EXPERIMENTO 4METODOS CUALITATIVOS PARA LA IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS (MONOSACARIDOS, DISACÁRIDOS Y POLISACARIDOS) REQUISITOS Repasar las estructuras de los principales monosacáridos, disacáridos y polisacáridos OBJETIVOS Identificar por métodos colorimetritos cuantitativos los principales monosacáridos, disacáridos y polisacáridos 1. FUNDAMENTOS Los carbohidratos están distribuidos ampliamente en vegetales y animales en los cuales tiene participación estructural, funcional y metabólica. Los carbohidratos se clasifican dependiendo del numero de átomos de carbono que posee y la función aldehídica o cetonia, estas a su vez le confiere la base para la mayoría de las reacciones usadas para su identificación y cuantificación. Cuando el carbohidrato esta formado por una sola molécula de carbohidrato, se denomina monosacárido, por dos, disacárido y por mas de dos, polisacárido. Los disacáridos son azucares formados por la unión de dos monosacáridos mediante el enlace glucosídico. Si este enlace se efectúa entre dos carbonos anoméricos, el disacárido no tendrá el potencial aldehído o cetona libre, por lo tanto no dan positivas aquellas pruebas que involucren la participación de estos grupos, recibiendo el nombre de azúcar no reductor, la sacarosa y la trealosa son ejemplos de los disacáridos no reductores (ver anexos). Todos los disacáridos que posean un carbono anomérico libre, darán positivas estas reacciones, llamándose azucares reductores, debido a que promueven la reducción del reactivo usado y ellos mismos se oxidan. Aunque la mayoría de los disacáridos carecen de importancia para el hombre, con algunas excepciones como la sacarosa, su estudio se debe a que disacáridos como la maltosa y la celubiosa, se originan como producto de la 47 Prueba de Molish Es una reacción general para carbohidratos que contienen más de 5 átomos de carbono. el almidón. 1. constituido por solo moléculas de glucosa es sin lugar a dudas la base alimenticia del globo terrestre. si son abundantes y representan para el hombre la principal fuente de energía metabólica de fácil aprovechamiento.1.1 1. la maltosa. especialmente en la población de bajos recursos. El fundamento radica en la reducción del acetato cúprico a oxido cuproso.1. la reacción se muestra en la siguiente figura: Figura 1 Reacción de Molish O OH OH OH OH OH CH CH CH CH CH CH2 Hexosa H2SO4 3H2O O HOH3C H Hidroximetil Furfura O C OH O HOH3C O C H + 2 HO H3 C OH O CH OH 1. aunque algunos disacáridos (los reductores) dan positiva la reacción. por ejemplo. se muestran las estructuras de los principales mono.1 Fundamentos químicos de las pruebas.hidrólisis de polisacáridos. 48 . di y polisacáridos. ya que así se hidroliza el disacárido. La positividad se reconoce por la formación de una coloración verde botella brillante. Los polisacáridos. es el producto de la hidrólisis del glucógeno y el almidón. En el anexo. pero con mas tiempo de calentamiento.3 Prueba de Bial o de Orcinol-HCl Es una prueba específica para pentosas la cual se muestra en la figura 2.2 Prueba de Barfoed: Es una reacción para identificar monosacáridos.1. 1. 1.5 Prueba de Lugol: Es una prueba que se usa para identificar almidón.6 Prueba de Benedict: Es una prueba específica para las sustancias reductoras con grupos carboxilos libres.4 Prueba de Seliwanoff: Es especifica para cetosas que contengan 5 o más átomos de carbono. El color azul. 49 .5 .1.1.dioxi-metil-fenil furfuril-metano) 1. 