HIDROLISIS DE LAS GRASAS POR ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA

UNIVERSIDAD MAYOR DE SANUniversidad del Perú, MARCOS DECANA DE ÁMERICA FACULTAD DE QUÍMICA, INGENIERÍA QUÍMICA E INGENIERÍA AGROINDUST RIAL E.A.P DE QUÍMICA MANUAL UNIVERSITARIO PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Dra. PERIODO ELECTIVO ADICIONAL 2015-O MARIA ROSARIO CALIXTO COSTOS LIMA – PERÚ 2015 Elaborado por Rosario Calixto Cotos Practica 02 Procedimiento Preparar una gradilla de 9 tubos de ensayo de acuerdo a la siguiente tabla 8 8. 6 mL de Ácido acético 0.4 1 .8 8.1 N mL de Ácido acético 0.0 7.4 7.0 1. 5 1 . 0 2 . 6 1 .Tubos mL de caseína 5% 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 1 mL de agua destilada mL de Ácido acético 1.01 N pH teórico pH experimental Observa la precipitación de la caseína a los 15 minutos (X) Reactivos Tubo de Ensayo 1 0 .0 7. 2 0 .0 N 8. 0 4 . 0 .5 8. 0 8 . 2 0 .0 5. Tubo de Ensayo 2 Tubo de Ensayo 3 Tubo de Ensayo 4 . Tubo de Ensayo 5 Tubo de Ensayo 6 Tubo de Ensayo 7 Tubo de Ensayo 8 Tubo de Ensayo 9       Se agito suavemente los tubos con la precaución de no formar espuma. luego se procedió a tapar los tubos. Se prosiguió a determinar los pH teóricos de cada uno de los tubos con los datos dados. Determinamos el punto isoeléctrico de la caseína. . Luego se determinó el pH experimental usando un pH metro. Los tubos se dejaron en reposo durante 15 minutos y observar el grado de turbidez o precipitación. PRACTICA 09 HIDROLISIS DE LAS GRASAS POR ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA . las enzimas llamadas Lipasas realizan la hidrólisis. que prefiere ácidos grasos de cadena larga de más de 10 átomos de carbono. que generalmente son sólidos a temperatura ambiente y constituyen la principal reserva energética en algunos organismos. liberando el Ácido graso de la posición 1 ó 3 del glicerol. ésta hidrólisis catalizada por lipasas se caracteriza por cierto grado de especificidad. los carbohidratos y otras sustancias. los peces en forma de ceras y en las plantas se almacenan en forma de aceites que adicionalmente tienen funciones de protección y proveen aromas y sabores característicos. en realidad los lípidos rara vez se encuentran en estado libre. Este último puede ser hidrolizado por medio de la transferencia del grupo acilo en posición 2 hacia la posición 1 o 3 por medio de las isómeras lipasa y ser finalmente hidrolizado a glicerol y AGL . ya que al hablar de grasas se refieren a un tipo especial de lípidos: Los triacilgliceroles. hidroliza a los TAG en diacilgliceroles. Los ácidos grasos naturales poseen un número par de átomos de carbono. La presencia de ácidos grasos en la estructura de los lípidos determina sus propiedades. II. diacilglicéroles y triacilglicéridos (TAG) En los alimentos los más comunes son los TAG. en las células. iniciada a partir AcetilCoA. OBJETIVO Determinar la actividad de la lipasa pancreática mediante la formación de ácidos grasos libres por titulación. Los productos son ácidos grasos libres (AGL) o 2-monoacilglicero (2-MAG). sí tienen por lo menos alguno de sus derivados. Los términos grasas y lípidos no pueden ser usados indistintamente. INTRODUCCIÓN En el organismo de los animales casi todos los lípidos se encuentran en complejo con las proteínas. de modo que las distintas lipasas actúan de modo preferencial sobre diferentes enlaces éster. Aunque se considera que no todos los lípidos tienen ácidos grasos. los otros son usados como aditivo por sus propiedades emulgentes. La enzima principal de la hidrólisis de los TAG es la lipasa pancreática. producto del mecanismo de biosíntesis. Los mamíferos