UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTAFACULTAD DE INGENIERÍA ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL NFORME N° 2 TEMA: CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO CURSO: LABORATORIO DE BIOPROCESOS GRUPO: C-2 PROFESOR: Ing. AUGUSTO CASTILLO CALDERON ALUMNOS: OSORIO DURAN ALEXANDER PARIA CABALLERO MILAGROS QUILICHE VERAMENDEZ WILDER QUISPE CIUDAD JUNIOR TERRONES ROSALES RUTH Nvo. Chimbote-Perú 2017 E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL INFORME N° 02 TÍTULO: CULTIVO CELULAR POR LOTES ALIMENTADO (CLA) CON AIREACION Y ALIMENTACION CONSTANTE UTILIZANDO UNA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 RESUMEN El presente trabajo está referido al desarrollo del inóculo y cultivo celular por lote alimentado con aireación y alimentación constante de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126, desarrollado por alumnos en el laboratorio de Bioprocesos. Para este trabajo se contó con cepas de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126, la cual fue tomada de un medio en el cual se encontraba inactivada. Se procedió a preparar un determinado medio de mantención, activación y fermentación. Seguido fue la activación y acondicionamiento de la cepa Saccharomyces cerevisiae. La experiencia consistió en obtener la cinética de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae. Este proceso se realizó en un matraz en Shaker, por 11 horas. Evaluando parámetros como consumo de sustrato (sacarosa), densidad óptica. Se observó cómo se va produciendo el crecimiento celular del Saccharomyces con los nutrientes de los medios y como va disminuyendo el sustrato, la Sacarosa (principal fuente de carbono). Y esto fue posible determinarlo mediante las lecturas de absorbancia (640 nm) en el espectrofotómetro y con las prueba de determinación de azúcares reductores – DNS, absorbancia de 540 nm. El monitoreo de la cinética de crecimiento de microorganismos es de gran importancia, en especial la de Saccharomyces cerevisiae, por sus tantas aplicaciones, ayudando así a obtener productos con la calidad o características deseadas u optimizar procesos. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 1 E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL I. INTRODUCCIÓN: Las levaduras son importantes para la ciencia desde hace 200 años (recordemos por ejemplo, a Louis Pasteur, considerado padre de la enología moderna, y que realizó grandes descubrimientos acerca de las fermentaciones). La importancia tecnológica de estos microorganismos es evidente: llevan a cabo reacciones de importancia crucial para la elaboración de productos como el vino o la cerveza. Sin embargo, con el desarrollo de la genética, la biología molecular y el estudio de los genomas, las levaduras se han convertido en herramientas de experimentación en laboratorio. Ejemplo de ello es que la levadura Saccharomyces cerevisiae que se utiliza para la elaboración del pan, la cerveza y el vino ha sido el primer organismo eucariota completamente secuenciado, en un proyecto llevado a cabo por un programa internacional. Las industrias que utilizan esta levadura para la alimentación o para la producción de medicamentos o de vacunas estaban interesadas en obtener los resultados de esta secuencia para intentar mejorar sus procedimientos de producción. Al hablar de Saccharomyces, es inevitable pensar en la gran utilidad práctica de la levadura en la vida del hombre, desde tiempos antiguos. Fue tal vez un descubrimiento casual de nuestros predecesores y que actualmente agradecemos profundamente. La realidad de la alimentación que conocemos actualmente, fermentada, es una realidad histórica, basada en el tipo de agricultura que implementaron nuestros antepasados mesopotámicos. Pero en muchas partes del mundo los seres humanos controlan fermentaciones de productos sólidos o líquidos, y las especies de levaduras implicadas no son siempre las mismas. Saccharomyces cerevisiae es un hongo ambiental levaduirforme, unicelular, sus células son ovoides y se reproduce por gemación, miden entre 5 y 10 micras, vienen estado aislado hasta que adquieren el tamaño necesario para dividirse, taxonómicamente pertenece al Phylum Ascomycota, a la clase Hemiascomycetes, del orden Saccharomycetales y de la familia de las Sacchacromycetaceae. Su metabolismo le permite crecer tanto en condiciones de aerobiosis como de anaerobiosis (Feldmann, 2005). LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 2 el sustrato se ha metabolizado y las condiciones el medio se han modificado y la 4) muerte. La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. sino que se adaptan al medio y en ocasiones sintetizan enzimas o componentes estructurales. Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la producción de cerveza. 3) estacionaria. en donde las células mueren. No obstante que los microorganismos varían considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar. gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol durante el proceso de fermentación (Feldmann. excretando productos metabolizados. 2) exponencial o log. 2005). 2003). 2010).E. que es la etapa donde el crecimiento celular desciende o para completamente ya que se han transformado las sustancias nutritivas. donde las células se reproducen sin limitación de de sustancias nutritivas a velocidad máxima y toman sustratos. por lo que en la fase aerobia se caracteriza por la producción de biomasa y la fase anaerobia generalmente por la producción de etanol. En el transcurso de la fermentación hay 4 fases de crecimiento: 1) lag o de adaptación en el que no hay incremento en el número de células.A. ya que la levadura presenta una fase de adaptación para producir las enzimas necesarias (tipo invertasa) que le permitan metabolizar el sustrato y así alcanzar la biomasa adecuada para la fermentación en donde la mayor parte del carbono se emplea como energía y sólo el 2% se asimila como material celular (Sánchez. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 3 . En esta práctica se monitoreó el crecimiento de Saccharomyses cerevisiae en un medio determinado.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Además posee alta actividad metabólica. fermentando alrededor del 90% del medio. debido a que su reserva de energía se ha agotado (Sánchez. Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular. Es importante la fase aeróbica. pan y vino. Identificar y describir las partes. conocimiento de la operación del fermentador.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 1. 1. E. esterilización. descarga y toma de muestras. Observar las zonas de crecimiento exponencial y limitado. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 4 . Activación celular y desarrollo del inóculo. OBJETIVOS: 2. Identificar en el fermentador los instrumentos de medición y control automatico.A. Diseño del medio de cultivo. Obtener los perfiles de masa celular.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL II.1 OBJETIVOS GENERALES: 1. En el cultivo por lote determinar µmax y Yx/s 6. asi como la calibración de los sensores. 8. Determinar Yx/s y Qx del CLA. fuente de C y O2 disuelto a través del tiempo total de fermentación en el bioreactor. 7. 5. Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lote alimentado (CLA) con alimentación constante utilizando una cepa de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126. 2. 3. 4. Puesta en marcha del CLA. accesorios y geometría. carga. dióxido de carbono e hidrógeno. excepto por la transferencia de gases tales como aire. MARCO TEORICO CRECIMIENTO MICROBIAL Para la obtención de datos confiables. después de proveer las sustancias nutritivas al fermentador y suministrar los materiales y la energía requeridos para la síntesis de biomasa. la evaluación del crecimiento microbial requiere la normalización de métodos experimentales. se inocula el medio con una cantidad determinada de células viables con lo que el cultivo se desarrolla sin intercambio de materiales con los alrededores. o el tiempo de germinación de un inóculo de esporas. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 5 . libre de gradientes de concentración y de sustancias inhibitorias. es el período de adaptación de la célula a los cambios de su ambiente fisicoquímico. puede representarse mediante una curva típica. En un cultivo por lotes. Curva de crecimiento microbial El período de latencia (lag) (A). donde las células se reproducen a intervalos regulares.A. Puede ser el tiempo requerido para desactivar un inhibidor presente en el medio. E. en la cual se observan las diferentes etapas representativas de los cambios de la biomasa (X) y de su ambiente.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL III. El desarrollo de un cultivo por lotes bajo condiciones fisicoquímicas adecuadas en un sustrato simple y homogéneo (cSi). P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL En el período de crecimiento acelerado (B). El período de muerte o decaimiento (F) ocurre en aquellos cultivos. algunas de interés económico. la velocidad disminuye al limitarse la disponibilidad de sustancias nutritivas. Por esta razón las velocidades crecimiento. producido por las sustancias nutritivas liberadas por el citoplasma de las células lisadas. En el período de desaceleración (D). por la formación de enzimas autolíticas. El agente responsable de la transformación es una célula viva que asimila diversos materiales.A. Uno de los aspectos más importantes del estudio de la cinética de estos procesos es la selección de los métodos analíticos seguros para evaluar confiablemente las sustancias consumidas y producidas por el microorganismo y la variación de su concentración con el tiempo. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 6 . La concentración de células en el medio constituye una medida adecuada de la concentración del sistema enzimático responsable de la transformación. se reproduce y produce otras sustancias. consumo de sustrato y de formación de producto. En algunos cultivos puede apreciarse un período de crecimiento críptico. generalmente se expresan como velocidades específicas referidas a la concentración de células activas. la velocidad aumenta desde cero hasta un valor máximo. VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO En los procesos de fermentación los microorganismos desarrollan su actividad vital en medios de elevada complejidad. El período estacionario (E) se produce cuando se agota una sustancia nutritiva. las células se reproducen. en condiciones de inanición. en un medio sin limitación de sustancias nutritivas.E. a la máxima velocidad compatible con el conjunto de condiciones existentes. En el período de crecimiento exponencial (C). En la Antártida existen bacterias que se reproducen a 7ºC. Generalmente los microorganismos crecen en un intervalo de temperatura ambiente entre 25 y 30ºC. pero que se desarrollan a mayor rapidez a temperaturas entre 20 y 30ºC. la naturaleza del metabolismo. (Pelczar.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Velocidad específica de crecimiento Velocidad específica de consumo de sustrato Velocidad específica de formación de producto INFLUENCIA DE ALGUNAS CONDICIONES AMBIENTALES SOBRE LA VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO Temperatura La temperatura afecta la velocidad de las reacciones celulares. los requerimientos nutricionales y energéticos y la composición de la biomasa. aunque existen microorganismos que se desarrollan a temperaturas inferiores a 0ºC y otros a temperaturas superiores a 93ºC. En la siguiente tabla se presenta una clasificación de los microorganismos en función de la dependencia de la velocidad de crecimiento con la temperatura.E. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 7 . 