, 1979,