los acumulan en forma de grasa.I. Su número de átomos de C varia de 4 (ácido butírico de lípido de la leche) a 38 (ceras) Los acilgliceroles se hidrolizan para formar glicerol libre y los ácidos grasos que los constituyen. Los acilgliceroles (constituido por una molécula de glicerol y ácidos grasos) pueden existir como monoacilglicéridos. Los diacilgliceroles son hidrolizados rápidamente hasta glicerol y ácidos grasos libres. La velocidad de absorción de los ácidos grasos depende de la longitud de su cadena (número de átomos de carbono) y de su grado de saturación. los insaturados de cadena larga son absorbidos más eficazmente que los saturados. La concentración de los ácidos grasos libres se determina mediante la titulación con NaOH 0. tubos de ensayo. ml - 2 - - Lecitina/ aceite ml - - - - . La acción conjunta de las enzimas pancreáticas y de las sales biliares lleva a la formación de micelas. Balanza analítica. buffer fosfato 0. papel parafina. ml - - 2 2 Sales biliares en buffer. pancreatina 1% Bureta. Fundamento La actividad de la enzima se evalúa midiendo los ácidos grasos libres que se liberaron en el curso de la hidrólisis de la grasa por acción de la lipasa pancreática.000 daltons que hidroliza los enlaces éster en posición 1 y 3 de los triacilglicéridos.1 M pH 8. bombillas.La lipasa pancreática es un polipéptido de 449 aminoácidos y PM de 50. pipetas. PROCEDIMIENTO HIDROLISIS DE LAS GRASAS POR ACCION DE LA LIPASA Tubos 1 Sales 2 blanco 3 Sin sales 4 blanco Aceite ml 1 - 1 - Buffer fosfato 0. baño maría. que progresivamente se enriquecen en productos hidrolíticos más polares que sus precursores. lecitina y glicerol.1 M pH 8. vasos de 50 mL. La acción de lipasa se ve potenciada por las sales biliares que al emulsificar las grasa las transforma en pequeñas micelas III.05N. probeta. IV. MATERIALES Y REACTIVOS Aceite. Así. gradilla. sales biliares. anotar el gasto en ml. Reactivos 5 mL de Buffer fosfato 0.1Sales M PH biliares 8 5 mL de Aceite en BufferLecitina / Aceite Tubo de ensayo 1 Sales Sales biliares en buffer Aceite Agua destilada Reactivos 5 mL de Buffer fosfato 0. Agitar por 15 ser cada 10 minutos.05N hasta que aparezca el color (Sólo a los tubos 1. La Pancreatina es un extracto de enzimas que contiene a la Lipasa pancreática. Titular cada tubo con NaOH 0. agregar NaOH 0.Agua destilada.05N hasta coloración ligeramente rosa. Agregar 5 ml de pancreatina 1% a cada tubo (los 5). ml 2 3 2 3 El color rosa del aceite no debe desaparecer en caso contrario. Incubar por 45 minutos a 370C. agitar constantemente durante la titulación.1Sales M PH biliares 8 5 mL de Aceite en BufferLecitina / Aceite Tubo de ensayo 2 Blanco 5 buffer mL de Aceite + Sales biliares en buffer + Agua destilada 3 mLbiliares de Aceite + Sales biliares en buffer 1 mL Aceite Sales en Agua destilada 2 mL de Sales biliares 5 mL de enSales buffer biliares en buffer + agua destilada . 2 y 3). 1M PH 8 + Agua destilada Tubo de ensayo 4 Blanco Buffer fosfato 0.1M PH 8 .1M PH 8 Agua destilada 5 mL de Buffer fosfato 0.Tubo de ensayo 3 Sin sales Aceite Buffer fosfato 0.1M PH fosfato 8 0.1M PH 8 + agua destilada 2 mL de Buffer fosfato 0.1M PH 8 Agua destilada 1 mL Aceite 3 mL de Aceite 5 mL + Buffer de Aceite fosfato + Buffer 0. 2 y 3 NaOH 0.05 N hasta que aparezca el color NaOH 0.Adherencia de Pancreatina al 1% Pancreatina al 1% (Lipasa Pancreática) Incubación y Agitamiento 4 Tubos de ensayo con 5 mL de mezclas 4 Tubos de ensayo con 10 mL de mezclas + 5 mL de Pa Agitar por 15 seg cada 10 minutos El color rosado del aceite no debe desaparecer en caso contrario.05 N Titulación de los 5 tubos NaOH 0.05 N Tubos 1. agregar NaOH 0.05 N 10 mL de las mezclas Coloración Transparenté Mezcla titulada Coloración Rosada N . 