1977). El requisito fundamental es la presencia de agua líquida. los destruye.E. ED es la energía de activación para la muerte térmica. entendido como una secuencia de reacciones. y es la energía necesaria para llevar las moléculas a un estado energético en el cual puedan reaccionar. se estimula inicialmente el crecimiento de los microorganismos. m EF es la velocidad efectiva de crecimiento que es igual a la velocidad de síntesis menos la velocidad de muerte. La aplicación de la ecuación de Arrhenius a un proceso microbiológico es un procedimiento cinético formal. R es la constante de los gases. La ecuación de Arrhenius constituye una hipótesis apropiada para describir el efecto de la temperatura sobre el crecimiento: Donde. EA es la energía de activación para el crecimiento. AD son los factores de frecuencia. Cuando es demasiado alta. permite prever desviaciones de este comportamiento. la complejidad del crecimiento microbial. y T la temperatura absoluta.A. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 8 .P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Temperatura (ºC) Grupo Mínimo Óptimo Máximo Termófilos 40 – 45 55 – 75 60 – 80 Mesófilos 10 – 15 30 – 45 35 – 47 Psicrófilos -5 – 5 15 – 18 19 – 22 obligados Psicrófilos -5 – 5 25 – 30 30 – 35 facultativos Energía de activación En el intervalo adecuado de temperatura. Sin embargo. A. se debe considerar como un factor inhibitorio MEDIOS DE FERMENTACION La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Macronutrientes. usualmente mediante la adición de ácido clorhídrico o ácido sulfúrico.E. Ca. S. al medio. b. La concentración del ion hidrógeno puede afectar en gran medida el crecimiento celular y. Mn. si el pH no está regulado. P. se consume H+. Mo. K y Mg. Como ya se explicó. Se prefiere el amoníaco gaseoso en lugar del hidróxido de amonio. Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe. Estos cambios muestran la necesidad de determinar y controlar el pH de un cultivo. los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular. en el metabolismo de NO3. el pH del medio de cultivo cambia como respuesta a la actividad microbial: se genera H + durante la demanda de NH4+.y en la utilización de aminoácidos como fuente de carbono. y una de las bases: hidróxido de sodio. por la posibilidad de contaminación de éste con esporas bacterianas. No obstante que los microorganismos varían considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distinción de las siguientes categorías de componentes: a. agregados en cantidades de gramos por litro que están representados por las fuentes de C. y LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 9 . Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos por litro. N.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL pH En muchos procesos de fermentación aerobia y anaerobia. de potasio o de amonio. extracto de levadura. algunos aminoácidos. Medios complejos en cuya composición intervienen sustancias de origen animal o vegetal como peptonas. macerado de maíz. Otros aspectos que son también importantes se refieren a todos los procesos y operaciones previos y posteriores a la etapa de fermentación y al conocimiento de los mecanismos bioquímicos que regulan la formación de algunos productos. en 1. 2. sino incorporados a estructuras celulares y de función metabólica específica. Medios sintéticos o medios químicamente definidos. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo. ácidos grasos no saturados. que están constituidos generalmente por componentes orgánicos suministrados en baja concentración y que no son sintetizados ni metabolizados por las células. como vitaminas. Los medios pueden clasificarse. Diseño El diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos correspondientes al proceso a desarrollar. etc. considerando la naturaleza química de los componentes. etc.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL c. En el estudio de los medios de cultivo es conveniente considerar en primer lugar el diseño para tratar a continuación la formulación y optimización de los mismos. pero que son químicamente indefinidas y de composición variable. harina de soja. que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas.E. Factores de crecimiento. el proceso y los sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos específicos del proceso.A. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 10 . la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las materias primas. ya sea autotrófico. El S es asimilado para la síntesis de aminoácidos azufrados. El 0 2 es uno de los oxidantes más comunes en el metabolísmo energético. Para la síntesis de proteína se requieren en general L-aminoácidos. Los requerimientos de K y Mg son también esenciales. y los heterotróficos que necesitan compuestos orgánicos como fuente de carbono.A. que corresponde a los microorganismos que obtienen el carbono del C0 2 como las algas y algunas bacterias. Otro factor esencial está determinado por las condiciones del cultivo. Una parte importante del primero está unida al RNA de manera que los requerimientos de K aumentan con los factores que influyen en el aumento del RNA de las células. aunque también son necesarios algunos aminoácidos de la serie D como D-alanina y D-aspártico para su incorporación a la pared de las células. El ión K actúa como coenzima y probablemente actúa como esencial para la estabilidad de los ribosomas y LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 11 . tiamina y otros componentes. Los requerimientos de otros macronutrientes como el P y el S son suministrados en forma de P04H y S04 (o aminoácidos azufrados). el N03 o S04 son utilizados como aceptores de electrones por algunas bacterias. Otras protistas obtienen su energía. coenzima A. como la velocidad de crecimiento. y polímeros celulares. y además se necesita para la biotina.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Requerimientos nutricionales Los requerimientos nutricionales están determinados por el tipo de metabolismo celular. El nitrógeno es utilizado para la biosíntesis de proteínas. Las fuentes de carbono cumplen también el rol de ser fuente de energía. En la ausencia del 0 2.E. Otro requerimiento nutricional está constituido por las fuentes de nitrógeno que pueden ser de naturaleza inorgánica u orgánica. El fósforo se incorpora en ácidos nucleicos. si es aerobio o anaerobio. Las bacterias metanogénicas son auxótrofos anaerobios que utilizan H2 para reducir el C02 a CH4 para obtener energía. en condiciones anaerobias por reacción de óxido-reducción realizadas sobre compuestos orgánicos. En algunos casos se requieren también póptidos de histidina. ácidos nucleicos y polímeros de la pared celular. Otros factores de crecimiento son las purinas.A. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 12 . a parte de los nutrientes requeridos por los microorganismos y que representan los requerimientos específicos del proceso considerado. la disponibilidad y la estabilidad en su composición química. Mn. e I. Se.. putrescinas. siendo importante considerar diferentes aspectos como el costo de los mismos. Cr.E. como por ejemplo por aumento de temperatura por encima de un valor óptimo. Los requerimientos de éstos compuestos pueden aumentar varias veces cuando el cultivo ha estado sujeto a "strees". Con respecto a los micronutrientes se distinguen 2 categorías: 1) Los que son frecuentemente esenciales para el crecimiento como Ca.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL actua como cofactor en numerosas reacciones del metabolismo. etc. niacina. Co. Mo. As. Tanto el K como el Mg se incorporan a los medios en forma de sales como fosfato y sulfato. Materias primas fundamentales Los componentes empleados en la industria de fermentación son generalmente complejos. Al. V. Cl. En algunos procesos existe la necesidad de efectuar otros agregados. se hace prioritario disminuir el costo de los medios. Ni. poliaminas. Cu y Zn y 2) Los que son raramente esenciales como B. Si tenemos en cuenta que el costo de los nutrientes representa entre al 10 y el 60% del costo total de mucho productos obtenidos por fermentación. Los requerimientos de factores de crecimiento comprenden ciertos aminoácidos y vitaminas del grupo B como tiamina. La mayor parte de las vitaminas son constituyentes de co-enzimas. Na. riboflavina. Si. A veces es difícil demostrar un requerimiento de un micronutriente porque generalmente está presente en suficiente cantidad como impureza de los componentes principales. En general los requerimientos de trazas de elementos son conocidas cualitativamente. ácido pantotético. cte. que representan para muchas bacterias y levaduras factores esenciales en los medios sin los cuales no se produce crecimiento celular. Fe. Sn. que es disponible en forma de pasta o polvo. Zn. 2) Extracto de carne. péptidos. es básicamente una mezcla de aminoácidos. tiempo de extracción y temperatura de la misma. 3) Extracto de levadura. Las fuentes de carbono pueden ser: 1) Hidratos de carbono como glucosa o dextrosa. sacarosa. algodón. alpechín y residuos sulfiticos. vitaminas solubles en H2O y carbohidratos. el agua de maceración de la industria del LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 13 .A. que es el extracto soluble en H2O de la malta de la cebada y 5) "Cornsteep". 4) Extracto de malta. almidón. gelatina. ya que si bien contienen hidratos de carbono y otras fuentes de carbono asimilables por los microorganismos. Son muy importantes también por su disponibilidad y costo reducido otras materias primas que contienen hidratos de carbono como granos. que se obtiene por extracción acuosa y concentración posterior variando su tipo de acuerdo a la calidad de carne. 2) Alcoholes como el glicerol y manitol. celulosas. melazas. También se pueden emplear otros subproductos o efluentes de industrias que por su contenido en fuentes de carbono son interesantes para algunos procesos como las vinazas de destilería. girasol. y 3) Hidrocarburos como hexadecano. dextrina. que son sin embargo solamente útiles para procesos de producción de biomasa destinados al consumo animal. etc.. caseína. Las fuentes de nitrógeno de naturaleza inorgánica más comunes son el amoníaco o las sales de amonio. Mediante ajuste de la relación enzima-sustrato y variando tiempo de hidrólisis es posible variar el tamaño de la cadena de polipéptidos. etc. como ser: 1) Hidrolizados de proteínas (Peptonas) que son obtenidas por hidrólisis ácida o enzimática de distintas fuentes proteicas como carne de diferentes órganos y animales. suero de queso. octadecano y otros. las peptonas aportan algunas vitaminas y sales inorgánicas como fosfatos y suministran también algunos micronutrientes como Ca. lactosa.E.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Las materias primas más importantes corresponden a fuentes de carbono y de nitrógeno. Aparte de su función como fuente nitrogenada. también contienen muchas impurezas que impiden su utilización en otros procesos por las dificultades y costo elevado que presentan las operaciones de separación y purificación de los productos. y puede ser obtenida mediante autólisis o plasmólisis de la levadura. harina de soja. Las orgánicas están representadas por varios productos. Fe y Cu. pescado. 7-12. 1- 3. es decir debe establecer las concentraciones de cada componente a ser utilizadas. la disponibilidad y el problema de impurezas que puede acompañar a las distintas materias primas utilizadas. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 14 . Por el conocimiento de la estequiometria de crecimiento y de formación del producto. Formulación La formulación tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios. Aunque este tema se tratará en el capítulo 5 es conveniente adelantar aquí algunos aspectos necesarios. Una primera aproximación con respecto a las cantidades a utilizar de las diversas fuentes lo da el conocimiento de la composición de biomasa del microorganismo a ser empleado.