GUIAS

1FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BIO035 BIO035 BIO035 BIO035 GUÍA GUÍA GUÍA GUÍA DE TRABAJO DE TRABAJO DE TRABAJO DE TRABAJO PRÁCTICO PRÁCTICO PRÁCTICO PRÁCTICO N° 1 N° 1 N° 1 N° 1 “ ““ “INSTRUMENTACIÓN Y PREPARACIÓN INSTRUMENTACIÓN Y PREPARACIÓN INSTRUMENTACIÓN Y PREPARACIÓN INSTRUMENTACIÓN Y PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE SOLUCIONES DE SOLUCIONES DE SOLUCIONES” ”” ” 2 ITRODUCCIÓ El laboratorio no es un lugar peligroso, siempre y cuando se actúe en él de manera responsable y cuidadosa. Para esto, es importante tener en cuenta ciertas medidas de orden que se aplican en todos los laboratorios y por sobre todo un buen uso del sentido común. De esta forma, es necesario recordar algunos principios básicos generales: 1. El mesón de trabajo debe estar siempre libre de efectos personales tales como abrigos, carteras, libros, etc. que entorpezcan el trabajo y que además puedan dañarse por el contacto con reactivos químicos, agua o calor. 2. Los reactivos químicos a utilizar deben ser manipulados con precaución, de acuerdo a sus características. Esta estrictamente prohibido pipetear directamente con la boca soluciones altamente alcalinas, ácidos concentrados o material biológico de riesgo. Si la vía de desecho de estas soluciones es el desagüe del laboratorio (previa indicación del profesor responsable del trabajo práctico), hacer correr abundante agua de manera simultanea para reducir el daño que estas soluciones fuertes pudieran ocasionar a las tuberías. Tener en cuenta que hay soluciones tales como el H 2 SO 4 que reaccionan violentamente con el agua, por lo tanto se debe proceder con sumo cuidado. 3. Si Ud. esta manipulando sustancias inflamables, asegúrese antes de destapar el frasco que no existan llamas abiertas ni material incandescente en las proximidades de su lugar de trabajo. 4. Si Ud. calienta una sustancia en un tubo de ensayo, no apunte la boca del tubo en dirección de alguna persona. Una ebullición violenta de la solución podría quemar a dicha persona. 5. Cuando trabaje con sustancias tóxicas volátiles debe hacerlo bajo una campana de extracción. Recuerde que un gas o vapor nocivo no siempre es perceptible por el olor. 6. Los materiales de desecho no solubles (papel filtro usado, fósforos, corchos deteriorados, etc.) deben tirarse al basurero o recipiente destinado para esta función, jamás dentro del desagüe del laboratorio. 7. Al término de cada sesión experimental, el mesón de trabajo y sus alrededores deben quedar limpios y secos. Todos los reactivos e implementos utilizados deben ser guardados en sus sitios respectivos. Asegúrese siempre que las llaves de gas y agua estén correctamente cerradas. 3 MATERIALES DE LABORATORIO Material Volumétrico. Durante el trabajo de laboratorio, en muchas oportunidades es necesario medir con exactitud volúmenes de líquidos para la correcta ejecución del paso experimental. Para ello, existen diversos tipos de materiales volumétricos. Por lo tanto, es necesario conocer los diferentes tipos de materiales y tener claro cual utilizar en cada ocasión. Cabe señalar que la precisión de la medida con estos materiales puede verse alterada. Considerando que la mayoría de los materiales volumétricos que se usan en el laboratorio están hechos en vidrio, y teniendo en cuenta que este material puede dilatarse o contraerse según la temperatura a la que esta expuesto, se ha establecido un estándar convencional de 20ºC para material de laboratorio destinado a medir volúmenes. La graduación de los utensilios considera dos tipos de posibilidades: - Aforo para contener - Aforo para entregar volúmenes determinados El nivel de los líquidos se estima por el aforo, que se define como la tangente horizontal al menisco inferior del líquido. Para realizar la medida, el nivel del líquido debe encontrarse frente al ojo del observador en posición vertical. Mientras más estrecho sea el diámetro donde se realiza el aforo este será más exacto. Fig. 1: posición del ojo para aforar de manera correcta una solución A continuación se describen los elementos más usados en la medición de volúmenes en el laboratorio: 1. PROBETAS Son cilindros verticales graduados, provistos de una base hexagonal. Sus capacidades normalmente son de 25, 50, 100, 250, 1000 y 2000 ml. El aforo esta previsto para entregar volúmenes. Debido a que su diámetro interior es amplio, las probetas sirven sólo para mediciones aproximadas de volúmenes. La graduación de una probeta está en relación a su capacidad, así la más grande tiene una graduación de 5 a 10 ml por cada división, en cambio las más pequeñas pueden tener hasta 1/10 de ml. 4 2. MATRACES AFORADOS Son botellas redondas de fondo plano, con cuello largo y estrecho y están confeccionados en vidrio no apto para resistir cambios de temperatura. Los matraces aforados están previstos para contener volúmenes con bastante exactitud, por lo que son usados para preparar soluciones en que es importante conocer la concentración exacta de ellas. Estas soluciones pueden ser preparadas por dilución de una cantidad conocida o medida de líquido, agregando agua (u otro solvente) hasta completar el volumen. También los matraces aforados se emplean para preparar soluciones de una concentración muy exacta por disolución de una cantidad precisa de sustancia previamente pesada, completando finalmente el volumen hasta el aforo con agua u otro solvente según sea el caso. Hay matraces aforados con capacidad para contener a 20ºC y con bastante exactitud 25, 50, 100, 250, 300, 1000 y 2000 ml de líquido o solución. 3. PIPETAS Se emplean para medir y entregar con precisión volúmenes menores de líquidos y soluciones. Dado que las pipetas son tubos de sección estrecha se logra una buena exactitud en la entrega de volúmenes por este tipo de material. La abertura del tubo en el extremo superior (bucal) de la pipeta, es de borde muy parejo, ya que habitualmente se hace succión con la boca y se obstruye herméticamente la salida del líquido con ayuda de la yema del dedo índice. El líquido succionado se mantiene dentro de la pipeta, en tanto no se permite la entrada de aire. Quitando parcialmente o totalmente el dedo de la abertura superior, se consigue el vaciado paulatino o rápido del contenido de la pipeta. La succión de líquidos corrosivos, tóxicos o de riesgo biológico debe siempre realizarse con la ayuda de peras de goma o jeringas adaptables a la boca de la pipeta (llamadas propipetas) para evitar la posibilidad que estos materiales lleguen a la boca del usuario. El extremo aguzado permite la entrega del líquido gota a gota. Sin embargo, el orificio estrecho del extremo inferior está pensado de manera que no entre aire con facilidad mientras se transporta el líquido de un recipiente a otro. Existen pipetas de diferentes capacidades: 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 25 ml. Y generalmente están diferenciadas por un color en la graduación. Ellas son capaces de entregar volúmenes totales o parciales. 4. PIPETAS VOLUMETRICAS Se reconocen por presentar su parte central más dilatada. Estas pipetas están diseñadas para entregar un volumen bien determinado, el cual está indicado en el cuerpo de ella. Este volumen puede estar delimitado por uno o dos aforos. Si son dos las marcas, el volumen indicado escurre cuando el menisco del líquido se mueve desde la marca superior a la marca inferior. Si es una sola marca (en el tubo superior), el volumen queda comprendido aquella marca y el extremo inferior de la pipeta. Al término del vaciamiento deben esperarse 15 segundos para que escurra todo el líquido que queda mojando las paredes de la pipeta. 5 5. BURETA Puede ser definida como una pipeta graduada y dotada de un mecanismo regulable para vaciarla. En el extremo inferior lleva intercalada una llave de vidrio o plástico inerte (teflón). Las graduaciones más comunes de una bureta son 25 y 50 ml., existiendo también microburetas de 1.5 y 10 ml. 6. MATRACES ERLENMEYER Son usados comúnmente para efectuar titulaciones, reacciones y para calentar soluciones, ya que su forma cónica evita en gran parte la evaporación. También posee graduaciones, pero las medidas que se realizan con ellas son sólo aproximadas. Existen matraces Erlenmeyer de 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 y 2000 ml. 7. VASO DE PRECIPITADO Se usa comúnmente para preparar soluciones o efectuar reacciones. Estos vasos poseen graduaciones de 5, 10, 50,125, 250,….2000 ml., sin embargo hay que tener en cuenta que esta graduación es sólo aproximada y permite estimar volúmenes, por lo tanto no son aptos para preparar soluciones en las cuales se desee un cierto grado de exactitud. 6 EQUIPAMIETO BÁSICO DE LABORATORIO. En la actualidad el equipamiento de los laboratorios se ha ampliado de manera considerable con la invención de nuevas tecnologías. No obstante, a continuación se describirán instrumentos de uso general y básico de un laboratorio común. 1. BALANZA DE LABORATORIO La unidad internacionalmente reconocida como patrón de peso es el kilogramo (kg). Sin embargo, comúnmente en el laboratorio la unidad de peso más usada es el gramo (g), así como el miligramo (mg) y el microgramo (µg) que son submúltiplos del gramo. La balanza es un instrumento que sirve para medir la masa de los cuerpos por el peso, es decir para determinar las veces que ellos contienen la unidad de masa llamada gramo. a) Balanza de precisión: Se caracteriza por un sistema oscilante de una barra o cruz apoyada sobre una columna. Actualmente a este tipo de balanza se le ha adicionado un sistema electrónico que registra la pesada. La capacidad de carga de las balanzas de precisión es generalmente hasta 500g y más comúnmente hasta 200g, con una exactitud de pesada al centésimo de gramo. b) Balanza analítica: Es un instrumento de alta precisión empleada en la pesada de reactivos livianos (del orden de los miligramos). A pesar de que las balanzas analíticas pueden presentar un variado tipo de diseños y aspectos exteriores, todas ellas se construyen basadas en los mismos principios. La base es de gran solidez y confiere estabilidad al instrumento evitando al máximo la posibilidad de vibraciones. La columna es un tubo por el cual se conduce el mando de arresto o bloqueo del sistema oscilante. La cruz esta hecha de una aleación especial de aluminio u otro metal estable que no permita deformaciones por el peso variable que debe soportar. 7 APLICACIÓN DE CALOR Un recurso habitualmente usado en el laboratorio es la aplicación de calor sobre muestras en orden a acelerar reacciones químicas, esterilizar, secar, calcinar, etc. Con este fin se emplean materiales resistentes al calor tales como tubos de ensayo, matraces erlenmeyer, crisoles, vasos de precipitado, balones matraces de fondo redondo. A menudo, la principal fuente de calor utilizada en el laboratorio es el mechero Bunsen. No obstante también se pueden utilizar baños termorregulados para cuando la temperatura de calentamiento que se desea aplicar no sobrepase los 90ºC. Estos en general funcionan con agua pero existen otros que emplean sustancias oleosas para alcanzar temperaturas superiores al punto de ebullición del agua. El uso de resistencias eléctricas en la generación de calor es otro de los procedimientos comúnmente usados en el laboratorio. Estos están presentes en instrumentos tales como hornos, autoclaves, mantas, baños secos, etc. La principal ventaja que presentan los baños termorregulados y aquellos instrumentos que utilizan como fuente de calor resistencias eléctricas es que son cómodos de trabajar, poseen exactitud en la regulación térmica y son seguros en su manejo. APLICACIÓN DE FRÍO En ciertas ocasiones durante el trabajo de laboratorio es necesario la aplicación de frío sobre ciertas muestras. Ello ayuda por ejemplo en la caracterización de sustancias puras por su punto de fusión, en la regulación de reacciones químicas y procesos enzimáticos, solubilización o liquefacción de gases, condensación o retención de vapores, cristalización y precipitación, estabilización de material biológico, liofilización, etc. Probablemente en algunas secciones de este curso práctico Ud. trabajará con material biológico (tejidos, estructuras celulares, etc.), los cuales deberán ser mantenidos en hielo. Esto tiene como objetivo la preservación funcional de dichos materiales biológicos. Hay que tener en cuenta que a temperaturas más elevadas (temperatura ambiente o mayor) una gran variedad de funciones biológicas se deterioran irreversiblemente. 8 PREPARACIÓ DE SOLUCIOES - CÁLCULO DE COCETRACIOES SOLUCIOES ACUOSAS En una solución acuosa se pueden distinguir 2 componentes: el soluto y el solvente. Solvente es el componente que se encuentra en mayor proporción y el soluto en menor proporción. Para identificar una solución no basta con indicar sus componentes, sino también es fundamental conocer la proporción de éstos en la solución. SOLUTO + SOLVENTE = SOLUCION EXPRESIOES DE COCETRACIO Concentraciones basadas en el volumen y, en la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen son las más ampliamente utilizadas en el trabajo de laboratorio. Las expresiones más usadas son: MOLARIDAD (M): Se define como el número de moles de soluto por litro de solución. Para calcular M (molaridad) se necesita conocer el peso del soluto y su peso molecular (PM): Una solución 1M: contiene 1 mol de soluto por litro de solución; contiene el número de Avogadro de moléculas de soluto por litro de solución. *Número de Avogadro: número de moléculas por gramo-mol; número de átomos por gramo/átomo; número de iones por gramo-ión; su valor numérico es 6,023 x 1023. Una vez preparada una solución, esta se puede mantener como solución stock concentrada y a partir de ella se pueden prepara diluciones necesarias, debido a que el número de moles no se altera al diluir una muestra, por lo tanto se establece que: Ci x Vi = Cf x Vf 9 Donde la concentración inicial (Ci) debe tener la misma unidad que la concentración final (Cf) y el volumen inicial (Vi) debe tener la misma unidad que el volumen final (Vf). Soluciones más diluidas en general se expresan en términos de milimolaridad (mM), micromolaridad (µM), u otras, donde: 1 mmol = 10 -3 moles 1 µmol = 10 -6 moles 1 nmol = 0,001 µmol = 10 -9 moles 1 pmol = 0,001 nmol = 10 -12 moles De esta manera: 1 mM = 10 -3 M =1 mmol/litro =1 µmol/ml 1µM =10 -6 M =1µmol/litro =1nmol/ml 1nM =10 -9 M =1nmol/litro =1pmol/ml Tabla 1: conversión de unidades de masa ORMALIDAD () Se define como el número de equivalente de soluto por litro de solución. Para calcular N se necesita conocer el peso del soluto disuelto y su peso equivalente (PE). (N) equivalentes = nº de equivalentes de soluto litros disolución nº equivalentes = masa de soluto (g) Peso equivalente Peso equivalente = Peso molecular n* 10 Donde n es: n*: número de H + o OH - reemplazables por molécula para ácidos o bases respectivamente o n*: número de electrones perdidos o ganados por molécula para agentes oxidantes y reductores. Si Ud. reemplaza la ecuación de PE en la ecuación de n° eq, y seguidamente reemplaza lo obtenido anteriormente en la ecuación de normalidad puede deducir que: N = M x n* PESO/VOLUME (%p/v) Se refiere al peso en gramos de un soluto en 100 ml de solución. Depende sólo del peso de la sustancia y del volumen en que esta disuelta. Para soluciones diluidas se puede expresar como: % p/v = peso del soluto en miligramos por 100 ml de solución. o también como una fórmula numérica: PESO/PESO (%p/p) Se refiere al peso en gramos de un soluto por 100 gramos de solución. La concentración de la mayoría de los ácidos comerciales vienen dadas en %p/p. Con el fin de transformar esta expresión de concentración en M (o N) se debe conocer la densidad (δ) de la solución. MOLALIDAD (m) Se define como el número de moles de soluto por 1000 gramos de solvente. Por lo tanto: M = n° moles kg disolv. Esta expresión de concentración es usada en ciertos cálculos físico-químicos La concentración expresada de esta manera se hace independiente de la temperatura. Dado que la temperatura afecta el volumen de una solución, la concentración de ésta se verá afectada cuando la expresión de concentración usada está basada en el volumen. Para soluciones diluidas, la situación es similar a lo descrito anteriormente en el caso de la expresión de molaridad. 