05 N Gasto Gasto Con sales Sin sales biliares Ml ml Tubo 1 8. Entonces como se tuvo a los tubos de ensayo por 45 minutos en incubación con la mano a 37°C.  PH: en este caso la enzima es más activa alrededor de pH= 6. lo que se puede ver en este caso son los posibles factores que afecten la actividad enzimática: temperatura. .6 ml tornando a una coloración rosada.6 Tubo 2 6.05 = 0. Miliequivalentes de Acidez con sales biliares =  gasto x 0.4 2.  Temperatura: la actividad enzimática se incrementa al aumentar la temperatura. La molécula de sustrato se transforma por reorganización de los átomos. RESULTADOS Cálculos: Los gastos en ml de NaOH 0.0 Tubo 4 9.01 *10-3 #eq-gsto 1. la velocidad de reacción se incrementa.La enzima.05 = 0.2*0.3 0. donde el gasto de volumen de NaOH fue 9. los productos de reacción. o por combinación de varias moléculas de sustrato. hasta que la enzima se desnaturaliza.3*0. hasta que se ocupan todos los centros activos. El tubo que presento mayor actividad enzimática es el tubo número 3.05 N B: Miliequivalentes de acidez sin sales biliares = 0. el sustrato hace contacto con el centro o sitio activo de la enzima .05 N mayor será la actividad enzimática. se liberan de la molécula de enzima .1 Gasto ml Tubo 5 Tubo 4  gasto 1.  Concentración de sustrato: al aumentar la concentración de sustrato. ahora libre puede reaccionar con otras moléculas de sustrato.3 Tubo 3 9.Se forma un complejo intermedio llamado enzimasustrato. mientras mayor sea el gasto de NaOH a 0. por rotura. pH.2 Miliequivales Acidez sin sales biliares =  gasto x 0.05 N A: Miliequivalentes de acidez con sales biliares = 2. El sustrato transformado.2  gasto  gasto Determinar la concentración de los AGL en función de la acidez: 1.V. concentración e inhibidores.115*10-3 #eq-gsto 1. ¿Cuál de los tubos presento mayor actividad enzimática? En la actividad enzimática de cualquier enzima. Mencione cinco propiedades de la lipasa pancreática  La lipasa pancreática es una enzima del tipo éster hidrolasas carboxílicas que se encarga de hidrolizar enlaces esteres propios de las lípidos mediante la adición de una molécula de agua dando lugar a ácidos grasos libres y glicerol. Que función cumplieron las sales biliares La función que cumplen las sales biliares en la hidrolisis de las grasas (aceite) es la de emulsificar y solubilizar las grasas.  Se secreta en forma activa (y no como proenzima) y funciona a un pH óptimo de 6 – 7 en presencia de colipasa. lo que provoca una reacción acido base debido a la mezcla entre un álcali y los ácidos grasos libres dando la formación de jabones. ¿Por qué se neutralizo el aceite utilizado en la práctica? Como la hidrolisis del aceite por medio de la lipasa pancreática va liberando ácidos grasos en la solución y al emplear hidróxido de sodio en la valoración ácido – base para la determinación indirecta de la cantidad de ácidos libres liberado. también sirve para neutralizar la acidez del aceite residual debido a los ácidos grasos libres 5.  Actúa rápidamente en interface hidrofóbica/hidrofílica de la emulsión de la grasa. 4. V.  Es una enzima que cataliza reacciones con una elevada especificidad de sustrato así como de forma regio o enantioespecífica.  Se estabiliza en la interface agua – aceite por acción de la colipasa y ácidos grasos libres. ¿Cuál fue la utilidad de la fenolftaleína? La fenolftaleína es un indicador ácido – base que indicó el cambio de pH dada por la neutralización del aceite residual obtenida por los ácidos grasos libres.2. 