HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA Histoquímica es el estudio químico de los tejidos independientemente del método de análisis empleado.En la práctica se emplea la palabra para designar el método junto con el auxilio de los microscopios ópticos (MO) y electrónico (ME). Esta técnica permite la identificación y localización de compuestos o radicales químicos en las células y tejidos. Esto se consigue provocando reacciones que dan productos insolubles que son coloreados o electrodensos y visibles por el MO y el ME . A. PRINCIPIOS BÁSICOS. 1. QUE LOS COMPUESTOS QUE DEBEN SER ANALIZADOS NO SEAN DIFUSIBLES. Este problema se resuelve insolubilizando los compuestos que van a ser estudiados por medio de la fijación del tejido. - Se recomienda el uso de fijadores con alcohol para el estudio de sustancias hidrosolubles como el glucógeno. - Hay que evitar los fijadores ácidos en las técnicas de visualización del fosfato cálcico. Los fijadores más utilizados son: - Formaldehído para el MO . - Glutaraldehído para el ME. 2. EL PRODUCTO DE LA REACCIÓN DEBE SER INSOLUBLE para evitar la difusión . 3 .EL MÉTODO UTILIZADO DEBE SER ESPECÍFICO PARA LA SUSTANCIA O GRUPO QUÍMICO QUE SE ESTA ANALIZANDO. En algunas reacciones la intensidad del color producido es proporcional a la concentración de la sustancia analizada.En este caso se puede medir dicha sustancia con un histofotómetro. B. PRINCIPALES SUSTANCIAS DE INTERÉS BIOLÓGICO DEMOSTRABLE HISTOQUÍMICAMENTE. 1. IONES IÓN HIERRO DETERMINACIÓN - EL ión férrico se demuestra por la reacción con la mezcla de FERROCIANURO POTÁSICO Y ÁCIDO CLORHÍDRICO que forma un precipitado azul oscuro de ferrocianuro férrico. - Esta reacción se usa para localizar los macrófagos del SRE y diagnosticar enfermedades en las cuales hay depósitos de hierro en los tejidos . El ácido oxida a los azucares en posición 1-2 y deja grupos aldehídos libres que reaccionan con el reactivo de SCHIFF dando un compuesto insoluble y coloreado. Su identificación se basa en métodos de detección de aminoácidos. 2.Hidrólisis del DNA con ácido clorhídrico para extraer las bases púricas y dejar en libertad los grupos aldehídicos del azucar. Esta reacción presenta proporcionalidad entre la intensidad del color producido y el contenido en DNA del núcleo. Se usa para el diagnostico de enfermedades metabólicas que producen depósitos intracelulares. 3. ÁCIDO NUCLÉICO DNA DETERMINACIÓN Se usa la reacción de FEULGEN que consiste : .Reacción de aminobenceno. POLISACÁRIDOS.Reacción de Sakaguchi que detecta la arginina de las proteínas básicas como las histonas y protaminas.El reactivo de SCHIFF (fuchsina básica con anhídrido sulfuroso) reacciona con el aldehído y forma un precipitado rojo. Esta reacción se usa para el estudio del hueso.FOSFATO Reaccionan con NITRATO DE PLATA y se forma fosfato de plata que es reducido por hidroquinona y forma un precipitado negro. En el caso de ser un polímero. . Se usan colorantes que se disuelven en las grasas como el SUDAN IV y el SUDAN NEGRO. La reacción más usada es la del PAS (ácido periódico-schiff). 5.Glucógeno en el hígado y músculo.Los tejidos se sumergen en soluciones alcohólicas saturadas de colorantes muy liposolubles y debilmente solubles en alcohol. . antes hay que tratar la muestra con un enzima glucogenolítico para que libere los azucares. PROTEÍNAS. . LÍPIDOS. . 4. ÁCIDOS NUCLÉICOS. RNA Tiene gran afinidad por los colorantes básicos (basofília) lo que hace que se tiña intensamente con el AZUL DE TOLUIDINA o de METILENO. Se encuentran unidos a proteínas o en forma libre. De este modo se demuestra la presencia de: . 