11 Problemas 1) Para 500 mL de una solución 0,2 M de ácido sulfúrico, calcule: a) los gramos de ácido sulfúrico que contiene b) el número de molécula de ácido sulfúrico que contiene c) la concentración N de dicha solución 2) Cuántos gramos de hidróxido de sodio sólido se requieren para preparar 500 ml de una solución 0.04 M. 3) Exprese las concentraciones de la soluciones anteriores en: a) N b) g/l c) % p/v 4) Para el hidroxido de bario, calcule: a) los gramos contenidos en 1 mol b) las moléculas contenidas en 1 g c) los gramos necesarios para preparar una solución 0,1 M d) los gramos necesarios para preparar una solución 0,5 N e) los gramos necesarios para preparar una solución 5% p/v 5) Calcule cuántos mL de ácido sulfurico 5M se requieren para preparar: a) 1500 mL de una solución 0,002 M b) 1 L de una solución 2 M c) 0,05 L de una solución 1M d) 20 mL de una solución 1 N e) 0,2 mL de una solución 0,1 % p/v 6) Para las sig. soluciones 2 M: Cuarzo (SiO 2 ), azúcar de mesa (C 12 H 22 O 11 ), calcita (CaCO 3 ) determine: a) PM de cada molécula b) Los gramos contenidos en 1 mol c) Moléculas contenidas en 1 g 7) Calcule cada una de las siguientes cantidades: a) la masa de 2,6 x 10 20 moléculas de ácido clorhídrico b) la masa de 0,5 mol de ácido fosfórico c) el número de moles en 60 g de cloruro de sodio 8) Si Ud. dispone de varias soluciones concentradas: cloruro de sodio 3 M, cloruro de potasio 1 M, cloruro de magnesio 1 M. A partir de estas, indique cuantos mL de cada una de ellas son necesarios para preparar 0,5 L de soluciones a las siguientes concentraciones: a) cloruro de sodio 2 N b) cloruro de potasio 2% p/v c) cloruro de magnesio 0,02 mM 12 9) Calcule la cantidad de soluto necesario para preparar las soluciones que se indican a) 1000 mL de hidroxido de sodio 2M b) 500 mL de cloruro de litio 0,5 M c) 10 mL de cloruro de calcio 5 % p/v d) 100 mL de cloruro de sodio 1 N 10) Qué cantidad de moles de glucosa existen en los siguientes volúmenes de solución 0.012 M a) 150 mL b) 1 L c) 10 4 mL d) 0,2 mL e) 300 µL 11) Calcule la molaridad y % p/v si Ud. disuelve 170 mg de sacarosa en los siguientes volúmenes: a) 700 µl b) 80 mL c) 10 5 µL d) 3x10 5 mL e) 1x10 3 µL 12) Calcule la normalidad si ud. disuelve 2 mg de ácido fosfórico en los siguientes volúmenes: a) 200 mL b) 0,2 mL c) 2000 µL d) 3 L e) 20 µL 13 Actividad Práctica Actividad Nº1: Reconocimiento del material de trabajo a) Ud. dispondrá de una cierta cantidad de material de vidrio, el que usará durante su trabajo práctico. Cuídelo y evite un tratamiento drástico o golpearlo. Su instructor le mostrará los distintos materiales de laboratorio y sus características. Además Ud. recibirá instrucciones de cómo trabajar con dicho material: pipetas, tubos de ensayo, matraces, etc. Actividad Nº2: Preparación de soluciones a) Preparación de una solución NaCl 3,5 M. Pese la cantidad necesaria y transfiérala a un vaso de precipitado. Adicione 2/3 del volumen final de agua destilada. Con la ayuda de una bagueta (barra de vidrio) acelere la disolución de la sacarosa en el agua. También puede recurrir a la aplicación de calor. En este caso deberá esperar hasta que la solución llegue a temperatura ambiente (20ºC) antes de llevar la solución a su volumen final. Enrase la solución a su volumen final en un matraz aforado. b) A partir de la solución antes preparada Ud. deberá confeccionar tres diluciones de tal manera que queden a 15%, 1% y 0.15 M respectivamente. Vacíe la solución concentrada en un vaso pp. limpio y seco. Tome las alícuotas respectivas con una pipeta volumétrica y vacíe en matraces aforados. Complete el volumen con agua hasta el aforo. Actividad Nº3: Informe n°1 en clases. Ud. recibirá una Informe n°1 el cual debe ser completado en clase y entregado al final de la misma. Asi mismo, TODOS los cálculos de las actividades anteriores deben ser anotadas en esta guía, de manera clara y ordenada. MATERIALES LABORATORIO 4 Matraces de aforo 100 ml. 1 espátula metálica. 1 embudo. 1 matraz Erlenmeyer 250 ml. 2 vasos de precipitado de 100 ml. 1 vaso de precipitado de 50 ml. 1 pizeta. 1 pipeta graduada de 1, 5 y 10 ml. 1 pipeta aforada d2 2 ml. 1 probeta de 100 ml. 1 pprpipeta de 2ml y 10 ml. 1 marcador. 1 baqueta de vidrio. Material para el grupo curso. 2 balanzas. NaCl. 14 Tabla 1: conversiones de medida universal 15 16 FACULTAD DE CIECIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMETO DE CIECIAS BIOLÓGICAS BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BIO035 BIO035 BIO035 BIO035 GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° 2 GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° 2 GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° 2 GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° 2 “MÉTODO CIENTÍFICO” “MÉTODO CIENTÍFICO” “MÉTODO CIENTÍFICO” “MÉTODO CIENTÍFICO” 17 ITRODUCCIÓ El objetivo de toda ciencia radica en brindar explicaciones para los fenómenos observados y establecer principios generales que permitan predecir las relaciones entre éstos y otros fenómenos. Estas explicaciones y generalizaciones se logran por un sentido común organizado al que se le denomina método científico. La base radical del método científico es la observación cuidadosa, libre de variables que le puedan afectar, los testigos adecuados y lo más cuantitativamente posible. Objetivo General del laboratorio: El objetivo de este trabajo práctico es que el estudiante se familiarice y reconozca cada una de las etapas del método científico y su aplicación en diferentes contextos investigativos. 1. Métodos y Planes El concepto de método: Es el camino para llegar a un fin. En consecuencia, los métodos de investigación serán los procedimientos que se apliquen para lograr los objetivos que los investigadores se proponen. Los métodos de investigación son más generales que las técnicas, las cuales se utilizan como medios de apoyo. Las técnicas son específicas y tienen un carácter instrumental. Por ejemplo: técnicas de muestreo, de cuestionarios, de entrevistas, de observación, etc. Una investigación elige un método y puede aplicar diversas técnicas. 2. Pasos en el plan de la investigación 1º PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Delimitación Fuentes documentales Formulación de hipótesis Definición de variables 2º OBTENCIÓN DE LOS DATOS 3º PROCESAMIENTO DE LA INFORMA- CIÓN Selección de técnicas Elaboración y validación de instrumentos. Elección de la muestra Trabajo de campo Planillas de registro Cálculos estadísticos Tablas y gráficos 4º ANÁLISIS DE LO DATOS Interpretación de resultados. Conclusiones Redacción de informe 18 Etapa1 : Planteamiento del Problema. Lo primero que tiene que hacer el investigador es clarificar y delimitar bien su problema de investigación. Esto ha sido precisado en el Módulo Nº2, junto con las Hipótesis y Variables. Ahora, nos referiremos a las fuentes documentales relacionadas con el problema. Hay tres razones fundamentales para que los investigadores busquen información pertinente desde un principio: Justificar la “originalidad del problema”. Se indaga en revistas especializadas, tesis, centros de documentación, etc. si existen investigaciones relacionadas con nuestro problema. Recopilar antecedentes teóricos para conformar un marco teórico actualizado que sirva de base para proponer una Hipótesis coherente con cierta lógica científica. Rastrear metodologías y técnicas aplicadas por otros investigadores del sector que nos preocupa, que pueden servir de modelos para seguir o modificar. Etapa 2 : Obtención de los datos. La selección de las técnicas que se requieren depende de la naturaleza del problema y la metodología de trabajo. Cuando la muestra, es pequeña y accesible, lo más recomendable es observar a todos los componentes de la investigación. Cuando la muestra es muy grande y a veces de un tamaño indeterminado, en este caso se procede a la elección de una porción representativa. Etapa 3 : Procesamiento de la información. Cada sujeto integrante de la muestra genera cierta cantidad de información, que es conveniente acumularlos en planillas de datos o planillas electrónicas. Para mayor facilidad del manejo de los datos acumulados, estos se codifican con números, signos o letras. Por ejemplo: los datos personales (edad, el sexo, curso, etc.) y las preguntas formuladas generan otras tantas columnas en la planilla. Las respuestas u observaciones registradas para cada sujeto, se distribuyen en tantas filas como sujetos tenga la muestra. Un aspecto importante en la confección de los instrumentos de investigación es pensar en forma anticipada de qué manera esta información se organizará en una planilla de datos. Cuando finalmente, los datos están ordenados en la planilla, se procederá a realizar los cálculos y pruebas estadísticas necesarias, de acuerdo con los objetivos que se persiguen. El siguiente paso será resumir la información y presentarla en tablas y gráficos, que muestren con claridad las relaciones de las variables que interesaban descubrir. Etapa 4 : Análisis de los datos y pruebas. La interpretación de los resultados se debe desprender con claridad del análisis de cada tabla o gráfico que se haya previsto. Las conclusiones se apoyan en los resultados presentados. El principal resultado será demostrar si la hipótesis es aceptada o fue falseada (recuerde el paradigma de la verdad). Recuerde que un trabajo de investigación sólo termina cuando se 19 ha elaborado el informe de investigación. 3. Los Diseños Experimentales En estos diseños, el elemento eje es el planteamiento de una Hipótesis causal, que establezca relaciones de CAUSA/EFECTO en el desarrollo de ciertos acontecimientos. El experimento viene a tener el carácter de medio de prueba, que se planea en forma deductiva para reunir evidencias que permitan inferir el valor de la hipótesis, de acuerdo al modelo clásico del Método Científico. Simbología usada en los diseños experimentales Variable independiente: X Variable dependiente : Y Experimentador : O Sujeto : S Pretest : T1 Postest : T2 Media : M Muestra aleatoria : R Grupo experimental : E Grupo control : C Puntaje medio x Requisitos necesarios para inferir relaciones causales en un diseño experimental. Cuando a una variable (X) se le atribuye la causa de otra (Y), se debe presentar tres clases de ante- cedentes. Que X anteceda a Y en el tiempo Que Y no esté siendo afectado por otras variables Que se demuestre una relación estadística significativa entre X e Y 4. El control de variables Para poder establecer relaciones causales de una variable independiente (X) sobre otra dependiente (Y), el investigador deberá manipular deliberadamente la primera variable para observar el efecto que estos cambios producen sobre la variable dependiente. Para que los resultados tengan validez, es indispensable realizar un control estricto de las condiciones de experimentación a fin de evitar la “contaminación” del experimento por “variables intervinientes” que interfieran sobre los resultados. Factores que afectan la validez interna de los datos: Historia contemporánea. Corresponde a cualquier tipo de acontecimientos que afecte a los “S” y pueda afectar a la variable “Y”, por ejemplo una epidemia de gripe puede disminuir el rendimiento esperado en un grupo de estudiantes. Maduración. Cuando el experimento se prolonga durante meses o más tiempo, los participantes “S” están desarrollando transformaciones biológicas y sicológicas que afectan su rendimiento 20 intelectual y físico y pueden afectar las mediciones finales. Administración de test. La administración de “T1” puede servir de experiencia de aprendizaje, y los “S” aumentarán sus respuestas en “T 2 ”, aunque no intervenga “X”. Instrumentación. Cambios que se realicen en los instrumentos en las nuevas mediciones o en los observadores, que pueden producir variaciones en los registros de los nuevos datos. Regresión estadística. Opera cuando se escoge a los “S” por sus puntajes extremos, sean muy altos o muy bajos. Al escoger a muy buenos alumnos para un programa o especial o los de bajo rendimiento para un plan de recuperación pedagógica. La media x de cualquiera de esos grupos diferenciales se desplazará hacia la x media de la población original, esté o no presente la variable “X”. Sesgos. Al escoger en forma arbitraria o casual grupos o cursos sin aplicar procedimientos aleatorios, se corre el riesgo que los grupos de comparación tengan habilidades o capacidades diferentes en relación a “X” antes de iniciar el tratamiento. Por ejemplo, elegir voluntarios o los estudiantes que siempre asisten a clases. Mortalidad experimental. Es la pérdida o retiro de integrantes de “E” o “C” una vez que se ha iniciado el experimento. Pérdidas mayores a un 5% se consideran graves. Interacción entre selección y maduración y otras condiciones. Corresponde a la suma de diferentes factores. La validez externa: Corresponde a la representatividad de los resultados de un experimento o su poder de generalización. Normalmente el experimento se lleva a cabo con una muestra de cierta población. Cabe preguntarse ¿A qué sujetos, grupos o población pueden aplicarse estos resultados? ¿Bajo qué condiciones o ambientes y variables de aplicación y de medición? El significado del grupo de control : Aquí reside el mayor grado de similitud con los criterios de comparabilidad exigidos por las ciencias naturales. Para este efecto, al grupo experimental se le administra el tratamiento “X”. El grupo de control no es sometido a “X”, permitiendo al “O” verificar por comparación, que la variable independiente es el único elemento que afectan los cambios registrados en la variable dependiente. 21 ACTIVIDADES PRÁCTICAS A) Un problema para ser analizado mediante la observación científica: ¿Qué factores hacen que una sustancia difunda en otra con diferente rapidez? Ponga 5mL de agua destilada en 5 tubos de ensayo, enumerados del 1 al 5. Caliéntelos a baño de María, de modo que los respectivos tubos alcancen una temperatura de 20, 25, 40, 55 y 70 ºC. Una vez alcanzadas las temperaturas para cada tubo, agregue a éstos 1, 2, 3, 4 y 5 gotas, respectivamente, de azul de metileno. Mida el intervalo de tiempo transcurrido (tiempo de difusión) entre el tiempo cero (momento en que se agrega el colorante) y el tiempo final (momento en que la distribución del colorante en el tubo es uniforme). Resultados 1. ¿Cuáles son las variables de este experimento y cómo deben situarse en los ejes de las coordenadas de un gráfico?. Responda y realice el gráfico en el envés de esta hoja. 2. ¿Qué efecto tiene la concentración sobre la velocidad de difusión? 3. ¿Qué efecto tiene la temperatura sobre la velocidad de difusión? 