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL maíz tiene mucha importancia por su utilización como componente esencial de los medios para la producción de varios antibióticos y enzimas. que además tiene en cuenta los requerimientos de las fuentes de energía. 46-48. es posible formular adecuadamente un medio.A. que si queremos formular un medio para producir una determinada cantidad de biomasa debemos promover las distintas fuentes que aseguren como mínimo las cantidades de elementos que deben ser suministrados.E.4-1%.0. Fósforo. Mg. En este sentido deben considerarse los costos.5-1. 0. Es muy importante también la correcta elección de una determinada fuente cuando se presentan varias alternativas posibles. Azufre. La composición de un medio mínimo basado en este principio. Nitrógeno. 0. Una composición elemental y típica de la biomasa es (en % de peso seco): Carbono. En general podemos escribir para cualquier proceso de fermentación: Fuente de C + Fuente de N + 02 + Minerales + nutrientes específicos ---> biomasa + productos + C02 + H20. Es decir. Entre los aminoácidos. la tiamina. Por ese motivo es necesario que los carbohidratos se esterilicen por separado de los compuestos nitrogenados orgánicos. En medios químicamente definidos se puede observar pérdida importante de magnesio. potasio. de manera tal que los cambios que se producen durante la esterilización pueden ser importantes. Los aminoácidos y factores de crecimiento son muy lábiles al calor. pH del medio. riboflavina y piridoxina son las más susceptibles de sufrir descomposición. dependerá no solamente de la naturaleza de los componentes sino también de la temperatura. Un ejemplo típico de interacción es la reacción de Maillard que tiene lugar entre los grupos carbonilos de los azúcares con los grupos amino de proteínas. En todos estos casos es aconsejable disolverlas LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 15 . amonio. glutamina. durante la esterilización por calor. los medios de fermentación utilizados en la industria son casi siempre complejos y a menudo con sólidos en suspensión. si no el amonio se volatiliza. La naturaleza de las interacciones que tienen lugar entre los componentes de un medio. sodio y fosfatos por precipitación de sales poco solubles como MgNH4PO4.A.E. etc. duración del calentamiento. A veces puede haber modificaciones beneficiosas o perjudiciales dependiendo del tiempo de esterilización. y entre las vitaminas hidrosolubles. En ciertos casos cuando el tiempo es solamente de 15-20 min se puede producir un efecto beneficioso. Existen casos en los cuales si se prolonga la esterilización 50 a 60 min se producen pérdidas de rendimiento que llegan hasta el 65% con respecto al medio normal. MgKP04 y MgNaP04. Las sales de NH4+ se deben autoclavar a pH 7 o menor. asparagina. y de la agitación. el triptofano. Es importante por lo tanto autoclavar las sales de calcio y magnesio aparte de los fosfatos. aminoácidos. Se forman así productos de condensación con lo cual se inactivan significativas cantidades de carbohidratos y nitrógeno amínico.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Conservación de la calidad nutriente Como ya dijimos anteriormente. social y de salud en la culturahumana. además de esterilizar correctamente los medios. LEVADURAS Levadura es un nombre genérico que agrupa a una variedad de hongos. probablemente. Este organismo se conoce también como la levadura de panadería. la especie cerevisiae constituye la levadura y el microorganismo eucariote más estudiado. ya que es necesario agregarla a la masa que se utiliza para preparar el pan para que este esponje o levante. las levaduras constituyen el grupo de microorganismos más íntimamente asociado al progreso y bienestar de la humanidad. y que a su vez ha inspirado un sinnúmero de obras de arte que ensalzan al Dios del vino y a aquellos que disfrutan su consumo. Dentro del género Saccharomyces. las levaduras han sido referidas como los primeros organismos “domesticados”. A menudo. la primera biotecnología Algunas especies de levaduras del género Saccharomyces son capaces de llevar a cabo el proceso de fermentación. de hecho el término levadura proviene del latín levare. que significa levantar.A.E. debido a que la fermentación para la producción de vinos representa. Como ya dijimos es fundamental. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 16 . propiedad que se ha explotado desde hace muchos años en la producción de pan y de bebidas alcohólicas. En la misma forma que la inactivación de microorganismos puede ser considerada una reacción cinética de primer orden. como especies no solamente inocuas sino de gran utilidad. el estudio de las levaduras como modelo biológico ha contribuido de manera muy importante a elucidar los procesos básicos de la fisiología celular. Desde el punto de vista científico. Las levaduras tienen importancia económica. De hecho. conservar al máximo la calidad nutriente de los mismos.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL separadamente en pequeños volúmenes de H2O y luego esterilizarlas por filtración. incluyendo tanto especies patógenas para plantas y animales. también la destrucción de algunos compuestos sensibles al calor puede ser tratada en la misma forma. vienen estado aislado hasta que adquieren el tamaño necesario para dividirse.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL SACCHAROMYCES CEREVISIAE Saccharomyces cerevisiae es una levadura. del orden Saccharomycetales y de la familia de las Sacchacromycetaceae. el hongo que produce la penicilina. En la naturaleza se encuentra sobre sustratos ricos en azúcares o en los exudados y savias dulces de algunas plantas. sus células son ovoides y se reproduce por gemación. por lo que en la fase aerobia se caracteriza por la producción de biomasa y la fase anaerobia generalmente por la producción de etanol. Saccharomyces cerevisiae es un hongo ambiental levaduirforme.E. pero también a hongos patogénicos tanto de plantas como de animales. 2005). taxonómicamente pertenece al Phylum Ascomycota. fermentando alrededor del 90% del medio. del grupo de los ascomicetos. las colmenillas o el Penicillium. miden entre 5 y 10 micras. El término "levadura" (de "levare" en la acepción de subir o levantar) remite a la experiencia visual de la masa del pan que se "levanta" cuando se añade levadura a la harina. Este grupo incluye a más de 60000 especies. Además posee alta actividad metabólica. unicelular. Su metabolismo le permite crecer tanto en condiciones de aerobiosis como de anaerobiosis (Feldmann. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 17 . Es importante la fase aeróbica. ya que la levadura presenta una fase de adaptación para producir las enzimas necesarias (tipo invertasa) que le permitan metabolizar el sustrato y así alcanzar la biomasa adecuada para la fermentación en donde la mayor parte del carbono se emplea como energía y sólo el 2% se asimila como material celular (Sánchez. un hongo unicelular. 2010). el más conocido de los cuales es Candida. entre ellas las trufas.A. a la clase Hemiascomycetes. sino también para la optimización del proceso de fermentación industrial. es posible generalizar sobre sus requerimientos de la siguiente forma: carbono. En términos generales explica cómo las levaduras interactúan con su medio biótico y abiótico. La biotecnología de levaduras se define como el uso de la fisiología de levaduras (Walker.E. Cada levadura presenta requerimientos nutricionales diferentes.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la producción de cerveza. NUTRICIÓN DE LEVADURAS El término nutrición de levaduras se refiere a cómo las levaduras se alimentan. metabolizan. azufre. REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES Los compuestos orgánicos e inorgánicos en un medio de cultivo desempeñan funciones de activadores o inhibidores para el crecimiento.A. A continuación se hará una revisión sobre los aspectos más importantes sobre la nutrición y metabolismo de las levaduras. nitrógeno. oxígeno. fósforo. de forma específica involucra dos aspectos: requerimientos nutricionales y la adquisición de los nutrientes. El entendimiento de los requerimientos nutricionales y las estrategias de adquisición de nutrientes. se reproducen y finalmente mueren. hidrógeno. junto con la regulación del transporte de nutrientes es importante no sólo para el cultivo de las levaduras en el laboratorio. gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol durante el proceso de fermentación (Feldmann. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 18 . crecen. específicamente explica cómo las levaduras se alimentan. su efecto dependerá de su naturaleza y de las concentraciones en el medio de cultivo. 1998). oligoelementos y factores de crecimiento. sin embargo. pan y vino. La fisiología de las levaduras es definida como el entendimiento de su crecimiento y metabolismo. 2005). La asimilación y LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 19 . SACAROSA La sacarosa tiene la fórmula C12H22O11 que pertenece a un grupo de hidratos de carbono llamados disacáridos. ya que aportan. extraída de la remolacha azucarera o de la caña de azúcar. es decir que contiene seis átomos de carbono y es una aldosa. Es una hexosa. sin embargo. disacáridos. ácidos grasos. esto es el grupo carbonilo está en el extremo de las moléculas. Además. Es el azúcar normal de mesa. la glucosa generalmente ocasiona efectos inhibitorios y de represión en la asimilación de otros azúcares. Las levaduras pueden asimilar azúcares (hexosas. que actúa como donador de un grupo amino para la síntesis de otros aminoácidos para la célula (Aguilar. Una pequeña proporción (5%) de sus requerimientos de carbono pueden ser incorporados del dióxido de carbono. Estos compuestos son generalmente azúcares. hidrocarburos y compuestos aromáticos. alcoholes. la misma que la fructosa pero con diferente posiciones relativa de los grupos–OH y O=. de los cuales la glucosa es la más empleada en levaduras. El ión amonio es empleado por las levaduras para la formación del ácido glutámico. 1998). al mismo tiempo. pentosas. SULFATO DE AMONIO El sulfato de amonio y sulfato diamónico son las sales más utilizadas como fuente de nitrógeno. debido a que no se encuentra libre de forma natural en sus hábitats. GLUCOSA La glucosa es un monosacárido con fórmula empírica C6H12O6.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL CARBONO Las levaduras son organismos quimioorganotróficos porque obtienen la energía y el carbono de compuestos orgánicos.E. es soluble en agua y ligeramente soluble en alcohol y éter. es una forma de azúcar que se encuentra libres en las frutas y en la miel. azufre y fósforo que la célula necesita. no es el azúcar más efectivamente metabolizable para todas ellas. oligosacáridos. trisacáridos. ácidos orgánicos. polisacáridos). se conoce que la velocidad de formación de etanol está limitada por la velocidad de transferencia de azúcares al interior de la célula (Walker. en la levadura se produce contra un transporte de concentracion en contra de un gradiente de concentración y por lo tanto se activa. Por otro lado.A. los ácidos nucleicos y sus metabolitos fosforilados. FOSFATO DE AMONIO El fosforo es esencial para las células de levaduras para su incorporación en moléculas estructurales. entre otras. el ion sulfato aporta el azufre necesario para maximizar el crecimiento de las levaduras. pero sustratos respirables como acetato o etanol que no son compatibles con la absorción de fosfato. cerevisiae es concebible que los bajos ylos sistema de alta afinidad pueden operar simultanea mente dependiendo sobre la disponibilidad de fosfato. En s. En s. Así. de hecho la absorción de fosfato pueden ser controlados por la concentración de ortofosfato intracelular. 