3. CUESTIONARIO . transformándolas en pequeñas micelas con lo cual disminuye la tensión superficial produciéndose la ruptura de los enlaces esteres. Además. fosfolípidos. ¿Cuáles son los productos liberados por acción de la lipasa pancreática? Síntesis: Páncreas exocrino Sustrato: Triacilgliceridos con ácidos grasos de cadena larga.1. Su fórmula molecular es C57H110O6 Tripalmitina es un glicérido de ácido palmítico. A diferencia con la Triestearina es en vez de ácido palmítico (C16:0) posee. Requiere: Colipasa. Su nombre IUPAC es 1. . fosfolipasa A2. Sales biliares y los ácidos grasos libres provenientes de la de las lipasas: Lingual y gástrica. o es Tripalmitato de glicerol. derivado de la grasa animal creada como producto derivado del procesamiento de la carnes y es utilizado como sebo en la manufactura de velas y jabón. Triestearina o también llamada Estearina o Glicerol triestearato de manera trivial.3-Di(octadecanoiloxi)propan-2-iloctadecanoato es un gliceril éster de ácido esteárico. ácido esteárico (C18:0)). Esquematice la estructura de un triestearina y tripalmitina. Su fórmula molecular es C51H98O6 2. Es un aceite que se encuentra en el aceite de palma y otros aceites o grasas. Acción enzimática: Hidrolisis ácidos grados C1 y C3 Productos: 2-moniacilgliceridos y dos ácidos grasos libres. Este último puede ser hidrolizado por medio de la transferencia del grupo acilo en posición 2 hacia la posición 1 o 3 por medio de las isómeras lipasa y ser finalmente hidrolizado a glicerol y AGL. Son generalmente sólidos a temperatura ambiente. Su principal representante es el ácido oleico (C-18).La lipasa pancreática . 3. Se encuentran en alimentos de origen animal.MAG). que prefiere ácidos grasos de cadena larga de más de 10 átomos de carbono. Los diacilgliceroles son hidrolizados rápidamente hasta glicerol y ácidos grasos libres. Ácidos grasos monoinsaturados Generalmente son líquidos a temperatura ambiente. Cuáles son los ácidos grasos poliinsaturados. y las excepciones son el aceite de coco y de palma. . cuando reemplazan parcialmente a los ácidos grasos saturados. Pueden disminuir el colesterol total y LDL. Ácidos grasos saturados No poseen dobles enlaces en su cadena. presente en el aceite de oliva. Presentan un doble enlace en su estructura. La grasa saturada aumenta el colesterol más que cualquier otro tipo de grasa. Los productos son ácidos grasos libres (AGL) o 2monoacilglicero (2. liberando el ácido graso de la posición 1 o 3 del glicerol. monoinsaturados y saturados presentes en los alimentos. El exceso de grasas saturadas puede aumentar la biosíntesis de colesterol y tiene efecto trombogénico. la enzima principal de la hidrólisis de los TAG es la lipasa pancreática . hidroliza a los TAG en diacilgliceroles. de los ácidos grasos y de los monoglicéridos absorbidos. a excepción de los pescados y mariscos.Ácidos grasos poliinsaturados Enzima Pepsina Fuente Jugo gástrico Jugo Amilasas pancreático Jugo Proteasas pancreático Jugo Lipasa pancreático Jugo Peptidasa entérico Jugo Maltasa entérico Jugo Sacarasa entérico Jugo Lactasa entérico Sales Biliares Bilis Poseen uno o dos enlaces en Glándula Pared estomacal Páncreas Páncreas Páncreas Pared duodeno Pared duodeno Pared duodeno Pared duodeno Hígado su estructura. Son componentes imprescindibles de las membranas celulares y precursores de las prostaglandinas (moléculas mediadoras en la inflamación). . Sustrato Productos Péptidos y Aminoácidos Proteínas Almidón Proteínas y péptidos Triglicéridos Maltosa Péptidos y Aminoácidos Ácidos grasos y glicerina Péptidos Aminoácidos Maltosa Glucosa Sacarosa Glucosa y Fructuosa Lactosa Glucosa y Galactosa Grasa Emulsión