4. Con estos datos elabore una hipótesis respecto al (los) factor (es) que afecta (n) la velocidad de difusión del orgánico utilizado. B) Una hipótesis para ser analizada mediante experimentación: ¿Confirmación o rechazo? Para verificar las posibles explicaciones, es indispensable ponerlas a prueba a fin de encontrar la verdadera. Por cuanto es preciso que diseñe un experimento, el que a través de los resultados que proporciona, podrá confirmar o rechazar las inferencias hechas; esto le permitirá determinar cuál o cuáles de las hipótesis son correctas. TUBOS Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Volumen de agua (mL) Temperatura (°C) Concentración (gotas) Tiempo (seg) 22 Modelo experimental (diseño). Resultados TUBOS Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Volumen de agua (mL) Temperatura (ºC) Concentración (gotas) Tiempo (seg) TUBOS Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Volumen de agua (mL) Temperatura (ºC) Concentración (gotas) Tiempo (seg) 1. ¿Cuáles son las conclusiones? 2. Con los datos obtenidos del modelo experimental, ¿es posible determinar la hipótesis correcta respecto al o los factores que afectan la velocidad de difusión del azul de metileno? Si es así, formúlelo. 3. ¿Cree usted que la hipótesis es válida para otro tipo de sustancias? 4. ¿Qué deberá hacer para generalizar la hipótesis? BIBLIOGRAFÍA • Labarca A. C. Los Métodos de Investigación Aplicados a las Ciencias de la Conducta. Facultad de Filosofía y Educación Departamento de Formación Pedagógica. U.M.C.E. www.umce.cl/publicaciones/mie/mie_modulo4.pdf 23 Materiales de laboratorio. Método Científico Materiales por grupo (3 alumnos por grupo) 2 pipetas de 5ml 2 gradillas 15 tubos de ensayo 2 picetas con agua destilada 1 termómetro de líquidos 1 vaso pp de 500ml 1 vaso pp de 250 ml 1 pinza de madera para tubos de ensayo 1 cronómetro 1 rejilla 1 trípode 1 gotario 1 matraz con 20 ml de azul de metileno al 50%. 1 lápiz rotulador 24 FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BIO035 BIO035 BIO035 BIO035 GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° 3 33 3 “ ““ “MICROSCOPÍA MICROSCOPÍA MICROSCOPÍA MICROSCOPÍA” ”” ” 25 Introducción El término célula fue usado por primera vez cuando Robert Hooke observó un trozo de corcho en un microscopio de luz en 1665. Luego, Antony van Leeuwenhoek observó en 1670 varios tipos de células y finalmente, fue en 1838 cuando Matthias Scleiden y Theodro Schwan propusieron a partir de sus observaciones microscópicas de diversos tejidos la teoría celular “Todos los organismos están compuestos de células y, todas las células provienen de la división de otras células preexistentes”. Estos descubrimientos dieron así origen al nacimiento de la biología celular contemporánea. Las células son muy pequeñas y además son traslúcidas lo que hace imposible su observación por ojo humano desnudo. Es por eso que el microscopio ha sido y, es una de las herramientas más utilizadas en biología. El progreso en la construcción de nuevos microscopios, así como el desarrollo y uso de nuevos métodos de fijación, corte y tinción han permitido una serie de descubrimientos en los campos de la histología, citología y bacteriología, permitiéndonos entender cada vez con más claridad la estructura de la célula y su organización, lo que es una importante ayuda para la comprensión de su funcionamiento. FIGURA 1: Relación entre el tamaño de diferentes células y sus componentes. Objetivo del trabajo Práctico El objetivo principal de este laboratorio consiste en que el estudiante comprenda el funcionamiento de un instrumento óptico como el microscopio y observe diferentes tipos celulares realizando comparaciones entre ellas. 26 El microscopio óptico y sus partes En términos generales, el microscopio es un sistema de lentes montados en un tubo. La distancia desde el tubo al objeto que se quiere observar puede regularse por medio de dos botones de ajuste y, todo el conjunto está dispuesto sobre un robusto soporte en el que también se apoya la platina sobre la cual se coloca la preparación a observar y, una fuentes de luz que se dirige a través del objeto en estudio. Las diferentes partes de un microscopio pueden agruparse en 3 sistemas fundamentales: FIGURA 2. Esquema de un microscopio óptico en el cual se indican sus partes El sistema mecánico se compone del pie en el cual se sustenta el instrumento y, la columna, que se encuentra fijada al pie y sostiene las otras partes del microscopio; el tubo que sostiene los oculares, el revolver portaobjetivos, la platina y el sistema de enfoque, tanto macrométrico (aproximado) como micrométrico (preciso). El sistema óptico se compone de 2 sistemas diferentes de lentes. Los oculares son 2 lentes separados por un diafragma fijo, tienen la función de aumentar la imagen proyectada por los objetivos. Los objetivos son 3 ó 4 lentes ubicados en el revólver, son los que aumentan la imagen y pueden ser secos (entre ellos y la muestra hay una capa de aire) o de inmersión (entre ellos y la muestra se coloca una sustancia especial que permite lograr un aumento mayor). Finalmente, el sistema de iluminación se compone de una fuente luminosa, que es generalmente una lámpara ubicada en el pie o en la base de la columna del microscopio. Si la fuente luminosa es independiente del microscopio, además se necesita de un espejo que refleje la luz y la desvíe hacia el condensador y de un condensador, que a través de un sistema de lentes concentra la luz que llega al condensador se regula por medio de un diafragma ubicado en su parte inferior. Adicionalmente se puede colocar un filtro, generalmente azul, para obtener una luz homogénea y parecida a la luz natural. Formación de la Imagen La luz posee una naturaleza dual y, puede ser entendida al mismo tiempo como una partícula y como una onda. La comprensión de este comportamiento, así como de algunas características de la luz, es importante para entender el proceso de formación de la imagen en un microscopio y, cómo manejando ciertos parámetros físicos podemos obtener imágenes más nítidas y de mayores aumentos. 27 La luz posee una determinada longitud de onda y viaja en el espacio con una determinada velocidad. Cuando la luz llega a una superficie que separa dos medios transparentes una parte de ella se refleja volviendo por el mismo medio en que se propagaba y, otra parte en cambio es refractada, penetra en el segundo medio y cambia su dirección y velocidad. Esto ocurre cuando la luz llega por ejemplo a una lente. Si ésta es convergente, los rayos se juntan en un punto, el que corresponde al foco, la distancia entre ese punto y el centro de la lente es la llamada distancia focal. Como ya vimos, la velocidad de la luz es diferente en el vacío que en otros medios. Esta diferencia de velocidad puede compararse mediante el índice de refracción, que corresponde al cuociente entre la velocidad de la luz en el vacío y la velocidad de la luz en un medio determinado en el que ésta incide. Mientras más se acerca un objeto al ojo, más detalles de él pueden ser distinguidos, pero hay una distancia límite a la que se pueden acercar los objetos y, sobre esa distancia y,a no se distinguen los objetos con claridad y, se hace necesario el uso de lentes o lupas para aumentar el objeto en estudio. El aumento de una lente está dado por el límite de cercanía a la que pueden llevar los objetos en el ojo humano y por su distancia focal. Si se quiere aumentar aún más una imagen, se pueden colocar dos lentes en serie (objetivo y ocular en el caso del microscopio compuesto) y, el aumento final logrado será entonces el producto del aumento de cada uno de ellos. Si tiene en un microscopio un objeto a observar, los rayos de luz reflejados o emitidos por el objeto que se sitúa fuera de la distancia focal de un lente (objetivo) al pasar por el objeto son refractados y enfocados en un plano que se ubica más allá de la cara opuesta de la lente obteniéndose una imagen real que es invertida y de tamaño distinto (mayor) al del objeto original. A medida que el objeto se acerca al foco la imagen obtenida es más grande. FIGURA 3. Esquema de la formación de una imagen con un lente simple La segunda lente (ocular) aumenta la primera imagen obtenida. La imagen final es una imagen virtual y aumentada. FIGURA 4. Esquema de la formación de una imagen en un sistema de lentes 28 El poder de resolución de un microscopio depende también de la apertura numérica, capacidad de una lente para aprovechar la mayor cantidad de rayos para formar la imagen. Esta puede aumentarse al usar entre el objetivo y el objeto a observar una sustancia con índice de refracción mayor del aire. Para esto se usan los llamados aceites de inmersión. Así, al aumentar la apertura numérica se obtienen mayores aumentos. Este tipo de aceites se usan solamente con objetivos especiales que se llaman lentes de inmersión. Poderes del Microscopio El microscopio posee varias características o poderes que determinan en forma importante su utilidad como herramienta de estudio. Estos son: * Poder de aumento: Es la razón entre el tamaño de la imagen que produce el microscopio y el tamaño original del objeto en observación. Este aumento se logra a través del ocular y de los objetivos y, ya que cada uno es capaz de amplificar la imagen, el aumento total logrado se obtiene al multiplicar estos dos valores de aumento. * Poder de definición: Es la capacidad del microscopio para formar imágenes nítidas y de bordes definidos. * Poder de penetración: Es la capacidad para visualizar los diferentes planos de una preparación y está dado por el ajuste de precisión que se logra con el tornillo micrométrico. * Poder de resolución: Permite distinguir como objetos separados dos puntos que se encuentran muy cercanos entre sí. Uso del Microscopio Para un buen uso del microscopio sea cuidadoso y siga atentamente las siguientes instrucciones: 1. Asegúrese de que el microscopio se encuentre en una posición cómoda para usted, tomándolo siempre de la columna. 2. Encienda la lamparilla. 3. Coloque el objetivo de menor aumento. 4. Coloque su preparación en la platina asegurándose de que ésta se encuentre con el cubreobjeto hacia arriba. 5. Abra totalmente el diafragma iris y suba el condensador casi hasta el tope. 6. Si su microscopio tiene espejo, céntrelo para que la preparación reciba el máximo posible la luz. 7. Enfoque la preparación bajando el tubo o subiendo la platina. Existe un tope que impide que los objetivos de menor aumento topen la preparación. 8. Mire a través del ocular y usando el tornillo macrométrico aleje lentamente el objetivo de la preparación, hasta lograr una imagen más o menos nítida. Termine de enfocar usando el tornillo micrométrico. 9. Una vez enfocada su preparación, regule la cantidad de luz que recibe su muestra cerrando para ello el diafragma. 10. Si después de realizar todos los pasos anteriores no logra observar su preparación en forma nítida, verifique que la preparación esté ubicada dentro del campo visual y que el cubreobjetos se encuentre mirando hacia arriba. Revise también la limpieza de la preparación, oculares, objetivos, condensador, 29 espejo y, por último, verifique que la iluminación sea la adecuada y que el objetivo se encuentre en su posición correcta. 11. Para cambiar de objetivo, gire el revolver hasta el objetivo del aumento que desea utilizar y, vuelva a enfocar su preparación utilizando para ello el tornillo micrométrico, y si fuera necesario, el macrométrico. 12. Para usar el objetivo de inmersión coloque sobre su preparación una gota de aceite de inmersión y, luego enfoque su preparación con el objetivo inmerso en el aceite. Una vez finalizada la observación, limpie cuidadosamente el objetivo eliminando el aceite de inmersión. Para ello utilice Xilol y una hoja de papel para lentes, especialmente dispuesto para ello, pues las pelusas del papel común permanecen en el objetivo y pueden interferir en observaciones posteriores. 13. Al terminar su trabajo limpie el resto del microscopio con un paño suave, apague la lamparilla, situé el objetivo de menor aumento en posición de observación, baje la platina y, cubra el microscopio. Preparación del Material a ser Observado en un Microscopio Existen dos tipos de preparaciones microscópicas, éstas corresponden a las preparaciones permanentes y a las preparaciones temporales. Ambas deben ser lo más delgadas posible para dejar pasar la luz a través de él y así lograr una buena observación. Las preparaciones permanentes son aquellas que se han sometido a un proceso largo de preparación, el que permite que se mantengan en buenas condiciones para su observación por periodos prolongados de tiempo. La preparación de estas muestras incluye etapas de fijación del material, deshidratación, inclusión en parafina, corte de la muestra en capas muy finas con un micrótomo, colocación de estas capas que contienen la muestra en un portaobjetos, disolución de la parafina, tinción de la muestra para contrastar las diferentes estructuras celulares y colocación de un cubre objetos para proteger la preparación. Las preparaciones temporales corresponden a cortes frescos del material a observar, los que se realizan en el momento y tienen una corta duración. Una vez realizados los cortes, se coloca una gota de agua en un portaobjetos y, en ella se ubica un trozo del material a observar, el que debe quedar completamente cubierto por el agua. Sobre esta preparación se coloca cuidadosamente un cubreobjeto, evitando la formación de burbujas que interfieren en la observación microscópica. Finalmente, se elimina exceso de agua y, la preparación puede teñirse para ser observada. Existen numerosas tinciones que se utilizan en microscopía y permiten una mejor observación de las estructuras celulares al contrastar en forma selectiva moléculas determinadas. Generalmente se usan diferentes colorantes, algunos ejemplos de ellos son el lugol que tiñe los granos de almidón de color azul-morado, la floroglucina que tiñe de rojo violeta las paredes celulares lignificadas, el azul de metileno que tiñe el protoplasma y las paredes celulares celulósicas, etc. 30 Otros tipos de Microscopios El avance tecnológico ha permitido en los últimos años el desarrollo de una serie de microscopios que con pequeñas modificaciones de los principios básicos del microscopio de luz permiten un mejor estudio de la célula. Algunos ejemplos son los siguientes: FIGURA 5: dibujos de diferentes tipos de microscopios Microscopio de contraste de fases: El mayor problema de la observación microscópica de muestras biológicas es el poco contraste que éstas poseen. Las partes invisibles de una preparación son atravesadas por la luz, sin que cambie su amplitud, pero produciendo un cambio en su fase. En este tipo de microscopio los cambios de fase de la luz se traducen en cambios de amplitud, este microscopio permite examinar objetos vivos, así como el seguimiento en ellos de procesos celulares como la mitosis. Microscopio de fluorescencia: Algunas moléculas emiten parte de la luz que absorben a longitudes de onda mayores a las que reciben. Este proceso es llamo fluorescencia y se presenta en forma natural, por ejemplo, en las clorofilas. Existen numerosos fluorocromos (moléculas capaces de emitir fluorescencia), los cuales pueden utilizarse para teñir muestras biológicas, cuyas estructuras se ven después por la fluorescencia de las moléculas unidas a ellas. En este tipo de microscopios la luz utilizada es de longitud de onda corta y, se logra por el uso de lámparas de mercurio. Esta luz incide en la muestra y, lo que se observa es la fluorescencia que proviene de ella. Si la unión de estos compuestos fluorescentes se hace específica se pueden observar estructuras celulares definidas, como por ejemplo, proteínas marcadoras de diferentes organelos. Microscopio electrónico: La luz se reemplaza por un haz de electrones que se obtienen al calentar un filamento en un tubo al vacío. Estos electrones son desviados en un campo electromagnético que cumple la función de condensador. Al pasar a través del objeto, los electrones son parcialmente deflectados; el grado de deflección de ellos depende de la densidad electrónica de la muestra. Debido a la baja densidad electrónica de las muestras biológicas, para aumentar el contraste de las muestras se 31 usan metales pesados que aumentan la interacción de ésta con los electrones incidentes. Después de pasar por la muestra, los electrones se colectan en un objetivo donde se forma la imagen, ésta se ve finalmente sobre una pantalla fluorescente, o en una placa fotográfica. Las imágenes logradas en este tipo de microscopio son siempre en blanco y negro y, las zonas más oscuras corresponden a zonas de mayor densidad electrónica en la muestra. Su poder de resolución es del orden de 4 Aº y, permite lograr aumentos de hasta 1.000.000 de veces. Sin embargo, una desventaja es que se necesitan cortes extremadamente finos y las muestras deben someterse a procesos de preparación (deshidratación) antes de ser colocadas al vacío para ser observadas. 