1998). También depende de la presencia en la de un sustrato fermentable exógeno como la glucosa. sino que la levadura sea capaz de adquirir estos nutrientes del medio y guarde un equilibrio con el mismo. no solo es importante que en el medio de cultivo se tengan los compuestos necesarios. en forma de fosforo ortofofato polimérico común mente disponible para la levadura en forma de ortofosfato inorgánico. Cerevisiae. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 20 . Levaduras también pueden almacenar fosforo en la vacuola. El transporte de azúcares en levaduras ha sido estudiado por muchos años. Que metabolizan muy rápidamente para el transporte de nucleótidos trifosfato.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL utilización de nitrógeno amoniacal y nitrógeno amino pueden variar según la levadura utilizada. ya que puede ser afectada por numerosos factores como la aireación y la concentración de glucosa.E. ADQUISICIÓN DE NUTRIENTES Para que las levaduras puedan cumplir con sus funciones. al menos tres sistemas se cree que translocan ortofosfato. debido a la importancia biotecnológica de esto en fermentaciones industriales. por lo que existen varios mecanismos para la translocación de la glucosa y otros sacáridos. fructosa y manosa. El transporte de glucosa alcanza el equilibrio y no es acumulativo.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Las levaduras. Durante el transporte no hay consumo de energía. Las fuentes favorables de nitrógeno para maximizar el crecimiento de levaduras son los iones de amonio. por ejemplo: en S. Aunque cada levadura es diferente se pueden realizar ciertas generalidades con respecto al transporte de azucares: a. glutamato y glutamina. La fosforilación acompaña a la glucosa al entrar a la célula. Todas las levaduras son capaces de usar el amonio como una fuente de nitrógeno y sales de amonio. y pueden transportar glucosa. b. d. 1996). Los transportadores de glucosa facilitan la difusión libre. Las fuentes de nitrógeno generalmente tienen una función anabólica de proteínas estructurales y enzimas funcionales. generalmente. f. e.E. La glucosa es tomada en contra de un gradiente de concentraciones. cerevisiae se conocen 20 transportadores de hexosas que difieren en su abundancia y afinidad para ciertas hexosas (Kruckeberg. sin embargo. pero son capaces de trasportar y utilizar compuesto de nitrógeno. transportan preferentemente la glucosa. las membranas celulares no son permeables a azúcares. Algunas fuentes de nitrógeno pueden ser catabolizadas inmediatamente a la entrada de la célula. c.A. TRANSPORTE DE NITRÓGENO Las levaduras no pueden fijar el nitrógeno atmosférico. Los transportadores de glucosa son estéreo específicos para ciertas hexosas. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 21 . Si el nutriente que se alimenta es el limitante del crecimiento. Así. ya sea mediante el empleo de caudales variables (F = F (t)). esta técnica permite controlar la velocidad de crecimiento () del microorganismo. Esta técnica se define como un cultivo en batch donde se alimenta continuamente medio nutritivo fresco o alguno de sus componentes. este método se emplea cuando se quieren evitar fenómenos de inhibición por sustrato y se requiere alcanzar una alta concentración de biomasa. El BA es particularmente útil en procesos en los que el crecimiento celular y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del sustrato limitante. por lo que V o. ESQUEMA Donde F(t): caudal de alimentación Sr(t): concentración de sustrato de la alimentación Vf: volumen final de trabajo Vo: volumen al inicio de la alimentación Xo: concentración de biomasa al inicio de la alimentación So: concentración de sustrato limitante al inicio de la alimentación El cultivo BA se inicia a partir de un cultivo en batch. En el caso del LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 22 . METODOLOGÍA EXPERIMENTAL: Empleando la técnica de batch alimentado (BA) o fed batch. E.A. Xo y So son las condiciones finales de dicho batch. o bien mediante la variación de la concentración de sustrato limitante (Sr=Sr (t)). es decir cuando el rendimiento celular o la poductividad de la biomasa o del metabolito buscado se ven afectados. Es posible elegir distintas condiciones de alimentación.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL IV. V0 V0. S0' X. es decir F=cte. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 23 .P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Trabajo Práctico se utilizará el sistema más simple.V = X0. El caso descrito hasta aquí tiene en cuenta que tanto F como Sr sean constantes.V0 µ < µmax X.V0' S0 = 0 BATCH t = t0 BATCH ALIMENTADO t Al obtener valores de Sr y F. y Sr=cte. dicha funcionalidad habrá de ser tenida en cuenta para resolver las ecuaciones planteadas.YX/S. S0 RESERVORIO BOMBA BIORREACTOR Puede representarse un cultivo en batch alimentado operando en las condiciones halladas.V µ = µmax X0'. X0. se ha DISEÑADO una alimentación para el cultivo en batch alimentado.E.t X0. F(t) SR(t) Vf.SR.V0 + F.A. Xf VR = Vf . Es claro que en caso de ser F = F(t) y/o Sr = Sr(t). E. Para el diseño se debe considerar: Usar Sustrato limitante: SACAROSA( C12H22O11). para su mantención. Control de pH usando electrodo y unidad de control. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo. el proceso y los sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos específicos del proceso.1 DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO Para diseñar el medio de cultivo se realizará de acuerdo a los alcances que nos proporciona la guía de práctica. activación y para la fermentación del cultivo por lote alimentado. Duración aproximada de 4 a 6 horas de la etapa de CLA. El diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos correspondientes al proceso a desarrollar.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 4. La existencia de las zonas de crecimiento exponencial y limitado. en el cual podemos conocer los requerimientos del microorganismo. Usar el bioreactor automatizado Biostat – A Plus recipiente de 2 litros.A. la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las materias primas. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 24 . LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 25 .15 Agar 20 1. hasta la aparición de la primera burbuja.15 Levadura Peptona 5 0.1. ACTIVACIÓN Y CULTIVO PARA Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 4. con mucho cuidado.50 Procedimiento: Preparar el medio de mantención.E. Luego de acuerdo a la tabla Nº 1 anterior se pesan las cantidades requeridas de cada compuesto. Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el matraz. con la ayuda de la balanza analítica. Se inicia teniendo en cuenta la referencia de composición de medios de cultivo de mantención para Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.A. según la tabla Nº1 para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126. agitando constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE MANTENCIÓN. en una probeta graduada. a partir de lo cual se controla 2 minutos.00 Glucosa 10 0. y después agregar los 50 ml de agua destilada. Medir 50 ml de agua destilada.1 MEDIO SOLIDO DE MANTENCION (YM solido) Tabla 01: Concentración de Nutrientes para el medio de mantención (50 mL) Peso (g) Nutriente Concentración (g/l) Para 50 mL Extracto de 3 0.25 Extracto de Malta 3 0. Mezclar todos los compuestos ya pesados en un matraz Erlenmeyer. Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de la olla. y llevarlos a la olla a presión.075 Solución de sales 5 ml/L 0. esperar 1 hora. y sales). e inmediatamente taparlos.1. según los la tabla Nº2 para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126. 4. finalizando la esterilización. esto para evitar la reacción entre estos dos componentes. previamente aflojar las tapas. para permitir el intercambio de gases. Pesar los componentes descritos en la tabla Nº2 Prepara 15 ml de medio de activación en un matraz de 50ml (separando fuente de carbono. y en caliente adicionar 6-7ml de la mezcla a cada tubo con la ayuda de una pipeta de 10 ml.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Preparar 6 tubos de ensayo con tapa.E. Se esterilizan por separado el extracto de levadura y malta en un tubo de ensayo (hasta 5 ml con agua destilada). Colocar los tubos en un vaso de precipitado previa cobertura con cartón.075 ml 75ul Procedimiento: Preparar el medio de activación.075 Extracto de levadura 3 0. Calentar hasta que la temperatura alcance los 121ºC y a partir de ello controlar 20 minutos. extracto de levadura y malta. la sacarosa en un matraz de 50 ml. luego colocarlos en posición inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.A.045 Extracto de malta 5 0.2 MEDIO DE ACTIVACION Tabla 02: Concentración de Nutrientes para un medio de activación (15 mL) Nutriente Concentración (g/l) Peso (g) Sacarosa 5 0. y por LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 26 . Luego de enfriar.35 0. contando desde la primera burbuja.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL último las sales en otro tubo de ensayo (hasta 5 ml.26 0. mezclar todo en el matraz en torno al mechero con todas las indicaciones de asepsia. y después llevar al Shaker por un tiempo de 10h. Para una concentración final: g/l.2 MEDIO DE FERMENTACION Para un volumen de medio: 30% del volumen del matraz. TABLA 03.2 TABLA 04 LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 27 .167 KH2 PO4 0.67 0.8 0.A. 35°C y 200rpm.016 Solución de sales 5ml/L 0.50 Tampón Citrato 100 ml/L 10 ml pH 4.1. De agua destilada).035 Mg SO4 7H2O 0.426 Extracto de 1.E. 04 y 05: Concentración de Nutrientes para el medio de fermentación TABLA 03 Peso (g) Nutriente Concentración (g/l) Para 100 mL Sacarosa 4.16 0. 4.18 Levadura (NH4)2 SO4 1. por un tiempo de 15 min. (NH4)2SO4 + KH2PO4 + MgSO4.7H2O Mg 19.157 MgSO4. contando desde la primera burbuja.24% 0. Pesar los componentes descritos en la tabla Nº 4 Disolver completamente cada compuesto con agua destilada de la siguiente manera: Sacarosa en un matraz con agua destilada + 15ml de medio de activación. FERMENTACIÓN DEL CULTIVO LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 28 .68% 0.79% 0. según la tabla Nº4 para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.85g/l C12H22O11 (NH4)2SO4 N 21.21% 0. Terminada la esterilización dejar enfriar.76 (NH4)2SO4 S 24. de agua destilada.09 KH2PO4 K 28. E.11% 3. Extracto de levadura en un tubo con 10 ml de agua destilada Esterilizar las diluciones por separado durante 15min.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Nutriente Fuente % S(g/l) Elemento Nutriente C 42.073 Limitante: Fuente Nitrógeno.7H2O + solución de sales en un tubo con 10 ml. Procedimiento: Preparar el medio de fermentación.86% 0.0165 KH2PO4 P 22.A. luego.A. se provoque en el comportamiento del crecimiento. al que se le mide la absorbancia y se centrífuga. guardando el sobrenadanante en viales y la masa sedimentada en capachos que serán expuestos a la estufa.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Inocular el caldo (medio rico + biomasa) a un matraz conteniendo medio de fermentación. para la adaptación del crecimiento Durante el desarrollo del cultivo. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE SALES CONCENTRADAS (1L) Pesar las correspondientes sales que conforman nuestra solución de sales concentradas para sepa de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126. una segunda fermentación que se realizará en el fermentador de 2000 ml. Una vez iniciado el crecimiento de biomasa se manipula el flujo de alimentación de tal manera que en tiempos determinados. A. tomar una muestra inicial. Luego se llevará a cabo la alimentación.E. utilizadas en los medios de cultivo en g/l LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 29 . para las evaluaciones del crecimiento de biomasa.lo cual se muestra en la guía de Práctica de Bioprocesos: Tabla 05 Composición de la solución de sales 100 veces concentrado. 