UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTÍN============================================================= FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL MANUAL DE PRÁCTICAS DE: MICROBIOLOGÍA AGROINDUSTRIAL POR: Ingº EPIFANIO MARTÍNEZ MENA Ingº NELSON GARCÍA GARAY TARAPOTO - PERÚ 2014 MANUAL DE PRÁCTICAS: “MICROBIOLOGÍA AGROINDUSTRIAL” POR: INGº M. Sc. EPIFANIO MARTÍNEZ MENA Ingeniero en Industrias Alimentarias Master Sciencie en Tecnología de Alimentos Responsable de la Asignatura de Microbiología Aplicada Docente Adscrito al DAIAI. INGº NELSON GARCÍA GARAY Ingeniero Agroindustrial Responsable del Laboratorio de Microbiología y Fermentación Responsable de la Asignatura Microbiología Aplicada Docente Adscrito al DAIAI. Segunda edición. Junio, 1995. Tarapoto - Perú Primera reimpresión. Abril, 2000. Tarapoto – Perú Corregida y actualizada. Marzo, 2012. Tarapoto – Perú INTRODUCCIÓN "No basta dar un paso para llegar a la meta, sino que cada paso debe ser una meta sin dejar de ser un paso". GOETHE El presente Manual de prácticas de Microbiología Aplicada se ha elaborado tomando en cuenta aquellos métodos que resulten prácticos en los análisis microbiológicos de los alimentos, los cuales son aplicados en los países latinoamericanos. No pretende satisfacer todas las exigencias de los especialistas en este campo de la microbiología de los alimentos, ya que ésta hoy en día, es una especialidad extensa; sino más bien es un pequeño compendio de técnicas aplicadas a cualquier laboratorio de control de alimentos. Los métodos que se presentan para la determinación de microorganismos que afectan la calidad higiénica y la vida útil de estos productos, son en su mayoría técnicas propuestas por organismos de probada solvencia científica como: International Comissión on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF), American Public Health Association (APHA), y unos pocos corresponden a técnicas propuestas por eminentes especialistas en el campo de la Microbiología de Alimentos como el Prof. Dr. D. A. A. Mossel y otros. El deseo de esta publicación, es que contribuya en algo a incrementar las fuentes de información, un tanto escasas en nuestro medio, esperando que las técnicas que se recomienden sean utilizadas en el Análisis Microbiológico de los alimentos. Finalmente, y como ésta es una primera edición, el autor ruega y quedará muy agradecido a los lectores que lo informen de cualquier errata u omisión observada. Ing. M. Sc. EPIFANIO MARTÍNEZ MENA Docente Adscrito Departamento Académico de Ingeniería Agroindustrial. INTRODUCCIÓN A LA SEGUNDA EDICIÓN Para publicar la segunda edición del “Manual de Prácticas de Microbiología Aplicada”, los autores revisaron honestamente la primera edición presentada por el Ingeniero Martínez Mena, y propusieron incluir algunas prácticas de interés en la carrera profesional de la Facultad de Ingeniería Agroindustrial. Siempre respetando los métodos y las técnicas ya propuestas, más los conocimientos adquiridos a lo largo demás de una década en los análisis microbiológicos de los alimentos, sumados a estos la enseñanza impartida a través de la asignatura de Microbiología Aplicada; queremos de esta manera llegar a los estudiantes de la Facultad de Ingeniería Agroindustrial de la Universidad Nacional de San Martín - Tarapoto, personas interesadas y público en general, y así aumentar los conocimientos en el campo microbiológico. Quedaremos muy agradecidos a los lectores que informen de cualquier errata u omisión observada. Ing. M. Sc. Epifanio Martínez Mena. Ing. Nelson García Garay. ÍNDICE GENERAL Página Introducción Introducción a la Segunda Edición Índice General : 5 Índice de Prácticas : 6 Precauciones de seguridad en el Laboratorio de Microbiología : 7 Instrucciones de Laboratorio : 8 Formato para la presentación del Informe de Laboratorio : 9 PRÁCTICA Nº 01 : 11 PRÁCTICA Nº 02 : 15 PRÁCTICA Nº 03 : 18 PRÁCTICA Nº 04 : 24 PRÁCTICA Nº 05 : 27 PRÁCTICA Nº 06 : 30 PRÁCTICA Nº 07 : 38 PRÁCTICA Nº 08 : 48 PRÁCTICA Nº 09 : 50 PRÁCTICA Nº 10 : 53 PRÁCTICA Nº 11 : 57 Referencias Bibliográficas : 60 ÍNDICE DE PRÁCTICAS Página PRÁCTICA Nº 01: Métodos de Esterilización. Por: Calor, Filtración, Humedad y Desecación, Radiaciones, Agentes Químicos. : 11 PRÁCTICA Nº 02: Observación Macroscópica y Microscópica de: Bacterias, Mohos y Levaduras. : 15 PRÁCTICA Nº 03: Familia Enterobacteriaceae. Coloración Gram. Galería Bioquímica de OxNiGLUMoCISKAD. : 18 PRÁCTICA Nº 04: Análisis Microbiológico de los Alimentos: Muestreo y transporte, Preparación de Diluciones, Tipos de siembra. : 24 PRÁCTICA Nº 05: Pruebas Microbiológicas más utilizadas en el Control Microbiológico de los alimentos: Expresión Microbiológica de la población microbiana de los alimentos. Microorganismos Indicadores. Microorganismos Indicadores de la Higiene Inadecuada: Bacterias Aerobias Mesófilas Viables. : 27 PRÁCTICA Nº 06: Microorganismos Indicadores de la Contaminación Fecal: Enterobacterias; Coliformes, Colifecales y E. coli; y Streptococcus del grupo D de Lancefield. : 30 PRÁCTICA Nº 07: Microorganismos Indicadores de Procesamiento y Conservación Inadecuada. Numeración de: Clostridium Sulfito Reductor; Hongos (Mohos y Levaduras); Staphylococcus aureus; Bacillus spp.; Investigación y Detección de Salmonella spp. : 38 PRÁCTICA Nº 08: Análisis Microbiológico de Aguas. Métodos de aplicación. : 48 PRÁCTICA Nº 09: Microbiología de la leche. Prueba de la Reductasa. : 50 PRÁCTICA Nº 10: Análisis Microbiológico de Alimentos Enlatados. : 53 PRÁCTICA Nº 11: Elaboración de productos alimenticios mediante la acción de microorganismos: Yogur, Vino, Vinagre, Encurtidos, Chucrut, etc. : 57 PRECAUCIONES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA 1) Los materiales tóxicos e infecciosos son siempre potencialmente peligrosos por lo que deben ser manipulados con el debido cuidado. 2) El uso indebido de aquellos materiales en el laboratorio pueden dar lugar a peligrosas consecuencias, no solo para el personal que comete la falta, sino hacia otras personas a las cuales dispersa las toxinas o microorganismos patógenos. 3) El análisis de microorganismos patógenos en alimentos, involucra ciertos riegos de contaminación ya sea desde el mismo alimento, como de los cultivos y concentrados tóxicos que se derivan de ello. 4) La experiencia establece que aquellos riesgos pueden ser minimizados y eliminados por la comprensión del peligro potencial y por la aplicación de prácticas apropiadas en el laboratorio. INSTRUCCIONES DE LABORATORIO 1) Use siempre guardapolvo. 2) No participar en los trabajos si tiene heridas en las manos. 3) No coma, beba o fume en el área del laboratorio, siempre evite el contacto de las manos con la boca, nariz, ojos, etc. 4) El área de trabajo que se le asignen, consérvelo limpio y ordenado. 5) Las carteras, libros y demás útiles colóquelos en las gavetas individuales u otro lugar, nunca sobre las mesas de trabajo. 6) Antes de cada sesión de trabajo, limpie el área con desinfectante y luego lave las manos. 7) Coloque las pipetas usadas en los recipientes destinados para tal fin. 8) Coloque el material de descarte en recipientes apropiados para autoclavar. 9) Los cultivos mixtos de microorganismos patógenos, requieren especial cuidado, evite que se produzcan aerosoles. 10) Para centrifugar materiales tóxicos o infecciosos use únicamente tubos con tapa. 11) En caso de producirse salpicaduras, cubra inmediatamente el área con desinfectante apropiado. 12) Reporte inmediatamente al profesor, cualquier accidente que ocurra, por pequeño que sea: rasguño, cortadura, quemadura. 13) Identifique su material de trabajo con Nº, fecha, experiencia y demás datos. 14) Incuba el material en la estufa, o en el lugar que se le asigne. 15) Deje su área de trabajo en perfecto orden a la hora de retirarse. 16) Lavarse las manos al principio y al final de cada sesión de trabajo. Se permitirá la comunicación y movilización de los estudiantes dentro del Laboratorio, siempre que la conversación y movimientos conciernen directamente con el trabajo que se efectúe. FORMATO PARA LA PRESENTACIÓN DEL INFORME DE LABORATORIO A continuación se va a proporcionar pautas generales para la estructura u ordenamiento en la redacción de un informe. Las pautas de una estructura básica son las siguientes: - Título - Introducción - Objetivo (s) - Revisión de literatura - Materiales y métodos - Resultados - Discusión - Conclusiones - Referencias Bibliográficas - Anexos. 1) TÍTULO. El título debe dar una idea precisa de la naturaleza del trabajo; debe ser claro y breve. 2) INTRODUCCIÓN. La introducción sirve para suministrar al lector los antecedentes, razones, implicaciones y otros aspectos que permitan conocer la naturaleza y finalidad del trabajo. Por ello una buena introducción debe reseñar brevemente los siguientes aspectos: - Importancia y naturaleza del estudio. - Propósito. - Relación con otros estudios. - Limitaciones del trabajo. 3) OBJETIVO (S). Se deben describir con precisión los propósitos de la práctica. Algunos lo incluyen al final de la introducción. 4) REVISIÓN DE LITERATURA. En esta parte se dan a conocer los hechos, opiniones o sugerencias de otros autores relacionados al tema de trabajo. Actualmente, se preconiza una revisión de literatura breve; sólo debe referirse a aspectos directamente relacionados con el tema del artículo, haciendo énfasis en los más recientes. El autor está en la obligación de mencionar las fuentes de información que usa, debe citar al autor o autores de los trabajos consultados. Las citas bibliográficas podrían escribirse de la siguiente manera: “Las levaduras son sensibles a la acción de los ácidos (Carbonell, 1970)”, y “Amerine (1970), demostró el efecto represivo del ácido acético sobre las levaduras”. 5) MATERIALES Y MÉTODOS. Es la parte descriptiva de los procedimientos usados en la investigación, en sus diferentes fases. Por materiales se tiene por ejemplo: procedencia del material, lugar de las experiencia, período de trabajo, dosis empleada, equipos e instrumentos, productos químicos, etc. Por método: El diseño experimental, las técnicas de laboratorio, los procesos técnicos, modificaciones de los métodos, etc. 6) RESULTADOS. Los resultados, son la presentación de los hechos obtenidos hasta la terminación de la experiencia. Esta presentación debe hacerse en un orden lógico, agrupando bien los diversos resultados. Conviene tener presente que los resultados se limitarán a los datos obtenidos, sean estos positivos o negativos. No se debe incluir suposiciones, conjeturas o posibles datos en otras circunstancias. No se puede especular. En esta parte se puede incluir cuadros estadísticos, tablas, ilustraciones (fotografías, mapas, gráficos, dibujos). 7) DISCUSIÓN. Ésta, es la parte más importante del informe, es considerada como la sustentación del trabajo. Es la parte central del escrito y en ella se refleja la personalidad, capacidad y madurez intelectual de la autor. El autor tiene que argumentar, discutir, refutar, hacer deducciones. Se deben puntualizar las ventajas y limitaciones de los resultados. 8) CONCLUSIONES. Es una puntualización de las generalizaciones, sugerencias y deducciones que emanan del trabajo. Las conclusiones tienen que basarse en hechos comprobados; tendrán claridad si se agrupan en un orden lógico y se enumeran. A continuación se algunos ejemplos: 1. Es posible conocer cepas de levaduras de alta capacidad fermentativa, a partir de uvas procedentes de viñedos de nuestro país. 2. Mediante el empleo de levaduras seleccionadas, se puede obtener una fermentación más rápida y un vino de mejor calidad. 9) REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. Es la enumeración de las publicaciones consultadas y citadas. Los elementos principales y el orden de una referencia o cita bibliográfica son las siguientes: Autor, Año de Publicación, Título de la publicación, Número de la edición, Casa editora, lugar de publicación, paginación. 10. ANEXOS. PRÁCTICA Nº 01: MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN. Calor, Filtración, Humedad y Desecación, Radiaciones, Agentes Químicos. I. INTRODUCCIÓN. Los laboratorios relacionados con estudios microbiológicos por lo menos debe contar con equipos básicos tales como: Autoclave, Estufas (de incubación y de esterilización), refrigerador, Microscopio, balanza. Para los trabajos microbiológicos, se requiere contar con anterioridad al desarrollo del experimento, contar con instrumentos limpios y sobretodo estériles; por lo tanto es necesario la preparación y esterilización de éstos por anticipado. Se entiende por ESTERILIZACIÓN a todo tratamiento de todo material con un agente físico o químico que conlleve a la eliminación de toda forma de vida en él. La inactivación parcial o la esterilización, se puede lograr de diferentes maneras: Por medio de calor (húmedo y seco), Por filtración, por humedad y desecación, Por radiación, y Por agentes químicos. II. OBJETIVOS. - Conocer el fundamento de los métodos de esterilización. - Conocer los equipos con que cuenta el laboratorio, y los que se utilizan para esterilización. - Conocer los materiales de vidrio, básicos para el uso en un laboratorio de microbiología. - Aprender a preparar los materiales de vidrio y medios de cultivo para su esterilización. III. MATERIALES Y MÉTODOS. Materiales. -Equipos: Autoclave, Horno, Estufas (incubación, esterilización), Baño María, Cámara luz UV. -De vidrio: Tubos de ensayo, placas petri, pipetas de 1, 2, 5,10 mL., matraces de 100, 250, 500, y 1000 mL. -Otros: Mecheros, asa bacteriológica, algodón, hilo pabilo, papel kraft, gradilla, tijera, fósforo, detergente, jabón, lapicero rotulador, escobilla, toalla. Procedimiento. A) ESTERILIZACIÓN POR MEDIO DEL CALOR. El efecto del calor sobre los microorganismos está en relación con el grado de humedad del ambiente de esterilización y es calor que se propaga es por conducción, convección y radiación; de ello se distingue dos métodos muy usados. CALOR HÚMEDO: Pasteurización, Tindalización, Ebullición y Vapor a presión en autoclave y CALOR SECO: Estufa de Esterilización, Fuego directo al rojo vivo e Incineración. CALOR HÚMEDO: La inactivación por calor húmedo requiere de menos temperaturas que la que se realiza en ausencia de agua. Los enlaces débiles se rompen más fácilmente por calor húmedo (atmósfera saturada de vapor de agua), debido a que las moléculas de agua pueden desplazar a los puentes de hidrógeno. Autoclave y manejo. Equipo que consta de una caldera de cobre cubierta por cobre y estaño y protegida por una camiseta metálica de acero inoxidable formando paredes dobles. En la base posee una fuente de calor eléctrica (resistencia), por encima de ésta se encuentra un recipiente con la base cribado para la salida de vapor y al mismo tiempo sirve para colocar los materiales, en la parte superior posee una tapa de bronce con un dispositivo alrededor que permite un cierre hermético además de contener tornillos para evitar la salida de vapor. La tapa en la parte externa también posee una válvula de seguridad que funciona cuando la presión interna excede; Una espita, que permite la salida del aire frío al inicio del calentamiento; un barómetro, para medir la presión; un termómetro, para temperatura. Modo de uso. Después de colocar el material a esterilizar previamente rotulado se prende el equipo y se deja la espita abierta, se cierra herméticamente la tapa y cuando hay desprendimiento de vapores por la espita hasta formar gotas de agua se cierra, luego se controla la temperatura y la presión deseada. Vapor a Presión. El autoclave, es el equipo usado para esterilización de materiales por calor húmedo en el laboratorio de microbiología, debido a que alcanza temperaturas superiores a la de ebullición del agua, el