3diamino-bencidina que cuando se reduce forma un compuesto coloreado. La enzima libera el fosfato que reacciona con el plomo y da un precipitado insoluble.Depósito intracelular de glucógeno en enfermedades congénitas.Después se añade sulfito de amonio que da color negro y electro denso al precipitado. FLUORESCENCIA. El formoaldehído reacciona con las catecolaminas produciendo compuestos fluorescentes. 7.. . 6. Su localización se basa en la producción de un precipitado fuertemente coloreado o electrodenso en el sitio de actividad enzimática. Sustancia fluorescente es la que absorbe luz de una longitud de onda determinada y emite luz en otra longitud de onda mayor. 1. ENZIMA FOSFATASA ÁCIDA DETERMINACIÓN Se usa el método de GOMORI que consiste en incubar cortes de tejidos en una solución que contengan GLICEROL FOSFATO SÓDICO y NITRATO DE PLOMO a pH 5 . . B.Glucosaminoglicano o mucopolisacárido que forman parte de los proteoglicanos. . Los azucares ácidos también reaccionan con el colorante AZUL DE ALCIAN. DESHIDROGENASAS Se usan cortes no fijados junto con un compuesto químico soluble y debilmente coloreado del tipo TETRAZOL. insoluble y electrodenso. En microscopía se suele usar la excitación con luz ultravioleta. Como sustratos se usa el peróxido de hidrógeno y el tetraclorato 3. transfiriendo iones hidrógenos desde el peróxido de hidrógeno al sustrato que se reduce. Se usa para localizar lisosomas. Se usa para detectar mitocondrias.Glucoproteínas. CATECOLAMINAS.El tetrazol es reducido y forma un precipitado coloreado llamado FORMAZAN. COMPUESTOS FLUORESCENTES. PEROXIDASA Promueve la reducción de ciertos sustratos. ENZIMAS. Fijación 2º. Los pasos que se siguen para obtener una preparación permanente son: 1º. cola de renacuajo) y que pueden ser observadas “in vivo”. Al Ac se le puede marcar con un compuesto fluorescente.RNA: fluorescencia roja amarillenta.Tiene por fin endurecer los tejidos. PREPARACIONES PERMANENTES Describiremos primero las preparaciones histológicas permanentes (laminas) para el estudio al microscopio óptico.Suele durar unas 12 horas. riboflavina(B2) y las porfirinas. 2. . Coloración A. Es la método más usado para la detección de autoanticuerpos en enfermedades autoinmunes.Colorantes con afinidad por las estructuras celulares como el Naranja de acridina que se une a los ácidos nucléicos: . FIJACIÓN. Esta prueba se usa en el diagnostico precoz del cáncer (células ricas en RNA).Los tejidos deben ser tratados inmediatamente después de ser cortados.Se hace a fin de evitar la autolisis y destrucción celular. sin fijar y teñir. . siendo pocas las estructuras que se examinan directamente (mesenterio. . Se basa en la reacción Ag-Ac. . ..Hay que conservar la morfología y la composición química de los componentes de los tejidos. INMUNOCITOQUÍMICA (INMUNOFLUORESCENCIA). Inclusión 3º. . Sirve para identificar proteínas especificas. como sucede en las preparaciones permanentes.Compuestos naturales constituyentes de las células: vitamina A. volviéndolos mas resistentes a las etapas subsiguientes de la técnica histológica. La fijación puede ser realizada por procesos: .DNA: fluorescencia verde amarillenta. Con este instrumento los objetos se examinan por transparencia. Corte con microtomo 4º. Mezclas fijadoras: . . Fijadores: .Glutaraldehído. .RESINA EPOXI para la ME. puesto que las proteínas son las principales responsables de la estructura celular y se degrada después de la muerte celular.GELATINA. QUÍMICO (uso de fijadores que inmovilizan las proteínas de los tejidos). Hay una serie de tratamientos a los que hay que someter a una pieza antes de la inclusión: . CELOIDINA.Las sustancias más usadas para este fin son: . .MÉTODO FÍSICO CARACTERÍSTICAS . como en bacterilogía. .Liquido de HELLY: dicromato potásico/cloruro de mercurio/formol Este paso es ESENCIAL.Da consistencia firme a los tejidos para que se puedan obtener cortes suficientemente finos.Tetraóxido de osmio.Frió. . tetraóxido de osmio y glutaraldehído apenas causan coagulación y se usan en ME. . B.Liquido de BOUIN: pícrico/formol/acético glacial . INCLUSIÓN.Cloruro de mercurio y ácido pícrico precipitan proteínas.Es la más usada en Histología. PARAFINA para la MO. Habitualmente se hace una doble fijación con una solución tamponada de: . como en el criostato.Calor.Formaldehído. Estos cortes son extendidos en agua caliente y después se llevan a un portaobjetos.TRATAMIENTO DESHIDRATACIÓN CARACTERÍSTICAS Se extrae el agua de los tejidos con baños de concentraciones crecientes de etanol ( de 70% a 100%).1 micra. .Los bloques de parafina son seccionados por la cuchilla del microtomo. Sustitución del etanol por un liquido miscible en etanol y parafina. .Se usa xilol. Usa nieve carbónica para congelar el tejido.02 a 0.Eliminan compuestos liposolubles ACLARAMIENTO O DIAFANIZACIÓN INCLUSIÓN O IMPREGNACIÓN C. pero dificulta la difusión de las moléculas. . El material se incluye en plásticos bastante duros del tipo epoxi y para cortarlos se usa un ultramicrotomo equipado con navaja de cristal o diamante. CORTE CON MICROTOMO. obteniéndose cortes de 3 a 8 micras de espesor.Debido al calor . . pues no inactiva las enzimas.CRIOSTATO es un microtomo de congelación más elaborado que permite la obtención rápida de cortes sin pasar por todas las etapas anteriores. . Se congela a -150 ºC y después se deshidrata lentamente a vació.Para el microscopio electrónico se requieren cortes de 0.Inconvenientes: .MÉTODO DE CONGELACIÓN-DESECACIÓN: Se mantiene la actividad enzimática. cuando se usa parafina. .Son muy utilizados en hospitales cuando se requiere un diagnostico rápido de un material patológico. .El microtomo de CONGELACIÓN SE USA PARA ESTUDIAR LOS LÍPIDOS DE LAS ESTRUCTURAS CELULARES.Se lleva la pieza a un recipiente rectangular y se deja solidificar. . .Destruyen muchas enzimas . benzol o toluol que dejan a la pieza translúcida. El criostato es también muy útil en histoquímica . ya que los solventes orgánicos los eliminan. . el xilol o toluol se evaporan y los espacios que dejan libre son ocupados por la parafina.Se colocan las piezas en parafina fundida a 60 ºC en el interior de una estufa. eosina y la fuschina ácida). COLORACIÓN. .Los componentes de los tejidos pueden ser: SUSTRATO BASÓFILO (tejidos que se tiñen fácilmente con colorantes básicos). COLORANTE BÁSICO (azul de toluidina y azul de metileno.Se realiza normalmente con MEZCLAS QUÍMICAS DE COLORANTES. ACIDÓFILO (tejidos que se tiñen fácilmente con colorantes ácidos). EJEMPLOS Nucleoproteínas y glicoproteínas ácidas.La mayoría de los colorantes se comportan como ácidos o como bases y tienden a formar sales con los radicales ionizables de los tejidos. . La doble coloración por la hematoxilina y la eosina es la más utilizada en la técnica histológica. Proteínas básicas del citoplasma.D. OJO: Los colorantes no proporcionan datos sobre la naturaleza química de los componentes a los que se unen. . TÉCNICA COMPONENT ES NÚCLE O CITOPLASM A FIBRAS COLÁGENA S FIBRAS ELÁSTICA S Irregular RETICULIN A Hematoxilin a-eosina Hematoxilina Azul - - Eosina Hematoxilina férrica Tricromo Masson Fuchina-ácida y Panceau Verde luz Negro Rosa - Rosa - Irregular - - - Rojo - - - - - Verde - - . ÁQCIDO (orange G. hematoxilina). .Aumenta el contraste de las estructuras y hace a los tejidos visibles y diferenciables unos de otros. . Hay ciertos tejidos. denominados cromotropos.El verde jano tiñe las mitocondrias. F.Nucleoproteínas. . . Los colorantes