05 CoCl2. TÉCNICA DE ASEPSIA Se usara en los días en que hay sembrado e inoculación de células. C.2H2O 1.5H2O 0. cada compuesto lo diluiremos con agua destilada en un vaso de precipitado adicionándole 100 ml de agua destilada con la ayuda de un agitador de vidrio.11 FeSO4.7H2O 0.0005 MnCl2.28 Cada compuesto se pesara con cuidado.01 MoO3 0. ESTERILIZACIÓN DE PIPETAS Las pipetas.A. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 30 . B.7H2O 0.6H2O 0. Las pipetas serán forradas con papel aluminio y puestas a la estufa por un tiempo 20 minutos a temperatura de 140-150 º C.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Nutriente Concentración (g/l) CaCl2. la solución se colocara en una fiola de 1 litro y se enrazara con agua destilada hasta completar 1litro.6H2O 0. Una vez realizado el preparado se llevara a refrigeración para su posterior utilización.12 ZnSO4. serán lavados y secados en la estufa Luego en cada pipeta se colocara un filtro de algodón para no contaminarlo al momento de ser utilizada.E. Luego de pesar.027 NaCl 0.06 CuSO4. así como también el total acomodo de las herramientas de trabajo (tubos de ensayo y gradilla) a utilizar. Tº = 35ºC y un t=10 horas hasta alcanzar un desarrollo celular suficiente.E. evidenciado por el incremento en la turbidez del medio.A. E. con la ayuda del mechero. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se agita hasta la completa disolución de todos los componentes. Llevar al Shaker a 200 rpm. por lo que se limpiara con paños de algodón toda la zona de trabajo hasta 3 veces. para posteriormente aforar hasta un litro.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Para realizar la inoculación es necesario y muy importante tener el lugar bien desinfectado.) Tomar una azada e inocular en un matraz con 20 ml del medio de activación. D. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 31 . DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES: MÉTODO DEL DNS (ÁCIDO DINITROSALICÍLICO) La preparación del reactivo DNS se requiere de lo siguiente: 10 g/l de ácido 3. se disuelve el tartrato en aproximadamente 500 o 600 ml de agua. paralelamente se disuelve el ácido DNS. INOCULACIÓN AL MEDIO DE ACTIVACIÓN Para la inoculación partimos de la cepa incubada en medio sólido de mantención (Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126. etc. Tapar el matraz que contiene el medio de activación con un tapón de gasa y algodón. Los tubos de ensayo y los matraces que serán utilizados en el medio rico primero serán lavados. secados y esterilizados en la estufa por un tiempo 20 minutos a temperatura de 140-150 º C.5 dinitrosalicílico (DNS) 200 ml/l de NaOH 2N 300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado Para la preparación de este reactivo. A. Se mantiene la mezcla en un baño de agua a ebullición durante 5 minutos para luego dejar enfriar. Se toma una muestra de volumen conocido. 3. al incrementarse la concentración de microorganismos. y se centrifuga a 1200 rpm.O El método se basa en el aumento de la turbidez del medio. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR POR D. Para ésta determinación es necesario que previamente se elabore una curva de calibrado.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la muestra: 1. Se lee la absorbancia a 540 nm. 2.E. La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado. 2. 4. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 32 . utilizando agua como blanco. Se añade un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra a analizar. Se elimina el sobrenadante y se resuspende el centrifugado con agua destilada. 3. La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestras de concentración conocida y analizadas según este procedimiento. Se elimina el sobrenadante. Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar restos de sustrato que pudieran alterar la determinación. para lo cual las concentraciones de microorganismos en el medio son determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento: 1. 6. esto puede ser detectado fácilmente por espectrofotometría a 640 nm. se redisuelve el precipitado y se seca en la estufa a 80 ºC hasta peso constante. 4. 5. Durante 20 minutos. F. Se añaden 10 volúmenes de agua destilada. E.A.(640 nm) Observaciones alumno y grupo 01 0 02 03 04 05 06 Nombre del CLA HORA TIEMPO Abs.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL CINÉTICA CULTIVO CELULAR POR LOTES Plan de Muestreos y Registro de Datos Grupo: Día: Microorganismos: Fuente Carbono: Nombre del Nº HORA TIEMPO Abs.(640 nm) alumno y grupo 01 02 03 04 05 06 07 LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 33 . 1 Materiales y Equipos: Balanza analítica Matraz Erlenmeyer de 250 ml. Mechero Bunsen Gradilla 6 Tubos de ensayo con tapas. Glucosa.2 Reactivos y nutrientes: Agua destilada. Peptona. Cocina a gas Olla a presión. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 34 .1 PREPARACIÓN DE SÓLIDO DE MANTENCIÓN: 5. MATERIALES. Espátula 3.1. Agar.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL V. Pipeta de 10 ml. INSTRUMENTOS Y REACTIVOS: Material Biológico: Cepa liofilizada de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 5. Extracto de malta. Vaso de precipitado. E.1. Varilla de vidrio Guantes. Extracto de levadura. 1 Materiales y Equipos: Balanza analítica 2 Matraz de 125 ml.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 5.E.2.2 Reactivos y nutrientes: Sacarosa Extracto de levadura Extracto de malta Solución de sales Agua destilada Alcohol 5. pHmetro.3. Varilla de vidrio Balanza analítica Gasa y algodón Papel aluminio – capachitos.A.3 PREPARACIÓN DE MEDIO DE FERMENTACIÓN: 5.2. Una probeta de 100ml Micropipeta Estufa Algodón Gasa Varilla de vidrio Espátula 5. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 35 .1 Materiales y Equipos: Matraz de 1 L 2 Matraces de 125 ml.2 PREPARACIÓN DE MEDIO DE ACTIVACIÓN: 5. 6.4 INOCULACIÓN AL MEDIO DE ACTIVACIÓN: 5.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 5.3.5.4.sólido ) 5.1 Materiales y equipos Matraz de 125 ml. 5. Algodón LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 36 .A. Algodón Gasa Agua destilada Aza bacteriológica Shaker Mechero Bunsen.6 ACTIVACIÓN CELULAR Y DESARROLLO DEL INÓCULO 5.O.E. trípode y rejilla.7H2O Extracto de Levadura Agua destilada Alcohol 5. trípode y rejilla 5.5 RESIEMBRA CELULAR (Solido .1 Materiales y equipos Aza bacteriológica Tubo de ensayo con medio sólido donde se encuentra el M.1 Materiales y equipos Matraz de 125 ml. Mechero Bunsen.2 Reactivos y nutrientes: Sacarosa (NH4)2SO4 Solución de sales KH2PO4 MgSO4. P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Gasa Agua destilada Aza bacteriológica Shaker Mechero Bunsen.2 Reactivos Muestra del medio.A.8. Centrífuga. Estufa.8.E.1 Materiales y equipos Matraz de 1 L conteniendo el medio de fermentación Espectrofotómetro pHmetro Gasa y algodón Centrifuga Tubos de ensayo Capachos de papel aluminio 5.7 DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LA BIOMASA 5.1 Materiales y equipos Espectrofotómetro. 5.8 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR POR DENSIDAD ÓPTICA: 5. trípode y rejilla 5. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 37 . Agua destilada.7. el simple empleo de circuitos electrónicos no elimina las interacciones del sistema con el ambiente. están bastante desarrolladas de manera que no es necesaria la utilización de cuartos especiales para la medida del peso.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 5.9 DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES: MÉTODO DEL DNS (ÁCIDO DINITROSALICÍLICO) 5. Agitador magnético.2 Reactivos 10 g /L de ácido 3. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 38 . Gradilla 5. De estos.9. 2 Vasos de precipitado de 1 litro Matraz de aforo de 1 litro. Pipeta.1 µg a 0. Balanza analítica Espátula. Mechero bunsen. Aun así.10 INSTRUMENTOS Balanza analítica La balanza analítica es una clase de balanza utilizada principalmente para medir pequeñas masas.E. Las balanzas analíticas modernas. Este tipo de balanza es uno de los instrumentos de medida más usados en laboratorio y de la cual dependen básicamente todos los resultados analíticos. Papel aluminio – capachitos.1 Materiales y equipos Espectrofotómetro.A.5 dinitrosalicilico (DNS) 200 mL / L de NaOH 2N 300 g/L de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado Sacarosa Estándar 5.9. que pueden ofrecer valores de precisión de lectura de 0.1 mg. También pueden tener movimientos de balanceo o vibraciones. que es el extremo LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 39 . Algunas perforaciones en los laterales del tubo permiten la entrada de aire en el flujo de gas (gracias al efecto Venturi) proporcionando una mezcla inflamable a la salida de los gases en la parte superior del tubo donde se produce la combustión. El quemador tiene una base pesada en la que se introduce el suministro de gas. muy eficaz para la química avanzada. Se emplean para mover cultivos celulares.A. matraces de distintos volúmenes con sus respectivos tampones para evitar el despilfarro de soluciones. pudiendo modificar el número de las revoluciones y la temperatura. en este caso. La determinación de pH consiste en medir el potencial que se desarrolla a través de una fina membrana de vidrio que separa disoluciones con diferente concentración de protones. Mechero Bunsen Es un instrumento utilizado en los laboratorios científicos para calentar o esterilizar muestras o reactivos químicos. cloruro de mercurio) y otro de vidrio. A veces tienen un control termostático adicional. pHmetro Es un sensor utilizado en el método electroquímico para medir el pH de una disolución. El movimiento puede ser orbital o de balanceo. La varita de soporte del electrodo es de vidrio común y no es conductor. mientras que el bulbo sensible.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL los efectos físicos son los más importantes porque no pueden ser suprimidos. Shaker Tiene como función agitar los recipientes. sumergidos en la disolución de la que queremos medir el pH. Una celda para la medida de pH consiste en un par de electrodos.E. En consecuencia se conoce muy bien la sensibilidad y la selectividad de las membranas de vidrio durante el pH. uno de calomel (mercurio. De allí parte un tubo vertical por el que el gas fluye atravesando un pequeño agujero en el fondo de tubo. está formado por un vidrio polarizable (vidrio sensible de pH). en función de la longitud de onda.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL sensible del electrodo.E. Incubadora Dispositivo que sirve para mantener y hacer crecer cultivos microbiológicos o cultivos celulares. Espectrofotómetro Sirve para medir. la humedad y otras condiciones en grado óptimo. Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. y no debe ser confundido con un espectrómetro de masa.1Hay varios tipos de espectrofotómetros. El fundamento de la autoclave es que coagula las proteínas de los microorganismos debido a la presión y temperatura. También es utilizado en los laboratorios de química para la cuantificación de sustancias y microorganismos. evitando con las altas presiones que el agua llegue a ebullir a pesar de su alta temperatura. Autoclave Una autoclave de laboratorio es un dispositivo que sirve para esterilizar material de laboratorio. tal como los priones.A. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 40 . la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o reacciones químicas que se miden en una muestra. utilizando vapor de agua a alta presión y temperatura. aunque recientemente se ha llegado a saber de algunas formas a celulares. La incubadora mantiene la temperatura. puede ser de absorción atómica. que pueden soportar las temperaturas de autoclave. tales como el contenido dedióxido de carbono (CO2) y de oxígeno en su atmósfera interior. de absorción molecular (que comúnmente se conoce como espectrofotómetro UV-VIS). En términos generales. la operación de un birreactor puede ser de tres modos distintos: Lote (batch) Lote alimentado (fed-batch) Continuo o quimiostato Unidad de control El diseño compacto de la unidad de control centraliza todos los componentes.A. Control automático de proceso de pH. variando en tamaño desde algunos mililitros hasta metros cúbicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable. Estos biorreactores son comúnmente cilíndricos. mezcla de gas. nivel de espuma y bomba de sustrato.E. etcétera) al organismo o sustancia química que se cultiva. En función de los flujos de entrada y salida. un biorreactor es un recipiente en el que se lleva a cabo un proceso químico que involucra organismos o sustancias bioquímicamente activas derivadas de dichos organismos. temperatura. ayudando especialmente en el ahorro de espacio. Todo en una sola carcasa. En algunos casos. pO2. Este proceso puede ser aeróbico o anaeróbio. espuma. un birreactor busca mantener ciertas condiciones ambientales propicias (pH.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Bioreactor Es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente biológicamente activo. velocidad de agitación. Los sistemas pre configurados para las aplicaciones LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 41 . tales como: Sistema electrónico de control y medida. Estos dispositivos se encuentran en desarrollo para su uso en ingeniería de tejidos. Un biorreactor puede ser también un dispositivo o sistema empleado para hacer crecer células o tejidos en operaciones de cultivo celular. Bombas con cabezales expuestos. Sistemas de control de temperatura oxígeno. concentración de oxígeno. interfaces para cuatro gases (aire.42 a 4. La LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 42 .P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL microbianas o de cultivo celular facilitan la selección y permiten un inicio rápido y sin complicaciones en el laboratorio.E. El software de control puede adquirirse también por separado para poder utilizar los ordenadores ya disponibles.2 . Para aplicaciones de cultivo celular. O2. Figura 1: Biorreactor con unidad de control compacta acoplado al tanque de agitación y ordenador para control de datos. Sólo tiene que conectar el tubo de aireación. El sistema incluye además un potente ordenador portátil para el control del biorreactor así como el software BioPAT® MFCS/DA para la adquisición y evaluación de los datos. Simple y control automático de aireación El sistema de aireación de la BIOSTAT® A plus proporciona control de flujo continuo sobre el rango de cada gas utilizado. CO2 y N2) están disponibles para la OD y el control del pH.A. configurar de manera pulsada cuenta con una boya flotante en la que se regula el flujo de aire que ingresara al bioreactor este se mide en el centro de la circunferencia y va desde 0. Figura 2: Colocación de los conductos Figura 3: Sistema de control de silicona esterilizables en la unidad de manual de flujo de aire. previamente ya esterilizado.E. que es modulado por el centro de control en el rotámetro donde controlamos el flujo de aire.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL versión microbiana cuenta con dos líneas de gas (aire y O2) para el control del OD. donde podemos fijar las condiciones como pH. temperatura. sobre uno de los agujeros en la tapa del fermentador y se LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 43 . Y para el caso específico de darle la aireación se tiene el compresor de aire de diafragma. Carga y descarga: Para cargar primero se toman las condiciones de asepsia para evitar cualquier contaminación. velocidad de agitación. reflujo de agua. se coloca en el autoclave por 2 horas aproximadamente. luego se coloca un embudo.A. control Operación: El equipo “Fermentador automatizado Biostat – A Plus de 3 litros” es operado desde el software que es accionado desde la laptop. Esterilización: Se esteriliza todo el fermentador menos los sensores. Las muestras se van a tomar a un nivel entre los dos rotores. En un extremo está el elemento sensible (Sensor RTD) y en el otro está el terminal eléctrico de los cables protegido dentro de una caja redonda de aluminio (cabezal).E. un tubo hueco. Este sensor PT100 es el corazón sensible a la temperatura de cualquier termómetro de resistencia. El incremento de la resistencia de la PT100 no es lineal pero si creciente y característico del platino de tal forma que mediante tablas es posible encontrar la temperatura exacta a la que corresponde.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL inocula el medio de fermentación con el medio de activación vaciando en el fermentador. Toma de muestras: Las muestras son tomadas por succión. Con la jeringa se succiona 5ml de muestra y se vacía en el tubo de ensayo.A. luego se cierra el conducto a presión con las pequeñas prensas. SENSORES: Sensor de temperatura: Función: Es un sensor de temperatura que a 0 °C tiene 100 ohms y que al aumentar la temperatura aumenta su resistencia eléctrica. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 44 . Antes de tomar la muestra se debe sacar con la jeringa 3ml. por el conducto para tomar muestras. que son los que se contienen en el conducto. E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Sensor de pH: Función: Para realizar la medición de pH se usan básicamente los sensores electroquímicos translucen la actividad química del ión de hidrógeno en una señal eléctrica. Los componentes básicos de un sensor electroquímico son un electrodo de trabajo (que detecta), un contra electrodo y generalmente también un electrodo de referencia. Estos se encuentran dentro de la carcasa del sensor y en contacto con un líquido electrolítico. Calibración: La calibración del medidor de pH varía dependiendo del fabricante, pero básicamente el método es el siguiente. Primero, limpie el bulbo de vidrio del electrodo sumergiéndolo en agua destilada, muévalo para apartar los restos de la solución del sustrato, luego saque el electrodo y déjelo secarse. Siguiente, encienda el medidor en el modo de calibración. Debe de verter la solución de calibración 4,0 en un vaso y después sumerja el electrodo en ella. Una vez que se calibra en la solución de 4,0, el número 7,0 va a comenzar a parpadear. Enjuague el electrodo con agua destilada, déjelo secar y luego sumérjalo en la solución de calibración de 7,0. Una vez que para de parpadear, está calibrado y listo para utilizarse. Descarte las soluciones de calibración; no vuelva a vaciar la solución en el envase original. La calibración debe de realizarse el día que se va a usar el medidor. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 45 E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Sensor de Oxigeno: Función: Los sensores de medición de oxígeno disuelto (OD) consisten básicamente de una camisa de acero inoxidable o de cristal que contiene dos electrodos y un electrolito adecuado. Para separar los electrodos y los electrolitos del caldo de fermentación, el sensor está cubierto por una membrana. El oxígeno difunde a través de la membrana y se reduce en el cátodo, que está polarizado negativamente con respecto al ánodo. Esto produce una corriente que puede ser traducida como concentración de oxígeno Calibración: El método más simple para calibrar este sensor es en aire, ya que si el Agua está saturada en aire la presión parcial de O.D. en agua será la misma que este tiene en aire. De este modo se obtiene el 100%. El 0% se logra mediante una solución saturada en Bisulfito de Sodio. Aguardar en cada caso a que la medición se encuentre estabilizada previo a tomar las mediciones, esto puede tomar unos 10 minutos aproximadamente. Sensor de Espuma: Métodos mecánicos: Consisten de adaptaciones de disco rotatorios montados sobre el eje principal de agitación. Estos dispositivos aseguran una buena eliminación de espuma, con la desventaja de que consumen elevadas cantidades de energía, lo cual se refleja en un incremento en los costos de producción. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 46 E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Métodos químicos Se realizan con la ayuda de agente antiespumantes los cuales pueden ser suministrados de forma automática. Algunos antiespumantes son metabolizados por los microorganismos, por lo cual pueden ser considerados como una fuente de carbono adicional VI. PROCEDIMIENTO 6.1 Preparación Del Medio De Mantención De acuerdo con la tabla N° 01, se pesaron las cantidades requeridas, haciendo uso de la balanza analítica. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 47 en un matraz Erlenmeyer. y en caliente se le adicionó entre 6- 7ml de la mezcla a cada tubo con la ayuda de una pipeta de 10 ml. y se tapó inmediatamente.A. Se calentó el matraz en el mechero Bunsen agitando constantemente con ayuda de una varilla de vidrio. a partir de lo cual controlamos 2 minutos. y después se le agregó los 50 ml de agua destilada ya medidos. Se preparó 6 tubos de ensayo con tapa. hasta la aparición de la primera burbuja.E. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 48 .P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Se mezcló todos los compuestos ya pesados. previamente se aflojaron las tapas. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 49 . Se ajustó las tapas de los tubos y luego se les colocó en posición inclinada a temperatura ambiente.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Luego se colocó los tubos en un vaso de precipitado y se puso dentro de la olla a presión. para permitir el intercambio de gases.A. Finalizando la esterilización.E. Se calentó hasta que la temperatura alcanzó los 121°C y a partir de ello se controló 20 min. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 50 .E.2 Resiembra Celular (Solido .P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 6. Luego se llevó a la incubadora a 30 °C durante 48 h.sólido ) Para la resiembra se siguieron las técnicas de asepsia y se colocó bajo mechero para mantener un ambiente estéril. La azada se realizó en el tubo desde adentro hacia fuera. El asa bacteriológica se sometió a fuego hasta alcanzar el rojo vivo. El procedimiento de resiembra se hizo en los tubos de ensayos preparados con medio sólido (con agar).A. 5 4 1.25 1.3 Determinación de La Curva de Calibrado de DNS (Ácido Dinitrosalicílico) Hidrólisis acida de la muestra Se tuvo una solución estándar de Sacarosa 2g/L. de la cual se prepararon 8 tubos de ensayo a diferentes concentraciones.E.l50 1.5 8 0 2 0 LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 51 .5 1.75 0.75 7 0.A. indicados en la siguiente tabla: N° Tubo ml.75 3 1. Agua Concentración Stándar destilada g/l 1 2 0 2 2 1.25 0.5 0.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 6.75 1.75 1.25 5 1 1 1 6 0. Solución ml.25 0.5 0. 7M y se llevó nuevamente al agitador de tubos. Luego se agregó 3.A. Seguido se colocó el vaso precipitado con los tubos en baño con hielo por 3 minutos.E. se les agregó a cada uno 0. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 52 .5 ml de NaOH 1. Se colocó los 8 tubos de ensayo en un vaso precipitado y se llevó a baño María a 60 °C por 10 minutos.5 ml de HCl concentrado y se agitó bien en el agitador de tubos.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL A los 8 tubos que contenían diferentes concentraciones de sacarosa. luego se llevó a agua con hielo por 3 minutos.