tratamiento se efectúa en un compartimiento herméticamente cerrado y saturado con vapor de agua y a presiones superiores a la atmosférica (121°C, y 15 Ib de presión por 15 minutos), en la esterilización de medios de cultivo y para materiales de desecho se utiliza mayor tiempo (hasta 30 minutos a 134°C, la presión se incrementa por encima de 26 Ib.). En sólo 7 minutos se eliminan todas las formas vegetativas y esporas contaminantes presentes. Ebullición. Método por el cual se pueden esterilizar jeringas, guantes de jebe, sondas, ropa, etc.; haciendo hervir durante 10 a 40 minutos, en donde se van a eliminar todas las formas vegetativas de los microorganismos y bacterias. Pasteurización. Método que por lo general se realiza en Baño María a una temperatura de 65°C por 30 minutos, en donde se eliminan todas las formas vegetativas de las bacterias pero no las termófilas; se utilizan en el saneamiento de leches y bebidas alcohólicas. También puede utilizarse estufas que alcancen temperaturas mayores de 60°C. En caso de leche, también puede utilizarse temperaturas de 72-75°C en capa fina, durante 15 segundos, esta pasteurización se denomina "STASSANIZACIÓN". Tindalización. Conocido comúnmente como calentamiento intermitente, consiste en someter al producto por tres días consecutivos a un calentamiento hasta 65°C durante media hora, se utilizan para sustancias que no soportan elevadas temperaturas. La temperatura puede variar de 56 a 100°C, los aparatos muy empleados son el de ARNOLD y de KOCH. Vapor Fluente. Su acción es similar a la del agua a 100°C, se usa mucho en los laboratorios para esterilizar medios de cultivo que llevan sustancias que se puedan alterar a temperaturas superiores; se hace actuar sobre el material un chorro continuo de vapor de agua por 30 a 60 minutos, el vapor debe ser obtenido a 100°C no más. CALOR SECO. Método por el cual, la esterilización necesita recurrir a mayores temperaturas que la efectuada por el calor húmedo, su acción fundamental es de oxidación de los constituyentes esenciales mediante la rotura de los puentes de hidrógeno y la desnaturalización de las proteínas. Existen tres formas de calor seco. - HORNO PASTEUR Y MANEJO. Equipo, que por lo general es grande y de forma rectangular o cuadrada, cubiertas por una pared triple metálica, la cual está recubierta en su interior por planchas de asbesto del mismo modo que la puerta y los lados, en la base están las resistencias eléctricas, las que permiten alcanzar elevadas temperaturas hasta 250°C, constan de un termostato, un termómetro y un cronómetro, las cuales facilitan su control durante su uso. Las temperaturas de esterilización usadas son de 160°C por una hora, de 170°C por 40 minutos, de 180°C por 20 minutos. En este tipo de esterilización el calor se inicia por conducción y se propaga por convección. Por lo general se utiliza para la esterilización de material de vidrio y material quirúrgico, una vez colocado los materiales en su interior, se cierra y espera hasta que alcáncela temperatura deseada y se propaga el tiempo indicado (evitar abrir durante el proceso de v esterilización). Flameado. Muy utilizado en esterilización de asas metálicas de siembra (hasta el rojo vivo), con las que se inoculan las bacterias; también se utiliza en la esterilización de bocas de tubos y placas petri al realizar el trasplante de los microorganismos. Incineración. Ideal para aquellos productos contaminados que no importa su destrucción como por ejemplo: ropa, cadáveres de animales y otros materiales de desecho. B. ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN. Consiste en hacer pasa un líquido por un material poroso cuyo diámetro de poro sea inferior al de las bacterias y virus. El mecanismo de filtración se debe al hecho de que los microorganismos por tener carga eléctrica negativa y los filtros carga eléctrica positiva, los microorganismos quedan adsorbidos frente a la presión y la acción del vacío. Las membranas que son utilizadas como filtros son de amianto o de acetato de celulosa cuya porosidad fluctúa de 0.005 a 1 um. De diámetro; muy útiles en la esterilización de medios líquidos, soluciones de albúmina, soluciones de antibióticos y otras sustancias que pueden ser alteradas por acción de calor. C. ESTERILIZACIÓN POR RADIACIONES. Rayos Ultravioleta (UV). La radiación UV producida artificialmente producida en el espectro de 2537 angstroms ha sido utilizada por su actividad germicida esterilizante por más de 30 años. La acción de los UV se debe a la producción de ozono que logra ia asepsia, ya que este gas conserva su acción inhibidora hasta una dilución 1 x 40.000. La inactivación de los microorganismos por los rayos UV, está en función de la dosis de energía radiante: la efectividad de la aplicación de una determinada intensidad de radiación es propia del intervalo de tiempo, sin embargo la dosis requerida para los diferentes microorganismos varí ampliamente. Las bacterias vegetativas son de tres a diez veces más susceptibles a la inactivación que las bacterias esporuladas; los hongos y sus esporas son cien a mil veces más resistentes que las bacterias vegetativas. Su utilidad en la esterilización de ambientes y superficies, cabinas de siembra, envasado de antibióticos, preparación de vacunas bacterias y virus inactivadas, potabilización de aguas de mesa. El tiempo mínimo para la exposición a la luz UV varía desde 30 minutos a más según el grado de contaminación y la distancia; y dependerá del nivel de aplicación rayos UV.(Alto nivel: destruye todos los microorganismos con la excepción de alta carga de esporas bacterianas; Nivel intermedio: inactiva el microorganismo Micobacterium tuberculosis, las bacterias vegetativas, la mayoría de los virus, hongos, pero destruyen necesariamente las esporas bacterianas; Bajo nivel: destruye la mayoría de las bacterias, algunos virus y algunos hongos, pero no se puede depender de ella para eliminar microorganismos como el bacilo de la tuberculosis y esporas bacterianas. Cuando se utiliza luz UV., es muy importante que las lámparas sean limpiadas periódicamente con alcohol y se verifique su efectividad con cierta frecuencia. Para la aplicación de luz UV., es necesaria una adecuada protección personal en particular de los ojos y manos. Se utilizan lámparas generadoras de luz UV., y las radiaciones UV comprendidas entre 210 y 328 nm. tienen acción bactericida pero esporicida; la longitud de onda más eficaz es a 3300 angstrom. D. AGENTES QUÍMICOS. Los que destacan son los bacteriostáticos y los bactericidas. Solución de Fenol al 2.5 %. Empleada en la esterilización de superficies muy irritantes para los ojos, siempre debe trabajarse con guantes. Alcohol al 70 %. Empleado en la desinfección de manos y material de polietileno. Solución de Formol. Contiene un aproximado de 4 % de formaldehido, se utiliza en la desinfección de superficies y en algunos casos en la esterilización de medios de cultivo. Hipocloritos. Contiene una concentración de 2500 ppm de cloro y se utilizan para descontaminar pipetas y vasijas. Solución de Yodo. Se prepara en alcohol al 50 % a una concentración de 1600 ppm de yodo y puede emplearse en la desinfección de manos. Otros. Cloramina al 2%, Alcohol Isopropílico al 70%, Peróxido de Hidrógeno al 6%. IV. CUESTIONARIO. 1. Nombrar los equipos de esterilización con que cuente el laboratorio e indicar su funcionamiento y aplicación. 2. Indicar qué materiales se esterilizan en el autoclave y en la estufa de esterilización y explicar la acción esterilizadora de esos equipos. 3. Explicar la manera de esterilizar ambientes, superficies (piso, mesas de trabajo, paredes), del laboratorio de Microbiología y Fermentación. 4. ¿Qué entiende por Bioseguridad, y cómo debe implementarse en el laboratorio? PRÁCTICA Nº 02: OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA DE: BACTERIAS, MOHOS Y LEVADURAS. I. INTRODUCCION. El cuerpo humano es una gran superficie cutánea y mucosa por la que entra en contacto con el medio ambiente. En la superficie existen diversos sectores, donde residen microorganismos con diferentes características de humedad, temperatura, pH y disponibilidad de nutrientes. La flora humana normal, es el conjunto de gérmenes que conviven con el huésped en estado normal, sin causarle enfermedad. Su composición es característica para la especie humana, tanto en los gérmenes que la componen en su número y distribución en el organismo. La flora normal coloniza las superficies cutáneomucosas normales; por otro lado, en el organismo existen sectores que son estériles en condiciones normales, por ejemplo, la pleura, meninges, cavidad peritoneal, pericardio, etc. La flora basal es la característica de cada sector del organismo y está constituida por gérmenes que siempre están presentes en ese sector. Por ejemplo, Staphylococcus epidermis en la piel, la Escherichia coli, en el intestino. En cambio la flora transitoria es variable de un ser humano a otro y está compuesta por gérmenes que colonizan en forma intermitente un determinado sector; esta flora puede incluir bacterias potencialmente patógenas para el propio individuo u otras personas que entran en contacto con él. La morfología de las bacterias es importante porque permiten distinguir las diversas formas, bacilar, cocos, espirilos, espiroquetas, sarcinas, diplococos, etc. Se debe tener mucho cuidado al preparar la muestra de alimento, la fijación por aplicación de calor a la lámina porta objeto luego la coloración, teniendo en cuenta elementos estructurales básicos que son necesarios para su identificación, como, por ejemplo: pared celular, cápsula, espora, flagelos, Gram, etc. y así poder lograr una buena observación de la morfología bacteriana. Los hongos, un grupo heterogéneo, de organismos eucariotas, heterótrofos no fotosintéticos, con pared celular. Basándose en la apariencia macroscópica de la colonia se puede diferenciar dos tipos de hongos: si producen colonias opacas, cremosas o pastosas se denominan LEVADURAS; si producen crecimientos aéreos, algodonosos o filamentosos, se denominan MOHOS. El conjunto de elementos que constituyen un hongo se denomina talo, el talo puede ser unicelular (en levaduras): en los mohos el talo incluye una parte vegetativa, el micelio, compuesta por hifas y una parte reproductora. Las hifas son tubos que contienen núcleo y citoplasma. El micelio puede ser tabicado y no tabicado. El crecimiento saprofítico de los hongos puede ser dañino y causar cuantiosas pérdidas si ocurre en materias primas industriales, además producen micotoxinas altamente toxigénicos y en algunos casos carcinógenos; son importantes en las fermentaciones industriales para la producción de cerveza, vino, pan, antibióticos, vitaminas y ácidos orgánicos. II. OBJETIVOS. - Adiestrar al estudiante en el cultivo de microorganismos (bacterias y hongos). - Conocer la diversidad de microorganismos que están presentes en el medio ambiente. - Observar el crecimiento de las colonias de microorganismos en diferentes medios de cultivo a partir de diferentes muestras de alimentos. - Observar la morfología macroscópica microbiana y aprender a diferenciar los distintos tipos. - Observar la morfología microbiana en nuestras teñidas a diferenciar los distintos tipos. - Utilizar correctamente el microscopio. III. MATERIALES Y MÉTODOS. Materiales. Equipo: Microscopio Material de vidrio: Placas Petri, laminas portaobjeto, laminas cubreobjetos. Colorante para tinción: solución de cristal violeta 1%, solución de safranina, solución de azul de metileno al 1 %. Otros: medios de cultivo, mechero de alcohol, asa bacteriológica, aceite de inmersión, pinzas de madera, fosforo y detergente Muestras de alimentos: yogurt, vinagre, frutas y verduras. Procedimiento. La observación macroscópica de los microrganismos, se realizarán observando la morfología de las colonias que crecen en los medios de cultivo; y la observación microscópica, se realizaran en muestras fijadas y teñidas. 1. MICROOSGANISMOS DEL AMBIENTE DE TRABAJO. Con medios de cultivo paqueteados (Agar Nutritivo, Oxitetraciclina Glucosa Agar y Agar Mac Conkey). Abrir las placas con el medio de cultivo y recorra el ambiente del laboratorio, cierre las placas e incubar en la estufa o lo que indique el profesor. Observar el crecimiento de los microorganismos sobre el medio de cultivo con la ayuda de una lupa o a simple vista. Esquematizar los resultados y realizar coloraciones (simples o Gram). 2. MICROORGANISMO DE LOS ALIMENTOS. - Poner diferentes muestras de alimentos, sobre filtros de papel húmedo. - Introducir en bolsa plásticas (como si fueran cámaras húmedas). - Dejar las muestras en un lugar tibio por unos días. - Observar y esquematizar los resultados. 3. BACTERIAS DEL YOGUR. Este es un producto lácteo producido por la fermentación de la leche, añadiendo una asociación de dos cepas bacterianas: el Streptococcus termophilus, poco productor de ácido, pero muy aromático, y el Lactobacillus bulgaricus, buen productor de ácido láctico, manteniendo a temperaturas que oscilan entre 40–45ºc. - Disolver una mínima porción de yogur en una pequeña gota de agua - Fijar con metanol para eliminar parte de la grasa. - Teñir con un colorante cualquiera de los ya mencionados durante 1-2 minutos - Observar al microscopio. En el experimento se podrá observar dos morfologías distintas de bacterias (cocos y bacilos). 4. BACTERIAS DEL VINAGRE. El vinagre es una solución acuosa rica en ácido acético resultante de la fermentación espontánea del vino o de bebidas alcohólicas de baja graduación. La acetificación del vino es producida por bacterias aeróbicas del ácido acético, principalmente Acetobacter aceti, y también por especies del género Gluconobacter. - Disolver una pequeña cantidad de muestra con una gota de agua en una lámina porta objeto y entender - Dejar secar y fijar con calor. - Teñir con un colorante cualquiera de los mencionados durante 1-2 minutos. - Observar al microscopio. En el experimento se observará la presencia de bacilos rectos con flagelos polares. 5. LEVADURAS DEL VINO. El vino de uva es elaborado a partir de zumo o jugo de uva por acción de levaduras (Saccharomyces ellipsoideus), que transforman la glucosa y fructosa del zumo a alcohol etílico y anhídrido carbónico, en ausencia de oxígeno. - Disolver una pequeña cantidad de muestra con una gota de agua en una lámina porta-objeto y extender. - Dejar secar y fijar con calor. - Teñir con un colorante de los mencionados 1-2 minutos - Observar al microscopio. En este experimento se observará levaduras esféricas ovoides y alimonadas IV. CUESTIONARIO. 1. Porqué es importante estudiar a los microrganismos?. 2. Porqué es necesario con algunas muestras, fijar y teñir para observar al microscopio. 3. Porqué es necesario añadir aceite de inmersión y observar con el objetivo de inmersión cuando se trabaja con muestras fijas?. 4. Explicar sobre los métodos de tinción que se utilizan en la microbiología?. 5. Qué medios específicos se utilizan para el cultivo de bacterias y hongos?. 6. Porqué es necesario ajustar el pH de los medios de cultivo, cuál es el valor adecuado para bacterias y hongos?. 7. Qué morfología macroscópica y microscópica, ha observado en la práctica, teniendo en cuenta las muestras usadas?. 