Escuela de Bioquímica UACh BIOQ251 Luis Guzmán, Sergio HernándezInforme 4: Cromatografía en gel Objetivos Separar mediante cromatografía en gel, proteínas que presentan distintas pesos moleculares. Comprender la importancia de esta técnica para la purificación de proteínas. Resultados Intensidad 1-10 Transparente Transparente Azul 10 Azul 9 Azul 8 Transparente Amarillo 8 Amarillo 9 Amarillo 10 Amarillo 7 Amarillo 6 Amarillo 5 Amarillo 4 Amarillo 3 Amarillo 2 Amarillo 1 Transparente Transparente Tabla 1. Fracciones eluídas de muestra a 200 μL Numero de Fracción 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Color Intensidad 1-10 Transparente Transparente Transparente Azul 10 Azul 9 Azul 8 Transparente Amarillo 8 Amarillo 9 Amarillo 10 Amarillo 7 Amarillo 6 Amarillo 5 Amarillo 4 Amarillo 3 Amarillo 2 Amarillo 1 Transparente Tabla 2. Fracciones eluídas de muestra a 50 μL Numero de Fracción 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Color Figura 1. Representación de las intensidades obtenidas por número de fracciones de muestras a 200 μL de azul de dextrano con dicromato de potasio y a 50 μL. Discusión . De acuerdo al resultado que Ud. eluyendo en primera instancia el azul de dextrano y luego el dicromato de potasio. de color amarillo. a medida que iba aumentando la tonalidad en mismas. 4. ya que el rango de separación de la columna de Shephadex G-50. ¿Qué podría decir del peso molecular de ambos compuestos en forma comparativa? Podemos concluir que el peso del dicromato de potasio se encontraba en el rango de separación provisto por la columna de Sephadex G-50. el que finalmente eluye mas tarde de color amarillo. por ende distintos pesos moleculares hasta alcanzar la tonalidad más oscura en ambos casos.¿Qué puede concluir de las distintas fracciones que ha colectado? Podemos concluir que estas poseían. 3. Luego de realizar la cromatografía de exclusión molecular. 2. ya que posee un peso molecular muy. para de esta manera calcular la concentración de estas. Sin embargo. utilizando la ley de Lambert Beer. distintas cantidades de moléculas. que iba desde 1000 a 30000 produciría la pronta elución del azul de 6 dextrano (que pesa alrededor de 2 x10 D) del dicromato de potasio (que pesa alrededor de 194. y haber separado cualitativamente las muestras eluídas se procede a medir las absorbancias de las distintas soluciones en un espectrofotómetro utilizándose como blanco el solvente que las contiene. juntos con sus respectivos coeficientes de extinción molar obtenidos en la literatura. la separación de azul de dextrano y dicromato de potasio se logro de manera eficiente. obtuvo. que eluyó de color amarillo. La diferencia en sus pesos moleculares y debido a que el azul de dextrano no se encontraba en el rango de separación por la columna de sephadex.2 D). . debido a la pronta elución por parte de este de la columna.Diseñe un método experimental que le permita cuantificar las muestras eluídas.¿Qué puede concluir acerca de los resultados obtenidos en las dos cromatografías realizadas? En primer lugar. en el presente practico inferíamos la pronta elución del azul de dextrano debido a su alto peso molecular. y la posterior elución del dicromato de potasio. debido a la obtención de dos colores en las fracciones. y que el dextrano azul se encontraba afuera de este. permitió la purificación de ambas proteínas.Apéndice 1. lo que nos permite poder cuantificar mas tarde con un espectrofotómetro y calcular los respectivos pesos moleculares de estas sustancias. ¿qué pasaría si el largo de la columna es de 100 cm? Construya un gráfico comparativo del resultado esperado. las distancias entre las distintas moléculas es mas amplia.¿Qué pasaría si en esta misma columna aplica una mezcla de ovoalbúmina y albúmina (PM = 43. ambas proteínas eluirian rápidamente. El largo de la columna utilizada experimentalmente fue de 5 cm. siendo sus respectivos pesos moleculares de 43000 para la ovoalbúmina y de 66000 separadas de forma efectiva.000. respectivamente)? ¿Se separarán ambas proteínas? Explique.5. provocando que el grado de fraccionamiento aumente.000 y 66. por lo que estas no serian 6. . debido a que el recorrido de las moléculas es mucho mayor.Con respecto al práctico realizado. lo que podría producir un riesgo debido ala difusión de las partículas. ya que estas no se encuentran en el rango de separación de la columna de Sephadex-50G. El aumento del largo de la columna a 100 cm permitirá una mayor resolución del proceso. Si la columna se encontrara en las condiciones utilizadas en el trabajo practico. por ende. la que permitió una buena separación de tanto las muestra a 200 μL como en la de 50 μL. obteniéndose resultados alterados. para la albumina.