1. pero se usa casi exclusivamente para identificar fructosa. se debe. La reacción se presenta en la figura 3 Figura 3 Reacción de Seliwanoff OH O OH HC l 3H 2 O O C O H C H2O H Hidroximetil-furfural C H 2 C C HC HC HC H 2 O H OH Fructuosa 1. posiblemente a la formación de un complejo: Ioduro de almidón.Figura 2 Reacción de Bial O OH OH OH OH CH CH CH CH CH2 Pentosa HCl 3H2O O O Furfural CH OH CH3 CH 3 OH O O CH + 2 HO OH H2O O CH 3 CH OH Orcinol OH bis (3. 6 Prueba Fenilhidrazina Es una prueba para distinguir asas (y oligosacáridos).1 MATERIALES Y MÉTODOS Materiales Tubos de ensayo. 2. La figura 5 muestra la reacción. como es el caso de la glucosa y la fructosa. mechero.Figura 4 Reacción de la prueba de Benedict cualitativo CuSO4 + 2 NaOH O C H ∆ ∆ Cu(OH)2 + Cu 2 O + R Na2 SO4 COOH + H 2 O Cu(OH)2 + R (rojo ladrillo) 1.1. Figura 5 reacción de la Prueba de Fenilhidrazina H O OH OH + H2O N NH2 H N N OH OH Fenilhidrazcina OH CHCHCHCHCHCH2OH OH CHCHCHCHCHCH2OH OH OH D-glucosa Fenilhidrazcina de D-gluco H OH OH OH OH H N NH2 H O OH OH OH NH2 CH N N CH CHCHCHCH2OH N N C C CH CHCH2OH CH + NH3 + Cetofenilhidrazona de D-glucosa Anilina N H H O OH OH H N NH2 N OH OH N N C C CHCHCHCH2OH OH C C CHCHCHCH2OH N OH N H + H2O Glucosazon 2. Los carbohidratos que solo se diferencian en sus átomos de carbono 1 y/o 2 darán la misma osazona. que son isomeros de función. pinzas de madera 50 . pero está es opaca. antes de los 6 min.5 ml 1.5 g de orcinol y 8 gotas de cloruro férrico al 1% (Cl3Fe.2.3 P. de Barfoed Sustancia problema Reactivo de Barfoed Acetato de cobre cristalizado 13. de Molish 0. brillante y totalmente transparente.2. contando los minutos y sacar del baño cada tubo inmediatamente después que haya aparecido el precipitado rojo ladrillo de Cu2O. Algunos azucares dan con el Bial una coloración verde. añadir 1. Añadir 1. 2.8 ml de ácido acético glacial (CH3COOH). Anotar el tiempo que corresponda a cada carbohidrato.50 ml 2.2. La aparición de un escaso precipitado rojo. Filtrar si es necesario. de Bial Sustancia problema Reactivo de Bial 300 ml de HCl concentrado en 250 ml de H2O destilada. Mezclar y calentar en baño de agua hirviente. Volumen 1 ml 2 gotas 2. P.2 Métodos Prueba Procedimiento En un tubo de ensayo colocar: Sustancia problema R. indica la presencia de una pentosa. entre 9 y 12 min indica la presencia de Lactosa o Maltosa.1 P.3 g en 200 ml de H2O destilada. de Molish: α-naftol al 10% en etanol Mezclar H2SO4 concentrado Dejar caer lentamente de por las paredes del tubo. La aparición de un color verde botella. indica que la muestra contiene carbohidratos.2.2. La aparición de un anillo violeta-rojizo en el sitio de contacto de los dos líquidos. La aparición de un precipitado rojo.5 ml 1 ml 51 . 1 ml 1 ml 2. indica la presencia de un monosacárido.6H2O) Mezclar Llevar a baño de maría hirviente durante 3 min. Sustancia problema Reactivo de Benedict cualitativo Sulfato cúprico + Citrato de sodio + Carbonato de sodio Mezclar Llevar a baño de María hirviente por 5 min.p 100 ml Mezclar y observar. enfrié los tubos en chorro de agua Dejar en reposo durante 5 min Examinar al microscopio la forma característica de los cristales de osazona. amarillo o rojo indica la presencia de un azúcar reductor. de Lugol 2 ml 1 gota 2.s. La formación de un color rojo cereza.2. Cubrir con la laminilla cubreobjeto evitando dañar