8. Qué nuestras recomendaría usar usted para esta práctica, que determinaría, explicar? PRÁCTICA Nº 3. FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE. Coloración Gram. Galería Bioquímica de OxNiGLUMoCISKAD. I. INTRODUCCIÓN. Existe un conjunto de microorganismos que integran la flora microbiana del intestino del hombre y de los animales, representados por millones de bacilos Gram negativo no esporulados, que se encuentran también en las excretas, aguas, pastos, suelos, alimentos y vegetales al estado normal y en descomposición, etc. El conocimiento de esta flora, es obligatoria en los estudios microbiológicos, no sólo porque algunos géneros y especies ocupan destacada posición en la patogenia entérica de origen humano animal, sino porque también es una base fundamental en la sanidad pública y en el diagnóstico bacteriológico en general. Nos estamos refiriendo a los integrantes de la Familia Enterobacteriaceae, cuyo conocimiento racional y orgánico permite establecer el diagnóstico inmediato de las enfermedades entéricas, dictar las medidas de orden epidemiológico y establecer las causales de una serie de enfermedades entéricas, dictar las medidas de orden epidemiológico y establecer las causales de una serie de enfermedades intestinales, que forman un extenso capítulo de la patogenia infecciosa del país. Algunos autores afirman que la tercera parte de las excretas normales y secas, de origen humano, se componen de bacterias, en su mayoría muertas; de las cuales 9/10 partes de ellas corresponden a las denominadas bacterias Gram negativas, que en casi su totalidad de las Enterobacteriaceae y el décimo restante por microorganismos Gram positivos. Si esta proporción ha sido considerado en un individuo que consume un régimen alimenticio normal y mixto, es de suponer la alteración que sufriría esta relación por variación de la dieta, por la implantación de estos dos patológicos y disturbios intestinales, cuyos agentes son precisamente, los miembros de esta familia, agrupados en las tribus: Salmonella, Shigella, Proteus , y Colibacilo, que integran numerosos géneros y especies. II. OBJETIVO. - Hacer que el alumno recuerde las técnicas y procedimientos básicos de Microbiología General, para poderlos aplicar posteriormente en el control microbiológico de los alimentos. III. REVISIÓN DE LITERATURA. A las enterobacterias, se les describe como microorganismos Gram negativo no esporulados, móviles o inmóviles, provistos de flagelos en perítrico, que adoptan la forma de bacilos y cocobacilos; viven normal y patológicamente como huéspedes en el intestino del hombre y de los animales, se les halla en los alimentos en descomposición, excretas de origen humano y animal, en las aguas del albañal y emuntorios; en general viven saprofíticamente en las materias orgánicas en descomposición. Gran número de especies que integran esta familia son patógenas para el hombre y los animales; produciendo infecciones graves en forma individual, endémica y epidémica. Son diferenciados por sus reacciones bioquímicas, caracterizándose porque reducen invariablemente los nitratos a nitritos, con excepción de Erwinia; tienen reacción oxidasa negativa, fermentan glucosa con producción de ácido (A) o ácido y gas (ag); algunos géneros, como Proteus, descomponen precozmente la úrea, y la mayoría es fenilalanina negativo, con excepción de Proteus y Providencia. La fermentación de la lactosa, la tolerancia al cianuro de potasio, reacción frente a ácidos orgánicos, y la descarboxilación de los aminoácidos, se realizan en forma variable. Evidentemente que los microorganismos integrantes de la Familia de las Enterobacteriaceae, no producen citocromo-oxidasa, son Gram negativos y reducen los nitratos a nitritos, aún cuando estas reacciones deben ser cuidadosamente consideradas, pues la prueba de la citocromo-oxidasa es positiva para las Pseudomonas, Alcaligenes, Aeromonas y Vibrios. IV. MATERIALES Y METODOS. A) Coloración Gram a partir de una cepa marcada - Desengrasar un porta-objeto con alcohol y algodón. - Descolgar una gota de agua estéril, suspender en ella una pequeña cantidad de cepa problema y homogenizar. - Dejar secar y flamear suavemente la extensión para fijarla. - Cubrir con una solución del colorante primario, Cristal violeta u otro similar y dejar en contacto por espacio de 2 minutos. Lavar con agua de caño. - Cubrir con el mordiente o fijador y dejar en contacto por un minuto. Lavar. - Decolorar con la solución de Alcohol-Acetona (1:1). Lavar. - Cubrir con solución de contraste, safranina u otro similar y dejar en contacto por 30 segundos. Lavar. - Secar suavemente, agregar una gota de aceite de inmersión y observar al microscopio. Anotar los resultados. B) Galería Bioquímica de OxNiGLUMoCISKAD para Enterobacterias. A partir de una cepa marcada, efectuar las siguientes pruebas bioquímicas: - Reacción de la Oxidasa (Ox) - Reducción de los Nitratos (Ni) - Fermentación de la Glucosa (G) - Fermentación de la Lactosa (L) - Hidrólisis de la Urea (U) - Ensayo de Movilidad por cultivo (Mo) - Asimilación del Citrato (C) - Formación del Indol (I) - Formación del Acido Sulfhídrico (S) - Prueba de la Tolerancia al Cianuro de Potasio CNK (K) - Transformación de la Fenilalanina en Acido Phenil Pirúvico APP (A). - Descarboxilación de la lisina (D) C) Fundamento y procedimiento de las pruebas bioquímicas para la familia Enterobacteriaceae Constituida por gérmenes abastonados Gramnegativo, móviles (flagelos en perítrico) e inmóviles, Oxidasa negativos, Nitratos son reducidos a nitritos, todas fermentan la glucosa con o sin producción de gas, la diferencia de estas bacterias se basan en el comportamiento bioquímico, tratamiento recomendado por MOSSEL-QUEVEDO y llamado: Ox Ni G L U Mo C I S K A D OXIDASA (Ox) Llamada también Citrocromo Oxidasa; Es una enzima por la cual las bacterias que las poseen, oxidan la tetrametil-para-fenil-endiamina en Indol (azul). Prueba En una placa petri colocar un papel de filtro, humedecer este con el reactivo de Kovacs (solución de tetrametil-parafenil-endiamina al 1% en agua destilada). Preparar el reactivo inmediatamente antes de usarlo, debido a que se oxida con el aire y la luz. En la parte humedecida hacer una estría de cultivo joven (18 a 24 horas de incubación) de más o menos 5 mm. de longitud considerar la prueba como positiva, si en 5 segundos aparece un color azul intenso. Las enterobacterias no deben dar esta reacción. REDUCCIÓN DE NITRATOS (Ni) Las bacterias que poseen la enzima nitrato-reductasa, tienen la propiedad de reducir los nitratos a nitritos. Prueba Sembrar el germen a estudiar en agar o caldo nutritivo que contenga además 1/1000 de Nitrato de Potasio. Después de incubar a 37º/24 horas, añadir gotas de solución A y de solución B (Reactivo de Gries) o en su defecto reactivo sólido formado por ácido sulfanílico, ácido tartárico, y alfa-naftil-amina. La prueba es positiva si aparece color rojizo en ambos casos. Sino aparece dicha coloración agregar sobre el cultivo que contiene el reactivo, Zn o Mg en polvo; observar después de 10 minutos si la coloración es rojiza, considerarla como negativa ya que en el caso, son el Zn, Mg, y no el germen, es el que se ha reducido en nitratos. PRUEBA MEDIO CULTIVO Tº Y TIEMPO REACTIVO A RESULTADO DE INCUBACIÓN AÑADIRSE POSITIVO Tetrametil Ox -.-.- -.-.- parafenil Sin coloración endiamina Ni Caldo nitrato 37ºC X 24-48 H Reactivo gries Color rojizo G Agar glucosa 37ºC X 24-48 H Color amarillo L Agar lactosa 37ºC X 24-48 H Color amarillo U Caldo urea 37ºC X 24-48 H Color grosella intenso Mo Agar Movilidad 37ºC X 24-48 H Turbidez C Agar Citrato 37ºC X 24-48 H Color azul simmons Reactivo Anillo rojo I Caldo peptonado 37ºC X 24 H de kovacs grosella S Agar kligler 37ºC X 24 H Coloración negra Agar base + 0.1 Disco blanco en K 37ºC X 18-24 H ml de CNK 0.5% superficie A Agar fenilalanina 37ºC X 18-24 H Sal Férrica Color verde D Agar lisina fierro 35-37ºC X 24-48H Color púrpura FERMENTACIÓN DE GLUCOSA, LACTOSA Y PRODUCCIÓN de H2S (GLS) El H2S es formado por determinadas Enterobacterias, ya sea por desaminación de aminoácidos azufrados (tiosulfatos, sulfitos). En el medio, el H 2S formado, reacciona con la sal de Fe contenido en él y da sulfuro de fierro (FeS) de color negro. La prueba en condiciones aerobias, es reversible. Prueba y lectura. Se puede realizar en un sólo medio: Kligler (Hierro dos azúcares), en el cual la siembra se realiza por picadura profunda, y una estría en la superficie. Incubar a 37ºC, por 18 a 24 Horas. Parte inferior amarilla: Fermentación de Glucosa. Parte superior amarilla: Fermentación de Lactosa. Ruptura del medio: Producción de gas (Glucosa) Ennegrecimiento en la puntura de inoculación: H2S positivo. Indicador del medio: Rojo de fenol HIDRÓLISIS DE LA UREA (U) Las enterobacterias que poseen la enzima ureasa, hidrolizan la Urea, alcalinizando en esta forma el medio de cultivo, haciendo virar con ello el rojo de fenol, indicador de este, del anaranjado al grosella intenso (prueba positiva). Medio de cultivo: Caldo úrea DETECCIÓN DE MOVILIDAD (Mo) Prueba Como medio de cultivo se utiliza un medio semi-sólido (agar nitratado que lleva 3% de agar) distribuidos en tubos de "U" la siembra se realiza por puntura, introduciendo la aguja de Kolle 5 mm de profundidad, sólo en una de las ramas. Lectura Después de incubar a 37ºC por 24 horas, considerar la prueba positiva, si un enturbiamiento se extiende desde la rama cultivada a la otra. KNO3: Fuente de Oxígeno, necesaria para la movilidad del germen aerobio. ASIMILACIÓN DEL CITRATO (C) Las enterobacterias que utilizan el Citrato de Sodio como única fuente de Carbono, alcalinizan el medio agar Citrato de Simmons, haciendo virar el indicador azul de bromo timol, del verde al azul intenso. Para esta prueba hay que tener las siguientes precauciones: - Utilizar tubos nuevos, o bien los usados, esterilizado al calor seco para destruir allí los posibles restos de materia orgánica que pudiera contener. - Realizar siempre la siembra a partir de un medio sólido porque con medio líquido se arrastraría restos de materia orgánica. - Realizar la siembra en pequeña cantidad y trazando sólo una línea a lo largo de la superficie de inclinación. PRODUCCIÓN DE INDOL (I) Algunas enterobacterias, tienen la propiedades hidrolizar el aminoácido triptofano. Uno de los productos finales de esta degradación es el Indol. Prueba. Para detectarlo, a un cultivo de 18 a 24 Horas en caldo Peptonado, adicionar el reactivo de Kovacs para Indol. Prueba positiva: Anillo grosella en la superficie. TOLERANCIA AL CIANURO DE POTASIO (K) Prueba. Para determinar la resistencia de las diferentes enterobacterias frente al CNK; se realiza la siembra del germen a estudiar, en medio base al que se le ha colocado previamente 0.1 ml. de una solución al 0.5%. Se usan tubos de 8 x 160 mm., y se siembran tres usadas de más o menos 6 mm. de diámetro, a partir de un cultivo de 18 a 24 horas Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas como máximo. Lectura Prueba positiva: Disco blanco en la superficie del medio. Prueba negativa: Turbidez en la parte inferior, con una superficie completamente transparente, o ausencia total de desarrollo. PRUEBA DE ACIDO PHENIL PIRUVICO (A) La fenilalanina, es un aminoácido que determinadas enterobacterias pueden transformar en ácido phenil pirúvico. Prueba. Sembrar el germen a estudiar, en forma abundante (estrías) aminoácido en estudio. Después de la incubación a 37ºC por 24 horas, investigar en el medio la presencia de ácido fenil pirúvico, adicionando unas gotas de sal férrica (Cl 3Fe). Prueba positiva: Aparición inmediata de color verde. DESCARBOXILACIÓN DE LA LISINA (D) Ciertas enterobacterias pueden transformar por descarboxilación la lisina en Cadaverina, que por desaminación libera grupos amino (NH 2), bajo la forma de NH3, alcalinizando el medio de cultivo. Prueba. Esta prueba se realiza en el medio de Taylor, que lleva glucosa, lisina y púrpura de bromocresol como indicador del medio. Lectura. Después de incubar a 37ºC por 24 horas, considerar la prueba como positiva si el medio Violeta varía al color púrpura. Prueba negativa: medio de color amarillo, por fermentación de la glucosa. V. CUESTIONARIO. 1) Porqué las bacterias gramnegativas retienen el colorante de contraste, durante la coloración Gram. 2) Mencione diferencias entre bacterias Gramnegativas y bacterias grampositivas. 3) Describa a las bacterias entéricas y nombre a los géneros más representativos, dando características de cada uno de ellos. 4) Mencione las enfermedades que ocasionan algunos géneros de la familia Enterobacteriaceae. PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE DIFERENCIACIÓN PARA ENTEROBACTERIAS DIV GRUPO Ox Ni G L U Mo C I S K A D 1 Shigela - + + - - - - - - - - - Alkalencens-Dispar - + + +- - - - + - - - +- Escherichia - + +g +- - +- - +- - - - +- 2 Salmonella - + +g - - +- + - - +- - +* Arizona - + +g -+ - + + - + - - + Citrobacter - + +g +- - + + - + + - - Bethesda-Ballerup - + +g - - + + - + + - - 3 Enterobacter - + +g + -+ + + - - + - +- Hafnia - + +g - -+ - + - -+ + - + Klebsiella - + +g +- + - + -+ - + - + Serratia + +g -+ - + + - - + - - 4 Proteus vulgaris - + +g - + + +- + + + + - Proteus mirabilis - + +g - + + +- - + + + - Proteus morgani - + +g - +- + - + - + + - Proteus rottgeri - + +g - -+ + + + - + + - Providencia - + +g - - + + + - + + - De acuerdo a EDWARDS (1960) g = Presencia de gas +- = Normalmente positivo (+) -+ = Normalmente negativo (-) * = Excepción Salmonella paratyphi PRACTICA Nº 4. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS (Muestreo, Preparación de diluciones y Tipos de siembra). I. INTRODUCCIÓN. Importancia del contenido microbiano de los alimentos. - Alimentos Puros: Se encuentran Bacterias, Mohos, Levaduras, y otros. - Alimentos degradados: Que puede ser ácidos, alcalinos, Insípidos, mediante las cuales los alimentos se descomponen, y se producen toxinas (sustancias proteicas producidas por microorganismos patógenas). Es importante para el Análisis Microbiológico de los alimentos, Estado Higiénico, Conservación, Procesamiento, y Manipuleo adecuado de los alimentos. Muestra y Transporte - Agua: Superficial (ríos, lagos); Subterránea (puquianos, pozos); Potable, etc. - Alimentos líquidos: Bebidas alcohólicas, Bebidas no alcohólicas, Jugos y Néctares, Leches, y otros similares. Estos alimentos usan como empaque para su venta, envases tales como: Botellas, bolsas, cajas, etc. - Alimentos sólidos: La superficie de los alimentos es la puerta de entrada para que empiece el deterioro de éstos. - Alimentos gaseosos: Mediante la exposición de las placas con el medio de cultivo específico, al medio ambiente; se pueden encontrar coliformes, mohos y levaduras, bacterias viables. Transporte de las muestras.- Esta operación debe variar en lapsos de tiempo 6-12 horas antes de iniciarse el análisis, y mantener en refrigeración a rangos de 3 a 5ºC. Muestreo en la fábrica o planta: La extracción de la muestra será efectuada por personal profesional o un técnico bien entrenado, y cada vez que se realice el muestreo, la muestra irá acompañada de su informe con los siguientes datos: - Nombre del producto del que se extrajo la muestra. - Lugar, Fecha y Hora de la toma de muestra. - Procedencia de la muestra. - Temperatura de la muestra al momento de la extracción. - Condiciones y circunstancias pertinentes en el momento de la extracción de la muestra así como también el estado de los envases y medio ambiente en que se han mantenido estos. El número de muestras a extraer, se realizará de acuerdo al tamaño del lote, pero para ello se hará uso de las siguientes tablas: A. Cuando el tamaño del lote es pequeño: Tamaño de lote (N) Tamaño de la muestra (n) Hasta 90 02 90 a 150 03 151 a 280 05 181 a 500 08 501 a 1200 13 más de 1200 20 B. Cuando el tamaño del lote es grande: Tamaño del lote (N) Tamaño de la muestra (n) 600 a menos 06 601 a 2000 13 2001 a 7200 21 7201 a 15000 29 15001 a 24000 48 24001 a 42000 84 más de 42000 126 II. OBJETIVO. - Introducir en el estudiante, las operaciones básicas en el Análisis Microbiológico de los Alimentos. III.MATERIALES Y MÉTODOS. 1. Materiales. - Solución salina peptona (S. S. P.) - Agar Recuento u otro similar - Matraces de 100, 250, 500 ml. - Pipetas de 1, 2, 5, 10 ml. - Tubos de prueba de 12 x 160mm - Placas petri grandes - Mecheros - Muestra de alimentos. 