32 Actividad Práctica OBJETIVOS: • Describir y analizar los principios básicos de la microscopía. • Aprender el manejo de algunas técnicas básicas de microscopía, como el montaje de preparaciones en portaobjeto y tinción de muestras. • Aprender a realizar observaciones microscópicas con el objeto de esquematizar, describir e interpretar adecuadamente lo observado. ACTIVIDAD º1: Cálculo del aumento y límite de resolución del microscopio. OBJETIVOS: • Conocer los componentes principales de un microscopio. • Comprender la función de los lentes oculares y objetivos. • Calcular el aumento final de los objetos observados y el límite de resolución del microscopio. La función principal del microscopio es aumentar la resolución, la cual nos permite observar detalles de los objetos que no es posible ver con el ojo humano. Al aumentar la magnificación, el tamaño observado del objeto, también debe aumentar la resolución; de otro modo, veríamos sólo una imagen de gran tamaño pero sin nitidez. El poder de resolución de un microscopio se define como la capacidad que permite hacer perceptible por separado, dos puntos situados muy próximos entre sí en el objeto. Esta capacidad está determinada por la apertura numérica (NA) de la lente, siendo directamente proporcional a ésta, e inversamente proporcional a la longitud de onda de la luz utilizada (λ). Poder de resolución = NA 0,61 x λ El recíproco del poder de resolución corresponde al límite de resolución, la distancia mínima que debe existir entre dos puntos para poder distinguirlos por separado. Límite de resolución = 0,61 x λ NA Teniendo claros estos conceptos, podemos comenzar el estudio de los componentes del microscopio, para llegar a calcular el aumento de las imágenes y la distancia mínima que podemos llegar a distinguir al realizar una observación en un microscopio compuesto. IMPORTATE: Recuerde que el microscopio es un instrumento óptico de gran precisión, por lo que debe ser manejado siempre en forma cuidadosa. Cualquier maltrato o golpe puede desajustar el instrumento y dañarlo gravemente. Trate de no tocar las piezas cuya función no conoce. Ante cualquier duda o problema, solicite siempre la ayuda de sus profesores ayudantes. • Observe cuidadosamente los distintos componentes del microscopio que le ha sido asignado. Compárelos con el esquema que fue entregado en la guía y, asegúrese de comprender la función precisa de cada uno de ellos antes de comenzar cualquier observación microscópica. 33 • Anote en la siguiente tabla el poder de aumento y apertura numérica de los lentes objetivos. Estos valores se encuentran en la parte cilíndrica o “cañón” de los lentes. AUMENTO APERTURA NUMERICA Anote el aumento y la apertura numérica de él o los lentes oculares. AUMENTO APERTURA NUMERICA • Anote ahora la apertura numérica del condensador: APERTURA NUMERICA (NA) • La resolución máxima de su microscopio depende de la apertura numérica efectiva máxima que posea. Este valor máximo corresponde normalmente al lente 100x o lente de inmersión. Observe ahora los siguientes valores: Apertura del lente 100x ___________________________ Apertura numérica del condensador ___________________________ Apertura numérica de la interfase de aire 1,0 Apertura numérica de la interfase de aceite 1,3 - 1,5 La apertura numérica efectiva máxima es el valor más bajo de los anteriores. Utilizando este valor menor de apertura numérica de trabajo, calcule el límite de resolución y la resolución de su microscopio asumiendo un λ= 400 nm, correspondiente a la luz visible. Límite de resolución: ____________________µ Resolución: ____________________µ ¿Qué conclusión puede obtener de estos resultados? 34 ACTIVIDAD º 2. Manejo del Microscopio observacion de preparacion de letra “e” impresa OBJETIVOS: • Aprender a utilizar correctamente un microscopio, relacionando cada uno de sus componentes con su función específica. • Entender el principio de formación de la imagen, comparando el tamaño y la posición de los objetivos observados a través de las lentes. 1) Utilizando el lente objetivo 10x observe la preparación con una letra “e” impresa con tinta sobre papel que le será entregada. Tenga presentes las instrucciones para el manejo correcto del microscopio que se encuentran en la Introducción de la presente guía. 2) Compare la orientación de la letra “e” en su portaobjetos (preparación) y en su campo visual (lo que observa a través del ocular del microscopio). ¿A qué se debe la diferencia observada? 3) Rote el revólver portaobjetivo hasta llegar al lente 40x y colóquelo en posición. Centre y enfoque la preparación con la letra “e”. ¿Hay algún cambio en la orientación de la letra “e”? 4) Dibuje a lápiz mina la imagen observada de la letra “e” con el objetivo 10x: ACTIVIDAD º 3: Determinación del diámetro del campo visual. Procedimientos y observaciones Tomar un cm 2 de papel milimetrado, colocarlo en un portaobjeto, mojarlo con agua destilada y ponerle el cubreobjeto. Con el lente lupa (4X) enfocar y lograr observar. Calcule el diámetro del campo visual contando mayor cantidad de cuadros observados. Recuerde que 1 cuadro corresponde a 1 cm 2 . Transforme la medida obtenida a unidades micrométricas. Calcule el diámetro del campo visual del resto de los lentes objetivos (10x, 40x, 100x), empleando la siguiente fórmula: DCV obj.x = DCV obj.4X * aumento obj.4X aumento obj. X Siendo DCV = diámetro del campo visual del lente objetivo del que se está averiguando, aumento obj. X del lente con el que se está trabajando. Agrupe sus cálculos en una tabla, de manera clara y ordenada. 35 ACTIVIDAD º3: Observación de preparaciones biológicas permanentes. OBJETIVO: • Conocer aspectos generales de las técnicas de fijación • Realizar observaciones microscópicas de preparaciones biológicas con el objeto de aprender a esquematizar, descubrir e interpretar adecuadamente lo observado. La fijación es un método que se utiliza para preservar la morfología y la composición química de las células que componen una preparación microscópica. Consiste en agregar agentes fijadores a la muestra como acetona, formaldehído o glutaraldehído, los cuales mantienen las interacciones entre las moléculas (proteínas, ácidos nucleicos, etc.) y permiten que las preparaciones duren en buen estado durante meses o años. Uno de los métodos más utilizados para realizar preparaciones permanentes consiste en fijar el material de interés en una solución FAA (formaldehído-alcohol-ácido acético), concentración (entre 50 y 100%) y finalmente embeberlo en parafina para obtener bloques que puedan ser cortados en secciones muy finas utilizando un micrómetro. Estas secciones que contienen material fijado y desecado se colocan cuidadosamente en un portaobjetos y, se disuelve la parafina con un solvente orgánico como xilol. Una vez hecho esto, la muestra se tiñe para contrarrestar las distintas estructuras celulares y se protege con un cubreobjeto montado sobre una sustancia sellante. 1) Tome las preparaciones biológicas asignadas por su profesor y que se encuentran en su bandeja de trabajo 2) Observe al microscopio cada una de las preparaciones escogidas y realice un dibujo de las células observadas en el espacio asignado para tal fin en su informe. 3) Al hacer su dibujo tenga presentes las siguientes recomendaciones: Los dibujos deben realizarse siempre a lápiz mina, evitando borrones y colores oscuros. La utilización de lápices de colores es opcional, pero el colorear su dibujo le puede ayudar a diferenciar con mayor claridad las estructuras observadas. Realice un dibujo simple o esquemático, pero lo suficientemente grande como para mostrar todos los detalles importantes. Trate de mantener una escala apropiada al tamaño de las estructuras observadas. Acompañe su dibujo de notas explicativas, escritas en forma ordenada, clara y breve. Si lo desea, anote los nombres de las estructuras identificadas en su observación. Indique siempre el aumento con que está observando su preparación. Ej: [40x]. ACTIVIDAD º 4. Observación de una preparación fresca (muestra real). OBJETIVO: • Realizar la preparación y observación microscópica de una muestra real líquida. 1) Coloque una gota de la muestra real líquida en el centro de un portaobjetos limpio, utilizando una pipeta Pasteur con gotario. 2) Tome cuidadosamente un cubreobjeto (sin dejar marcas de huellas dactilares) y colóquelo en un ángulo de 45º sobre el portaobjetos. Deslícelo hasta ponerlo en contacto con la gota de agua y déjelo 36 caer gradual y lentamente sobre ella. Trate de evitar la formación de burbujas de aire pues interferirán con su observación. 3) Limpie el exceso de agua con un trozo de papel absorbente, cuidando de no dejar pelusas sobre el cubreobjeto. 4) Comience la observación microscópica de su preparación en el objetivo 10x y prosiga aumentando gradualmente el aumento. 5) Realice un dibujo de los organismos que observe. Descríbalos en forma clara y breve. ACTIVIDAD º 5: Determinación del tamaño celular (TC). Una vez calculado el DCV de cada uno de los lentes objetivos, se puede estimar el tamaño celular (TC) utilizando la siguiente formula: TC = (DCV obj. X) / nº de células Donde: DCV obj. X: corresponde al DCV del lente objetivo que estoy ocupando en mirar las células; nº de células: el número de células que se observan (contabilizan) a través del diámetro de dicho campo visual. Determine este el valor de TC de la preparación de frotis anteriormente dibujada ACTIVIDAD °6 : Observación de muestras frescas • Aprender a realizar preparaciones de tejidos temporales Observación de Elodea sp. • Sobre un portaobjetos deposite unas hojas de Elodea sp, cubra con un cubreobjeto y observe al microscopio. • Comience la observación microscópica de su preparación en el objetivo10x y prosiga aumentando gradualmente el aumento. • ¿Qué estructura logra distinguir?. Esquematice. Observación de Protozoos. • Coloque una gota de la muestra real líquida en el centro de un portaobjetos limpio, utilizando una pipeta Pasteur con gotario. • Tome cuidadosamente un cubreobjeto (sin dejar marcas de huellas dactilares) y colóquelo en un ángulo de 45º sobre el portaobjetos. Deslícelo hasta ponerlo en contacto con la gota de agua y déjelo caer gradual y lentamente sobre ella. Trate de evitar la formación de burbujas de aire pues interferirán con su observación. • Limpie el exceso de agua con un trozo de papel absorbente, cuidando de no dejar pelusas sobre el cubreobjeto. • Comience la observación microscópica de su preparación en el objetivo 10x y prosiga aumentando gradualmente el aumento. • Realice un dibujo de los organismos que observe. Descríbalos en forma clara y breve. 37 ACTIVIDAD º 7: Observación de tejidos vegetales frescos sin y con tinción (Catáfilo de cebolla). OBJETIVO: • Aprender a realizar preparaciones de tejidos temporales con tinción. La mayoría de los colorantes de células o tinciones son de naturaleza orgánica y aromática. Existen dos tipos generales de colorantes: básicos y ácidos. En los básicos, el grupo cromóforo (que da el color) es básico o catiónico, por ejemplo el grupo azo (N=N). Los colorantes ácidos poseen generalmente grupos nitrilo (NO 2 ) o aromáticos. Ejemplos de colorantes ácidos son eosina y azul de anilina. De colorantes básicos, azul de metileno, cristal violeta y azul de toluidina. El mecanismo de acción de la mayoría de los colorantes se basa en la propiedad de proteínas, ciertos polisacáridos y ácidos nucleicos de ionizarse como ácidos o como básicos, lo que les permite reaccionar con los grupos cromóforos de las tinciones. La carga neta de las moléculas es la que determina con que tipo de colorante reacciona y, es lo que permite realizar tinciones específicas para distintos tipos de moléculas y estructuras celulares. 1) Tome el trozo de cebolla que le ha sido entregado y, con una hoja de gillete limpia realice un pequeño corte en forma transversal al tejido. Levante cuidadosamente el epitelio de la cebolla y tire de él hasta obtener un trozo adecuado de tejido que le permita realizar una buena observación microscópica. Si el trozo que usted cortó es demasiado grande, córtelo para darle un tamaño adecuado. 2) Coloque una gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio, utilizando una pipeta Pasteur con gotario o una pizeta. 3) Sobre la gota ubique un trozo de catáfilo de cebolla de tamaño adecuado para que pueda ser cubierto posteriormente por el cubreobjetos. Su muestra debe quedar completamente cubierta por el agua. 4) Ponga una gota de la tinción a utilizar a un lado de su muestra e incline el portaobjetos de tal modo que el colorante baje por capilaridad hasta atravesar el tejido. Limpie el exceso de colorante con un papel absorbente. 5) Tome cuidadosamente un cubreobjeto (sin dejar marcas de huellas dactilares) y colóquelo en un ángulo de 45º sobre el portaobjetos. Deslícelo hasta ponerlo en contacto con la muestra de catáfilo de cebolla y déjelo caer gradual y lentamente sobre ella. Trate de evitar la formación de burbujas de aire pues interferirán con su observación. 6) Limpie el exceso de agua con un trozo de papel absorbente, cuidando de no dejar pelusas sobre el cubreobjeto. 7) Limpie el exceso de agua con un trozo de papel absorbente, cuidando de no dejar pelusas sobre el cubreobjeto. 8) Comience la observación microscópica de su preparación en el objetivo10x y prosiga aumentando gradualmente el aumento. 9) Realice en su informe un dibujo esquemático del tejido de la cebolla antes y después de la tinción, describiendo brevemente lo observado. 38 Bibliografía * Biología Celular y Molecular, De Robertis y de Robertis, 11 ed ., 2 da impresión, 1998, Ed. El Ateneo, Bs. Aires. * Molecular Biology of the Cell, Alberts, Bray, Lewis, Raff Roberts & Watson, 3 ed , 1994, Garland Publishing Inc., new York & London. Microscopy http://ostracon .biologie.uni-kl.de/b online/e03/03.htm Fluorescence Microscopy www.cimc.cornell.edu/Pages/Fluor.htm Cell & Molecular Biology Online http://www.cellbio.com/cuorses.htm Materiales de laboratorio. Microscopía Materiales por grupo (3 alumnos por grupo) • Microscopio por alumno. • Porta objetos. • Cubreobjetos. • Letra impresa fijada en portaobjeto. • Preparaciones histológicas; Corte intestino delgado de rata, Tejido hepático y Frotis sanguíneo. • Porta objeto con papel milimetrado (1cm2) • 1 Cebolla. • Hojas de Elodea (frescas) • Muestra de agua con Protozoos • Alcohol. • Bisturis. • Picetas. • Gotarios. • Lugol. 