los cristales con movimientos bruscos o exceso de muestra.s.2. ácido acético glacial y agua destilada en una proporción de 1:1:4 Mezclar bien Coloque los tubos en agua de baño hirviendo durante 10 min. Llevar a baño de María hirviente durante 10min.5 % en H2O. el carbohidrato es un monosacárido o un disacárido. indica el glucógeno o eritrodextrina. Sustancia problema Reactivo de fenilhidrazina.7.4.2. colocando con mucho cuidado una gota en el portaobjeto. añadir H2O c. Sustancia problema Reactivo de Lugol: A 5 g de Iodo y 10 g de K añadir H2O c. P.p. tomar 3 ml añadir 12 ml HCl concentrado. P. P.2.5. de Benedict 0. Si el color no cambia.5 ml 2 ml 2.5 ml 52 . Se mezclan fenilhidrazina. 35ml. La aparición de una coloración azul indica la presencia del almidón y una coloración roja. La aparición de un precipitado verde. Al final del período de calentamiento. Volumen 1 ml 2 ml 2.6. de Seliwanoff Procedimiento En un tubo de ensayo colocar: Sustancia problema Reactivo de Seliwanoff: Resorcinol al 0.Prueba 2. P. de Fenilhidrazina 2 ml 0. indica la presencia de fructosa. Fenilhidrazina (-) No cambia No es reductor Sacarosa (+) Precipitado rojo Reductor (+) Cristales en forma de palma (Glucosazona) Glucosa (+) Cristales en forma de estrella (Galactosazona) Galactosa P.3 Marcha analítica para monosacáridos.2. Benedict P. Fenilhidrazina (+) Cristales en (+) Cristales en forma de Flor forma de nido (Maltosazona) (Lactosazona) Maltosa Lactosa 53 . Seliwanoff (-) Incoloro o una leve coloración Glucosa o galactosa (+) Rojo Fructosa (+) Verde Pentosa (+) Precipitado rojo de 9 a 12 min. Bial (-) Otro color Hexosa P. disacáridos y polisacáridos SUSTANCIA DESCONOCIDA Prueba Molish (-) incolora No es carbohidrato (+) Anillo rojo o violeta Carbohidrato Prueba Barfoed (+) Precipitado rojo antes de los 6 min. Disacárido o Polisacáridos Prueba Lugol (+) Azul Almidón (-) Amarillo Disacárido (+) Rojo o amarillo oscuro Glucógeno P. Monosacárido P. 4 Preparación del almidón de diversas especies de granos para observar los gránulos al microscopio. colóquelas en orden de reactividad y explique el por qué de ese orden. Cuál es la importancia energética del almidón. Cuales son las aplicaciones prácticas de las pruebas estudiadas. Dibuje los monosacáridos glucosa. Molish. anote sus observaciones. 4. cetónica. 54 . cite ejemplos. 6. Dibuje dos o tres gránulos en el cuadro que tiene en su informe. 2. 1. 5.4. 8. alcohólica. levorrotatorio. Suspenda algunas partículas del almidón comercial (Papa. Neutralizar los tubos 1 y 2 añadiendo 7 gotas de NaOH 1 N y 7 gotas de agua a los tubos 3 y 4 3. ácida. 7. 2. 10.5 ml de Benedict y lleve a baño de María por 2 min. yuca y fríjol) en dos gotas de agua sobre un portaobjeto. Escriba las funciones: aldehídica. Explique por qué el monosacárido gliceraldehido da negativa la P. 9. 12. Hervir simultáneamente todos los tubos en baño de María durante 1 min. centro quiral. Defina los siguientes términos: azúcar reductor y azúcar no reductor. Escriba la glucosa en forma de silla. Efectué un enlace glucosídico. clasifíquelos según el número de átomos de carbono y la función principal Efectué un enlace hemiacetálico y uno hemicetálico. escriba las diferencias entre ambos enlaces. Observe los resultados y anote en su informe. A cada tubo añada 0. galactosa. Escriba y compare las fórmulas de la maltosa y la trealosa. 