2. Métodos. Muestreo en el laboratorio para el Análisis Microbiológico. - En Muestras líquidas. En estos casos, es necesario realizar un buen agitado con el fin de homogenizar bien la muestra, de manera que no haya fases diferenciadas en el líquido. También cabe indicar que no es necesario realizar una dilución inicial para efectuar al análisis microbiológico, pues este se realiza directamente a partir de la muestra original (m. o.), ya sea leche, agua, licores y bebidas en general, etc. - En muestras sólidas. En el caso de muestras sólidas es necesario diluir con una solución fisiológica, para poder efectuar el análisis; ya que directamente de la muestra sólida no se puede realizar dicho análisis. Para proceder al homogeneizado, se pueden elegir uno de dos, Tomar de 10 a 20 gr. de la muestra sólida para el análisis. Tendremos resultados más exigentes utilizando 20 gr., ya que el tamaño de la muestra es mayor con relación la flora deseada. Para someter la muestra ya homogeneizado, es necesario pesar exactamente dicha cantidad de muestra, extraídos de diferentes partes de la muestra en condiciones asépticas. El homogeneizado se realiza mezclando la muestra pesada con una solución fisiológica (por lo general solución salina peptonada), en volumen tal que sumada al peso de la muestra resulte 100 ml. el homogeneizado se efectúa vigorosamente mediante una licuadora, cuidando utilizar los vasitos en estado estéril, por tiempo no mayor de 3 minutos. El homogeneizado resultante se denomina solución madre (S.M.), que vendría a ser también la primera dilución, a partir de la cual se preparan las demás diluciones y los análisis microbiológicos respectivos. Preparación de las diluciones para el análisis microbiológico. Utilizando la muestra original (muestras líquidas), o la solución madre (muesta sólida homogenizada), se preparan las diluciones para lo cual se procede de la siguiente manera: Tomar con la ayuda de una pipeta estéril, un milímetro de la muestra original (líquido) o solución madre (homogeneizado), y llevar aun tubo de ensayo estéril conteniendo 9 ml. de la Solución Salina Peptonada (SSP) estéril, homogenizar; será la dilución 10 (-2), y así sucesivamente hasta obtener las diluciones requeridas. Composición de Solución Salina Peptonada Peptona............................. 1.0 gr. Cloruro de Sodio.............. 8.5 gr. Agua destilada.................. 1.0 L. Esterilizar a 120ºC por 15 minutos, debidamente repartidos en tubos de ensayo a razón de 9 ml. y en frascos erlenmeyer a razón de 90 ml.. Tipos de Siembra. a. Incorporación : 1.0 ml. de la dilución respectiva. b. Extensión : 0.1 ml. de la dilución respectiva. c. Estrías : - Por picadura profunda y estría superficial. - Por agotamiento de superficie IV. CUESTIONARIO. 1. Porqué se utiliza Solución Salina Peptonada (SSP), o suero Fisiológico en la preparación de diluciones?. 2. Cuál es la importancia de las diluciones?. 3. Para la toma de muestras de alimentos sólidos, líquidos, semilíquidos, gaseosos; ¿Qué materiales utilizaría?. De ejemplos de estos tipos de alimentos. 4. Fundamente, Porqué utilizaría y en qué casos, siembra por Incorporación, siembra por Extensión, siembra por Estrías; en los Análisis microbiológicos de los alimentos?. PRÁCTICA Nº 5. PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS MÁS USADAS EN EL CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS (Expresión Microbiológica de la población microbiana de los alimentos. Microorganismos Indicadores. Microorganismos Indicadores de la Higiene Inadecuada: Bacterias Aerobias Mesófilas Viables). I. INTRODUCCIÓN. 1) Expresión Microbiológica de la Población Microbiana de los Alimentos. - La población microbiana de los alimentos se expresa por un entero seguido de un decimal y multiplicando por 10, elevado a una potencia. Esa expresión en lo posible debe provenir de un promedio de resultados. Ejemplo: 4,5000 4.5 x 104 4,5600 4.6 x 104 - La población microbiana siempre está dada en número de colonias o microorganismos por gramo de muestra si la muestra es sólida o por mililitro si es líquida. Cuando la población es cero o cercana a cero, se expresa como nulo; y cuando la población está entre cero y uno, se dice menor que uno. - Cuando el análisis es cualitativo, es decir se investiga la presencia o ausencia de un microorganismo en un alimento y no la cuantía, el resultado se expresa como Negativo o Positivo, respectivamente. 2) Microorganismos Indicadores Todos los alimentos ya sean frescos o procesados, están sujetos a diversos factores de alteración, como consecuencia, se conservarán de acuerdo a como son o fueron tratados, manipulados, almacenados, etc., y de acuerdo a la eficiencia aplicado al procesamiento del alimento. De tal manera que existen grupos de microorganismos que nos indican por ejemplo mal procesamiento, deficiencia del almacenaje, condiciones higiénicas inadecuadas, contaminación fecal, tratamiento térmico inadecuado, etc. La presencia de estos microorganismos en cierto número se considera como índice de que el alimento fue tratado, conservado y manipulado en condiciones inadecuadas, que permitieron la llegada o resistencia y proliferación de microorganismos patógenos. A estos se les denomina MICROORGANISMOS INDICADORES. Los principales microorganismos indicadores son: a) Microorganismos de Higiene Inadecuada. b) Microorganismos Indicadores de la Contaminación Fecal. c) Microorganismos Indicadores de Procesamiento y Conservación Inadecuada. 3) Microorganismos Indicadores de Higiene Inadecuada. a. Las materias primas contaminadas, limpias, y desinfectadas incorrectamente o condiciones inadecuadas de tiempo/temperatura durante la producción o conservación de los alimentos o una combinación de estas circunstancias, se expresarán en un recuento alto de gérmenes viables. b. Por lo general, alimentos que contienen partes o sus constituyentes en descomposición, presentan cargas elevadas de alrededor de 10 6 a 108 microorganismos por gramo o mililitro. c. También se puede afirmar que los recuentos altos indican que el producto va a alterarse pronto. d. El número de bacterias aerobias estrictas y anaerobias facultativas mesófilas viables totales, es la prueba microbiológica más adecuada, como índice de higiene de los alimentos. NOTA: También es necesario advertir que existen casos en donde los recuentos altos carecen de significado como es el caso de las salchichas, encurtidos, quesos y otros productos lácteos, donde es natural una gran multiplicación de los microorganismos, ya que tiene lugar una "fermentación" o "maduración" del producto. e. El número de microorganismos viables, es el número de colonias que se desarrollan a partir de un g. o mL. de muestra sobre un determinado medio de cultivo. f. Preparación del medio de cultivo Agar Recuento (Plate Count). Triptona ................................................. 5.0 gr. Extracto de Levadura en polvo .................. 2.5 gr. Glucosa ................................................... 1.0 gr. Agar Agar ................................................ 15.0 gr. Agua destilada ........................................ 1.0 L. Después de la disolución de estos ingredientes, llevar el pH a 7.0 y luego esterilizar a 121ºC x 20 minutos. II. OBJETIVO. - Enseñar al estudiante el significado y las operaciones a seguir en la ejecución de la prueba microbiológicas más utilizadas en el control microbiológico de los alimentos. III. MATERIALES. 1. Materiales. - Placas petri, tubos de ensayo, pipetas de 1, 2, 5, 10ml, frascos erlenmeyer, licuadora, cuchillos y vaso de licuar. - Agar Recuento, SSP (Solución Salina Peptonada), Estufas de incubación, Mecheros. - Diversas muestras de alimentos. 2. Métodos. La forma de operar y calcular el recuento bacteriano es el siguiente: Mezclar en placas estériles 1 ml. de la serie de diluciones con 15 ml. del medio de cultivo, conservado a más o menos 50ºC. Luego de solidificado, adicionar una capa fina de medio de cultivo a manera de "capa selladora" (más o menos 5 ml). Luego incubar a 37ºC x 24 - 48 horas. Después contar el número de colonias que se han desarrollado en las placas petri que contienen entre 30 y 300 colonias, guardando siempre la relación de décimo entre las diluciones contiguas. Calcular el número de bacterias viables por ml. o gr. de muestra; el resultado debe ser expresado como: N = a x bn Donde: a, varía entre 1.1 - 9.9 b, es igual a 10 n, puede ser 2 ó más de 2 Ejemplo: 58'846,532 Se debe escribir: 5.9 x 107 ufc/g. ó ml. IV. CUESTIONARIO. 1. Reporte otros métodos de recuentos bacterianos, indicando fundamentos, operación y precisión. 2. Defina lo que es un factor de dilución. 3. Defina lo que es un microorganismo indicador. 4. Qué significa los límites de 30 a 300? 5. El análisis microbiológico de una muestra de harina de maíz, se obtuvo el siguiente resultado de Gérmenes Aerobios Mesófilos Viables (considere que analizó 18 g. de muestra). Lecturas Dil. Nº 1 Nº 2 S.M. Infin. Infin. -2 308 284 -3 28 76 -4 04 6 Calcule el número de colonias (ufc) por gramo de muestra. 6. Del análisis microbiológico de una muestra de agua se ha obtenido el siguiente resultado de Gérmenes Aerobios Mesófilos Viables (GAMV). Lecturas Dilución Nº 1 Nº 2 M.O. Infin. Infin. -1 629 Infin. -2 458 Infin. -3 222 531 -4 38 98 -5 3 11 Nota: La lectura Nº 2, se obtuvo de tubos de diluciones bien agitadas. Se pide: a) Encontrar el número de microorganismos por mL. de agua. b) Fundamentar el porqué de la elección de los datos para los cálculos. c) Discutir acerca de la importancia del agitado de la solución. 7. Por qué utiliza el pH 7.0 y una relación Temperatura/Tiempo de esterilización de 121º C x 20 minutos. PRACTICA N° 6. MICROORGANISMOS INDICADORES DE LA CONTAMINACION FECAL (Enterobacterias: Coliformes, Colifecales, y E. coli; y Streptococcus del grupo “D” de Lancefield). I. INTRODUCCIÓN. Los microorganismos indicadores de la contaminación fecal, principalmente son: Enterobacterias totales, Coliformes, Echerichia Coli, y Streptococcus del grupo de D de Lancefield; por cuanto normalmente se les encuentra en el tracto digestivo del hombre y de animales de sangre caliente. A) ENTEROBACTERIAS TOTALES. La Enterobacterias, son un conjunto de microorganismos que integran la flora microbiana del intestino del hombre y de los animales que poseen las siguientes características: Son bacilos gram negativos no esporulados; Son móviles e inmóviles, provistos de flagelos en peritrico; Se les diferencia por sus reacciones bioquímicas y que se caracterizan porque todas reducen los nitratos a nitritos, con excepción de Erwinia sp., tiene reacción oxidasa negativa, fermentan la glucosa con reducción de ácido(A) o ácido y gas(AG); Algunos gérmenes descomponen precozmente la urea; La mayoría son fenilalanina negativa, con excepción del proteus y providencia; La fermentación de la lactosa, la tolerancia al Cianuro de potasio, y la descarboxilación de los aminoácidos, se realizan en forma variable. Las reacciones bioquímicas de las Enterobacterias, son mayormente utilizadas con la finalidad de investigar y detectar Salmonella sp, en los alimentos. B) COLIFORMES. El termino coliforme, comprende los géneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, y Citrobacter, y se caracterizan por utilizar la lactosa como fuente de carbono. Los coliformes distintos a la E. coli, persisten en el suelo o sobre las superficies, tales como los granos, frutas y otros productos del campo. C) COLIFECALES. Son un grupo de microorganismos procedentes de la incubación del inoculo a la temperatura de 44 a 45.5° C, que contienen por lo general un alto porcentaje de E. coli tipo I y II, por lo que son muy indicativos de la contaminación fecal. D) Escherichia coli. Este microorganismo habita naturalmente en el tracto digestivo del hombre y de otros animales de sangre caliente. La presencia de este microorganismo en un alimento dado se interpreta como contaminación directa o indirecta de origen fecal, por lo que se considera a la E. coli como el indicador clásico de la presencia simultánea de bacterias patógenas entéricas, entre ellas, Salmonella tiphy, otras Salmonellas, Shigella, Vibrios, parásitos diversos, y virus entéricos. Sin embargo la presencia de E. coli en un alimento no indica que existan también necesariamente gérmenes patógenos, sino simplemente advierte el riesgo de que pudieran estar presentes. E) Streptococcus del grupo “D” de Lancefield: El grupo “D” de Lancefield incluye además, de los enterococos, especies menos resistentes, tales como los Streptococcus bovis y Streptococcus faecalis. Los enterococos, se encuentran normalmente en las heces de mamíferos y humanos, como demuestran los estudios realizados por Buttiaux y Mossel en 1961, en el que llaman la atención sobre el valor de los alimentos no industrializados, es decir brutos de la asociación entre el grupo “D” de Streptococcus y las bacterias del grupo Coli-aerógenes, como indicadores de la contaminación fecal. La presencia de un gran número de enterococos en un alimento significa una calidad microbiológica dudosa (excepto en los casos en que se haya utilizado cepas específicas para la fermentar el alimento), ya que su presencia indica, bien la exposición del mismo, a condiciones que pudieran haber permitido una amplia multiplicación de muchas especies no deseables, o la deficiencia en las prácticas sanitarias. Los enterococos pueden tener un papel muy importante como indicadores de una limpieza y desinfección deficiente en las plantas y fábricas de los alimentos, a causa de su gran resistencia a la desecación, a las altas temperaturas, a los detergentes y a los desinfectantes. Debido a su mayor resistencia a la congelación, los Streptococcus se prefieren como microorganismo indicadores de la falta de limpieza y su desinfección de los alimento congelados y de modo semejante pueden ser muy indicativos en los alimentos que fueron tratados por el calor o deshidratado, procesos que destruyen organismos indicadores más sensibles, tales como las Enterobacterias. Justamente, esta resistencia es la razón de la impresión de estos cocos como indicadores generales de la contaminación fecal ya que pueden sobrevivir en condiciones adversas , lo que significa que guardan escasa relación la posible presencia de agentes patógenos mucho menos resistentes, tales como la Salmonella spp. y Shigella spp., que aun cuando hubiesen llegado al mismo tiempo que los cocos al alimento, posiblemente no habrían sobrevivido. En conclusión, podemos considerar lo siguiente: - Las Enterobacterias totales, son indicadores de los métodos de limpieza y desinfección de superficies en las fábricas de alimentos y de calidad higiénica de los componentes de los alimentos. - La E. Coli, es un buen indicador de la contaminación fecal para la mayoría de los alimentos. - Los demás coliformes, son buenos indicadores de una limpieza y de infecciones no adecuadas o de una industrialización o procesamiento no correctos de los alimentos. - Los Coliformes fecales, tienen una mayor probabilidad de contener gérmenes de origen fecal, por lo que son organismos indicadores mucho más seguros de la contaminación fecal que los Coliformes totales. - Los Enterococos, son indicadores de limpieza y desinfección deficientes en las plantas y fábricas de alimentos (alimentos congelados y desecados). MEDIOS DE CULTIVO: Los medios de cultivos en la siguiente práctica son los siguientes: A) Para Enterobacterias. Método de Recuento en placas. Agar Mac Conkey, por el método de recuento en placas. Se debe añadir a la fórmula del Agar Mac Conkey, 10 g. de glucosa. Cuando se trata de determinar la presencia de Salmonella spp., se produce de otra manera, ya que la presencia en los alimentos de cualquier serotipo de Salmonella, es potencialmente peligrosa como fuente de enfermedad para el hombre, bien de modo directo por el consumo de estos alimentos o indirectamente mediante la contaminación secundaria de utensilios, de equipos para el tratamiento e industrialización de los alimentos o de otros alimentos. B) Para Coliformes.