39 FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BIO035 BIO035 BIO035 BIO035 GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° 4 44 4 “COMPONENTES QUÍMICOS DE LA “COMPONENTES QUÍMICOS DE LA “COMPONENTES QUÍMICOS DE LA “COMPONENTES QUÍMICOS DE LA CÉLULA” CÉLULA” CÉLULA” CÉLULA” 40 Introducción Las células son estructuras increíblemente complejas y diversas, capaces de autorreplicarse y de realizar una amplia variedad de funciones especializadas en los organismos multicelulares. En términos generales, las células se componen de agua, iones inorgánicos y moléculas orgánicas que contienen carbono. Tanto el agua como los iones inorgánicos son muy importantes en el funcionamiento celular, sin embargo, son los compuestos orgánicos de la célula los que le dan características únicas. Hidratos de carbono, proteínas, lípidos y ácidos nucleicos son los cuatro tipos principales de moléculas orgánicas que se encuentran en la célulay, cumplen en ella tanto roles estructurales como funcionales. Las células obedecen a las mismas leyes físicas y químicas que determinan el comportamiento de los sistemas no vivosy, su química básica puede ser entendida en términos de las estructuras y funciones de estas cuatro clases principales de moléculas orgánicas. Los HIDRATOS DE CARBOO, como su nombre lo indica, se componen de carbono, hidrógeno y oxígeno. Los hidratos de carbono más simples son los monosacáridos. Todos ellos contienen grupos hidroxilo, así como aldehído o ceto. Estos azúcares simples se polimerizan a través de reacciones de deshidratación para formar oligosacáridos (2-6 moléculas de monosacárido) o polisacáridos (cientos o miles de moléculas de monosacáridos). El enlace formado en esta reacción se conoce como enlace glicosídico. Los polisacáridos juegan papeles importantes como moléculas de almacenamiento de energía, así como también son componentes estructurales de la superficie celular. Los oligosacáridos se unen comúnmente a proteínas o lípidos dando origen a las glicoproteínas y glicolípidos. Estos son parte importante de las membranas y, participan así en los procesos de reconocimiento celular e interacción entre células. Los monosacáridos y algunos disacáridos, en medio alcalino y en caliente, presentan una capacidad reductora que permite su reconocimiento en distintos tipos de muestras, entre ellas los líquidos biológicos como la orina y la leche. La reacción de Somogyi permite el análisis rápido de azúcares basada en la capacidad de los monosacáridos para reducir algunas moléculas, entre ellas los hidróxidos metálicos. Los componentes principales del reactivo de Somogyi son sulfato de cobre (CuSO 4 ), hidróxido de sodio (NaOH), que reaccionan para formar hidróxido de cobre (Cu(OH) 2 ). La precipitación de este hidróxido se evita agregando a la solución tartrato doble de sodio y potasio (C 4 H 4 KNaO 6 ·4H 2 O), obteniéndose una solución de color azul intenso. Calentando el reactivo de Somogyi en presencia de un hidrato de carbono reductor como la glucosa, aparece un precipitado rojo ladrillo correspondiente a óxido cuproso (Cu 2 O). A su vez, el reactivo Lugol está formado por una mezcla de yoduro de potasio (KI) con una solución de yodo (I 2 ) y, posee una coloración marrón-rojiza muy característica. La prueba del Lugol permite la identificación de polisacáridos como el almidón en muestras de distinto origen: soluciones, sólidos y muestras de origen vegetal como semillas y tubérculos. Al interactuar el I 2 con el almidón se produce una coloración azul-violeta característica que se explica por que el yodo queda atrapado entre los dos tipos distintos de cadenas que conforman la estructura química del almidón: las cadenas de amilosa, sin ramificaciones, que producen el color azul intenso y las cadenas ramificadas de amilopectina, que al unirse al yodo produce la coloración violeta. Los productos de hidrólisis del almidón producen una coloración marrón-rojiza y, si son de muy bajo peso molecular no forman productos coloreados. 41 Los LIPIDOS son moléculas insolubles o escasamente solubles en agua, debido a que una gran parte de ellos es hidrofóbica. Esta parte hidrofóbica sólo contiene carbono e hidrógeno. Los lípidos proveen una importante forma de almacenamiento de energía, son los principales constituyentes de las membranas y, son importantes en los procesos de señalización celular, tanto como hormonas esteroidales como moléculas mensajeras. Las PROTEÍAS están formadas por monómeros llamados aminoácidos, que se unen entre si por medio del enlace peptídico. Este enlace covalente a través del cual los aminoácidos polimerizan se forma entre el grupo carboxilo (COO) de un aminoácido y el grupo amino (NH 3 + ) del siguiente por la eliminación de una molécula de agua. Las interacciones hidrofóbicas y covalentes, como los puentes de azufre (S-S), que se establecen entre los aminoácidos que forman una proteína determinan en ella diferentes niveles de estructura, los cuales contribuyen a su plegamiento y a que adopten su conformación final característica. Así la pérdida de esta conformación puede llevar a la pérdida de la función que una proteína realiza. En la célula, las proteínas tienen una serie de importantes funciones; catalizan una gran cantidad de reacciones químicas, proveen rigidez estructural, controlan la permeabilidad de las membranas, regulan las concentraciones de los metabolitos, reconocen y se unen a otras biomoléculas en forma covalente, participan en el movimiento celular y, controlan el funcionamiento de la expresión génica. Las proteínas son macromoléculas formadas por polímeros de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. Esta característica estructural permite su identificación en solución mediante distintos métodos, entre los que destaca la utilización del reactivo de Biuret. Este se utiliza para realizar análisis cuantitativo mediante mediciones de espectrofometría. El reactivo de Biuret esta formado por sulfato de cobre (CuSO 4 ) y tartrato doble de sodio y potasio (C 4 H 4 KNaO 6 ·4H 2 O) en medio alcalino. El Cu +2 reacciona con los grupos amino (>NH) del enlace peptídico de las proteínas, formando un enlace coordinado con 4 átomos de nitrógeno. Este enlace coordinado es responsable de la coloración azul intensa característica del método al reaccionar las proteínas con el reactivo. Las proteínas pueden ser precipitadas con facilidad modificando su solubilidad. Esto se logra agregando a la solución 42 sustancias con cargas opuestas a las que poseen las proteínas, se produce la neutralización de las cargas de su superficie y una disminución brusca de la solubilidad en solventes acuosos. Otra estrategia utilizada para la precipitación de las proteínas en solución es la adición de sales neutras como sulfato de amonio ((NH 4 ) 2 SO 4 ), las que por su gran solubilidad compiten con las proteínas por el agua que constituyen su capa de solvatación. Los ÁCIDOS NUCLEICOS poseen dos tipos principales de macromoléculas, el ácido ribonucleico o RNA (por el nombre en inglés Ribonucleic Acid) y el ácido desoxirribonucleico o DNA (Deoxyribonucleic acid). Ambos tipos están formados por polímeros de nucleótidos (ribonucleótidos en el caso de RNA y 3’ desoxirribonucleótidos en DNA) unidos por enlaces fosfodiester (ver anexo). Ambos tipos se diferencian en el azúcar que contienen en sus nucleótidos (ribosa en el RNA y 3`desoxirribosa en el DNA) y, en que el RNA se presenta como una molécula de una sola hebra mientras que el DNA es de doble hebra. La función general de los ácidos nucleicos es permitir el flujo de la información genética contenida por una célula a otra célula hija y utilizar esta información para la expresión génica. La molécula de DNA se conoce como la molécula de la herencia y almacena la información genética en los genes que codificaran para proteínas y RNA. El RNA participa principalmente en transformar la información contenida en el DNA a moléculas funcionales como lo son las proteínas. El RNA se presenta principalmente en tres formas que cumplen distintas funciones: El RNA mensajero que transporta la información contenida en un gen hasta el citoplasma; el RNA ribosomal que forma parte estructural y catalítica de los ribosomas en los cuales se produce la traducción de la información contenida en los RNA mensajeros a proteínas; el RNA de transferencia participa como molécula adaptadora para transformar la información desde el RNA mensajero a proteína. Las SALES MINERALES son moléculas inorgánicas que se encuentran formando parte de los seres vivos y, aunque se encuentran en pequeñas cantidades en comparación a las biomoléculas, tienen funciones muy importantes en las reacciones metabólicas, en la regulación de éstas o como constituyentes celulares. Las sales más abundantes en los seres vivos son los cloruros, los fosfatos y los carbonatos de calcio, sodio, potasio y magnesio. La función que las sales minerales desempeñan en el organismo depende del estado físico en que se encuentren, ya sea como sales precipitadas, donde forman parte de endoesqueletos de vertebrados (fosfatos y carbonatos), de conchas de moluscos y dientes (carbonatos) y de estructuras de sostén en plantas como las gramíneas (sílice); o como sales disueltas, formando parte de todos los plasmas intra e intercelulares disociadas en forma de iones como los cloruros (Cl-), fosfatos (PO-33), etc. Las sales disueltas tienen numerosas funciones, pero la más importante es la función homeostática o el mantenimiento constante del medio celular interno. También participan en la regulación de la presión osmótica determinando la concentración de la disolución. 43 ACTIVIDAD PRÁCTICA ACTIVIDAD ° “1: HIDRATOS DE CARBOO OBJETIVOS • Describir a mono y polisacáridos mediante características químicas generales. • Relacionar estructura de mono y polisacáridos con algunas de sus propiedades químicas. A) Identificación de monosacáridos mediante la reacción de Somogyi: Para comparar la capacidad reductora de distintas muestras conteniendo mono y polisacáridos, se realizará la reacción de Somogyi en distintas soluciones. Esto permitirá identificar la presencia y el tipo de hidrato de carbono que se encuentra en las distintas soluciones que se entregarán en el laboratorio. Según las siguientes instrucciones realice un esquema de trabajo que le permita seguir claramente las acciones a realizar. Repita este proceso en cada uno de los experimentos siguientes. • Prepare 6 tubos de ensayo colocándolos en una gradilla. Rotule cada uno de los tubos de tal modo que pueda recordar claramente con cual muestra está trabajando. • Agregue a cada uno de los tubos 5 mL del reactivo de Somogyi ya preparado y 8-10 gotas de cada una de las siguientes soluciones según el siguiente esquema: Nº Tubo Muestra 1 Agua destilada 2 Solución glucosa 1% 3 Solución almidón 1% 4 Solución almidón 1% tratada con ácido en caliente 5 Solución NaCl 1% 6 A entregar en el práctico • Agitar bien cada uno de los tubos y, colocarlos en un vaso de precipitado a baño María hirviendo durante 3 minutos. • Deje enfriar y observe si aparece algún precipitado en la solución, anote cuál es el color y la cantidad relativa del precipitado en cada uno de los tubos. • Interprete cada uno de los resultados obtenidos. B) Identificación de polisacáridos mediante la prueba del Lugol: De manera similar al experimento anterior, organice los tubos y compararemos la capacidad de distintas muestras representativas de mono y polisacáridos para reaccionar con el Lugol. • Prepare 6 tubos de ensayo con cada una de las muestras según el mismo esquema del experimento anterior. • Agregue a cada uno de los tubos 2 gotas de solución de Lugol diluida y agite. • Observe el color producido en cada uno de los tubos. Interprete los resultados obtenidos según su conocimiento de la estructura de mono y polisacáridos. 44 ACTIVIDAD ° 2: PROTEÍAS OBJETIVOS • Reconocer la presencia de proteínas en solución mediante reacciones químicas generales. • Relacionar la estructura química de las proteínas con su solubilidad en distintos medios. A) Reacción de Biuret para la identificación de proteínas: • Rotular 5 tubos de ensayo y colocar en cada uno de ellos 2 ml de cada una de las siguientes muestras: Tubo Muestra 1 Agua destilada 2 Solución glicina 1% 3 Clara de huevo (Ovoalbúmina) 4 A entregar en el práctico 5 Solución NaCl 1% • Agregar a cada tubo 1 ml de reactivo de Biuret y agitar. • Observar la variación de color en los tubos. ¿Cómo explica la diferencia de intensidades en los tubos que presentaron una reacción positiva? ACTIVIDAD º 3: RECOOCIMIETO DE LÍPIDOS A) Reconocimiento de muestras ricas en lípidos mediante su solubilidad: Las grasas son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se forman pequeñísimas gotas formando una “emulsión” de aspecto lechoso, que es transitoria, pues desaparece en reposo, por reagrupación de las gotitas de grasa en una capa que por su menor densidad se sitúa sobre la capa de agua. Por el contrario, las grasas son solubles en los llamados disolventes orgánicos, como el éter, benceno, xilol, cloroformo, etc. Procedimientos y Observaciones • Tomar dos tubos de ensayo y poner en uno de ellos 3 ml de agua y en el otro tubo 3 ml de éter. • Añadir a cada tubo 1ml de aceite y agitar fuertemente. Observar la formación de gotitas o micelas y dejar en reposo en la gradilla. Observe la reacción. Tubo Muestra 1 Agua destilada + aceite 2 Agua destilada + éter 3 Aceite + éter 45 ACTIVIDAD º4: RECOOCIMIETO DE SALES MIERALES Procedimientos y Observaciones • Preparar una gradilla con dos tubos de ensayo. En cada tubo agregar 3 ml de suero de leche., numerar los tubos. A) Identificación de cloruros • Al tubo 1 añadir 1 ml de solución de nitrato de plata. • Observar un precipitado blanco de aspecto lechoso. Tubo Muestra 1 Agua destilada + AgNO 3 2 Leche + AgNO 3 B) Identificación de calcio • Al tubo 2 añadir 10 gotas de solución de oxalato de amonio al 1%. • Observar un precipitado blanco cristalino Tubo Muestra 1 Agua destilada + C 2 H 8 N 2 O -4 2 Leche + C 2 H 8 N 2 O -4 ACTIVIDAD º5: RECOOCIMIETO DE EZIMAS Determinación de la presencia de Catalasa, una enzima muy importante ¿Cúal es la función de la catalasa en el organismo humano? ¿Cuál es la ubicación elular de la Catalsa? La reacción de la catalasa sobre el H 2 O 2 , es la siguiente: 2H 2 O 2 2H2O + O 2 Procedimientos y Observaciones: A) Activación de la enzima • Colocar en un tubo de ensayo unos trozos de hígado. • Añadir 5ml de Agua Oxigenada. • Observar y registrar resultados. B) Inactivación de la enzima • Colocar un en tubo de ensayo dos trozos de hígado. • Añadir agua para hervir la muestra. • Hervir durante unos minutos. • Después de este tiempo retirar el agua sobrenadante. • Añadir Agua Oxigenada. • Observar y registrar resultados. 46 BIBLIOGRAFIA Molecular Cell Biology, James Darbell, Harvy Lodisch, David Baltimore, 1986, Cientific American Books, New York, U.S.A. Parte 1, The molecules in Cells. The Cell: a molecular approach, Geoffrey M., Cooper, 1997, ASM Press., Washington, U.S.A. Parte 1, The chemistry of Cells. MATERIALES DE LABORATORIO Reactivos y Material Biológico Somogyi = 10 ml Lugol = 15 ml (para todo el curso, con gotario) Glucosa 1% = 10 ml Almidón 1% = 30 ml NaCl 1% = 15 ml NaOH 20% = 15 ml CuSO4 1% = 5 ml Glicina 1% = 5 ml Nitrato de Plata 1% = 10 ml (para todo el curso, con gotario) Oxalato de Amonio 1% = 10 ml (para todo el curso, con gotario) Eter = 5 ml Acido Acético = 20 ml (para todo el curso, con gotario) Agua Oxigenada = 15 ml Alcohol 96° a 0°C = 50 ml Agua destilada = 50 ml NaCl 2M = 50 ml SDS (detergente líquido) = 15 ml (para todo el curso) Aceite Vegetal = 3 ml Clara de Huevo = 5 ml Leche = 1 litro (para todo el curso) Hígado de Pollo fresco y trozado = 3 (para todo el curso) Arena = 10 gr Material de Vidrio por grupo 30 tubos de ensayo. 