GUIA_DE_PRACTICA_2011

ALUMNO (a): 2 PRESENTACION Los profesores de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la U niversidad Nacional de Trujillo, han actualizado la Guía de Práctica, donde el estudiante encontrará una breve introducción de la importancia bioquímica y correlato medico de cada práctica, así como el procedimiento a desarrollar, finalizando con un breve cuestionario a fin de ampliar o concretar la aplicación de lo tratado. La Bioquímica es sin duda la ciencia que más ha aportado al desarrollo de la Medicina, basada en una rigurosa apl icación del método científico de la investigación experimental. En la práctica, los alumnos a partir de los conocimientos adquiridos en los diálogos, seminarios y casos clínicos, tienen la oportunidad de plantear interrogantes, contrastarlas con un experimento en forma ordenada, obten iendo resultados que al final se discutirán en grupo con el docente. También podrán conocer algunos métodos aplicados al diagnóstico clínico o al estudio nutricional. La práctica en Bioquímica, constituye un estímulo importante en el desarrollo de la investi gación experimental, permitiendo a nuestros estudiantes desarrollar habilidades y destrezas en trabajos de investigación y así obtener logros a nivel nacional para nuestra Facultad. Un recuerdo especial para los profesores que sentaron las bases para la actual guía de práctica como el Dr. Hugo Alpaca Muñoz, el Dr. Jorge García Ventura y un agradecimiento a todos los docentes que de una u otra manera aportaron con sus conocimientos para disponer de esta herramienta que beneficiará a los alumnos de nuestra Facultad. Dr. CARLOS ARANCIBIA ARROYO Dra. MARIA DAYSI REYES BELTRAN Dr. JUAN VALLADOLID ALZAMORA Dr. JORGE HUAMAN SAAVEDRA Dr. WALTER OBESO TERRONES Dr. ALFREDO LARIOS CANTO Dr. JORGE PLASENCIA ALVAREZ Dr. HECTOR RODRIGUEZ BARBOZA 3 I UNIDAD SUBESTRUCTURA CELULAR: ENZIMAS Y BIOENERGETICA REUNION DE LABORATORIO N° 01 PRACTICA N° 01 DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS I. INTRODUCCION: La vida depende de una serie ordenada de reacciones químicas que son catalizadas por enzimas formadas para este fin. Las enzimas son proteínas relativamente frágiles con tendencia a sufrir desnaturalización e inactivación, es decir alteraciones en su conformación, por efecto de diversos agentes físicos y químicos como: temperatura, ácidos, álcalis fuertes, sales pesadas, pH, etc. Las enzimas se encuentran en pequeñas concentraciones en los materiales biológicos resultando , complicada su individualización o purificación. Para poder verificar directamente las propiedades comunes o similares de la naturaleza proteica que las caracterizan, experimentalmente se pueden utilizar las propiedades de catalizadores específicos que tienen las enzimas, como indicador de las alteraciones que pueden sufrir éstas cuando son sometidas a la acción de diferentes agentes físicos y químicos. De esta manera, sin necesidad de individualizar o purificar una determinada enzima se pueden verificar cómo los agentes físicos y químicos afectan la naturaleza proteica de las enzimas, disminuyendo su actividad. La finalidad de la presente práctica, es evidenciar las características proteicas de las enzimas y que expuestas a la acción de diversos agentes físicos y químicos hacen variar su comportamiento y actividad catalítica. II. REACTIVOS A UTILIZAR: NaOH 1N SO4 Cu 20% NaCl 0.15M Amilasa salival 1.0% Solución iodada HCl 3N y 0.05N Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 Ácido tricloro acético (A.T.C.A.) al 20% III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Preparar: SISTEMA A TUBOS COMPONENTES (en ml) Amilasa al 1% NaOH 1N HCl 3N Ácido Tricloro acético 20% Sulfato de Cobre al 20% Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 I 1.0 2.4 II 1.0 2.4 III 1.0 2.4 IV 1.0 2.4 V 1.0 2.4 VI 1.0 2.4 6 ml.5 VI 5 0.5 0. Pre incubar por dos minutos a 37 ºC.0 VI 1.4 2. de la enzima tratada.5 0. Observar el color producido e interpretar los resultados. Agregar 0.0 1.0 V 1. CUESTIONARIO: 1.0 I 1. Durante este lapso construir el siguiente SISTEMA B: SISTEMA B: TUBOS COMPONENTES (en ml) Almidón al 1. d.4 2.5 e.5 V 5 0.1 M / pH 6.0 IV 1.0 1. Dejar en incubación a 37 °C por 20 minutos. Esquematice el procedimiento de la práctica.0 III 1.0 II 1. c. Interprete y explique bioquímicamente cada uno de los pasos realizados durante el desarrollo de la práctica 2.5 III 5 0.0 1.0 5. .5 IV 5 0.4 2.0 1. Explique la teoría de la acción molecular de las enzimas sobre sus respectivos sustratos.4 a.0 1. IV.0 a.5 0. Explique los tipos de enlaces fuertes y débiles que existen entre los aminoácidos para conformar una determinada proteína. Observar el aspecto y color producido e interpretar.5 I 5 0.0 1.5 0. c. Dejar los 5 primeros tubos del sistema en reposo por 10 minutos a la temperatura ambiente.5 0.4 2. d.0 5. 3.05N De los tubos de reacción del sistema (B). Colocar el tubo VI en un baño de agua hirviendo por 10 minutos.4 2. 4. b.6 NaCl 0. A continuación armar el siguiente sistema: TUBOS COMPONENTES (en ml) HCl 0.5 II 5 0.0 5.15 M Agua Destilada 5. agregar: Solución yodada 0.0% en solución acuosa Buffer fosfato 0.0 5. de cada uno de los tubos del sistema (A) a su correspondiente tubo del último sistema (B).4 2. b.0 5. II.Cloruro de sodio solución 0.1M . 