- Método de Recuento en placas. Agar Rojo Violeta con Sales Biliales (VRBA), que tiene la siguiente composición: - Cristal Violeta 2.0 mg. - Rojo Neutro 30.0 mg. - Extracto de levadura en polvo 3.0 gr. - Sal Bilial N°3 1.5 gr. - Lactosa 10.0 gr. - Cloruro de sodio (Na Cl) 5.0 gr. - Peptona 7.0 gr. - Agar Agar 15.0 gr - Agua destilada 1.0 L Después de la disolución llevar el pH del medio a 7.3. El calentamiento se realiza a más o menos 100°C para la disolución de los ingredientes, al eliminar las bacterias vivas que pueden dificultar la numeración de Coliformes, hace que no haya necesidad de esterilizar el medio , solo se le conserva a 50 – 60°C después de lograrse la disolución. Este método permite enumerar no solamente los bastones Gram (-) que fermentan la lactosa (denominada bacterias coliformes o coli-aerógenes), como la E. coli, Citrobacter freundii, Enterobacter aerógenes, etc., sino también las bacterias intestinales lactosa (+), conocidas como Colifecales, patógenas indeterminados, como la Salmonella, Arizona, Shigella, y las especies denominadas “Paracolobactrun”. El medio se caracteriza porque lleva consigo un colorante apropiado y sales biliales que van a inhibir el desarrollo de las bacterias que no sean Coliformes. C) Para Coliformes totales, Coliformes fecales y Escherichia coli.- Método de Numero Más Probable (NMP). 1) Prueba Presuntiva, para determinar Coliformes Totales. Para esta prueba se utiliza el Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis al 2% (CLVBB) a doble y simple concentración. - Verde Brillante 15.0 mg. - Peptona 10.0 gr. - Lactosa 10.0 gr. - Bilis deshidratada 20.0 gr - Agua destilada 1.0 L Esta fórmula es a simple concentración, para obtener doble concentración, se adiciona el doble de cada componente en un litro de agua destilada. Después de la disolución llevar el pH a 7.0 – 7.2 y repartir en tubos de ensayo a razón de 9.0 ml. Provistos de una campana Durham y esterilizar a 121°C x 15 minutos. 2) Prueba Confirmativa o Test de Eijkman, para determinar Colifecales. Se utilizan Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis al 2%(CLVBB) a simple concentración, y Caldo Peptonado , cuya composición es la siguiente: - Peptona o Triptona 10.0 gr. - Cloruro de sodio 5.0 gr - Agua destilada 1.0 L. Después de la disolución llevar el pH a 7.0 y repartir a razón de 5.0 ml. por tubo de ensayo y esterilizar a 121°C por 20 minutos. 3) Prueba Bioquímica IMViC, para determinar E. coli; se utilizan los medios de cultivo. -Medio Politrópico Kligler. Después de la disolución llevar el pH a 7.4, repartir en tubos de ensayo y esterilizar a 121°C x 20 minutos; luego dejar solidificar en posición inclinada bajo la forma de “pico de flauta”. -Medio para ver la formación del Indol. Se utiliza el caldo Peptonado o Triptonado. -Medio para la reacción del Rojo de Metilo. -Medio para la reacción de Voges ProsKauer. Para las dos reacciones se utiliza el mismo medio (MR-VP) y es inútil el ajuste del pH, repartir en tubos de ensayo esterilizar a 121°C x 20 minutos. -Medio para asimilación del Citrato. Se utiliza como medio el Citrato de Simmons. Después de la disolución llevar al pH a 6.8, luego repartir en tubos de ensayo y esterilizar a 121°C x 20 minutos; dejar solidificar bajo la forma de “pico de flauta”. D) Para Streptococcus del grupo “D” de Lancefield.- Método de Número Más Probable (NMP). Caldo glucosado con azida de sodio, para la prueba presuntiva para Streptococcus del grupo “D” de Lancefield; cuya composición es: - Triptosa 15.0 gr - Extracto de carne en pasta 4.5 gr - Glucosa 7.5 gr - Cloruro de Sodio 7.5 gr - Azida de Sodio 0.2 gr - Purpura de Bromocresol 15.0 mg. - Agua destilada 1.0 L. Después de la disolución de los ingredientes, llevar el pH a 7.2 y repartir 9.0 ml., por tubo de ensayo y esterilizar a 121°C x 15 minutos. Este medio se caracteriza porque contienen la azida de sodio, que inhibe el crecimiento de la mayor parte de otras bacterias que no sean Streptococcus. El método a utilizar es el del NUMERO MAS PROBABLE (NMP), de manera similar que para la determinación Escherichia coli. Caldo Violeta de Etilo con azida de sodio (caldo EVA), para la prueba confirmativa para Streptococcus del grupo “D” de Lancefield; cuya composición es: - Triptosa 20.0 gr - Glucosa 5.0 gr - K2HPO4.3H2O 2.7 gr - Azida de Sodio (NAN3) 0.4 gr - Violeta de etilo 0.83 mg - Purpura de Bromocresol 15.0 mg - Agua destilada 1.0 L. Después de la disolución llevar el pH a 7.2 y repartir 9.0 ml. Por tubo de ensayo y esterilizar a 121°C por 15 minutos. En este medio, la azida de sodio y la violeta de etilo, actúan como inhibidores estrictos de toda bacteria que no sea Streptococcus del grupo “D” de Lancefield. II. OBJETIVO. Enseñar al estudiante las técnicas e interpretación de los microorganismos indicadores de la contaminación fecal en los alimentos. III. MATERIALES Y METODOS. 1) Materiales. Placas Petri, tubos de ensayo, pipetas de 1, 2, 5 y 10 mL., frascos Erlenmeyer, licuadora, cuchillos, vaso de licuar, mortero y pilón, estufas de incubación, baño maría eléctrica, Agar Rojo Violeta con Sales Biliales (VRBA), Agar Mac Conkey, Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis al 2%(CLVBB) de doble y simple concentración caldo Glucosado con azida de sodio de doble y simple concentración, Caldo Violeta de Etilo con Azida de Sodio, y muestras de alimentos sospechosos. 2) Procedimiento. Para el recuento de Enterobacterias. La forma de sembrar es como sigue: Mezclar en placas petri estériles 1.0 mL. De la serie de diluciones con más o menos 15.0 mL. Del Agar Mac Conkey. Dejar enfriar hasta la solidificación, luego recubrir la mezcla con más o menos 5.0 mL. del medio de cultivo. Luego de solidificado, incubar a 37°C por 24 – 48 horas. Pasando el tiempo de incubación, contar las colonias de las placas que contienen entre 30 y 300 colonias. Tanto en colonias violetas con precipitado rojo violeta, como aquellas transparentes, amarillentas verdosas y deducir el número de Enterobacterias por gr. o mL. de muestra. Para el recuento de coliformes. Mezclar en placas Petri esteriles, 1.0 mL. De la serie de disoluciones con más o menos 15.0 mL. Del medio de cultivo, y mezclar. Una vez solidificado recubrir la mezcla con más o menos 5.0 ml del medio estéril. Luego llevar a incubación a 37°C x 24 – 48 horas: luego de este tiempo contar las colonias de las placas que contienen entre 30 – 300 colonias, el número de colonias violeta rodeadas de un precipitado rojo violeta, y deducir el número de coliformes por gramo o mililitro de muestra. C). Para Coliformes, Colifecales y E. coli. Método de Número Más Probable (NMP). 1) Para Coliformes Totales. - Pipetear tres veces 10 mL. del homogeneizado del alimento, en tres tubos de ensayo con CLVBB al 2% de doble concentración. - Pipetear tres veces 1 mL. del homogeneizado en tres tubos de ensayo con CLVBB al 2% a simple concentración. - Pipetear tres veces 1 mL. de cada uno de las diluciones siguientes del homogeneizado en tres tubos de ensayo con CLVBB al 2% a simple concentración. - Agitar cada tubo de ensayo e incubar a 36- 37°C x 24 – 48 horas. - Pasado el tiempo de incubación, anotar los tubos de ensayo que muestren producción de gas más de 1/3 del volumen de la campana de Durham. - Elegir la dilución más alta (la más diluida), en la que sean positivos de formación de gas los tres tubos y las dos diluciones superiores (más diluidas) más próximas. Si esto no es posible, a que ninguna de las diluciones trabajadas presentan tres tubos positivos, seleccionar las tres últimas diluciones y anotar el número de diluciones y anotar el número de tubos positivos de cada una. Por ejemplo: Si las tres últimas diluciones positivas fueron 1:100, 1:1000, y 1:10000; y el número de tres tubos positivos en cada dilución fuera: 3 – 1 – 0, el resultado se anotaría del siguiente modo: Diluciones: 1: 100 =3 1: 1000 =1 1: 10000 =0 Este valor 3 – 1 – 0, se busca en la tabla del NMP, de tres alícuotas; y nos dará la población de coliformes totales. La población se calcula de la siguiente manera: Lectura: 3 – 1 – 0 (1:100, 1:1000, 1; 10000). Valor de la Tabla del NMP: 43 Dilución intermedia: fd(i) = 1000 NMP Población/gr. o mL. = --------- X fd (i) 100 43 2 N° = --------- X 1000 = 430 = 4.3 X 10 UFC /g. o mL. 100 Nota: Estos cálculos han sido realizados considerando que se analizaron 10 Unidades de muestra problema. 2) Para determinar el Número de Colifecales. Se sigue el Test de Eijkman, compuesto por dos tubos de ensayo conteniendo CLVBB al 2% a simple concentración, uno y caldo Peptonado (CP) el otro, en los que siembran por azadas el inoculo de cada tubo positivo de la prueba anterior, luego se incuban en Baño María a 44°Cx 24 horas. Para el cálculo se anotan los tubos de CLVBB al 2 % con formación de gas (aquí no interesa ya la condición de más de 1/3 del volumen de la campana, suficiente con que haya igual o cercado a 1/3 de gas) y su respectivo CP con formación de Indol (formación de anillo rojo grosella con tres gotas de reactivo de Kovac´s). Cualquier variación contraria, se considera prueba negativa. Luego del triple número obtenido, se logra el valor respectivo de la tabla de NMP y se procede igual que para el anterior caso visto. 3) Para determinar E. coli. Para determinar E. coli, se hace uso de la galería Bioquímica de IMViC; a partir de los tubos positivos con CLVBB al 2% procedentes del Test de Eijkman, se siembran unas azadas por picadura profunda y estría superficial en el medio Politrópico de Kligler Irón Agar, y se incuban a 37°Cx24 horas. Seguir trabajando solo con aquellos tubos con Kligler que hayan virado al “amarillo” la parte superior a todo el medio (lactosa positivo).Descartar aquellas que presenten además un precipitado negruzco o la parte superior del tubo o todo el medio de color rojo. De los Kligler positivos, se siembran por azadas en 4 tubos que contienen: Caldo Peptonado, caldo Rojo de Metileno, Caldo Voger Proskauer, y Agar Citrato de Simmons; luego se incuban a 37°Cx24 horas. Se consideran para las lecturas los siguientes resultados: - Caldo Peptonado (l). Se investiga la formación de Indol formando después de la incubación, agregando gotas de reactivo de Kovac´s y agitando en seguida. La reacción es positiva si la fase alcohólica esta coloreada de rojo claro u oscuro y constante. - Caldo Rojo de Metilo (M). Después de haber incubado la siembra a 37°C por 24 horas, agregar 5 gotas de una solución al 0.04% de rojo de metilo. La reacción se considera positiva, si la coloración es roja y negativa si es amarilla. - Caldo Voges ProsKauer (Vi). Caracteriza gérmenes que producen Acetil Metil Carbinol (AMC) a partir de glucosa que lleva el medio de cultivo. Al Acetil Metil Carbinol, se reconocen oxidándolo a diacetil. Al tubo con el medio respectivo inoculado e incubado a 37°C por 24 horas, se le agrega unos mgs. de creatina p.a y 0.5 mL. de una solución de soda al 40% y agitar fuertemente por 3 minutos. La reacción es positiva, si la coloración rojo carnil aparece al cabo de 10 minutos. (La lectura se puede hacer solo con KOH, pero la creatina se utiliza como estabilizador). - Agar Citrato de Simmons (C). Una vez sembrada el inoculo por estría superficial en el Agar citrato de Simmons inclinado, e incubado a 37°C por 24 horas; la reacción es positiva si el medio presenta una coloración azul. Luego de los resultados obtenidos (confirmados según IMViC en la tabla N°1), se logra el valor de la tabla del NMP, para después calcular la poblacion de E. coli, en la muestra problema, de manera similar que los anteriores. Tabla N° 1 ============================================ I M Vi C Escherichia coli + + - - Enterobacter aerógenes - - + + (O Aerobacter aerógenes). Citrobacter -+ + - + Klebsiella -+ - + + D) Para Streptococcus del grupo “D” de Lancefield. Sembrar en los tubos con el medio estéril, la serie del Número más probable, cuya técnica ya la hemos desarrollado anteriormente, e incubar a 37°C x 24 – 48 horas. La reacción se considera positiva, cuando los tubos presentas una acidificación (viran del rojo purpura al amarillo), las que posteriormente, para su confirmación, se siembran inóculos de estos tubos sospechosos, por azadas, en un medio liquido selectivo denominado caldo Eva e incubarlo a 37°C por 24 horas. La prueba se considera positiva, si en el fondo del tubo con caldo EVA con el inoculo, se observa un precipitado blanco violeta y redondo que da la impresión de ser una pastilla. TABLA Nº 2: TABLA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) DE MC CRADY TUBOS POSITIVOS ÍNDICE DEL NMP Limite Confianza (95 %) 10ml 1.0ml 0.1ml POR 100 ml Inferior Superior ---------------------------------------------------------- 0 0 1 3 0.5 9 0 0 2 6 0 0 3 9 0 1 0 3 0.5 13 0 1 1 6 0 1 2 9 0 1 3 12 0 2 0 6 0 2 1 9 0 2 2 12 0 2 3 16 0 3 0 9 0 3 1 13 0 3 2 16 0 3 3 19 1 0 0 4 0.5 20 1 0 1 7 1.0 21 1 0 2 11 1 0 3 15 1 1 0 7 1.0 23 1 1 1 11 3.0 36 1 1 2 15 1 1 3 19 1 2 0 11 3.0 36 1 2 1 15 1 2 2 20 1 2 3 24 1 3 0 16 1 3 1 20 1 3 2 24 1 3 3 29 2 0 0 9 1.0 36 2 0 1 14 3.0 37 2 0 2 20 2 0 3 26 2 1 0 15 3.0 44 2 1 1 20 7.0 89 2 1 2 27 2 1 3 34 2 2 0 21 4.0 47 2 2 1 28 10 150 2 2 2 35 2 2 3 42 2 3 0 29 2 3 1 36 2 3 2 44 2 3 3 53 3 0 0 23 4 120 3 0 1 39 7 130 3 0 2 64 15 380 3 0 3 95 3 1 0 43 7 210 3 1 1 75 14 230 3 1 2 120 30 280 3 1 3 160 3 2 0 93 15 380 3 2 1 150 30 440 3 2 2 210 35 470 3 2 3 290 3 3 0 240 36 1300 3 3 1 460 71 2400 3 3 2 1100 150 4800 3 3 3 1100 más --------------------------------------------------------------------------------------------------- IV. CUESTIONARIO. 1. Que finalidad tienen las diluciones? Donde se requieren más diluciones, en una muestra fresca o en una muestra procesada). Porque?. 2. Defina lo que es un microorganismo indicador de la contaminación fecal, y cuál es la importancia en los alimentos?. 3. Exponga todo acerca de la influencia de los microorganismos indicadores de la contaminación fecal en la salud del hombre. 4. Qué le indicaría la presencia en gran número de Streptococcus del grupo “D” de Lancefield y de coliformes en un alimento procesado, y otro caso donde solo se observa una gran población de Streptococcus del grupo “D”?. 5) Describa la función que desempeñan cada uno de los medios de cultivo descritos en la presente práctica. 6) Reporte el fundamento de la tabla del NMP de MC Crady. 