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Reactivo DNS Se rotuló 8 tubos de ensayo con tapas y de las muestras de la Hidrólisis Acida. Se adición 500 µl de DNS a cada tubo y luego se llevaron a ebullición por 5.A.E. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 53 . se cogió con una micropipeta 500 µl de cada una de ella y se vacío a estos tubos. se agitó en el Maxi mix 8agitador de tubos).E.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Luego con una pipeta. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 54 .A. se agregó 5 ml de agua destilada a cada tubo. Luego se llevó al espectrofotómetro y a 540 nm se midió la absorbancia. y se dejó reposar por 15 minutos. Después de reposar los tubos. se colocó el tubo con la muestra en el equipo y se leyó su absorbancia. se leyó la absorbancia a 540 nm. De la misma forma se leyó las absorbancias de las muestras de los tubos restantes. Luego se calibró el espectrofotómetro con DNS (blanco). se retiró el tubo con agua destilada. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 55 . Después se realizó la lectura de cada tubo. simultáneamente se había colocado en el equipo otro tubo con agua destilada.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL LECTURA EN EL ESPECTROFOTÓMETRO A 540nm – CURVA DE CALIBRADO DNS: Se había encendido el equipo al inicio de la práctica.E.A. para ello se vació la muestra en el tubo o celda del espectrofotómetro. Así se obtuvo los datos para la curva de calibrado de DNS. y seguido se lavó el tubo (3 veces con agua destilada). Seguido se vació la muestra del segundo tubo en el tubo que se lavó. En un matraz de 125ml se adicionó la glucosa y se agregó 15ml de agua destilada. Se pesó todos los componentes descritos en la tabla N°02 en la balanza analítica para un medio de activación de 25 ml.4 Preparación Del Medio De Activación para la curva de Calibrado de Biomasa.E. Previo a esto se elaboró un tapón hecho de gaza y algodón.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 6. para colocarlo en el matraz para evitar la contaminación del medio. en otro tubo se agregó la solución de sales y agregamos 5ml de agua destilada.A. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 56 . En un tubo de ensayo se colocó el extracto de levadura y malta y se le agregó 5ml de agua destilada. se vació el contenido de los tubos al matraz. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 57 . Luego se inoculó (en el medio de activación) y se llevó el matraz al Shaker por 10h a 35°C y 200rpm. se controló 15 minutos a partir de la primera burbuja. además dentro de la olla se colocó cartón para evitar que se rompan los materiales de vidrio. Luego de enfriar. así se tuvo preparado el medio de activación con todas las indicaciones de asepsia.E. en torno al mechero.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Luego se llevaron a esterilizar los 2 tubos y el matraz en la olla a presión.A. se cubrió los tapones con papel aluminio. para tener el mismo medio de activación para los 3 subgrupos. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 58 . seguido se eliminó el sobrenadante y se quedó con el pellet (sólido).P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Después de las 10 horas se sacaron los matraces del Shaker. luego se agregó tampón citrato (aprox. se procedió a vaciar el contenido en un solo matraz.E. 5ml).A. De aquí se obtiene un promedio de absorbancia para el valor de 1:1 (sin dilución) Luego se centrifugó los 4 tubos por 15 minutos. Luego se sacaron 4 muestras de 5 ml del matraz y se les midió absorbancia en el espectrofotómetro a 640 nm. E. por 12 horas a 80 °C. se colocaron en el desecador por media hora. al final se quedó el pellets en los tubos. Luego se colocó los pellets en los capachos.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Se agitó y se volvió a centrifugar en el Vortex (centrifuga) por 20 minutos. Así se obtuvo el peso seco de cada capacho. Luego se procedió a pesar cada capacho. nuevamente se agregó solución tampón y se centrifugó. el promedio de este sirvió para saber la concentración de biomasa en el medio de activación (g/ml). Se colocó los capachos con pellets en la estufa. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 59 . Después que se retiró los capachos de la estufa (día siguiente).A. luego se volvió a botar el sobrenadante. que previamente habían sido rotulados y colocados en la estufa. 970 01:04 01 01 0.A.607 01:07 01 06 0. A los cuales se les medió absorbancia en el espectrofotómetro a 640nm.453 LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 60 .712 01:06 01 04 0.E.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Con lo que quedó en el matraz de medio de activación se hizo diluciones según la tabla siguiente.790 01:05 01 02 0. CON LO CUAL SE OBTUVO LA CURVA DE CALIBRADO DE Diluciones Biomasa Agua destilada Absorbancia (ml) (ml) 640nm 01:03 01 0 0.530 01:8 01 09 0. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 61 .E.A. En un tubo de ensayo se colocó el extracto de levadura y malta y se le agregó 5ml de agua destilada. Se pesó todos los componentes descritos en la tabla N°02 en la balanza analítica para un medio de activación de 25 ml. En un matraz de 125ml se adicionó la glucosa y se agregó 15ml de agua destilada. Previo a esto se elaboró un tapón hecho de gaza y algodón.5 Preparación Del Medio De Activación para la Cinética. en otro tubo se agregó la solución de 9 sales y agregamos 5ml de agua destilada.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 6. para colocarlo en el matraz para evitar la contaminación del medio. además dentro de la olla se colocó cartón para evitar que se rompan los materiales de vidrio. Luego se inoculó (en el medio de activación) y se llevó el matraz al Shaker por 10h a 35°C y 200rpm. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 62 . así se tuvo preparado el medio de activación con todas las indicaciones de asepsia.E. en torno al mechero. se vació el contenido de los tubos al matraz.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Luego se llevaron a esterilizar los 2 tubos y el matraz en la olla a presión.A. Luego de enfriar. se controló 15 minutos a partir de la primera burbuja. se cubrió los tapones con papel aluminio. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 63 .A. Se disolvió el compuesto con agua destilada de la siguiente manera: Sacarosa en un matraz de 500ml con 76 ml de agua destilada.6 Preparación Del Medio De Fermentación para la Cinética. (NH4)2SO4 + KH2PO4 + MgSO4. Extracto de levadura en un tubo con 10 ml de agua destilada. Dentro de los 76 ml de H2O destilada se consideró 2ml por las pérdidas en evaporación durante la esterilización.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 6.E.7H2O + 10 ml tampón citrato + 1ml de solución de sales. sobre capachos de papel aluminio. De acuerdo con la tabla N° 03. se pesó las cantidades requeridas en la balanza analítica. A. (a partir de la primera burbuja).P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Se esterilizó las diluciones en la olla a presión por 15min.E. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 64 . se dejó enfriar y luego se envolvió con papel para ser guardado en la refrigeradora. Terminada la esterilización. Se vaciaron las mezclas de los tubos en el matraz (con su debido flameado). Seguido se colocó en la estufa el medio de activación (debió estar 1 hora pero solo se colocó por 40 minutos).E.7 Determinación De La Cinética De Crecimiento De La Biomasa Debido a que la preparación del Medio de Activación y las diluciones del medio de Fermentación se preparó la semana anterior. Cerca al mechero se preparó el medio de fermentación. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 65 . Y se dejó que las diluciones del medio de fermentación se descongelen. se retiraron del congelador. El medio de fermentación era un medio traslúcido.A. Seguido se agitó el medio de activación y se tomó de él 5ml los cuales se colocaron en el medio de fermentación. Se sacó los 3 matraces de medio de activación de la incubadora y se mezclaron frente al mechero.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 6. para las próximas lecturas.E. Todas las lecturas registradas a través de las horas de fermentación se anotaron en una hoja de registro para ir evaluando el crecimiento de las levaduras durante 11 horas. y se realizó la lectura a 640 nm. Los 5 ml de muestra se agregaron en una celda del espectrofotómetro. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 66 . Se colocó el matraz en el Shaker.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Con una pipeta limpia y estéril se procedió a sacar 5 ml del medio de activación.A. y se colocó el sobrenadante en un vial.E. Terminado la centrifugación.A. para su posterior análisis de azucares reductores. El sobrenadante depositado en los viales se colocaron en un recipiente (taper). LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 67 . y este se colocó en la refrigeradora. y este se centrifugó por 15 minutos. – DNS. se retiró el tubo de ensayo. el cual se tapó.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Una vez realizada la lectura en el espectrofotómetro. la muestra de la celda se colocó en un tubo de ensayo. Se tuvo cuidado de que las levaduras no se combinen con el sobrenadante. E.8 Determinación De Azúcares Reductores: Método Del Dns (Ácido Dinitrosalicílico) Hidrólisis acida de la muestra Se colocó las muestras de los viales en tubos de ensayo.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 6. Seguido de la agitación se llevó los 5 tubos de ensayo a Baño María a 60°C por 10 minutos.5 ml de HCl concentrado luego se agitó bien en el agitador de tubos. 2 ml y se les agregó a cada uno 0. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 68 .A. P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Después se colocó en baño con hielo por 3 minutos.70M y se agitó en el agitador de tubos. Reactivo DNS De las muestras de la Hidrólisis Acida.E. a continuación se le adicionó a cada tubo 3. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 69 . se cogió con una micropipeta 500 µl de cada una de ella y se vacío a estos tubos.A. Seguido se adicionó 500 µl de DNS a cada tubo.5ml de NaOH 1. E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Se llevó los tubos a ebullición por 5, luego se llevó a agua con hielo por 3 minutos. Luego con una pipeta se agregó 5 ml de agua destilada a cada tubo, y luego dejar reposar durante 15 minutos. Después de reposar los tubos, se agitó en el agitador de tubos - Maxi mix. Luego se procedió a leer a 540 nm en el espectrofotómetro. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 70 E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL LECTURA EN EL ESPECTROFOTÓMETRO A 540nm: Se calibró el espectrofotómetro con DNS (blanco). Después se realizó la lectura de cada tubo (5 tubos), para ello se vació la muestra en el tubo o celda del espectrofotómetro, se leyó la absorbancia a 540 nm, y seguido se lavó el tubo (3 veces con agua destilada), simultáneamente se había colocado en el equipo otro tubo con agua destilada. Seguido se vació la muestra del segundo tubo en el tubo que se lavó, se retiró el tubo con agua destilada, se colocó el tubo con la muestra en el equipo y se leyó su absorbancia. De la misma forma se leyó las absorbancias de las muestras de los tubos restantes. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 71 E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL VII. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES O TAREAS: DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES DE Pichia stipitis NRRL Y-7124 DÍA ACTIVIDAD 12/06/17 Presentación del preinforme. Preparación del medio de mantención. 13/06/17 Preparación del DNS. Curva de calibrado para DNS. 14/06/17 Resiembra en medio de mantención. Preparación del medio de activación. 