2 gradillas 1 mortero de cerámica 1 trozo de gaza para filtrar 3 vasos pp de 100 ml 1 vaso pp 500 ml 1 embudo 1 probeta 100 ml 1 varilla de vidrio 3 gotarios 3 pipetas graduadas 1 ml 2 pipetas graduadas de 5 ml 47 3 pipeta graduada de 10 ml 1 matraz Erlenmeyer 500 ml 1 matraz Erlenmeyer 250 ml 1 piceta con agua destilada 1 mechero (trípode y rejilla) 1 pinza madera para tubo 1 lápiz rotulador. 1 cooler con hielo por mesón de trabajo Nota: Las pipetas deben reciclarse, por tanto, deben ser lavadas con abundante agua destilada antes de volver a utilizar. 48 FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BIO035 BIO035 BIO035 BIO035 GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° 4 GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° 4 GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° 4 GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° 4 “ORGANIZACIÓN SUBCELULAR” “ORGANIZACIÓN SUBCELULAR” “ORGANIZACIÓN SUBCELULAR” “ORGANIZACIÓN SUBCELULAR” 49 Introducción Las células aparecieron sobre la tierra hace 3,5 billones de años, probablemente debido a la agregación espontánea de moléculas. Las primeras células eran relativamente simples y pequeñas, similares a los organismos que actualmente conocemos como procariontes. Luego aparecieron las células eucariontes, más grandes y de organización más compleja, que hoy forman parte de animales y plantas. Por definición y, a diferencia de las células procariontes, las células eucariontes poseen un núcleo que contiene la mayoría del DNA envuelto en una membrana. Esto deja al material genético en un compartimiento separado del resto de los contenidos de la célula o citoplasma, donde ocurren las reacciones metabólicas. En el citoplasma se pueden distinguir varios organelos: cloroplastos, mitocondrias, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, ribosomas, peroxisomas, lisosomas, citoesqueleto, los cuales cumplen funciones específicas dentro de la célula. El Núcleo es el organelo más grande de la célula y está separado del citoplasma por una envoltura que consiste en dos capas de lípidos, la cuál posee una serie de poros los cua´les mantienen en constante comunicación el núcleo con el citoplasma celular y sus organelos. Contiene todo el DNA cromosomal, el que se encuentra empacado en las fibras de cromatina por su asociación con proteínas denominadas histonas. Fig.1 : esquemas los dos tipos de célula eucariota: animal y vegetal La Membrana Plasmática es la envoltura externa de la célula. Corresponde a un bicapa continua de fosfolípidos de 4-5 nm de espesor, en la cual se encuentran embebidas varias proteínas. Algunas de estas proteínas sirven como bombas y canales para el transporte de moléculas específicas hacia el interior de la célula y, desde la célula al medio externo. La membrana celular es una estructura dinámica, en la cuál todos los elementos embebidos tienen movimiento. Fig 2: esquema de la bicapa lipidica con proteínas en rojo Las Mitocondrias son muy similares a las bacterias tanto en tamaño como en forma. Contienen su propio DNA, sintetizan proteínas y pueden reproducirse al dividirse en dos, por lo que se cree que provienen de la simbiosis de una célula eucarionte primitiva con un organismo procarionte, que correspondería a una mitocondria primitiva. Estos organelos son responsables de los procesos de respiración celular y producción de energía. Los Cloroplastos, al igual que las mitocondrias, también tendrían un origen simbiótico. Se encuentran sólo en los organismos capaces de realizar la fotosíntesis, como las algas verde-azules y las plantas. Los cloroplastos corresponden a plastidios que contienen clorofila y, están rodeados de una 50 membrana doble. Además, contienen un elaborado sistema de membranas en su interior en el cual se encuentra el aparato fotosintético propiamente tal. Fig 3: representación gráfica de un cloroplasto (A) y una mitocondria (B), donde se pueden observar sus diferencias, principalmente en la conformación interna de ambos, en donde se pueden apreciar el apilamiento de tilacoides en el casao del cloroplasto y la formación de las crestas mitocondriales en el caso de las mitocondrias. El Retículo Endoplásmico (R.E.) corresponde a sacos, tubos y capas de membranas que se extienden a través del citoplasma y que ocupan un amplio sector de la célula. La membrana del Retículo endoplásmico es una continuación de la membrana nuclear. Se especializa en la síntesis de lípidos y proteínas de membrana, así como también de materiales que están destinados a ser exportados de la célula. El Retículo endoplásmico rugoso está asociado a los ribosomas, que se unen en su parte externa y se encargan de la síntesis de proteínas. El Retículo endoplásmico liso no contienen ribosomas y se encarga del metabolismo de lípidos. Fig 4 : Dibujo de los retículos endoplasmáticos liso y rugoso El Aparato de Golgi o tamién llamados Dictiosomas (que es el conjunto de sacos que apilados forman este organelo) también corresponde a un sistema de sacos membranosos. Se encarga de la modifica-ción, destinación y, empaquetamiento otros organelos. Alrededor de él se encuentran numerosas vesículas pequeñas que transportan sustancias entre el mismo organelo y los diferentes compartimentos de la célula. Fig 5: esquema representativo de los dictiosomas apilados para formar el aparato de Golgi, donde se puede apreciar el trafico vesicular que realiza. 51 Los Lisosomas son vesículas membranosas que contienen enzimas hidrolíticas requeridas para la digestión de moléculas al interior de la célula. De este modo, estas enzimas se mantienen aisladas del resto de los componentes celulares evitando la degradación de moléculas como proteínas y ácidos nucleicos. Por otras parte los Peroxisomas también corresponden a vesículas. En ellas se produce peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) durante la oxidación por el oxígeno de varios tipos de moléculas. Esta sustancia es peligrosa y gracias a la existencia de los peroxisomas se mantiene aislada al resto de los componentes de la célula. Fig 6: organización de los lisosomas y vacuolas, función y vía intracelular Los Ribosomas son grandes complejos de RNA y proteínas. Se componen de una subunidad grande y una subunidad pequeña que se ensamblan para formar un complejo que se encarga de llevar a cabo el proceso de traducción en la síntesis de proteínas. Los ribosomas procariontes y eucariontes son muy similares y, pueden encontrarse tanto libres en el citoplasma como unidos a membranas formando parte del retículo endoplásmico rugoso. El Citoesqueleto corresponde a filamentos de proteínas que forman un enrejado en el citoplasma. Esta red de filamentos está formada por los microtúbulos, filamentos de actina y filamentos intermedios. El citoesqueleto le da a la célula su forma y provee la base de sus movimientos. Generalmente se organiza desde una región cercana al núcleo donde se encuentran los centríolos y desde ahí se extiende al resto de la célula. Aunque técnicas avanzadas como la Microscopía Electrónica permiten una visualización detallada de la estructura de la célula, esto no es suficiente para definir la función de sus componentes. Para esto, ha sido necesario aislar los organelos del resto de la célula para realizar estudios bioquímicos que permitan determinar la función exacta de cada uno de ellos. Fraccionamiento Subcelular Así como un tejido puede ser separado en las células que lo constituyen, con las técnicas adecuadas la célula puede separarse en los diferentes organelos y macromoléculas que la componen. Una de las técnicas más utilizadas para tal propósito es el Fraccionamiento Subcelular, que permite obtener componentes celulares aislados, en grandes cantidades y con alto grado de pureza. Esta técnica fue desarrollada entre otros por Alberte Claude y Christian Duve entre 1940 – 1950 y, consiste en la separación de los componentes de la célula en base a su tamaño y densidad. El primer paso a seguir en un fraccionamiento subcelular es la ruptura u homogenización de la muestra. Esto se logra a través de diferentes procedimientos como sonicación (exposición a sonidos de alta frecuencia), schok osmótico o simplemente moliendo las células en homogenizadores mecánicos. En esta etapa se rompen muchas de las membranas de la célula, incluyendo la membrana plasmática y el retículo endoplásmico, las que quedan formando pequeños fragmentos o vesículas que dan origen a la fracción microsomal. El resto del los componentes celulares (núcleo, mitocondrias, 52 cloroplastos, aparato de Golgi, lisosomas y perixosomas) permanecen intactos. Las partículas y vesículas así obtenidas conservan la mayor parte de sus propiedades bioquímicas originales y permiten el estudio de la función de cada organelo celular por separado. La suspensión de células rotas obtenidas anteriormente es llamada lisado u homogenizado y, es la que se fracciona en la segunda etapa del proceso. Se realiza a través de una serie de etapas sucesivas de centrifugación en las que los componentes de la célula se separan en un campo gravitacional. Si dos componentes de distinta masa e igual tamaño y forma están en un mismo medio, el cuerpo de mayor masa sedimentará (se irá al fondo) a mayor velocidad debido a su mayor peso. El peso es el producto de la masa (m) y la fuerza de gravedad (g), por tanto la fuerza de gravedad se incrementa, la velocidad de sedimentación también aumentará. Para aumentar el campo gravitacional se usan las Centrífugas. Estos instrumentos consisten en rotores con cavidades para los tubos, los que se hacen girar a diferentes velocidades, de manera que a mayor velocidad el campo gravitacional obtenido es mayor. Lo mismo ocurre a mayor distancia entre el tubo y el eje de giro del rotor. En otras palabras, el campo gravitacional generado depende directamente del radio de giro y de la velocidad de rotación. Al término de una centrifugación se pueden distinguir en el tubo dos fases. En el fondo del tubo se obtiene un sedimento o pellet y, sobre él una parte líquida llamada sobrenadante. Fig. 8: esquema de una centrífuga típica Generalmente, la primera etapa de separación consiste en una centrifugación a baja velocidad a la cual sedimentan sólo las células que permanecen enteras y las partículas subcelulares más grandes, los núcleos. Así, el primer pellet obtenido corresponde a una fracción enriquecida en núcleos y el sobrenadante contiene al resto de los componentes celulares en suspensión. El sobrenadante se somete a una segunda centrifugación que se realiza a velocidades intermedias, en la que sedimentan mitocondrias, cloroplastos, lisosomas y peroxisomas. El nuevo sobrenadante se recentrifuga a alta velocidad obteniéndose un pellet enriquecido en membrana plasmática y retículo endoplásmico (fracción microsomal). Una última centrifugación del sobrenadante anterior a velocidades aun mayores permite sedimentar finalmente los ribosomas, dejando el sobrenadante sólo la porción soluble del citoplasma, el citosol. 53 Fig 9 : Esquema de un fraccionamiento subcelular típico. Las fracciones que se obtienen por el procedimiento anterior son fracciones enriquecidas, pero no totalmente puras de los diferentes organelos. Existen otras modalidades de centrifugación en las que se utilizan medios de mayor densidad que se obtienen con soluciones de sacarosa, polímeros o proteína permitiendo realizar el proceso de separación en gradientes de densidad, obteniendo organelos con mayores grados de pureza. Generalmente el proceso de fraccionamiento celular se evalúa mediante el análisis de la forma en que se distribuyen algunos componentes celulares de localización subcelular conocida en las diferentes fracciones obtenida. Estas moléculas son llamadas marcadores de cada una de las fracciones. Por ejemplo, el DNA es un marcador de la presencia de núcleos, las enzimas del ciclo de Krebs o de la cadena respiratoria son marcadores de mitocondrias y, el proceso de fotosíntesis indica la presencia de cloroplastos. De este modo, el análisis de la distribución de los diferentes marcadores en todas las fracciones subcelulares obtenidas permite conocer la distribución y pureza relativa de los distintos organelos y, el nivel y calidad de los componentes contaminantes de cada fracción. La obtención de organelos celulares aislados permite entonces estudiar en forma relativamente específica algunos procesos celulares que ocurren en compartimentos particulares, aislándolos de las reacciones que ocurren en otros organelos. Por ejemplo, se puede estudiar la síntesis de proteínas en ribosomas aislados o asociados a membranas, el transporte de sustancias a través de la membrana plasmática, la fotosíntesis en cloroplastos, el procesamiento de glicoproteínas en el aparato de Golgi, etc. 54 A su vez cada organelo contiene enzimas o moléculas que lo caracterizan, las que no se encuentran en los otros compartimentos celulares y permiten identificarlos. El DNA es la molécula marcadora de núcleos. Esta macromolécula puede ser identificada mediante colorantes básicos que se unen a ella cuando se encuentra ionizada, como el azul de tripán, azul de toluidina y azul B. Las mitocondrias pueden ser identificadas por la actividad de la enzima Succinato deshidrogenasa que cataliza la deshidrogenación estereoespecífica de Succinato a Furamarato durante el ciclo de Krebs, según la siguiente reacción: Succinato Fumarato + 2 H + + 2 e - Los protones y electrones liberados permiten seguir la reacción a través de la decoloración del azul de metileno, que en su estado oxidado es azul y al reducirse se torna incoloro. Sin embargo, el azul de metileno reducido puede fácilmente ser oxidado por el oxígeno del aire y, recobrar su coloración azul intensa. Para evitar esto, se cubre el medio de reacción con aceite mineral o vaselina líquida, lo que permite realizar la reacción en ausencia de oxígeno. ACTIVIDA PRÁCTICA A.- Fraccionamiento subcelular de Hígado OBJETIVOS • Conocer las técnicas de homogeneización usadas en el fraccionamiento subcelular. • Comprender los fundamentos de la técnica de centrifugación usada en el fraccionamiento subcelular. • Comprender el concepto de moléculas marcadoras y su utilidad en la evaluación del fraccionamiento subcelular. El Fraccionamiento Subcelular comprende dos etapas, una primera etapa de ruptura u homogeneización y, una segunda etapa de fraccionamiento propiamente tal. El fraccionamiento o separación de los distintos componentes celulares se realiza mediante una serie de centrifugaciones sucesivas, las que sedimentan los diferentes organelos en un campo gravitacional dependiendo de su masa y tamaño. Al centrifugar una muestra se obtienen dos fases claramente definida: el pellet que corresponde al sedimento propiamente tal y el sobrenadante, que corresponde a la fracción líquida que permanece sobre el material sedimentado. El pellet obtenido corresponde a los organelos que han sedimentado, éstos se resuspenden y se guardan para el resto de los análisis bioquímicos, mientras que el sobrenadante se vuelve a centrifugar. La etapa de ruptura y homogeneización de la muestra se realiza colocando el tejido fresco a fraccionar y una cantidad adecuada de solución tampón, la que deja los organelos en suspensión y sirve para que no se rompan durante el fraccionamiento en un homogeneizador. Todo el proceso se realiza además en frío (4ºC) para evitar una posible degradación de las estructuras celulares y así conservar intactas la mayor parte de las características funcionales originales del organelo que se pretende aislar. 