Techniques d'hybridation in situ et d'immunohistochimiepeu sensible (difficultés d'accessibilité de la sonde vers sa cible) . soufre 35.Hybridation in situ L'hybridation in situ permet de détecter l'expression d’un ARNm grâce à l’hybridation d’une sonde spécifique complémentaire dans un tissu donné.. tritium... bio-dUTP.. . Les sondes froides sont marquées par un haptène (digoxigénine. biotine) et révélées par un AC couplé à une enzyme (peroxydase. sonde complémentaire ARNm Les sondes chaudes = sondes radioactives révélées par émulsions photographiques (précipitation des grains d'argent): marquage autoradiographique Utilisation de nucléotides radiomarqués: phosphore 32.): détection immunoenzymatique (immunocytochimie) Utilisation de nucléotides modifiés: dig-dUTP.. Avantage: ..très spécifique Inconvénients: .la séquence recherchée doit être en grande quantité . . ) . (Pour les détections immunocytochimiques on ne fait pas de contre-coloration. thionine. après révélation de l'émulsion photographique. -Après 6 semaines d'exposition on procède à des essais de révélation du marquage. . Lorsque le marquage atteint une intensité satisfaisante on procède à la révélation de l'ensemble des lames: les lames sont plongées dans un bain de révélateur puis plongées dans un bain de fixateur photographique.Les lames émulsionnées sont stockées à 4°C à l'abri de la lumière et de l'humidité pendant une période de 6 à 9 semaines.-Détection du marquage microautoradiographique Afin de détecter la présence de la sonde radioactive au niveau cellulaire les lames sont recouvertes d'une fine couche d'émulsion photographique: .les lames sont immergées à l’obscurité brièvement dans l'émulsion et mises à sécher. …) ou à d'autres marquages selon les expérimentations.Observation du marquage microautoradiographique La présence de la sonde radioactive hybridée sur les ARNm recherchés se traduit. . par la présence de grains d'argent sur les cellules. Après un rinçage de 30 minutes à l'eau distillée on peut procéder à la contrecoloration (crésyl violet. . Hybridation in situ: autoradiographie Brightfield Darkfield . NeuN. PSA-NCAM. Exemple: mise en évidence de l’expression de GFAP... peroxydases Complexe Avidine-biotine biotine DAB (diaminobenzidine) + Ni + H2O2 Oxydation Produit coloré AC II biotinylé avidine AC I Antigène .L'immunohistochimie L'immunohistochimie permet de détecter l’expression d’une protéine dans un tissu donné. .Les coupes sont ensuite perméabilisées avec du triton (détergent).Animaux sont perfusés : d’abord avec un tampon hépariné pour éliminer un max de sang puis avec para-formaldéhyde (PAF) 4% = fixe les tissus à l'instant t. .Incubation avec AC primaire (1 nuit).On révèle l’activité enzymatique de la peroxydase de Raiffort avec comme chromogène la diaminobenzidine (DAB) qui par oxydtion devient coloré et l’eau oxygènée comme substrat. .Protocole expérimental: . Si AC secondaire chèvre = sérum de chèvre. . .On supprime les peroxydases endogènes avec du méthanol +H2O2.Coupes du cerveau au vibratome (50 m) dans du tampon phosphate (PBS). . .AC secondaire avec un système d’amplification du signal avidine-Biotine (ABC= avidin-biotin complex).Les coupes sont déshydratées dans des bains d’éthanol (gradient) pour éliminer l'eau des coupes puis montées sur les lames dans une solution gélatinée qui permet à la coupe de coller à la lame. . .On bloque les sites aspécifiques avec du sérum ou BSA. . Immunohistochimie NeuN: révélation avec la DAB . Immunohistochimie fluorescente: observation au microscope à fluorescence AC-p67phox AC-GFAP DAPI Merge . sonde chaude: autoradiographie .double immunohistochimie: .Double marquage .sonde chaude NeuN: protéine (marron) Activin βA: ARNm (points bleus) .double immunoprécipitation (bleu et marron) .immunohisto + hybridation in situ: 1.AC anti-prot 2.sonde froide: immunoprécipitation 2.double hybridation in situ: 1.double immnunofluorescence (émission de 2 longueurs d'onde ≠) . A partir de l’observation du marquage sur les coupes disponibles proposer la (les) structures exprimant ce marqueur. Révélation du marquage ARNm d’un facteur de transcription egr-1 A partir de l’observation du marquage sur les coupes disponibles proposer la (les) structures exprimant ce marqueur. Marquage sonde froide : Révélation du marquage ARNm codant pour le gène de la glutamate décarboxylase (GAD).TD n°3 Objectif : Observer la localisation de différents marqueurs révélés par hybridation in situ ou immunohistochimie et répondre aux diférentes questions I. A votre avis il y a-t-il co-localisation possible entre l’ARNm et la protéine? Révélation du marquage ARNm d’un facteur de transcription NFkB. Dans quelle voie de synthèse intervient cette enzyme Où est situé le marquage ? .Hybridation in situ : Marquage sonde chaude : Révélation du marquage ARNm du transporteur à la dopamine. A partir de l’observation du marquage sur les coupes disponibles proposer la (les) structure (s) exprimant ce marqueur. Quelles sont les difficultés rencontrées par raport à ce marquage ? Proposer une explication. membranaire). Préciser la localisation cellulaire du marquage (nucléaire. Préciser la localisation de la protéine (structures. cytoplasmique.) : Quel type cellulaire est révélé par ce marqueur ? . cytoplasmique. Préciser la localisation cellulaire du marquage (nucléaire. Préciser la localisation de la protéine (structures.) : Quel type cellulaire est révélé par ce marqueur ? Révélation du marquage de la protéine PSA-NCAM (Polysialic acid neuronal cell adhesion molecule) Préciser la localisation cellulaire du marquage (nucléaire. hippocampe. membranaire). hippocampe. Préciser la localisation de la protéine (structures. striatum…. Préciser la localisation de la protéine (structures.) : Quel type cellulaire est révélé par ce marqueur ? Révélation du marquage de la protéine NeuN (facteur de transcription).II. Immunohistochimie : Révélation du marquage de la protéine GFAP (GLIAL FIBRILLARY ACIDIC PROTEIN). striatum…. hippocampe. cytoplasmique. membranaire). striatum…. Préciser la localisation cellulaire du marquage (nucléaire. membranaire). hippocampe. striatum…. cytoplasmique.) : Quel type cellulaire est révélé par ce marqueur ? Révélation du marquage du récepteur aux glucocorticoïdes (facteur de transcription).