3. AUTO-EVALUACIÓN. Volumen de la solución del disacárido (ml) 1 1 1 1 HCl 1 N (ml) 1 1 0 0 H2O (ml) 0 0 1 1 Tome cuatro tubos de ensayo y siga el siguiente procedimiento: Solución del disacárido 1 Maltosa 2 Sacarosa 3 Maltosa 4 Sacarosa Seguidamente: 1. 2. 3.1 Tubo Hidrólisis ácida de disacáridos. Explique en que consiste la hidrólisis ácida de disacáridos. 11. Defina los siguientes términos: carbono anomérico.2. Cubra con la laminilla y examine al microscopio. 4. ribosa y fructosa. 1 ANEXO REPRESENTACIÓN DE FISCHER DE MONOSACÁRIDOS Representación de Fischer de los monosacáridos mas frecuentes en la naturaleza carbonos H H H H H H C OH C O 1 C O C O C O * * * * C O H C OH H C OH H C OH HO C H 2 * HO C H HO C H H C OH HO C H 3 HO C H H C OH HO C H H C OH H C OH H C OH 4 5 6 H H C OH C OH H H C OH C OH H H C OH C OH H D-Galactosa D-Ribosa H C OH H H H C OH C OH H D-Fructosa H D-Glucosa H D-Manosa 4. 4.4.2 REPRESENTACIÓN DE HAWORTH Representación en estructuras de Haworth CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH O * O * O * O * O * CH2OH α-D-Manopiranosa α-D-Glucopiranosa β-D-Ribofuranosa β-D-Fructofuranosa α-D-Galactopiranosa 55 . 3 DISACÁRIDOS MAS IMPORTANTES Y ESTRUCTURAS DEL PIRANO Y FURANO DISACARIDOS MAS IMPORTANTES CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH o o o o o o MALTOSA α−D-glucopiranosil (1-4) α−D-glucopiranosa CH2OH CH2 CELUBIOSA β−D-glucopiranosil (1-4) β−D-glucopiranosa CH2OH CH2OH o o o o o o ISOMALTOSA α−D-glucopiranosil (1-6) α−D-glucopiranosa CH2OH LACTOSA β−D-galactopiranosil (1-4)α−D-glucopiranosa CH2OH o HO2HC o o CH2OH o CH2OH o o TREALOSA α−D-glucopiranosil (1-2) α−D-glucopiranosido SACAROSA α−D-glucopiranosil (1-2) β−D-fructofuranosido PIRANO o o BOTE SILLA FURANO o o 56 .4. a = eje axial.glucosa (anómero beta) Alfa-D.4.glucopiranosa (Estructura en silla) clave: * = Carbono anomérico.glucosa (anómero alfa) (e) CH2OH 6 a (a) H 5 O H (e) e 4 6 e 5 (e) OH H (a) H a (a) *1 e 3 a 2 e * 1 a e a O 4 OH (e) 3 2 OH (a ) H (a) OH (e) Alfa-D. e = eje ecuatorial 57 .4 ANÓMEROS DE LA GLUCOSA Y REPRESENTACIÓN EN SILLA D-GLUCOSA H O H H 1C C 2 C 3 C 4 C 5 C 6 H * OH OH H 1C C * HO H 1C * C 2 C 3 C 4 C 5 C 6 H H OH H2O O 2 OH H2O HO H H OH HO H H2O H 3 4 C C C C H OH H2O HO H H OH O H H 5 OH H 6 OH OH H H OH H (Estructuras de Fisher) D.glucopiranosa (Estructuras de Howard) Alfa-D.glucosa Beta-D. para reportar la positividad o negatividad de la reacción. Molish P. Bial P. Use los signos (+) o (-). INFORME 4 Apellidos Grupo de prácticas Fecha Calificaciones Entrada (CARBOHIDRATOS) Nombres N° del mesón N° del estudiante Desarrollo Informe Definitiva 1. N0 Muestra P. Seliwanoff P. Ud.5. Lugol P. Benedict P. Sobre la base de los resultados de sus pruebas. En la casilla “N0 Muestra”. Fenilhidrazina Nombre de la muestra problema 2. coloque el numero de cada tubo de las muestras problemas que se le entrego. Complete el siguiente cuadro con la información deseada. Dibuje y anote y sus observaciones sobre los cristales identificados en el microscopio Dibujo de los cristales de osazonas Observaciones 58 . puede identificar la muestra problema. Barfoed P. sin anexar hojas. anote sus observaciones Almidón Dibujo Yuca Papa fríjol Observaciones 4. Dibuje en el siguiente cuadro los gránulos de almidón. Anote sus resultados y la explicación sobre la hidrólisis ácida de disacáridos Tubo 1 Resultado Explicación 2 3 4 Nota: El informe debe ser entregado al finalizar la práctica.3. 59 .