55 EXPERIMETO º 1 Usted recibirá un homogenizado filtrado, preparado por sus profesores, el cual se obtuvo de la siguiente manera: 1. Dejar en inanición una rata una noche antes del experimento. 2. Matar un ratón adulto (cerca de 30 g) por dislocación cervical y rápidamente extraer el hígado desde la cavidad peritoneal (descartar la vesícula biliar). Dejar el hígado en 50 ml de Buffer IBc frío en un pequeño vaso. 3. Dejar el hígado libre de sangre usando IBc frío. (Usualmente entre 4 y 5 clarificaciones es suficiente) 4. Picar el hígado en pequeños pedazos utilizando tijeras. Esto podría ser realizado mientras se mantenga el vaso en una fuente con hielo. 5. Descartar el IBc usado durante picado y reemplazarlo con 5 ml de IBc frío fresco y transferir la suspensión al tubo de homogenizado (mortero) y operarlo a 1600 RPM mezclando de 3 a 4 veces. Recordar: • A 4ºC se minimiza la activación de daño generado por fosfolipasas y proteasas. • El radio optimo entre el tejido y el buffer de aislamiento es de 1:5 a 1:10 (peso:volumen) • Enfriar el tubo de homogenizado en hielo por 5 minutos antes de iniciar el procedimiento. 6. Trasferir el homogenizado a un tubo Falcon de polipropileno y centrifugar a 600 g (2500 RPM app.) por 10 minutos a 4ºC. 7. Transferir el sobrenadante a tubo de centrifugación y centrifugar a 7000 g (6000 RPM app.) por 20 min. a 4ºC. 8. Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 5 ml de IBc frío. 9. Centrifugar a 7000 g (6000 RPM app.) por 20 min. a 4ºC. 10. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet conteniendo mitocondrias en 1 ml de IBc. 11. Trasferir la suspensión mitocondrial en un tubo Falcon y guardar en hielo. Recordar: • Minimizando la exposición al oxigeno se puede mantener la funcionalidad de la porción mitocondrial por largo tiempo. • Es recomendable utilizar esta preparación mitocondrial entre 1 a 3 horas post. aislamiento. 12. Medir la concentración mitocondrial utilizando el método de Biuret (o de Bradford, pero el lisado mitocondrial se diluye en order al punto de saturación de la prueba). Recordar: • La concentración usual de mitocondrias en este tipo de preparación es de cerca de 80 mg/ml y el volumen total es de 1 ml. 56 EXPERIMETO º 2 En un portaobjetos limpio y seco coloque una gota de la suspensión de núcleos P1 obtenida anteriormente y que usted ha mantenido en hielo. Coloque sobre ella un cubreobjetos y observe su preparación al microscopio usando para ello el objeto de 40X. Agregue el azul de tripán y vuelva a observar su preparación de núcleos. ¿Qué observa?. Repita el proceso con la fracción enriquecida en mitocondrias P2. Coloque una gota de la muestra en un portaobjetos, coloque sobre ella un cubreobjetos, realice la tinción con azul de tripán y observe al microscopio usando el objetivo de 40X. ¿Qué ocurre?. EXPERIMETO º 3 Separe 4 tubos de ensayo, rotúlelos en forma adecuada y colóquelos en hielo de manera que estén fríos. Agregue a cada uno de los tubos las soluciones que correspondan según el siguiente esquema: Nº Tubo Succinato 0,1 M Azul de Metileno Agua destilada Fracción nuclear (P1) Fracción mitocondrial (P2) Fracción microsomal (S2) 1 Blanco 1 mL 1 mL 1 mL --- --- --- 2 Fracción nuclear 1mL 1 mL 1 mL 1 mL --- --- 3 Fracción mitocondrial 1mL 1 mL 1 mL --- 1 mL --- 4 Fracción microsomal 1 mL 1 mL 1 mL --- --- 1 mL Agite el contenido de cada tubo y agregue a cada uno de ellos 2 mL de aceite mineral o vaselina líquida. Coloque los tubos en un baño termorregulado a 37º C y observe si ocurre decoloración en algunos de los tubos. B.- Observación de un corte de hígado de rata utilizando el objetivo de inmersión. OBJETIVO • Aprender a utilizar correctamente el objetivo de inmersión y comparar una muestra fresca de una fijada El poder de resolución de un microscopio depende también de la apertura numérica, capacidad de una lente para aprovechar la mayor cantidad de rayos para formar la imagen. Esta puede aumentarse al usar entre el objetivo y el objeto a observar una sustancia con índice de refracción mayor del aire. Para esto se usan los llamados aceites de inmersión. 57 EXPERIMETO º 4 En base a sus conocimientos de microscopía, observe la muestra de hígado de rata utilizando los objetivos de 4, 10 y 40 X. Enfoque la zona que desea observar con el objetivo seco de aumento mayor (40 X). Sin bajar la platina ni cambiar la preparación de posición, gire el revólver portaobjetivos de modo que quede en una posición intermedia entre el objetivo mayor seco y el de inmersión. El objetivo de inmersión corresponde al aumento de 100X y, tiene una inscripción que dice “oil”. Deposite cuidadosamente sobre el cubreobjetos de su preparación una gota de aceite de inmersión. Tenga cuidado de no manchar con aceite su microscopio. El aceite de inmersión NO deber ser utilizado en los otros objetivos, por lo tanto, una vez que se ha colocado el aceite NO deberá cambiar de objetivo sin antes limpiar cuidadosamente el aceite usando para eso un trozo de papel absorbente especial embebido en xilol. Lleve el objetivo de inmersión al eje óptico y enfoque utilizando para ello el TORNILLO MICROMETRICO. El objetivo de inmersión DEBE quedar inmerso en el aceite. Una vez finalizado su trabajo retire la preparación y limpie muy bien su microscopio con xilol de manera que no queden en él restos de aceite. Recuerde limpiar también su preparación. Bibliografía Biología Celular y Molecular,De Robertis y de Robertis,11 ed , 2 da impresión, 1998, Ed. El Ateneo, Bs. Aires. Biología Celular y Molecular, Lodish y col. (2002), 4 ed , Ed. Panamericana Elementos de Biología Celular y Genética. Parte 2: Estructura y Función Celulares. Métodos de Estudio en Biología Celular. Fraccionamiento Subcelular, López R., 1 ed , 1985, Departamento de Biología Celular y Genética, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. Molecular Biology of de Cell, Alberts Bray, Lewis Raff, Roberts & Watson, 3 ed ., 1994, Garland Publishing Inc. , New York & London. The Cell: A Molecular Approach, Cooper G.M., 1997, ASM Press, Washington, U.S.A. Materiales Laboratorio. Fraccionamiento Sub Celular 1. Para el homogenizado • Ratón. • Pinzas. • Bisturí. • Tijeras. • Homogenizador. • Embudo. • Gasa. • Centrifuga. 58 • Hielo. • Buffer IBc 2. Para el laboratorio ( p/g = por grupo de 3 alumnos) • 3 Microscopios. • Corte de hígado de rata • Porta objetos. • Cubreobjetos. • 1 Lápiz rotulador • Centrifuga. • Baño termorregulador. • Hielo • 2 gotarios. (p/g) • 8 tubos de ensayo (p/g). • Gradilla para tubos de ensayo. • 3 pipetas 1 ml (p/g). • 1 pipeta 5 ml (p/g). • 1 baso precipitado de 50 ml (p/g). • Azul de Metileno. • Succinato 0.1 M. • H2O destilada. (picetas). • Azul de tripan. • Aceite mineral o vaselina. • Tubos para centrifuga (p/g) • Piceta Buffer IBc: Buffer para el aislamiento de células y mitocondrias de hígado de ratón: Para 100 ml de IBc: • 10 ml de Tris-MOPS 0,1 M • 1 ml de EGTA/Tris • 20 ml de sucrosa 1 M • Aforar a 100 ml con agua destilada • Ajustar pH a 7,4 Tris-MOPS 0,1 M: disolver 12.1 g de Tris en 500 ml de agua destilada y ajustar el pH a 7,4 utilizando MOPS en polvo (4-Morpholinepropanesulfonic acid). Llevar la solución a 1 litro y guardar a 4 ºC. EGTA/Tris 0,1 M: disolver 38,1 g de EGTA (Ethylene -bis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic acid) en 500 ml de agua destilada y ajustar el pH a 7,4 utilizando Tris en polvo. Llevar la solución a 1 litro y guardar a 4 ºC. Sucrosa 1 M: disolver 342,3 g de sucrosa en un litro de agua destilada, mezclar bien y almacenar a -20 ºC. 59 FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BIOLOGÍA CELULAR BIO035 BIO035 BIO035 BIO035 GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° 5 GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° 5 GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° 5 GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO N° 5 “M “M “M “MITOSIS, MEIOSIS Y FECUNDACIÓN” ITOSIS, MEIOSIS Y FECUNDACIÓN” ITOSIS, MEIOSIS Y FECUNDACIÓN” ITOSIS, MEIOSIS Y FECUNDACIÓN” 60 ITRODUCCIO Tal como enuncia la Teoría Celular “Todos los organismos están compuestos de células y, todas las células provienen de una célula preexistente”. La capacidad de reproducirse es una propiedad fundamental de la célula y, está finamente regulada, de modo que la información genética se conserve y se mantenga un equilibrio entre las células preexistentes y las células nuevas. Así como los seres superiores cumplen con un ciclo de vida en el que nacen, crecen, se reproducen y mueren, las células en crecimiento pasan por el llamado Ciclo Celular. Éste comprende dos etapas fundamentales, la interfase y la división propiamente tal, que ocurre por los procesos de mitosis o meiosis. Fig 1 : esquema del ciclo celular en eucariontes mostrando cada una de sus fases. La interfase es el periodo más largo del ciclo celular y, corresponde al tiempo que toma una célula entre una división mitótica y la siguiente, o sea que puede entenderse como un período en el cual la célula se prepara para dividirse. Durante este tiempo, la célula aumenta lentamente su tamaño y duplica su material genético en una secuencia ordenada de eventos que pueden subdividirse en tres etapas principales, G1, S y G2. Después de una división celular, las células hijas resultantes comienzan la interfase de un nuevo ciclo celular en la etapa G1. Durante esta etapa la célula retoma su actividad biosintética que durante la mitosis es muy baja, llevándola nuevamente a sus niveles normales. Luego pasa a la fase S. Esta es una etapa de síntesis, en la cual la célula sintetiza DA y termina cuando el contenido de DNA se ha duplicado y, los cromosomas han replicado. La etapa siguiente es G2, en ella se condensan los cromosomas ya duplicados en espera para la división celular. Después de esta serie de etapas la célula se encuentra lista para una nueva división y, entra en la fase M o de mitosis. 61 MITOSIS Durante la mitosis una célula se divide y da origen a dos células hijas genéticamente iguales entre sí. Lo que ocurre con el material genético es una separación equitativa de dos conjuntos cromosómicos iguales entre sí y al de la célula original. Esto es posible gracias a que en la fase S de la interfase el material genético y las proteínas que constituyen la cromatina han sido duplicados. La mitosis completa de una célula demora aproximadamente una hora, durante la cual ocurren muchos eventos diferentes, los que se han agrupado en 4 etapas: 1) Profase Dentro del núcleo la cromatina se condensa para formar los cromosomas. Al principio éstos se ven como filamentos largos y finos, pero al término de la profase son más cortos y gruesos y, se ubican cerca de la envoltura nuclear. Los centríolos se han duplicado y, se encuentran en polos opuestos de la célula. Finalmente, la envoltura nuclear se rompe y la profase termina 2) Metafase Los cromosomas condensados al máximo se ubican en el centro o ecuador de la célula gracias a la ayuda del huso mitótico que es un complejo conjunto de microtúbulos que se orientan de polo a polo de la célula cerca de los centríolos. Los microtúbulos se unen a los cromosomas al insertarse en el cinetocoro de cada centrómetro. Durante la metafase cada cromosoma está compuesto por dos cromátidas, cada una de las cuales posee un cinetocoro. Fig 2 : esquema de un cromosoma metafísico. 3) Anafase La característica principal de esta etapa es el movimiento de los cromosomas hacia los polos de la célula. Esto ocurre gracias al acortamiento de los microtúbulos del huso mitótico 4) Telofase y Citodiéresis Sobre los cromosomas que están en los polos de la célula se forma la envoltura nuclear. Los cromosomas se condensan y, el núcleo aumenta de tamaño por hidratación y descondensación de la cromatina. El núcleo resultante es esférico y, en él se puede observar el nucléolo. En células animales, la citodiéresis ocurre por un estrangulamiento del sector del citoplasma que se encuentra entre los dos núcleos nuevos gracias a una gran concentración local de microfilamentos con uso de energía. En células vegetales existe la pared celular y, esta etapa ocurre por la formación de un tabique entre los dos núcleos nuevos. Este se forma por vesículas del sistema de Golgi y, finalmente se forman las dos membranas plasmáticas a cada lado del tabique, quedando completa la división celular. 62 Fig 3 : esquema de la mitosis en células animales, con todas sus fases. MEIOSIS En todos los ciclos de reproducción sexual la nueva generación de individuos se origina por la fusión de dos células haploides que provienen de él o los organismos progenitores. Estas células son los gametos y, se obtienen mediante el proceso de meiosis, que ocurre en todos los organismos de reproducción sexual e implica la producción de células haploides, las que se mantienen como tales hasta el momento de la fecundación en el que los gametos se fusionan y el nuevo organismo vuelve a su estado diploide. La meiosis ocurre solo en las células germinales de las gónadas y da como resultado a los gametos, tanto óvulos como espermios. La meiosis implica una etapa de duplicación del DA y, dos divisiones celulares sucesivas para formar así cuatro células haploides que contienen la mitad del material genético original a partir de cada célula que entra en este proceso. Los eventos más destacados de la meiosis son: duplicación del DNA nuclear, apareamiento de los cromosomas homólogos, dos divisiones celulares sucesivas y finalmente, la formación de las células hijas haploides. Durante este proceso hay una activa transcripción y síntesis de proteínas celulares y, se produce una gran variabilidad genética que se obtiene gracias a los fenómenos de “crossing-over” y permutación de los cromosomas que aseguran una muy baja posibilidad de obtener gametos genéticamente iguales. Lo anterior es una ventaja al momento de adaptarse a un medio altamente cambiante y otorga la individualidad de los organismos ya que no existe ningún organismo que sea totalmente idéntico a otro. 63 Un núcleo diploide contiene dos versiones muy similares de cada cromosoma, cada una de las cuales proviene de uno de los padres. Estas dos versiones de cada cromosoma son los llamados cromosomas homólogos. Cuando los cromosomas se duplican por replicación de DNA, las copias del cromosoma replicado en un principio permanecen fuertemente asociadas y se llaman cromátidas hermanas. En una división meiótica en que las células que se forman son haploides cada célula hija debe contener solo un miembro de cada cromosoma homólogo, el de origen materno o el de origen paterno y así se obtiene sólo la mitad del número original de cromosomas. Después de la replicación del DNA cada par de cromosomas duplicados se empareja con su homólogo y forman una estructura llamada bivalente que posee cuatro cromátidas. Cuando la primera división celular ocurre, cada célula hija contiene dos copias de uno de los cromosomas homólogos. Estas células son haploides. En la segunda división celular, los cromosomas no se duplican; se ubican en el centro de la célula en el huso mitótico y las cromátidas hermanas se dividen como en una mitosis normal. La meiosis se divide en varias etapas, éstas se nombran de la misma forma que las etapas de la mitosis, pero se les agrega un número I ó II según se trate de la primera o segunda división celular, así, la meiosis se divide en: 1) Profase I Esta es la primera etapa de la meiosis y, también es la etapa de mayor duración. En ella ocurre el proceso de “crossing-over” en el que los cromosomas homólogos intercambian parte de su DA por un proceso denominado recombinación genética. Esto cambia el contenido del DNA de los gametos respecto al del organismo progenitor y, ocurre cuando los cromosomas homólogos se encuentran muy juntos. Los lugares en los que ocurre recombinación se llaman quiasmas. Esta etapa a su vez está dividida en 5 etapas: Fig 4: esquema de las 5 subdivisiones de la profase I de la meiosis, mostrando el estado y apariencia de los cromosomas en cada una de ellas. a) Leptoteno: cada cromosoma se condensa y, está unido por sus extremos a la envoltura nuclear. Los cromosomas ya se han replicado y consisten en dos cromátidas hermanas que se encuentran muy juntas. 