16/06/17 Activación del microorganismo. Curva de calibrado para peso seco de biomasa. Esterilización de pipetas y preparación de viales. 20/06/17 Preparación del inoculo. Seguimiento de cinética en cultivo por lote. Seguimiento de cinética microbiana por CLA. 21/06/17 Análisis DNS 03/07/17 Presentación del informe final LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 72 P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Plan de Muestreos y Registro de Datos Grupo: C-2 Día de la experiencia: 21/06/17 Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 Fuente Carbono: Sacarosa pH 4.2 T °C: 35°C N rpm: 220 rpm V∘=1L Vf=2L Tcla= 6h TIEMPO Absorbancia Nombre del Nº HORA Observaciones (horas) (640 nm) alumno 01 0 Todos 02 03 04 05 06 CLA TIEMPO Absorbancia Nombre del HORA Observaciones (horas) (640 nm) alumno 01 02 03 04 05 06 07 LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 73 .A.E. 7875 X prom (g/L) 0.65 0.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL VIII.866666667g/L [X] ABS 0.0062 0.73 0.1907 0.12 0.2424 0. de un caldo de medio de activación de 20 mL de volumen fermentado en matraz de 125 mL N° CAPACHO PESO (g) PESO+CELULAS g CELULAS X (g/L) 1 0.775 3 0.6375 2 0.1879 0.854 0.0063 0.0051 0.47 0.157 LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 74 .2487 0. RESULTADOS Y DISCUSIONES Volumen de muestra 8 ml diluido 1:8.962 0.475 0.2 0. E.36 0.613 0.1817 0.73333333 La concentración del caldo es: C=8*X promedio =5.1958 0.A.15 0. 2 0 0 0.856 13 0.6 0.E.2 1 y = 1.6 0.8 [X] Se obtuvieron los resultados finales de absorbancia de cada muestra: N° MUESTRA ABS 1 0.646 7 0.816 12 0.4 0.7 0.912 14 0.5 0.4 0.376 2 0.521 3 0.3 0.8 ABS 0.A.723 5 0.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 1.709 9 0.827 11 0.951 LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 75 .882 6 0.3178x + 3*10^(-16) R² = 1 0.774 10 0.1 0.685 8 0.2 0.762 4 0. 339 4:30:00 1.5 1 0.887 3.079 5:30:00 2.961 5:00:00 2.598 9:00:00 2.395 2:00:00 0. este crecimiento que se figura en la gráfica es producto de que la biomasa como tiene más medio para vivir sigue reproduciéndose.51 7:30:00 2.5 CLA CL 3 2.097 3:30:00 1.5 BIOMASA [X] 2 1. E.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Reemplazando en la curva de calibrado mis datos de las nuevas absorbancias para asi hallar la curva de t vs [X] t (horas: min) [X] 0:00:00 0. el crecimiento de biomasa en fase alimentada comienza en el punto de inicio de la fase estacionaria del cultivo por lote.477 8:00:00 2.285 1:00:00 0.578 3:00:00 1.A.152 6:30:00 2.349 7:00:00 2.5 0 0:00:00 1:12:00 2:24:00 3:36:00 4:48:00 6:00:00 7:12:00 8:24:00 9:36:00 10:48:00 TIEMPO (horas : minutos) En la imagen se observa que el crecimiento por lote nos da un crecimiento inferior que un alimentado de biomasa.768 9:30:00 2. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 76 . 5 0 0 0:00:00 1:12:00 2:24:00 3:36:00 4:48:00 6:00:00 7:12:00 8:24:00 9:36:00 10:48:00 Tiempo (horas : minutos) [X] [S] En la gráfica se nota que el crecimiento de biomasa esta en relación a la disminución de sustrato.36 1:00:00 0.849 2:00:00 0. E.5 2 3 1.152 0.202 8:00:00 2.079 0.395 3.095 3:00:00 1.097 0.526 3:30:00 1.289 9:30:00 2.768 0.219 7:00:00 2.A.5 2 1 1 0.196 9:00:00 2.477 0.441 4 6 CLA Concentración de sacarosa (g/L) Concentración de biomasa (g/L) 3.887 0.289 6:30:00 2.578 3.231 5:30:00 2.598 0.339 0.961 0.228 5:00:00 2.111 4:30:00 1.51 0.278 7:30:00 2.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL En el proceso de DNS obtuvimos las concentraciones de sustrato durante el periodo de lote y alimentación: t (horas:min) [X] [S] 0:00:00 0.349 0. pero se recalca que en el medio alimentado la disminución de sustrato se hace casi constante pues la alimentación es pequeña y cada vez que se consume el sustrato lo compensa la alimentación.5 CL 5 3 4 2.285 4. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 77 . El medio adecuado para la mantención de un cultivo debe poseer una fuente de carbono. E. g/L de biomasa para iniciar la fermentación. En el desarrollo de la fermentación notamos que el consumo del nutriente es más acelerado que el crecimiento de la biomasa. CONCLUSIONES Se logró diseñar el medio de cultivo con los componentes necesarios para lograr crecimiento óptimo de Saccaharomyces cerevisiae ATCC 4126. LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 78 . fuente de carbono. nitrógeno y sales en cantidades adecuadas para así satisfacer los requerimientos nutricionales del microbio y favorecer la reproducción celular y la producción de etanol. La activación celular permitió el reinicio de las actividades metabólicas de la Saccaharomyces cerevisiae con el desarrollo del inóculo se alcanzó una cantidad inicial de………. El diseño de los diferentes medios tanto activación como fermentación debe tener la adecuada cantidad de fuente de N.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL IX.A. vitaminas (extracto de levadura) y otros (las demás sales usadas) para que Saccharomyces cerevisiae pueda desarrollarse. QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo.com/doc/14173118/4-Esterilizacion-y-Preparacion-de- Medios-de-Cultivo http://www.org/Simbio/mbio_ind/cap4_mi. Editorial McGraw-Hill de México.org/Simbio/mbio_ind/cap4_mi. y Bouix.c erevisiae.science. Leveau.oas. Ingeniería Bioquímica http://www./ Biomass and Bioenergy 90 (2016) 32-41 Microbiologia.science.htm http://www.com/C3CBCL.pe/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=7&ve d=0CEUQFjAG&url=http%3A%2F%2Ffcq- microdealimentos.pdf http://biorreactores. Li et al.A. J.org/Simbio/mbio_ind/cap4_mi. S. Reid D.org/Simbio/mbio_ind/cap4_mi.pdf http://biorreactores.g de Biomasa/g de Fructosa.com/ciencia64_02. (2000).C. X.tripod. M. 1982.com/C3CBCL. E.com/ciencia64_02. Pelczar J.oas.com%2Ffile%2Fview%2FCientica%2Bde%2BS.pdf http://es. un td= …… hr.science. YX/S = ………. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: Y. Zaragoza. Los Microorganismos de Interés Industrial.oas. Microbiología Industrial./ Enzyme and Microbial Technology 41 (2007) 312-317 A.acenologia. 2da Edición. 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E.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 81 .A. 15𝑔 𝑝𝑒𝑝𝑡𝑜𝑛𝑎 ∶ 5𝑔 → 1000𝑚𝑙 𝑥 → 50𝑚𝑙 𝑥 = 0.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL DISEÑO DEL MEDIO DE MANTENCIÓN (50 ML) Nutriente Concentración (g/l) Extracto de Levadura 3 Peptona 5 Extracto de Malta 3 Agar 20 Glucosa 10 Cálculos: 𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎 ∶ 3𝑔 → 1000𝑚𝑙 𝑥 → 50𝑚𝑙 𝑥 = 0.A.15𝑔 LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 82 .25𝑔 𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑚𝑎𝑙𝑡𝑎 ∶ 3𝑔 → 1000𝑚𝑙 𝑥 → 50𝑚𝑙 𝑥 = 0.E. P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 𝐴𝑔𝑎𝑟 ∶ 20𝑔 → 1000𝑚𝑙 𝑥 → 50𝑚𝑙 𝑥 = 1𝑔 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 ∶ 10𝑔 → 1000𝑚𝑙 𝑥 → 50𝑚𝑙 𝑥 = 0.E.5𝑔 DISEÑO DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN (15 ML) Nutriente Concentración (g/l) 5 Sacarosa 3 Extracto de levadura 5 Extracto de malta 5 ml/L Solución de sales 𝑆𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 ∶ 5𝑔 → 1000𝑚𝑙 𝑥 → 15𝑚𝑙 𝑥 = 0.075𝑔 LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 83 .A. A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL 𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎 ∶ 3𝑔 → 1000𝑚𝑙 𝑥 → 15𝑚𝑙 𝑥 = 0.075𝑚 DISEÑO DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN Hallamos porcentaje de nutrientes: 𝐶12 𝐻22 𝑂11 PM = 342 gr/mol LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 84 .075𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑙𝑒𝑠 (𝑙𝑖𝑞𝑢𝑖𝑑𝑜) ∶ 5𝑚𝑙 → 1000𝑚𝑙 𝑥 → 15𝑚𝑙 𝑥 = 0.E.045𝑔 𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑚𝑎𝑙𝑡𝑎 ∶ 5𝑔 → 1000𝑚𝑙 𝑥 → 15𝑚𝑙 𝑥 = 0. P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL HALLAMOS EL % NUTRIENTE 𝑃𝑀𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑥𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 %𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = 𝑥100 𝑃𝑀𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜 12𝑥12 %𝐶 = 𝑥100 342 %𝐶 = 42.24% KH2PO4 P 22.A.79% KH2PO4 K 28.68% MgSO4.11% % Elemento Nutriente Fuente Nutriente C12H22O11 C 42.86% LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 85 .21% (NH4)2SO4 S 24.11% (NH4)2SO4 N 21.7H2O Mg 19.E. 11 𝑌 𝑥⁄𝑠 = 𝑥0.468𝑔𝑟/𝑔𝑟 Hallamos el So ∆𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑆0 = 𝑌𝑥/𝑠 2 𝑆0 = 0.468 𝑆0 = 4.39 gr/l C 45% N 9% Mg 0.0% Hallamos para el C: 𝑌 𝑥⁄𝑠 .5 %𝑛𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑌 𝑥⁄𝑠 = 𝑥𝑓 %𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 42.4% K 0. 𝑓 = 0.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL PORCENTAJE DE BIOMASA: Composición elemental de la Saccharomyce.5% P 2.5 45 𝑌 𝑥⁄𝑠 = 0.E. XF=3.273𝑔𝑟/𝑙 LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 86 .A. VF= 1L. 39 𝑆0 = 2.A.06 𝑔𝑟/𝑚𝑜𝑙 Hallamos el % nutriente 𝑃𝑀𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑥𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 %𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = 𝑥100 𝑃𝑀𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜 14𝑥2 %𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = 𝑥100 132.36 𝑆0 = 1.436 𝑔𝑟 /𝑙 LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 87 .06 %𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = 21.36𝑔𝑟/𝑔𝑟 Hallamos el So ∆𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑆0 = 𝑌𝑥/𝑠 3.2 𝑌 𝑥⁄𝑠 = 2 𝑌 𝑥⁄𝑠 = 2.E.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Sulfato de amonio: (𝑁𝐻4 )2 𝑆𝑂4 𝑃𝑀 = 132.2% Hallamos 𝒀 𝒙⁄𝒔 𝒙 %𝑛𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑌 𝑥⁄𝑠 = %𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 21. 5 𝑌 𝑥⁄𝑠 = 11.A.68 𝑌 𝑥⁄𝑠 = 2.E.68% Hallamos 𝒀 𝒙⁄𝒔 𝒙 %𝑛𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑌 𝑥⁄𝑠 = %𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 28.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL BiFosfato diacido de potasio 𝐾𝐻2 𝑃𝑂4 𝑃𝑀 = 136 Hallamos el % nutriente 𝑃𝑀𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑥𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 %𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = 𝑥100 𝑃𝑀𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜 39𝑥1 %𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = 𝑥100 136 %𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = 28.47 𝑆0 = 0.47 𝑔𝑟/𝑔𝑟 Hallamos el so ∆𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑆0 = 𝑌𝑥/𝑠 3.296 𝑔𝑟/𝑙 LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 88 .39 𝑆0 = 11. 3 %𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = 𝑥100 246.E.47 gr/mol Hallamos el % nutriente 𝑃𝑀𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑥𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 %𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = 𝑥100 𝑃𝑀𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜 24.47 %𝑁𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = 9.65𝑔𝑟/𝑔𝑟 Hallamos el so ∆𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑆0 = 𝑌𝑥/𝑠 3.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Sulfato de magnesio heptahidratado: Hallamos: 𝑀𝑔𝑆𝑂4 .138 𝑔𝑟/𝑙 LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 89 . 7𝐻2 𝑂 Pm= 246.A.86 𝑌 𝑥⁄𝑠 = 0.86% Hallamos 𝒀 𝒙⁄𝒔 𝒙 %𝑛𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑌 𝑥⁄𝑠 = %𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 9.39 𝑆0 = 24.65 𝑆0 = 0.4 𝑌 𝑥⁄𝑠 = 24. 24% KH2PO4 P 22.68% MgSO4.A.86% INSTRUMENTOS Autoclave Mechero Bunsen Incubadora LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 90 .11% (NH4)2SO4 N 21.79% KH2PO4 K 28.E.7H2O Mg 19.21% (NH4)2SO4 S 24.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL % Elemento Nutriente Fuente Nutriente C12H22O11 C 42. P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL pHmetro Balanza analítica Shaker Espectrofotómetro Biorreactor LABORATORIO DE BIOPROCESOS Página 91 .A.E.