Se encuentran principalmente en alimentos de origen vegetal. La grasa del alimento es hidrolizada en el intestino delgado a ácidos grasos y glicerina por la acción conjunta de las sales biliares (son derivados del ácido cólico que emulsionan y saponifican las grasas) y de la lipasa pancreática. ¿Cuáles son las enzimas que digieren las grasas en el sistema digestivo de un mamífero? Indique la función de cada una. Omega-3 (n-3): representado por el ácido linolénico proveniente de semillas y cereales. Los ácidos grasos poliinsaturados se dividen en dos grupos: Omega-6 (n-6): representado por el ácido linoleico Presente fundamentalmente en aceites de semillas y cereales. y araquidónico. 4. así que debemos aportarlos a través de la alimentación. y por el ácido eicosapentaenoico y docosahexaenoico presentes en las grasas de pescados y mariscos. Son esenciales porque no se sintetizan en el organismo. En la pared del duodeno y en las células adiposas se produce una neoformación de triglicéridos a partir de la glicerina. respectivamente. en menor cantidad. con la posterior incorporación de los aminoácidos glicina o taurina. Otros ácidos biliares son productos intermediarios de su síntesis y también pueden estar en el producto final. Las sales biliares que se segregan en la bilis al intestino para contribuir a la digestión de los lípidos se sintetizan en el hígado a partir de colesterol en una ruta en la que interviene el citocromo P450. 7alpha. que origina el ácido cólico.12-trihydroxy-24-oxocholan-24-yl] amino} ethanesulfonicacid. que son las sales de sodio y potasio de los ácidos taurocólico y glicocólico. Su nombre IUPAC es 2-{[(3alpha. 5. 5beta. Cite cuatro sales biliares y como intervienen en la emulsificación de las grasas El ácido taurocólico procede del ácido cólico (uno de los ácidos biliares) conjugado con el aminoácido taurina en el carbono 17.La grasa no absorbida en el intestino delgado es excretada en las heces. produciendo heces grasientas que dificultan la limpieza de las instalaciones.Este ácido con sodio y potasio da lugar a una de las sales biliares. El ácido glicocólico procede del ácido cólico (uno de los ácidos biliares) conjugado con el aminoácido glicina en el carbono 17. los cuales son conjugados de los aminoácidos glicina y taurina con ácido cólico. 12alpha)-3. Función de las sales biliares . Las principales sales biliares son glicocolato y taurocolato. 7. provocando y estabilizando la emulsión de las grasas para que puedan ser digeridas por las enzimas digestivas en el medio acuoso del intestino (quimo). y también contribuyen a la absorción de colesterol. debido a sus cargas (+) y (-) y a su gran núcleo hidrofóbico de anillos de carbono. Editorial Moderno. Métodos selectos de bioquímica experimental. E y K. Univ. 2009. Bioquímica Conceptos esenciales. 2011. Blasco. Feduchi. 1° edición. Campbell Bioquímica 6ta edición. 2012 2. Zamora Espitia. Romero. Esquema simplificado de las rutas de síntesis de los ácidos biliares sales biliares VI. Editorial Cengare Learning. nacional de Colombia. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Por ello son solubles en agua y también pueden interaccionar con las grasas. o solubilizadores. México. 1° edición. . D.Los ácidos biliares glicocólico y taurocólico interaccionan con iones de sodio o de potasio para dar los resultados finales: glicocolato y taurocolato. También allí producen la emulsión de otros compuestos liposolubles como las vitaminas A. Así actúan como detergentes. 3. Yañez. Estas sales tienen carácter heteropolar (o anfipolar). en el otro extremo de la molécula. que se excretan por vía biliar al intestino.