metacromáticos suelen ser básicos.El rojo neutro para identificar los distintos tipos de leucocitos. como la matriz cartilaginosa. como el azul de toluidina y tionina. pasando a púrpura. se modifica el color azul por unión al tejido.SUPRAVITALES: se agrega el colorante a las células o tejidos que permanecen vivos después de ser separados del organismo.VITALES: no provocan la muerte.Glucosaminoglicanos sulfatados. . Los componentes tisulares que pueden colorearse metacromáticamente. Se inyecta al animal vivo. .Fuchinaresorcina Impregnació n argéntica Fuchina y resorcina Sales de plata - - - Púrpura - - - Castaño - Negro Los factores que influyen en la tinción son: .El carmín y azul tripán se usan para el estudio de la fagocitosis. .Pureza y concentración del colorante. E.pH y temperatura. Ejemplos: . Se usan colorantes relativamente no venenosos que son retenidos selectivamente por algunas células del organismo. . METACROMASIA.Tiempo. fuertemente ácidos de la matriz cartilaginosa y los mastocitos del tejido conectivo. que al usar colorantes como el azul de toluidina. . son principalmente: . MANIPULACIÓN EXPERIMENTALES DE CÉLULAS VIVAS.La alizarina se une a la matriz ósea recién formada y se ha usado para el estudio de la formación del hueso. Las técnicas de tinción pueden ser: . A este fenómeno se le denomina metacromasia. Hacer una réplica al molde de la superficie fracturada depositando una capa de carbono.Retirar las láminas y queda sobre su superficie una fina película de emulsión. hipoclorito sódico). CRIOFRACTURA.G. Colocar la réplica en una rejilla de cobre y llevarla al ME.Se sumergen las preparaciones biológicas en la emulsión calentada y fundida. 3º. Llevar la muestra a presión atmosférica normal y destruir el tejido por una sustancia que no ataque el molde (ácido fuerte. Los puntos negros que aparecen corresponden a los sitios del órgano que contienen el isótopo. 3º. Inyectar el isótopo radiactivo al órgano en estudio. Sirve para el examen de cortes ultrafinos. La superficie fracturada muestra elevaciones y depresiones correspondientes a las diversas estructuras de los tejidos. 2º. Fases: 1º. RADIOAUTOGRAFIA Se basa en el efecto de las radiaciones sobre las emulsiones fotográficas que contienen bromuro de plata (microdetectores de radiactividad). Dejar un período de exposición y revelar la película. así se elimina el agua por sublimación. 6º. 4º. El tejido fracturado se mantiene a muy baja temperatura y en alto vacío. Poner un corte de órgano en contacto con la película de emulsión fotográfica. a) Técnica de emulsión liquida: . Depositar una capa de metal pesado sobre la superficie de carbono para dar un aspecto sombreado. Congelar el tejido a temperatura muy baja. Fases: 1º. 5º. . Fracturar con una cuchilla de metal afilada. 2º. La cantidad de gránulos de plata es proporcional a la radiactividad presente y así permite también la medida de la cantidad relativa de dicha sustancia. Los cationes de plata que son alcanzados por la radiación se transforman en plata metálica que aparece negra al microscopio óptico (MO). . Permite el estudio de la ultraestructura de las células sin los posibles artefactos producidos por la fijación y la inclusión (ej: membrana plasmática). b) Aplicaciones: con el uso de isótopos radiactivos de C. como la secreción de gránulos de zimógeno. S. H.Llevar al microscopio (ME ó MO). es posible marcar las moléculas de numerosos compuestos que intervienen en el metabolismo.. . generalmente a baja temperatura.Proceso de revelado semejante al usado para placas fotográficas en una cámara oscura.Secar y guardar al abrigo de la luz. . De esta forma se localiza el proceso metabólico y su velocidad. N. P. .