7) Analizando 15 g. de una muestra de tomate, en la investigación de la contaminación fecal se ha encontrado el siguiente resultado: Medio VRBA Dilución L - 1 L - 2 S.M. inf. 786 -2 589 286 -3 68 43 -4 13 8 Encontrar el número de Coliformes por gramo de muestra, y fundamente la elección de sus datos para sus cálculos. PRÁCTICA No 7. MICROORGANISMOS INDICADORES DE PROCESAMIENTO Y CONSERVACIÓN INADECUADA (Numeración de: Clostridium Sulfito Reductor; Staphylococcus aureus; Bacillus spp.; y Hongos (Mohos y Levaduras); e Investigación y Detección de Salmonella spp.). I. INTRODUCCIÓN. La presencia de Clostridium en los alimentos, por lo general indica, que posiblemente el tratamiento térmico fue insuficiente para destruir las esporas de Clostridium, que pudiera hallarse, por ejemplo, si se trata de un alimento enlatado, indicaría insuficiente trato en la destrucción de las esporas de Clostridium botulinum que pudieran estar presentes. En los alimentos refrigerados o desecados, la presencia de Clostridios en número anormalmente elevado, o en proporción realmente alta de la población bacteriana total, pudiera indicar un peligro por parte, tanto de Clostridium perfringens, como de Clostridium botulinum. El Staphylococcus aureus, es utilizado como indicador de la contaminación a partir de la piel, boca y de las fosas nasales, de los manipuladores de alimentos; como también del material y equipo mal limpiado. Cuando se encuentra un gran número de estafilococos e un alimento significa que la temperatura de conservación no ha sido adecuada, así como tampoco la limpieza y desinfección de los utensilios. En lo que se refiere a la población de Bacillus, son aerobios y están presentes normalmente en el suelo y en la materia en descomposición de origen animal y vegetal, varios producen una sustancia viscosa en medios que contienen sacarosa. Varían los caracteres fisiológicos, ya que hay aerobios estrictos y especies que son anaerobios facultativos. Un pequeño número de termófilo, en los cultivos viejos puede verse formas Gram negativos y algunas especies, se describen mejor como “Gram indefinida”. Aparte del Bacillus cereus, el organismo que causa alteración de los alimentos y de B. anthracis, la identificación de otras especies es extraordinariamente difícil. El Bacillus cereus, es potencialmente productor de una forma leve de intoxicación alimentaria semejante en síntomas y en periodo de incubación a la determinada por el Clostridium perfringens. En este caso, no ha sido demostrada la sustancia casual. Este germen es común en el suelo, la vegetación y en muchos alimentos, brutos o manufacturados. Thatcher (1972) indica que, "el principal factor que influye en la proliferación de este microorganismo, que determina casos de intoxicación únicamente cuando se encuentra en gran número en el alimento, es la refrigeración inadecuada de los alimentos proteicos cocinados de alto contenido de humedad”. Una población de Bacillus cereus de menor a 10 mos/g. en los alimentos, no es prueba suficiente que permita concluir que este organismo es la causa de un caso o brote de intoxicación alimentaria. La flora de mohos y levaduras, en proporciones elevadas indica mal tratamiento, manipuleo y protección inadecuada del alimento. La presencia de cualquier serotipo de Salmonella, es potencialmente peligroso como fuente para el hombre, bien de modo directo para el consumo de estos alimentos o indirectamente mediante la contaminación secundaria de utensilios, de equipos para el tratamiento e industrialización de los alimentos. Esto serotipos de salmonella, producen la salmonelosis, que es una enfermedad que afecta al tracto-intestinal, siendo más grave en niños y ancianos. Esta infección se caracteriza por temperaturas elevadas, diarrea, a veces tan intensa que determina una gran deshidratación, dolores intestinales y vómitos. La causa más frecuente de la Salmonelosis; es el consumo de alimentos contaminados, otra viene a ser el de los portadores, que generalmente son aquellos manipuladores de los productos contaminados y los pacientes que sufren de Salmonelosis. En las fábricas y plantas, donde se tratan y se industrializan los alimentos, estos productos se determinan a parir de otros alimentos no tratados, a partir del aire del ambiente, o por contacto con superficie en la que se depositaron restos en polvo de ingredientes alimenticios, tales como los productos derivados de los huevos. La moderna tecnología de producción en masa e los alimentos y la distribución de estos en grandes zonas, son factores que pueden ocasionar innumerables brotes de enfermedades en poblaciones numerosas. Para evitar estos problemas de contaminación, es preciso adoptar en las industrias donde se manipulan productos contaminados con estos gérmenes, medidas adecuadas de higiene. II. OBJETIVO. Enseñar al estudiante la interpretación de los procedimientos microbiológicos para la numeración de Clostridium, Staphylococcus aureus, Bacillus spp, y Hongos (Mohos y levaduras); e Investigación y Detección de Salmonella spp. en diversos alimentos. III. MATERIALES Y METODOS. 1) Materiales: - Muestras de alimentos sospechosos - Tubos de ensayo, placas Petri, mecheros, pipetas, y otros. - Solución Salina Peptonada en frascos Erlemmeyer y en tubos de ensayo. - Agar sulfito de hierro, Parafina o agar simple al 15 %. - Medio Oxitetraciclina Glucosa Agar (OGA) en placas. - Agar Baird Parker en placas - Agar Dextrosa Triptona o Agar Dextrosa Peptona. - Caldo Manitado (simple y doble concentración) en frascos. - Caldo Selenito, Caldo Tetrationato Base, Agar Kligler. - Agar Desoxicolato Citrato, Agar Salmonella Shigella, Agar Bismuto Sulfito. - Galeria Bioquimica OxNiGLUMoCISKAD. 2) Métodos y Procedimiento. a) Toma de muestra. Proceder de la siguiente forma en condiciones asépticas. - Pesar 10g de la muestra homogenizar en 90 ml de SSP estéril, para después preparar las diluciones requeridas, donde se estudiara la población de Clostridium, Staphylococcus aureus, Bacillus spp., Hongos (Mohos y Levaduras). - Pesar 25g de muestra problema y se investigará la presencia de Salmonella spp. b) Numeración de Clostridium Sulfito Reductores. - Llevar 1mL de cada dilución de la muestra problema (o lo indicado por el profesor), a tubos grandes y estériles a los cuales previamente se les ha añadido 4ml, de agua estéril, pasteurizar a 80°C por 10 minutos enfriar bruscamente en agua helada y adicionar el Agar Sulfito de Hierro (previamente enfríado a 40 – 45°C), homogenizar, luego enfriar inmediatamente y finalmente añadir una capa de agar blanco estéril (más o menos 5ml), dejar solidificar incubar a 37°C por 3-5dias. Contar las colonias que desarrollan tomando un color negro intenso. Los límites para el recuento de colonias en estos tubos son 5 y 50; por tanto, MENOS A 5 COLONIAS ES CERO, Y MAYOR A 50 COLONIAS ES INFINITO. Los cálculos y las expresiones de estas poblaciones se realizan de la misma forma que para los recuentos en placas. Agar Base - Triptona 15.0 g. - Extracto de Levadura 10.0 g. - FeSO 4 7 H2O 0.2 g. - Agua destilada 1.0 L. Disolver en baño maría y ajustar el pH a 7.0; esterilizar a 121°C por 20 minutos y conservar a 50°C aproximadamente. 10 ml de solución de sulfito. - Solución al 5% de Na 2 SO3 7H2O, que se esteriliza por filtración y se prepara inmediatamente antes del empleo. 10 ml de solución de polimixina. - Disolver el contenido de una ampolla de 50 mL. de Sulfato de Polimixina B en 50 mL. de agua destilada estéril. c) Numeración de Hongos (Mohos y Levaduras). -Llevar 0.1mL de cada disolución en otras tantas placas Petri conteniendo el medio OGA (Oxitetraciclina Glucosa Agar) estéril y solidificado. Extender sobre la superficie del medio con la ayuda de una espátula de Drigalsky. Incubar a temperatura de 22°C o al medio ambiente por 3 a 5 días. Al cabo de este tiempo realizar el recuento de Mohos (colonias filamentosas) y el de levaduras (colonias pastosas y brillosas), por separado los límites para el recuento de colonias debe ser ente 3 - 100 colonias. Los cálculos y expresiones de la población se realizan de forma instruida anteriormente. Los componentes de la Oxitetraciclina Glucosa Agar con los siguientes: - Extracto de levadura en polvo 5.0 g. - Glucosa 20.0 g. - Agar Agar 20.0 g. - Agua destilada 1.0 L. Disolver en Baño María y Esterilizar a 121°C por 20 minutos y conservar a 50°Caproximadamente. Agregar en condiciones Estériles, 100ml de una solución acuosa al 0.1% de Oxitetraciclina bajo la forma de terramicina, recientemente preparada y esterilizada por filtración. Repartir en placas petri estériles. Identificación de mohos y levaduras: Cuando se quiere identificar el moho, se procede a aislar las células respectivamente en láminas portaobjetos estéril es conteniendo una capa fina de medio OGA, sobre la que se inocula el moho a estudiar, luego se cubre la superficie con una lámina cubre-objeto estéril; convenientemente acomodado en el interior de una placa Petri estéril, se incuba a 22°C o al medio ambiente por 3-5 días. MICRO CULTIVO EN CÁMARA HÚMEDA. Si el interés del investigador se centra en la población de las levaduras, de características macroscópicas convenientemente definidas y anotadas (color, altura, forma, aspecto, tamaño, radio, etc.), se aísla en tubos de ensayo que contienen agar OGA inclinado, realizando con el fin de obtener una cepa de cada levadura. Se les incuba a 22°C o al medio ambiente por 3-5 días las cepas desarrollas, se someten a tres pruebas, para la determinación de su identidad. Pruebas de la fermentación de los azúcares. - se utiliza los siguientes azucares: sacarosa, glucosa, rafinosa, maltosa, galactosa y fructuosa; que se preparan de acuerdo a la siguiente composición: - Extracto de levadura en polvo 5.0 g. - Azúcar que se desea estudiar 10.0 g. - Agua destilada 1.0 L. Después de la disolución de los ingredientes, repartir en tubos provistos de campana de durham, más o menos 5 – 7 mL. del caldo azucarado y esterilizar a 121°C por 15 minutos. La cepa en estudio se siembra por suspensión es estos azucares, con la ayuda de un asa de kolle. Se incuba a 22 - 26°C por 3 - 5 días. Al cabo de este tiempo se observará una variación de PH y producción de gas carbónico en las campanitas de durham. Los resultados obtenidos se comparan con las tablas de identificación de algunos autores, especialmente el de JORGENSEN-HANSEN (1959). Prueba de la asimilación de nitratos.- Para esta prueba se utiliza el siguiente medio: -PO4KH2 0.10% -MgSo4.7H2O 0.05% -Glucosa 2.00% -Agar agar 2.00% -Nitrato de Potasio 1.00% Se disuelve los ingredientes en baño maría y se esteriliza a 121°C por 20 minutos, luego se reparten en placas petri estériles. Una vez solidificado el medio, se siembra la cepa de levadura por estría y se incuba a 22 - 26°C por 3 – 5 días. La misma operación se realiza en forma paralela en las placas que contienen el mismo medio, pero sin “Nitrato de Potasio” y con adición de peptona al 1%. El objetivo es que la peptona constituya un medio nutritivo excelente para levaduras y desarrollo que estas tengan aquí, es considerado como típico. En cambio, el nitrato de potasio, es muy pobre como nutriente y las levaduras poca capacidad de asimilarlo. Prueba de la ascosporosis. - para esta prueba se utiliza el siguiente medio. - Glucosa 1.0 g. - Peptona de sodio 10.0 g. - Cloruro de sodio 5.0 g. - Agar agar 30.0 g. - Agua destilada 1.0 L. Repartir 5 mL. por tubo de 160 x 16 mm. y esterilizar a 115°C por 15 minutos y dejar enfriar en posición inclinada para obtener una gran superficie. La cepa de la levadura se siembra por estría superficial y se incuba a 22 - 26°C (o temperatura ambiente), por 10 -15 días. Al cabo se este tiempo se observa al microscopio una extensión de estas levaduras, con el fin de determinar la forma, ordenamiento y numero de esporas en las ascas. Si se requiere una mejor visibilidad, se puede practicar una coloración Gram o con azul de metileno. d) Numeración de Staphylococcus aureus. Sembrar 0.1 mL. de cada disolución (o lo indicado por profesor) de la muestra problema, en las placas Petri que contiene el medio solidificado y estéril. Extender el inoculo en las superficies del medio con la ayuda de una espátula de Drigalsky estéril. Incubar a 37°C por 24-48 horas, si aparecen colonias pequeñas de color negro rodeado de un halo transparente (la enzima lecitinasa ha digerido la lecitina del medio), estamos frente a un Staphylococcus aureus sospechoso o presuntivo. Para confirmarlo, se les practican las PRUEBAS DE PATOGENICIDAD a un número de colonias sospechosas igual a la “raíz cuadrada del total de colonias sospechosas de la placa Petri respectiva” (en caso de que el número total de colonias es mayor a 5), o todas las colonias sospechosas de la placa Petri (en caso de que el número total de colonias sospechosas es 5 o menor que 5). MEDIO BASE: - Triptona 10.0gr - Extracto de carne 5.0 gr - Extracto de levadura 1.0 gr - Glicocola 12.0 gr - Piruvato de sodio 10.0 gr - Cloruro de litio 5.0 gr - Agar agar 20.0 gr - Agua destilada 1.0 L 3ml de Telurito de potasio (solución al 3.5% filtrado sobre G5). 50ml de una emulsión de yema de huevo (concentrada Egg, YOLK EMULSION, OXOID) o bien preparada en el laboratorio al 20% en condiciones asépticas 50 ug/ml de Sulfamezatina. Preparar una solución stock al 0.2% p/v de sal sódica de Sulfamezatina disolviendo 0.5 de Sulfamezatina pura (Imperial Chemical Industries) en 25 ml de NaOH N/10 y llevar a 250 mL. con agua destilada. Estas colonias sospechosas seleccionadas, se inoculan en sendos tubos de ensayo con caldo BHI (Caldo Cerebro Corazón) y se incuban a 37°C por 24 horas. El caldo BHI tiene la siguiente composición: - Infusion de cerebro de ternera 200.0 g. - Infusion de corazon vacuno 250.0 g. - Proteasa peptona 10.0 g. - Dextrosa 2.0 g. - Cloruro de sodio (NaCl) 5.0 g. - Fosfato de disodio (Na2PO4) 2.5 g. - Agua destilada 1.0 L. Ajustar el pH a 7,4 y después de la disolución se reparten en tubos de ensayo chico (10 x 70 mm) a razón de 5 ml. por tubo. Esterilizar a 121 o C x 15 minutos. Las pruebas de Patogenicidad son las siguientes: Prueba de la Coagulasa. Mezclar en un tubo estéril 0.5 ml de suero de conejo o plasma oxalato de conejo (deshidratado y regenerado).Incubar a 37 o C y observar desde la media hora. Es coagulasa positivo, cuando se produce coagulación de suero. Reacción de la Desoxirribonucleasa (Dnasa). Sembrar por estría en placas Petri que contienen Agar Dnasa sodificado y estéril, e incubar a 37 o C por 24 horas. Al cultivo obtenido, cubrirlo con milímetros de una solución de HCl 1N, la prueba será positiva si aparece una zona clara y transparente alrededor de las colonias (lo que significa que la enzima Desoxirribonucleasa ha digerido el ácido Desoxirribonucleico del medio). El medio Dnasa tiene la siguiente composición: - Triptosa 20.0 .r - ADN 2.0 g. - NaCl 5.0 g. - Agar agar 15.0 g. - Agua destilada 1.0 L. Después de la disolución, esterilizara a 121° C por 10 minutos, luego enfriar y mantener a 50 C para adicionarle 10mL./Litro de una solución de cristal Violeta al 0.1 % estéril. Repartir en placas estériles y enfriar. Prueba de Fermentación Manitol. Sembrar en un medio Agar manitol (por picadura profunda) mantenido a 40C (semi-sólido), la cepa sospechosa, y dejar enfriar hasta que se solidifique completamente. Incubar a 37° C x 24 horas; y ser posible hasta 2 o 3 días. El cambio de coloración del purpura al amarillo, en todo el tubo nos indica Manitol Positivo. El medio Agar Manitol tiene la siguiente composición: - Triptona 10.0 g. - D-manitol 10.0 g. - Extracto de levadura polvo 1.5 g. - Cloruro de sodio 5.0 g. - Agar agar 15.0 g. - Púrpura de la bromocresol 15.0 mg. - Agua destilada 1.0 L. Ajustar el pH del medio a 7.0., después de la disolución repartir en tubos de 13 x 100 mm.a razón de 5 ml por tubo y esterilizar a 121 o C x 20 minutos, y dejar enfriar el media hasta 40 o C en posición vertical. Prueba de fosfatasa: Sembrar por estrías en medio Agar fosfatasa solidificada y estéril en placas Petri, la cepa sospechosa. Incubar a 37 o C x 24 horas. Revelar el crecimiento bacteriano con una solución y transparente alrededor de la colonia. El medio Agar Fosfatasa tiene la siguiente composición: - Extracto de carne 10.0 g. - Peptona 10.0 g. - Cloruro de Sodio 5.0 g. - Agar agar 15.0 g. - Agua destilada 1.0 L. Ajustar el pH del medio a 7.5 y después de la disolución esterilizar a 121 o C por 20 minutos. A 1.0 L. de Agar Base Fosfatasa estéril y enfriada a 50 oC adicionar asépticamente 1 ml. de fosfato de fenolftaleína al 1% estéril. Repartir en placas Petri estériles y enfriar hasta solidificarse. e. Procedimiento para Bacillus spp. - Calentar el homogenizado (S.M o M.O) y sus diluciones a 75 - 80 oC por 10 - 20 minutos. Luego sembrar 1ml de c/u de las diluciones en sendas placas Petri estériles, posteriormente adicionarlo el Agar Dextrosa