64 b) Cigoteno: los cromosomas homólogos comienzan a aparearse por sus extremos en puntos muy cercanos a la envoltura nuclear. Luego como en una especie de cierre, los cromosomas continúan apareándose para alinearse en toda su extensión, quedado los genes homólogos enfrentados. Esta estructura se llama complejo sinaptonémico y, los cromosomas homólogos así apareados son el bivalente en que realidad es una tédrada ya que cada uno de los dos cromosomas está duplicado. Fig 5: esquema del complejo sináptonemico c) Paquiteno: ocurren las recombinaciones en que se intercambia el material genético de cada cromosoma con su homólogo. Aquí ocurre el crossing over. Fig 6: intercambio de DA que ocurre entre los cromosomas homólogos, donde se muestra el quiasma y luego el segmento intercambiado. d) Diploteno: los cromosomas homólogos se desaparean, el complejo sinaptonémico se deshace y, los cromosomas homólogos quedan separados aunque permanecen unidos a través de los quiasmas. En esta etapa los cromosomas se descondensan y ocurre síntesis de RNA. Fig 7: microfotografía de los quiasmas formados entre los cromosomas homólogos. e) Diacinésis: la síntesis de RNA cesa, los cromosomas se condensan intensamente y se sueltan de la envoltura nuclear que comienza a desaparecer. Los cromosomas homólogos siguen unidos a través de los quiasmas en los lugares donde ha ocurrido recombinación 65 Luego de este último punto termina la Profase I y comienzan las etapas de división celular propiamente tal. 2) Metafase I En esta etapa desaparecen los quiasmas. Los centríolos se encuentran duplicados y se mueven hacia los polos de la célula. Se organiza el huso mitótico y los cromosomas se ubican por pares homólogos en el centro de la célula, de modo que cada cromosoma de un par homólogo se orienta hacia un polo diferente de la célula, sin importar si es paterno o materno, lo que genera diferentes distribuciones posibles de cromosomas y aumenta la variabilidad genética del proceso 3) Anafase I Los cromosomas migran hacia polos opuestos de la célula, segregándose los cromosomas homólogos en los extremos opuestos de ella, gracias a la depolimerización y polimerización de los microtúbulos del huso mitótico. 4) Telofase I Alrededor de los cromosomas en cada extremos de la célula se reconstituye la envoltura nuclear. La cromatina se descondensa y, casi simultáneamente ocurre la división del citoplasma o citodiéresis. Después de la primera división cada célula resultante tiene la mitad del número de cromosomas original, pero cada cromosoma se encuentra duplicado y compuesto por dos cromátidas hermanas. Ahora comienza la segunda división celular, sin que se produzca una nueva duplicación del DA. 5) Profase II La cromatina se condensa nuevamente en cromosomas y la envoltura nuclear desaparece. 6) Metafase II Los cromosomas se ubican en el centro de la célula y el huso mitótico se une a ellos de modo que cada cromátida hermana se orienta hacia un polo distinto de la célula. 7) Anafase II Cada cromátida hermana migra hacia un polo distinto de la célula 8) Telofase II En cada polo celular, Alrededor de los cromosomas se reconstituye la envoltura nuclear, se descondensan los cromosomas y ocurre la división del citoplasma Cada célula resultante después de la segunda división meiótica es haploide ya que tiene la mitad de los cromosomas originales de la especie y cada cromosoma tiene solo una cromátida. 66 Fig 7: esquema de la meiosis 67 FECUDACIÓ En el proceso de fecundación los gametos haploides se fusionan para dar origen a un nuevo organismo que es nuevamente diploide. Cuando esto ocurre, el óvulo se activa para comenzar el desarrollo del nuevo individuo y, los núcleos de ambos gametos se fusionan para formar el genoma del nuevo organismo. La fecundación es un proceso especie-específico, lo que quiere decir que los espermios y óvulos de cada especie se reconocen específicamente a través de moléculas especiales de adhesión, lo que impide que un espermio de una especie fertilice óvulos de una especie diferente. Aunque muchos espermios ataquen a un mismo óvulo, un óvulo sólo puede ser fecundado por un espermio. La poliespermia se encuentra bloqueada gracias a una depolarización rápida de la membrana del óvulo, el cambio de las cargas a través de la membrana impide que un segundo espermio pueda fusionarse. Esto es importante, porque si más de un espermio inyecta su núcleo en un óvulo se forma más de un huso mitótico y la segregación de los cromosomas durante la división celular es anormal, resultando en embriones alterados o no viables. Fig 8: esquema del proceso de fecundación en eucariontes superiores, que ocurre con el encuentro entre un espermatozoide y un ovocito. La fertilización comienza cuando la cabeza de un espermio contacta la cubierta gelatinosa de un óvulo. Esto gatilla en el espermio la llamada reacción del acrosoma, en la que el contenido de la vesícula del acrosoma se libera al medio externo, esta contiene enzimas hidrolíticas que ayudan al espermio a penetrar la cubierta del óvulo y así llegar a la capa vitelina además de proteínas que ayudan a la unión del acrosoma a esa capa y, enzimas hidrolíticas que ayudan a penetrar a través de la capa vitelina para llegar a la membrana plasmática. Cuando las dos membranas plasmáticas entran en contacto se fusionan y, así se produce la entrada del núcleo del espermio hacia el interior del óvulo. Una vez fertilizado el óvulo pasa a llamarse cigoto. Una vez que los dos pro-núcleos se encuentran en el interior del óvulo deben migrar para encontrarse y poder fusionarse. Este movimiento se realiza por medio del citoesqueleto. Los cromosomas se juntan cuando las envolturas nucleares desaparecen en preparación a la primera división celular dando término al proceso de fecundación y comenzando el desarrollo embrionario. 68 ACTIVIDAD PRÁCTICA OBJETIVOS: • Identificar las fases del ciclo celular y sus características principales. • Describir las fases de la mitosis, meiosis y sus características principales. • Aprender a identificar células en distintas etapas de la mitosis y meiosis mediante observación microscópica de tejidos fijos. • Conocer algunas generalidades del proceso de fecundación mediante observación microscópica de distintas preparaciones, frescas y permanentes. A.- Observación microscópica del proceso de fecundación in vitro de molusco (Choromytilus chorus). OBJETIVOS: Realizar preparaciones frescas de gametos masculinos y femeninos de molusco (Choromytulus chorus) para su caracterización microscópica. Observar una fecundación in vitro Los moluscos (Phyllum Mollusca) son organismos invertebrados, de cuerpo blando y que generalmente están cubiertos por una concha calcárea. Poseen un manto que cubre el cuerpo y deja una cavidad donde se ubican las branquias, los sistemas reproductor, renal y digestivo. Debido a su gran capacidad adaptativa, los moluscos han llegado a ocupar los ambientes más diversos, tanto marinos como aguas dulces y terrestres. Son el segundo grupo de seres vivos de mayor abundancia y diversidad ya que en la actualidad cuenta con más de 50.000 especies vivientes. Algunos ejemplos de organismos pertenecientes al grupo de los moluscos son los choros, choritos, almejas, lapas, caracoles, pulpos y calamares. En el trabajo práctico vamos a utilizar ejemplares de un molusco perteneciente a la clase bivalvia o bivalvo, Choromytilus chorus (“choro maltón”). Los bivalvos presentan su cuerpo comprimido lateralmente y lo cubren dos valvas o conchas articuladas en la región dorsal (charnela). Poseen un pie muscular que puede emerger a través de las valvas pues está adaptado para excavar el fondo del mar en busca de alimentos. No poseen cabeza, sólo una amplia lámina de tejido o manto que forma una cavidad donde se localizan las branquias. El manto está unido a la concha mediante fibras musculares. Fig 9: esquema de un molusco bivalvo típico Su sistema respiratorio, digestivo, excretor y nervioso son bastante simples, presentando unas pocas estructuras especializadas. Los sistemas reproductivos de hembras y machos son estructuralmente similares, pues poseen un par de gónadas ramificadas que rodean el intestino y tienen 69 conductos simples que se dirigen a un tubo acuífero con salida al exterior. Descargan así sus gametos directamente al agua y, tanto la fertilización como el desarrollo embrionario son externos. Su estado larvario es del tipo veliger (larva que vive libre en un medio acuático), después de lo cual comienza la secreción calcárea que da lugar a la concha. Esto le permite secretar filamentos firmes producidos por una glándula especializada (biso), que se pegan firmemente a las rocas en las cuales habitan. Con el objeto de obtener especimenes de choro maltón adecuados para nuestro trabajo práctico, se contara con ejemplares vivos que han siso mantenidos en un acuario con agua de mar filtrada, suministrándoseles una adecuada oxigenación del medio con una bomba de aire. ACTIVIDAD PRÁCTICA °1: extracción de gametos masculinos y femeninos de choro maltón El color del manto de los choros es característico de cada sexo, lo que nos permite seleccionar ejemplares adecuados para la extracción de los gametos. Para observar el color del manto, es necesario levantar de forma cuidadosa una de las valvas tratando de no dañar las estructuras internas del molusco. Junto con identificar su sexo, podemos observar sus principales características estructurales, mencionadas anteriormente en la guía (charnela, manto, pie, branquias, biso, sistemas de órganos). En los choritos las gónadas están compuestas por conductos ciliados ramificados desde donde se abren numerosos sacos o folículos, se encuentran rodeando el intestino y están muy próximas, siendo a veces muy difícil separarlas. Cuando las gónadas o el tejido gonadal han alcanzado la plena madurez, son fáciles de ver y ocupan gran parte del cuerpo blando del animal. Los gonaductos que transportan los gametos hasta la cavidad corporal se desarrollan, aumentan de tamaño y se pueden observar a simple vista. El color es la característica que permite diferenciar a machos de hembras, siendo las gónadas de los primeros de color amarillo y en el caso de las hembras de color café oscuro. Una vez identificados los aparatos reproductores, que se encuentran en posición ventral, procederemos a tomar una muestra de gametos masculinos de los ejemplares de color anaranjado, aspirando con una pipeta Pasteur la solución blanquecina que se encuentra sobre el manto y la gónada. Esta solución corresponde a los espermatozoides maduros. Repetiremos el procedimiento con los ejemplares femeninos, con el manto de color negro, pero esta vez tomaremos una muestra de la solución de color negro que se encuentra sobre el manto y la gónada que corresponde a los óvulos maduros. Colocamos cuidadosamente ambas muestras en una placa de vidrio, rotulada en forma adecuada, agregando aproximadamente 2 mL de agua de mar filtrada a cada uno de los pocillos con el objeto de resuspender los gametos en la solución. Proceda entonces a adicionar a un tercer pocillo de la placa una alícuota de aproximadamente 1 mL de cada una de las soluciones de gametos, agitando suavemente la mezcla con el objeto de que los gametos masculinos y femeninos entren en contacto. De esta forma, hemos realizado una fecundación in vitro. • Realice preparaciones frescas de la solución de gametos masculinos, femeninos y de la muestra recién fecundada, colocando una gota de cada una de las soluciones en un portaobjetos limpio y adecuadamente rotulado. Coloque sobre la gota un cubreobjetos y proceda a observar sus preparaciones al microscopio. Aplique sus conocimientos de microscopía, observando la muestra con los objetivos 4, 10 y 40X antes de utilizar el objetivo de inmersión. • Describa brevemente sus observaciones, caracterizando la estructura de los gametos y su comportamiento en cada una de las muestras. 70 ACTIVIDAD PRÁCTICA °2: Observación microscópica de preparaciones permanentes de tejidos en distintas etapas de la mitosis. OBJETIVO: Identificar y caracterizar células en distintas etapas de la mitosis en preparaciones permanentes de tejido vegetale Aplicando sus conocimientos de microscopía observe la preparación de mitosis en células vegetales de Allium cepa (L.). • Identifique en el tejido observado células que se encuentren en distintas etapas de la mitosis, indique sus características principales realizando un dibujo simple, esquemático y claro. ACTIVIDAD PRÁCTICA °3: Observación microscópica de una preparaciones permanentes de tejidos en meiosis y gametos masculinos de mamífero. OBJETIVO: Identificar y caracterizar células en distintas etapas de la meiosis en preparaciones permanentes. • Aplicando sus conocimientos de microscopía y la utilización correcta del objetivo de inmersión, observe las siguiente preparaciones: oviductos y/o ovarios de rata, epidídimo y/o testículo de rata. • Identifique en la preparación observada células en distintas etapas de la meiosis, describiendo sus características principales en el espacio asignado para tal propósito en el informe. Observación microscópica de preparaciones permanentes de gametos masculinos • Aplicando sus conocimientos de microscopía y la utilización correcta del objetivo de inmersión, observe las siguientes preparaciones: espermatozoides de humano y/o toro. • Observe detalladamente la organización de las células que componen los tejidos, e identifique en ellos la presencia de los gametos y sus estructuras características. Bibliografía Biología Celular y Molecular, De Robertis y de Robertis, 11 ed , 2 da impresión, 1998, Ed. El Ateneo, Bs. Aires. Elementos de Biología Celular y Genética. Parte 3. Transmisión de la Información y Reproducción. Varios Autores. 1 e d., 1985, Departamento de Biología Celular y Genética, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. 71 Molecular Biology of the Cell, Alberts Bray, Lewis Raff Roberts & Watson, 3 ed ., 1994, Garland Publishing Inc. , New York & London. The Cell: A Molecular Approach, Copper G.M., 1997, ASM Press, Washington, U.S.A. Zoología, Cockrum E.L. y Mc Cauley, W.J., 1 ed , 1967, Ed. Interamericana, México. Materiales Laboratorio. Mitosis, Meiosis y Fecundación Materiales por grupo (3 alumnos por grupo) 2 unidades de erizo negro o chorito malton. 3 microscopios. 1 Tijera. 1 pinza. 2 gotarios. 1 porta objeto escavado. Cubre objetos 2 vasos pp 50 ml Lápiz rotulador Por curso: Agua de mar filtrada. Preparaciones histológicas: Mitosis (catafilo de cebolla), Corte de testículos, Corte de ovarios y Muestra de espermatozoides de toro y rata. Televisor con microscopio. 3 Aceite de inmersión. 3 Solución limpiadora. Papel óptico.