HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência Pronta

HPLC – CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIAAlexandre Alves de Castro Maisa Carla Ragozoni Pereira DQI - Química Analítica Instrumental II LAVRAS 2013 Introdução  Nas indústrias químicas, alimentícias, petroquímicas, farmacêuticas, refinarias, laboratórios de análises clínicas, ambiental e forense;  Frequentemente é necessário separar, isolar, purificar, identificar e quantificar os componentes de misturas muitas vezes bastante Introdução   Definição de cromatografia: Conjunto de técnicas de separação cujo princípio depende da distribuição diferenciada de um dos componentes de uma mistura entre duas fases, uma considerada estacionária, e a outra, móvel;  A natureza química e física dos componentes da mistura definem o grau de afinidade entre as duas fases, acontecendo o fenomeno de migração diferencial. Introdução   HPLC Do ingles HPLCÉ High também Performance conhecida Liquid como: Chromatography. Cromatografia Líquida de Alta Performance, de Alta Pressão ou de Alto Desempenho;  É uma técnica ultra-microanalise podendo, dependendo da substância e do detector empregado, quantificar massas inferiores a 10-18 g. Descrição Geral da HPLC  A amostra é dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatográfica preenchida com a fase estacionária (FE).   . os componentes passam por um detector que emite um sinal elétrico o qual é registrado. constituindo um cromatograma. Ao sair da coluna. Um solvente (FM) é bombeado com vazão constante e desloca os componentes da mistura através da coluna. Descrição Geral da HPLC 6 . Descrição Geral da HPLC . Descrição Geral da HPLC . Descrição Geral da HPLC . Descrição Geral da HPLC . Descrição Geral da HPLC . Descrição Geral da HPLC . Descrição Geral da HPLC . Descrição Geral da HPLC . Descrição Geral da HPLC . Conceitos Fundamentais da HPLC  Operação pela qual uma mistura é dividida em pelo menos duas frações com diferentes composições. É obtida por meios físicos embora reações químicas possam ser envolvidas no processo.   . Os métodos físico-químicos de separação são baseados na utilização de alguma propriedade física das substâncias a serem separadas. Objetivo: Separar individualmente os diversos constituintes de uma mistura de substâncias seja para identificação.   . quantificação ou obtenção da substância pura para os mais diversos fins. Simplicidade da técnica. Manuseio de pequenas quantidades de amostra (10-9 – 1015g).Conceitos Fundamentais da HPLC      Importância da cromatografia: Velocidade. Poder de resolução. Instrumentação em HPLC . A fase móvel deve ser degaseificada. vácuo (trompa d’água). purga com hélio.Fase Móvel  A fase móvel não pode conter partículas para evitar danos à bomba. injetor e coluna.    . As técnicas de degaseificação são: refluxo com resistência de aquecimento. A escolha do filtro é função da natureza da fase móvel. uso de membrana semipermeável.  Alumina. com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 mm. esférico. recoberto com uma camada fina e porosa de:  Sílica. .Fase Estácionária Basicamente são dois tipo de FE:  Pelicular: Consiste de leito de polímero ou vidro nãoporoso.   Partículas menores reduzem a distancia de contato do soluto com as FE e FM. MAIOR será a eficiência na separação. e consequentemente melhorando a eficiência da coluna. Quanto MENOR for a partícula.Fase Estácionaria   Partícula Porosa: Consiste em micropartículas porosas com diametros de 3 a 10 mm. . facilitando o equilíbrio. As partículas são constítuidas dos mesmos materias do recobrimento pelicular. Cromatografia em fase reversa (FR): a fase estacionária é apolar e a fase móvel polar.Fase Estácionaria    De acordo com as fases móvel e estacionária pode-se classificar o processo basicamente como: Cromatografia em fase normal: a fase estacionária utilizada é polar e a fase móvel é apolar. enquanto que os polares são retidos pela fase estácionaria e são eluídos depois. portanto os compostos polares são eluídos primeiro e os mais apolares eluídos posteriormente. . os solutos mais apolares são eluídos primeiramente. em relação a eluição. Devem ser constituídas de material inerte.Bomba   Principais características da bomba: Leva a fase móvel desde o reservatório até a coluna. Deve operar a pressões de até 500 atm com a mesma precisão e exatidão de operações a pressão quase ambiente. As vazões normalmente empregadas     . Alta resistência à corrosão – inércia química a solventes comuns. Bombeamento por Gradiente  Alteração da composição da fase móvel. Bombeamento por gradiente baixa pressão:   . O bombeamento por gradiente pode ocorrer à baixa pressão ou a alta pressão. sem alteração da vazão total. Bombeamento por Gradiente  Bombeamento por gradiente alta pressão: . de 5 a 20µl.  