Triptona, conservado a 50 oC. - Dejar solidificar, para adicionarlo una segunda capa de medio de cultivo. - Incubar a 32oC por 24 -48 horas. - Contar las colonias desarrolladas con un halo amarillo (por producción de ácido). Entre las colonias que se cuentan están las siguientes especies de Bacillus. Bacillus subtilis. Colonias enlazados, lisas o rugosas, de 4.5 mm. de diámetro en Agar Dextrosa Triptona, con un halo amarillo. Bacillus mesentericus : Se considera que es sinónimo de B. subtilis en Europa, pero en América se supone pertenecen a B. pumilis . Las dos cepas producen el "pan viscoso". Bacillus cereus: Colonias grandes, irregularmente planas, como “vidrio molido “de 4-6 mm. cuando crecen en Agar Dextrosa Triptona; con producción de ácido. Bacillus stearothemophilus : Este germen y otros termófilos asociados con él ,forman sobre Agar Dextrosa Triptona colonias grandes, de 4 mm. con un halo amarillo, que se debe a la producción de ácido, cuando se cultiva a 60 oC, pero crece probablemente a 37oC y no lo hace a 20 oC. Este germen es la causa de la alteración de los alimentos enlatados conocida como agriado sin abombamiento (flatsour), produce acido pero no gas. Los cálculos y las expresiones de la población se realizan de la misma forma que para los recuentos en placas petri. Preparación del medio de Cultivo. Agar Dextrosa Triptona (o Agar Dextrona Peptona). Triptona (ó peptona) 10.0 g. Dextrosa 5.0 g. Púrpura de bromocresol al 1.6% 3.0 mL. (0.048g) Agar agar 12.0 g. Agua destilada 1.0 L. Se disuelve por calentamiento, ajustar el pH a 6.6- 7.0, luego esterilizar a 121 oC por 15-20 minutos. Mantener el medio a 50 oC para utilización en el análisis. El producto podrá conservarse en refrigeración. f. Procedimiento para Investigación y Detección de Salmonella spp. Pre-enriquecimiento: Adicionar 25 gramos de muestra problema a 80 mL. de Caldo Manitado simple. Incubar a 37ºC por 18 - 24 horas (en caso positivo vira el color de púrpura a amarillo). Si la muestra problema proviene de un tratamiento técnico (como congelado, deshidratado, enlatado, etc), utilizar Caldo Manitado de doble concentración. El Caldo Manitado se prepara de la siguiente manera: Extracto de carne 1.0 g. Proteosa peptona #3 10.0 g. D-manitol 5.0 g. Cloruro de sodio 5.0 g. Sol.alcohólica de púrpura de Bromocresol al 1.6% 1.0 mL. Agua destilada 1.0 L. pH del medio 7.2 - 7.4 Después de la disolución repartir en frascos a razón de 80 ml. c/u y esterilizar a 121ºC por 15 minutos. El caldo de doble concentración es aquella que contiene el doble de los ingredientes en 1.0 L. de agua destilada. Enriquecimiento: Sembrar 0.5 mL. de Caldo Manitado positivo en cada uno de los siguientes medios: Caldo Selenito y Caldo Tetrationato. Incubar a 37ºC por 24 horas. Los medios de enriquecimiento se preparan de la siguiente manera: Caldo Tetrationato: Proteosa peptona 5.0 g. Sales biliares 1.0 g. Tiosulfato de Calcio 10.0 g. Agua destilada estéril 1.0 L. pH del medio 7.0 Disolver al Baño María hasta ebullición, evitando el sobrecalentamiento. Enfriar por debajo de 60ºC y agregar la solución Yodada. 2 ml. de solución Yodada: (Yodo cristalizado, 6.0 g.; yoduro de potasio (IK), 5.0 g.; Agua destilada estéril, 20 ml.) Preparación extemporánea. La mezcla de ambos, repartir en tubos de ensayo estéril a razón de 10-12 ml. cada tubo. No calentar después de añadir la solución yodada. La prueba será positiva cuando se produce un precipitado en el fondo del tubo y una fase líquida superior turbia. Caldo Selenito: Triptona 5.0 g. Lactosa 4.0 g. Selenito de Sodio 4.0 g. Fosfato de Sodio 10.0 g. Agua destilada 1.0 L. pH del medio 7.0 Disolver por ebullición y repartir en tubos de ensayo estéril a razón de 10 - 12 mL. cada tubo. La prueba será positiva cuando el caldo adopte un aspecto turbio y un color ladrillo rojizo. Selección: De los medios de cultivo de enriquecimiento positivos; Sembrar en placas petri conteniendo los medios de siembra por estrías (Agotamiento de superficie). Los medios de cultivo Selectivos son Salmonella Shigella Agar (SSA) y Desoxicolato Citrato Agar (DCA). También se puede utilizar Bismuto Sulfito Agar (BSA). Una vez sembrado se incuba a 37ºC por 24 horas, al cabo de los cuales se aíslan las colonias que presentan las siguientes características: SSA: Colonias entre incoloras y rosa pálido, opacas y translúcidas; algunas colonias con centro negro. DCA: Las colonias típicas de salmonellas son aplanadas, con los bordes incoloros y el centro gris o negro. BSA: Las colonias son pardas, grises, tendiendo a negro, y presentan a veces un brillo metálico. Si el fin del estudio es determinar el número y la proporción relativa de los diferentes serotipos presentes en la muestra, deben aislarse 12 colonias (6 de cada placa de medio selectivo) pero si se trata simplemente de determinar la presencia o ausencia de Salmonellas, basta sólo 2 colonias de cada medio de Agar selectivo, para llevar a cabo con ellas las pruebas de identificación. Identificación: Las colonias sospechosas sembrar por picadura profunda y estría superficial en un agar politrópico inclinado llamado "Kligler". Se incuba a 37º C por 24 horas. Las salmonellas son glucosa positiva, H 2S positivos y lactosa negativos, además Gram negativo, comprobado estos resultados en el Kligler, se deberá continuar con la Galería bioquímica OxNiGLUMOCISKAD, de lo contrario, la prueba de Investigación y detección de Salmonella spp, culmina en el Kligler. En la preparación de los medios para la galería bioquímica de OxNiGLUMoCISKAD, revisar la práctica referente a esta galería. Ox Ni G L U Mo C I S K A D Salmonella spp + Ag - - -+ + - +- - - + Shigella spp + + A - - - + + - - - - IV. CUESTIONARIO. 1. Cómo es la contaminación y que le indica la presencia de Clostridium Sulfito Reductores, Hongos (mohos y Levaduras), Staptylococcus aureus , Bacillus spp y Salmonella spp , en los alimentos? 2. Haga una lista de alimentos alterados por Clostridium, Hongos (Mohos y Levaduras) y Staphylococcus aureus, Bacillus spp; y Salmonella spp. 3. Haga una relación de las enfermedades ocasionados por Clostridium, Hongos (Mohos y Levaduras) y Staphylococcus aureus, Bacillus spp y Salmonella spp., por el consumo de alimentos contaminados. 4. Qué cantidad de microorganismos por gramo de muestra, está permitido en los alimentos utilizados como muestra para la práctica, para su consumo?. PRÁCTICA Nº 8. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA. I. INTRODUCCIÓN. Los principales medios a través del cual los microorganismos patógenos alcanzan los suministros de agua, es la contaminación fecal. Las enfermedades más importantes que pueden tener su origen en el agua son la fiebre Tifoidea, otras salmonelosis, cólera, y disentería bacilar y amébica. Los agentes virales de infecciones como hepatitis y poliomielitis son organismos fecales y pueden estar presentes en agua contaminada. El método para el examen bacteriológico del agua está destinado a darnos un índice de la contaminación fecal. Los microorganismos patógenos no se multiplican necesariamente en el agua, pero sin embargo pueden estar presentes en gran número y fácilmente de detectarse si hay contaminación fecal. Entonces un cuadro demostrativo de E. coli en agua, nos indica una fuente fecal de los organismos. En aguas cuya fuente se ha sometido a proceso de purificación (tal como los reservorios), la presencia de E. coli es un indicador de que el proceso de clorificación es inadecuado. A través de patrones bacteriológicos, el agua para beber (agua potable) debería estar libre de coliformes y no contener más de 10 microorganismos por mililitro. II. OBJETIVO. Efectuar el examen bacteriológico del agua utilizando la Técnica de filtración por membrana. III. MATERIALES Y MÉTODOS. 1. Materiales. - Muestra de diferentes tipos de agua (manantial, agua corriente, ríos, riachuelos, agua de caño, etc.) - Pipetas estériles y Pinzas estériles. - Equipo de Filtración de Membrana. - Medios de Cultivo. - Estufa de Incubación. 2. Métodos. - Un disco filtrante estéril se pone en la unidad de filtración. - Se hace pasar un volumen de agua (100 ml) por el disco filtrante las bacterias serán detenidas en la superficie de la membrana. - Se quita el disco filtrante y se pone sobre una almohadilla absorvente que se ha saturado previamente con el medio de cultivo apropiado (2 ml aproximadamente). Las almohadillas absorventes con los discos filtrantes se acomodan en placas petri de tamaño especial y se incuban a 35º por 20 horas. - Después de la incubación se desarrollan colonias sobre el disco filtrante en cualquier lugar donde haya quedado atrapado por la filtración. - Con una lupa o utilizando el microscopio con el objetivo de menor aumento examine la superficie del filtro para las colonias que poseen una superficie brillosa, verduzca. Cuente el número total de éstas colonias "brillosa -verdosas" sobre el filtro. IV. CÁLCULOS . Anotar el número de colonias que se hallan presentes en el agua examinada usando la siguiente fórmula: Nº de Coliformes contados X 100 -------------------------------------------- = Nº de Coliformes / 100 ml. Mililitros de muestra Ejemplo: Una muestra de 20 ml. se agregó al filtro embudo que contenía aproximadamente 80 ml de agua estéril. Después de la incubación, se contaron 32 colonias brillosas sobre el filtro de membrana. Entonces: (32 X 100) / 20 = 160 coliformes / 100 ml. V. CUESTIONARIO. 1. Explique la importancia del método empleado en la práctica en el análisis de las aguas destinadas al consumo humano y la industria. 2. Comente sobre los diferentes tipos de agua (río, agua de caño, manantial, agua de lluvia, pozos.). 3. Cómo procedería Usted para poder utilizar esas aguas arriba mencionadas, en la industria y el consumo humano?. Explique por separado cada uno de ellos. 4. Comente y explique acerca de las aguas que se usan en la Región San Martín para el consumo humano y la industria. PRÁCTICA Nº 09. MICROBIOLOGÍA DE LA LECHE I. INTRODUCCIÓN La leche es un excelente medio de cultivo para numerosos microorganismos productores de alteraciones, inclusive mohos y levaduras, por su elevado contenido de agua, su pH casi neutro y su riqueza en alimentos para los microorganismos. Generalmente la leche fresca no pasteurizada contiene más o menos microorganismos en relación con la higiene del ordeño, limpieza y manipulación del utillaje. - La leche cruda mantenida a temperatura de refrigeración durante varios días, muestra invariablemente algunas bacterias o todas de los siguientes géneros: Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Microbacterium, Propionibacterium, Micrococcus, Coliformes, Proteus, Pseudomonas, Bacillus , y otros. En cuanto a la Reducción del Azul de Metileno, es un método indirecto para calcular el contenido total de bacterias de la leche. De manera que en lugar de contar las bacterias, se establece una correlación entre el tiempo que se necesita para reducir el colorante azul de metileno en la leche a una forma incolora y la probable población bacteriana de la muestra. Por lo general, el tiempo que se necesita para la reducción del colorante es inversamente proporcional al número de bacterias presentes en la leche. Este método puede adaptarse para el examen de gran número de muestras en un corto tiempo, pero sin embargo, si la población bacteriana es alta, este método no nos da la información de la probable fuente de contaminación. No hay necesidad de que los utensilios de vidrio utilizados para esta prueba sean estériles, pero su contaminación puede reducirse al mínimo tratándoles con agua hirviente o vapor que circule libremente. Tal como existe en la ubre, la leche posee un potencial de oxido-reducción suficientemente bajo para reducir inmediatamente el azul de metileno. La incorporación de oxígeno durante el ordeño, enfriamiento, trasvase, etc. eleva el potencial redox aproximadamente de + 0.06 a - 0.01 voltios. Se cree que en el mecanismo de la reducción del colorante durante la prueba, intervienen varios factores relacionados entre sí, pero lo que si es seguro que el proceso respiratorio de las bacterias elimina oxígeno de la leche, provocando un cambio en el potencial de óxido-reducción, puesto que por lo general, el oxígeno mantiene un potencial positivo, y a medida que el potencial va oxidando, el hidrógeno pasa de los elementos constitutivos de la leche y de los metabolitos al azul de metileno, causando su reducción. La prueba del azul de metileno, por su sencillez y la rapidez con que se obtienen los datos, es fácil, práctica y económica; sin embargo este método tiene sus limitaciones y son las siguientes: 1) La temperatura de incubación de 37ºC (98.6ºF) no es favorable para el metabolismo de todas las bacterias contenidas en la leche. 2) Las distintas bacterias tienen capacidad diferente por lo que respecta a rebajar el potencial de óxido-reducción de la leche. Por estas razones: - Las bacterias termodúricas permanecen inactivas durante la prueba, y esta es la objeción más importante, ya que estas bacterias son las que constituyen el problema más importante para el elaborador. - Las bacterias psicrófilas y termófilas tendrán muy poca o ninguna actividad durante la prueba. - Los materiales inhibidores de la leche impedirán también la proliferación de muchas bacterias y harán que la prueba de una indicación de una calidad más alta que la realmente existente. II. OBJETIVOS. - Conocer el número de microorganismos presentes en la leche, mediante Recuento en placas y aplicación de la prueba del azul de metileno. - Comparar resultados de estas dos pruebas de cuantificación. III. MATERIALES Y MÉTODOS. 1. Materiales: - Muestras de leche. - Materiales de vidrio: Pipetas, placas petri, tubos ensayo. - Medios de cultivo para Gérmenes Viables y Coliformes. - Solución saturada de azul de metileno. - Mecheros. - Estufa de incubación. - Agua estéril. 2. Métodos: a) Recuento en placas para Gérmenes Viables y Coliformes. Siembra por incorporación, tal como lo realizado en las prácticas anteriores. b) Prueba de la Reducción del Azul de Metileno. - Codificar tres tubos de prueba grandes y estériles. I. R. : Inicio de Reducción. M. R. : Muestra para Reducción. F. R. : Final de Reducción. - A cada tubo codificado, agregar 10 ml. de leche. - Añadir 1 ml. de la solución del Azul de Metileno a dos tubos (IR Y MR). Mezclar. - Al tercer tubo (FR) agregar 1 ml de agua estéril. Mezclar. - A los tubos IR y FR introducir en agua hirviendo por 3 minutos. - A todos los tubos poner en Baño María a 35 - 37º C. Tener cuidado que el nivel del agua esté por encima del contenido del tubo. - Controlar el tiempo, a partir del momento que se dejo el tubo en Baño María. Hacer controles a partir de 30 minutos. Interpretación de Resultados. - Para recuento en placas para Gérmenes Viables y Coliformes, según lo aprendido en prácticas anteriores. - Para la prueba del Azul de Metileno. Durante la incubación se observan cambios de color, lo que expresa el tiempo transcurrido desde el inicio de la incubación hasta decoloración completa. El tiempo de reducción se expresa en horas y medias horas transcurridas desde el inicio de la incubación hasta la completa decoloración. Bajo ninguna circunstancia se reportan los resultados en términos de números de bacterias. Precauciones. - Evitar una prolongada exposición de los tubos que contienen la leche y el colorante a la luz, especialmente a la luz solar. - Se debe mantener los tubos en Baño de agua fría hasta completar el lote de muestras para colocar en baño de agua caliente, pero si se tiene que esperar un tiempo conveniente antes de la incubación, almacenarlos entre 0 y 4.4ºC. Tabla de calificación. Más de 4 horas. Muy Buena (A) De 3 a 4 horas. Buena (B) Más de 30 min. a menos de 3 horas. Aceptable (C) Hasta de 30 minutos. Mala (D) IV. CUESTIONARIO. 1) Explique las causas por las que en algunas muestras de leche es rápida la reducción del Azul de Metileno. 2) Cuánto es el estándar aceptable de Gérmenes Viables y Coliformes en leches frescas destinadas al consumo humano. PRÁCTICA Nº 10. MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS ENLATADOS (CONSERVAS). I. INTRODUCCIÓN Si bien el objetivo del enlatado de alimentos es la destrucción de los microorganismos, con todo, en determinadas ocasiones, estos productos experimentan alteraciones microbianas. Las principales causas de estas alteraciones son: El tratamiento insuficiente, el enfriamiento inadecuado, la contaminación de la lata como consecuencia de fugas a través de las costuras y la alteración de los alimentos antes de ser enlatados. Como quiera que algunos alimentos enlatados sean sometidos a tratamientos térmicos de poca intensidad, es de esperar que, al realizar el examen microbiológico de tales alimentos, se pueda encontrar un número bastante elevado de diferentes tipos de microorganismos. Los microorganismos que alteran los alimentos enlatados, se pueden clasificar de la siguiente manera. 1. Microorganismos Mesófilos: Anaerobios de la Putrefacción, Anaerobios Butíricos, Acidúricos del Agriado Plano, Lactobacilos, Levaduras, Mohos. 2. Microorganismos Termófilos: Esporas del Agriado Plano, Termófilos anaerobios que producen Ácido Sulfhídrico, y Termófilos anaerobios que producen no Ácido Sulfhídrico. II. OBJETIVOS - Dar a conocer al alumno las pautas a seguir para llevar a cabo un control de calidad microbiológica de alimentos enlatados (conservas). III. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Materiales: - Muestra problema. - Caldo Cerebro Corazón. - Caldo Cerebro Corazón + Cisteína + Almidón. - Caldo Oxitetraciclina Glucosa. - Abridor de latas estéril. - Espátulas, Tijeras, Pinzas (Estériles). 2. Método. a. Toma de muestra. Tomar las muestras de acuerdo a las reglas matemáticas: - En el caso de un lote aislado, 1 al 2% de latas (de acuerdo a la exactitud requerida en el análisis). - Para un examen de rutina en la misma fábrica de 10 a 20 latas (según la exactitud que se requiere). En ambos casos tomar las muestras al azar. Retirar las etiquetas de las latas, lavar estas con agua jabonosa y escobilla. Colocar las latas dentro de hojas de papel filtro, perfectamente limpio, con el objeto de descubrir cualquier pérdida del producto. b. Pre-Incubación: Realizar 2 tipos de pre-incubación. - A 32 – 37ºC X 15 - 21 días. - A 55ºC X 7 - 10 días. NOTA: Durante el período de pre-incubación examinar y agitar las latas diariamente, invirtiéndolas de posición, separar y examinar inmediatamente aquellas que muestran hinchamiento o pérdida de contenido. c. Preparación de las latas para el examen: Desinfectar con alcohol al 7% todas las latas a examinar. Flamear la parte a ser abierta con la ayuda de un mechero por el lado que no tiene número de control. Abrir con un abridor de latas estéril, eliminar totalmente la tapa y abrir la conserva con la base de una placa estéril. d. Examen del contenido de una conserva: Examinar cuidadosamente y asépticamente el contenido de la lata y efectuar las pruebas de esterilidad para conservas que consiste en lo siguiente: Investigación de aerobios. Medio de cultivo: Caldo Cerebro Corazón (CCC), o Brian Hearth Infusion (BHI). - Tomar tres (03) tubos que contengan 20 ml de CCC, agitar para eliminar el oxígeno disuelto en su seno, y añadir a cada tubo 2 - 3 gr. de muestra problema. - Incubar por 24 - 48 horas a la misma temperatura que se pre-incubó la conserva. Investigación de anaerobios. Medio de cultivo: Caldo Cerebro Corazón adicionado 30 mg. de Clorhidrato de cisteína y un gramo de almidón soluble por un litro respectivamente. - Proceder de igual forma que para aerobios; además añadir una capa de parafina estéril (punto de fusión 45 – 55ºC). - Finalmente incubar por 24 - 48 Horas, a la misma temperatura que se pre-incubó la conserva. Investigación de hongos y levaduras. Medio de cultivo: Oxitetraciclina Glucosa líquida (sin agar). - Usar una serie de tres tubos que contenga el medio antes indicado, y cada tubo añadir la misma cantidad de muestra problema anteriormente indicado. - Incubar a temperatura ambiente por 3 - 5 días. e. Control De Sellado. El cierre de la lata debe ser adecuado para retener la calidad de los productos enlatados, requiriéndose una resistencia permanente, contra presiones externas o internas que pueden tener lugar durante el procesamiento, embarque y almacenamiento. En el examen se utilizan los siguientes procedimientos: Inspección visual. Durante el proceso de producción es esencial mantener constantemente un observador que pueda detectar fallas que son notorias a simple vista. La detección puede ser: Visual o táctil y los defectos pueden ser: Sellos incompletos, falsos sellos, caídas de un reborde, presencia de arrugas, etc. En las plantas industriales se acostumbran hacer estas observaciones por lo menos cada 15 minutos. Mediciones Externas Se requiere de un micrómetro par su medición. La medida de la altura del espesor y de la profundidad del sello debe hacerse por lo menos cada 2 horas, con tres (03) lecturas para cada dimensión. Las mediciones normales son: * Longitud o altura : 0.177-0.123 pulg. ó 3.01-3.08 mm. * Espesor : 0.053-0.057 pulg. ó 1.37-1.47 mm. * Profundidad : 0.123 pulg. ó 3.08 mm. Barnizado y otras características. Observar si el barniz del interior de la lata se ha desprendido o se ha oscurecido; lo mismo anotar las características organolépticas del contendido de la conserva, excluido el sabor. IV. RESULTADOS Si hay desarrollo, hacer coloración gram para determinar la clase de gérmenes presentes. Considerar que el producto es estéril si un tubo como máximo demuestra desarrollo. Sin embargo, si esto ocurre, mejorar la asepsia durante la manipulación o controlar la cantidad de la materia prima. V. CUESTIONARIO 1. Organolépticamente (uso de los sentidos), cómo demostraría que un alimento enlatado está malogrado?. 2. Qué géneros de microorganismos se encuentran en alimentos enlatados, como signo de deterioro?. Explique. ESQUEMA PARA DIAGNOSTICAR LA CAUSA DE ALTERACIONES DE UN ALIMENTO ENLATADO LATA O BOTE DE ALIMENTO ENLATADO GAS NO HAY GAS (liso) DESCENSO DE pH H2S (Generalmente fugas) Olor a H2S, maíz y AGRIADO POR MESÓFILOS guisantes, color negro, TERMÓFILOS Putrefacción sulfhídrica AGRIADO LACTOBACILOS FLORA VARIADA (Frutas) (Fugas) ABOMBAMIENTO POR H2 H2O-H2 CO2 LEVADURA ALCOHOLICA CARNES CURADAS (Bacillus spp.) TERMÓFILOS MESÓFILOS (Olor ácido) OLOR PUTREFACTO OLOR ÁCIDO (Anaerobios de la Putrefacción) FERMENTACIÓN BUTÍRICA FERMENTACIONES VARIADAS AEROBACILOS (Gérmenes anaerobios sacarolíticos) (Fugas) PRÁCTICA Nº 11. ELABORACIÓN DE PRODUCTOS ALIMENTICIOS MEDIANTE LA ACCIÓN DE MICROORGANISMOS (Yogur, Encurtido, Vinagre, Vino, Chucrut, Pan, etc.). I. INTRODUCCIÓN La ciencia que estudia, describe y sistematiza los microorganismos se llama microbiología, en el sentido más amplio, se entiende la ciencia de todos los microorganismos, de tan pequeñas dimensiones que no son perceptibles a simple vista. Tales microorganismos también se engloban bajo el concepto de microbios. La microbiología abarca las ciencias de los hongos filamentosos, las levaduras, las bacterias. Aquellos seres microscópicos que se denominan microorganismos de la industria de la fermentación o más brevemente “MICROORGANISMOS FERMENTATIVOS”, son aquellos que mediante sus procesos metabólicos transforman los hidratos de carbono en alcoholes o ácidos orgánicos (eventualmente aldehídos y cetonas) con o sin formación de anhidrido carbónico u otros gases. Entre los microorganismos de fermentación se deben mencionar en primer lugar a las levaduras; pero también, entre los hongos filamentosos y entre las bacterias, se pueden hallar microbios que se deben considerar como microorganismos fermentativos. Los verdaderos microorganismos de fermentación, encuentran utilización en la técnica a saber, en la fermentación de bebidas fermentadas como la cerveza, vino, sidra y similares; en la fabricación de etanol y otros alcoholes; en la obtención de ácido orgánico, sobre todo acético y láctico; y en pequeñas proporciones, en la producción de aldehídos y cetonas. Los procesos fermentativos se llevan a cabo en medio ácido o acidifican el medio. Fermentación, es el proceso en que los carbohidratos y sustancias similares, se oxidan liberando energía, en ausencia de aceptores de electrones compuestos. Los aceptores finales de electrones, son compuestos orgánicos producidos directamente en el desdoblamiento de los carbohidratos. A partir de que sirve para conservar los alimentos y para contribuir la variedad de la dieta del hombre, tiene otras consecuencias importantes. Varios de sus productos finales, particularmente los ácidos y alcoholes, son inhibidores de los microorganismos patógenos comunes que logran introducirse en los alimentos; como en la incapacidad del Clostridium botulinum de crecer y producir toxina cuando el índice de pH es inferior a 4,5. Entre los microorganismos de mayor importancia de las fermentaciones, se tienen a las levaduras, seguido de los hongos y luego las bacterias. Las levaduras son hongos verdaderos cuyo crecimiento habitual y predominante es unicelular. Los efectos de las levaduras en los alimentos pueden ser beneficiosos o perjudiciales. Fermentaciones realizadas por levaduras toman parte en la elaboración de alimentos como el pan, cerveza, vino, vinagre, y quesos de maduración superficial; las levaduras se cultivan para la obtención de enzimas y como alimento. Las levaduras son perjudiciales cuando determinan la alteración del Chucrut, jugo de frutas, jarabes, melazas, miel, gelatinas, carnes, vinos, cerveza y otros alimentos. Los hongos, microorganismos multicelulares, filamentosos, cuyo crecimiento en los alimentos se conoce fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso. Los hongos filamentosos abarcan muchas especies, hasta la fecha se han descrito, al menos 100 mil especies, distribuidas en unos 3000 géneros. Cuando los hongos saprofitos viven en la naturaleza, atraviesan por lo que sabemos un ciclo vital, que consiste en la permanencia invernal en el terreno, para lo cual desarrollan órganos especiales de reposo, e invernación, y en la permanencia veraniega en frutos y partes vegetales en putrefacción. En el estadío mencionado en último lugar, el hongo desarrolla su micelio y sus órganos reproductores. Algunos hongos filamentosos se encuentran durante todo el año en la naturaleza al estado fructificante, sin embargo sobrepasa toda la capacidad reconocida en el tiempo de los hongos filamentosos producir antibióticos, bajo lo cual se entienden productos farmaceúticos que, cuando se introducen en el organismo humano o animal, son capaces de luchar de una forma muy activa contra las bacterias o especies virácicas productoras de enfermedades. También en la agricultura, los hongos filamentosos saprofitos tienen una enorme importancia, en el sentido útil contribuyen a la formación de humus en el terreno. Las bacterias son microorganismos unicelulares, ampliamente distribuidas por toda la naturaleza, las bacterias se encuentran en el suelo, en la superficie del agua, en la atmósfera, y como es natural en la superficie de la mayoría de los objetos que están a nuestro alcance en la vida diaria. En la vida del hombre, las bacterias juegan un papel extraordinariamente importante. El hombre por ejemplo, ya está predestinado desde el nacimiento para la convivencia con bacterias; su salud y su bienestar están amenazadas durante toda la vida por las bacterias reproductoras de enfermedades y la mayoría de los productos alimenticios que el hombre necesita, están expuestas a la destrucción bacteriana; por otra parte, muchos productos alimenticios importantes se obtienen con la ayuda de bacterias. Las bacterias que amenazan la salud del hombre y de los animales, se llaman patógenos. Estos representan la menor parte de todas las bacterias existentes, su peligrosidad se fundamenta en la capacidad de formar sustancias tóxicas o de destruir tejidos. II. OBJETIVO - Dar al estudiante las pautas necesarias preliminares para la elaboración de productos agroindustriales, mediante el uso de microorganismos. III. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Materiales A. YOGUR - Leche fresca - Leche en polvo - Cultivo de Yogur - Cocinilla eléctrica - Baño maría - Refrigeradora - Materiales diversos de vidrio - Saborizantes B. VINO - Materia prima e insumos (Uva, Azúcar) - Equipo de fermentación - Baldes y Bandejas de plástico - Materiales diversos de vidrio 2. Método. A. Para Yogur Batido MATERIA PRIMA (Leche fresca) PASTEURIZADO (80 - 90ºC por 30 minutos) (Si se desea, agregar leche en polvo de 30 a 40 gramos por litro de leche) ENFRIADO, (Hasta 40 - 45ºC) INOCULACIÓN (agregar cultivo de yogur de 20 a 30 gramos por litro de leche) INCUBADO (A 40 - 45ºC por 2.5 a 3 horas) REFRIGERADO (Poner en refrigeración) BATIDO Y ENVASADO (Previa adición de edulcorante y saborizantes) B. Para Vino. MATERIA PRIMA (Uva) LAVADO, DESPALILLADO Y SELECCIONADO ESTRUJADO ADICIÓN DE AZÚCAR ADICIÓN DE CULTIVOS FERMENTADORES PRIMERA FERMENTACIÓN (4 - 6 días) DESCUBADO SEGUNDA FERMENTACIÓN (20 - 30 días) TRASIEGO CLARIFICADO, FILTRADO ENVASADO IV. RESULTADOS, DISCUSIONES Y CONCLUSIONES. Todos los resultados presentar en cuadros y graficarlos, hacer las discusiones respectivas previa revisión bibliográfica, para así poder emitir sus conclusiones. V. CUESTIONARIO. 1. Hacer una lista de productos agroindustriales que se elaboran mediante el uso de microorganismos. Mencionar al o a los microorganismos responsables de cada producto. 2. Hacer una lista de los productos que se elaboran en la Región San Martín por acción de microorganismos. Nombrar a las empresas productoras. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1. APHA (American Public Health Association), 1976. “Compendium of Methods For the Microbiological Examination de Foods” Washington D. C. USA. 2. APHA (American Public Health Association), 1977. “Recommendad Methods For the Microbiological Examination Foods”, 4th editions Washington D. C. USA. 3. BANWART G. J. 1982. “Microbiología Básica de los Alimentos”, Ed. Antrophos del Hombre, Barcelona - España. 4. DIFCO, 1984. “Dehydrated Culture Media and Reagements for Microbiología”, 10th ed., Detroit-Michigan-USA. 5. DIGESA, 2008. “Norma sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad para alimentos y bebidas de consumo humano”. NTS N° 071 – MINSA/DIGESA V.01. Resolución Ministerial N° 591- 2008-MINSA. Lima – Perú. 6. GARCÍA G. M., QUINTERO R. R. 1993. “Biotecnología Alimentaria”, Ed. Limusa, México. 7. ICMF., 1984. “Ecología Microbiana de los Alimentos”, Ed. Acribia S. A., Zaragoza- España. 8. ICMF., 1995. “Microorganismos de los Alimentos”, 2da. ed., Ed. Acribia S. A., Zaragoza-España. 9. JAGNOW G., DAVID W. 1991. “Biotecnología: Introducción con experimentos modelos”, Ed. Acribia S. A., Zaragoza-España. 10. MERCK E. 1994. “Manual de medios de cultivo: Más que 100 años. Medios de cultivos Merck”. Darmstadt, R. F. Alemania. 11. MOSSEL D. A., QUEVEDO F. 1967. “Métodos Recomendados para el Control Microbiológico de los Alimentos”, Serie CLEIBA, Lima-Perú. 12. QUITO VIDAL M. 1985. “Guías de Prácticas de Microbiología de los Alimentos”. UNALM, Lima-Perú. 13. RATTO M. A., VEGA C., GARRIDO T. 1983. “Control Microbiológico de Leches y Productos Lácteos: Métodos Recomendados”, Lima-Perú. 14. RODRÍGUEZ ESPEJO, Y. M., 2010. “Manual de Prácticas de Microbiología General”, U.N. de San Martín. Tarapoto - Perú. 15. THATCHER F. S., CLARK D. S. 1973. “Análisis Microbiológico de los Alimentos”, Ed. Acribia S. A., Zaragoza-España.