A amostra é introduzida na válvula com auxílio de uma microseringa com agulha sem ponta. A injeção é efetuada pela rotação da válvula da posição de carga para a posição de injeção.  .Injetor  Uso de válvulas especiais que permitem introdução com grande precisão e exatidão de volumes que variam. em geral. Colunas Cromatográficas  Na HPLC podem ser usados três tipos de colunas: .  . Empregada com finalidade de saturar a FM com o líquido da FE.Colunas Cromatográficas   Coluna de saturação: É colocada entre a bomba e o injetor sendo usada para condicionar a fase estácionaria. Aumenta o tempo de vida útil da coluna analítica. Satura rapidamente. É utilizada para prevenir impurezas e compostos fortemente retidos.Colunas Cromatográficas       Coluna de guarda: É colocada entre o injetor e a coluna analítica. . O custo das diversas trocas dessas coluna ainda é menor do que uma nova coluna analítica. esta possui de 2 a 5 cm. Colunas Cromatográficas   Coluna de separação: Responsável pela separação dos componentes da amostra. . Podem ser separadas em colunas analíticas e colunas preparativas. O aço inoxidável é o material mais frequentemente utlizado. isolamento e purificação de proteínas. São constituí das de um tubo de algum material inerte.    .separação. Coluna analítica: Permitem a separação de pequenas quantidades do material a ser analisado.Colunas Cromatográficas   Coluna preparativa: Cromatografia de filtração em gel. capaz de resistir às pressões em que será usada. A coluna deve ser guardada em solvente orgânico ou FM. geralmente sílica ou seus derivados. pois apresentam perda na eficiência quando são dobradas.Colunas Cromatográficas    Os tubos das colunas são preenchidos com a fase estacionária conveniente. . Tem diâmetro interno uniforme. São normalmente retas.        . Não contribuir para o alargamento do pico. Reprodutibilidade. gerando sinal quando da passagem de substâncias. Resposta rápida aos analíticos. Resposta linear. Um detector ideal deve possuir as seguintes características: Alta sensibilidade.Detector  Dispositivos que examinam continuamente o material elúido. Estabilidade.  Espectrofotometira UV-Visível.  . Não destrutivo.  Eletroquímico.  Espectrometria de massa LC/MS.  Fluorescência. Seletividade. Tipos de detectores: Os principais detectores utilizados em HPLC são:  Índice de refração.Detector    Falicidade do manuseio. amostrador automático. vazão da bomba. Armazenar e registrar. Controlar a composição da fase móvel (isocrática e por gradiente).    . temperatura da coluna. Realizar cálculos para “System Suitability Test” (SST).Aquisição de dados   Atualmente utilizam-se softwares que permitem: Processar os dados de cromatograma. Não existe um detector universal com boa detectabilidade e baixo custo: .Vantagens e Desvantagens      Vantagens: Não necessita que a amostra seja volátil ( requisito da CG).    Desvantagens: Alto custo do equipamento e manutenção. Alta resolução. Tempo reduzido da análise. Boa detectabilidade e bons resultados quali e quantitativos. Aplicabilidade . Aplicabilidade . Aplicabilidade . H2SO4 CCl3 em sistema de aço inox: corrosão do sistema. Usar HCl. . Usar fita Teflon para vedar as conexões: sem efeito e pode causa entupimento.Dicas do que não fazer em HPLC      Lavar um sistema com tampão usando orgânico puro: precitiação. injetor. Deixar o sistema parado com a fase móvel contendo tampão ou acidos/bases fortes: cristalização= danificação dos selos da bomba. entupimento do detector. Injetar amostras que podem precipitar a fase móvel: testar miscibilidade. ) – ISBN 9780471681625. Bliesner Wiley 2006 – (304 pag. ed. pág. Validation Chromatographic Methods – A Practical Guide – David M.    HPLC Made to Measure – Stravos Kromidas – Wiley – 2006 –ISBN 352731377X.htl Pharmaceutical Technology. 1ª Ed. HPLC for Pharmaceutical Scientists – Yuri Kazakevich – Rosario Lobrutto –Wiley Jan 2007(1104 pag. vol. número 3.   . Optimizing HPLC Separations http://www. Validação de métodos cromatográficos. Brasileira. Modern HPLC for practicing scientists – Michael W. HPLC – A practical user’s guide – Marvin C. ed. 1998. Edgard Blucher.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature. junho 1998.Referências  HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis – George Lunn – Norman Schmulf – Wiley Interscience – 1997 (1632 pag.sigmaaldrich.Dong – Wiley Interscience – 2006. Fundamentos da Cromatografia a líquido de alto desempenho – REMOLO CIOLA-. 2. HPLC Methods for Recently Approved Pharmaceuticals – George Lunn – Wiley 2005 (717 pag.     HPLC Practical and Industrial Applications – Joel Swadesh. The Reporter.) – ISBN 9780471741473. McMaster – John Wiley & Sons – 2007. 12.) – ISBN 0471181765.) – ISBN 9780471669418. Obrigado! Obrigado! .