1 ml. 1 ml. El reactante o sustancia química que reacciona para dar un producto en un sistema enzimático se llama sustrato. La finalidad del presente trabajo experimental es determinar la actividad enzimática. utilizando la enzima amilasa salival que tiene la capacidad de degradar el almidón en maltosa (disacárido reductor) y algo de glucosa. . verificando tanto el sustrato residual y los productos formados en dicha reacción. Verificando el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL ) después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura.1M Agua destilada I 5 ml. Solución Cúprica alcalina. 4 ml.Solución de almidón pH 6. Solución fosfomolíbdica. REACTIVOS A UTILIZAR: .0 al 1%. la actividad de cualquier sistema enzimático puede ser demostrada de dos maneras: 1.0 al 1% Solución de cloruro de sodio 0.Reactivo Folin Wu: a. y Volverlos a colocar al baño de agua a 37 °C durante 10 minutos.5 PRACTICA N° 02 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I. .Solución yodada. INTRODUCCION: Las enzimas pueden ser descritas como catalizadores complejos de origen biológico que tienen un alto grado de especificidad y eficiencia.Ácido Clorhídrico 0. de enzima al tubo II. Para poder mostrar la actividad enzimática se debe tener presente fundamentalmente que cada reacción química debe ser catalizada por una determinada enzima. . . y Agregar 1 ml. En general. b. la vida tal como es no podría existir. III. permitiendo que las reacciones químicas dentro de la célula ocurran rápidamente a través de vías bien definidas. solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente. entonces en un organismo vivo habría tantos sistemas enzimáticos como sustratos reaccionantes. y Colocar los tubos al baño de agua a 37 °C por 5 minutos.Enzima al 1% (amilasa salival).05N . Debido que se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reacción dada. 3 ml. Verificando los productos liberados después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) y Armar el siguiente sistema: ETAPA A: TUBOS COMPONENTES Solución de almidón pH 6. Sin estas proteínas especializadas. 2. II 5 ml. Mezclar. observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante III.05 N De los tubos I y II: Etapa A Solución yodada I 5 ml. II 5 ml. donde se observe la energía de activación y el estado de transición. Elabore un gráfica para demostrar la acción de una enzima sobre su sustrato. observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante.5 ml. a este nuevo sistema. 0. 0. Haga una lista de todos los componentes de un sistema enzimático y defínalos. y Inmediatamente cumplidos los 10 minutos. 1ml. ¿Qué métodos conoce para determinar la actividad enzimática? Explique la acción bioquímica de cada uno de los componentes en los pasos seguidos para determinar la actividad enzimática. 1ml. 3. . y Mezclar. 0. 2ml. 1ml.6 CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL. 2ml. 2. transferir 0. 4.5 ml.5 ml. TUBOS COMPONENTES Ácido clorhídrico 0. CUESTIONARIO: 1. De cada uno de los tubos del sistema anterior.5 ml. 1ml. 0.5 ml. CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (Folin WU) TUBOS COMPONENTES De los tubos I y II: etapa A Solución Cúprica alcalina Hervir 8 minutos Enfriar Solución fosfomolíbdica Agua destilada y I 1ml. II 1ml. 1N en cada tubo. INTRODUCCION: El punto isoeléctrico es la concentración de iones hidrógeno en el cual la proteína es eléctricamente neutra. cuando se encuentran en una solución que tienen pH igual al PI. .Solución de caseína en Acetato de Sodio 0.0 II 5. cada proteína posee un determinado punto isoeléctrico (PI).0 IX 5. iguales o mayores al PI. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Marcar una serie de tubos de ensayo de 1 al 9 TUBOS REACTIVOS (en ml.0 1.0 1.Ácido acético 1N .0 III 5. Mezclar Extraer 5ml. TUBOS CONTENIDO ( en ml.0 1.) Ácido Acético 1N Agua Destilada      I 3.8 II 5 III 5 IV 5 V 5 VI 5 VII 5 VIII 5 IX 5 Mezclar el tubo N° 1 Extraer 5ml.0 1.0 1. de solución y se elimina.) Contenido Anterior Caseína 0.2 6. Por tanto.0 Mezclar al instante por inversión. En el tubo N° 9 una vez efectuada la mezcla.1N (sal)  I 5. de solución del tubo N° 1 y agregarlo al tubo N° 2.0 IV 5.Indicador de pH: Papel Indicador ó pHmetro. la proteína sufre variaciones en la constitución de sus grupos químicos.0 1.0 V 5. REACTIVOS A UTILIZAR: .7 PRACTICA N° 03 DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LAS PROTEINAS I. que precipitan porque la solubilidad en estas condiciones disminuye al mínimo. de caseína en acetato de sodio 0. produciéndose en consecuencia variaciones en la estructura terciaria o cuaternaria y por lo tanto en su función biológica Aparte de otras propiedades que presentan las proteínas.1N III. algunas proteínas son muy díficilmente solubles y precipitan.0 1. Completando del mismo modo hasta completar la serie. .0 VI 5. . se extrae 5 ml.0 VIII 5. porque el número total de cargas positivas es igual al número total de cargas negativas contenidas en la proteína. La presente práctica tiene por finalidad demostrar que el punto o pH isoeléctrico de las enzimas es una característica físico química común de estas moléculas. se puede determinar el PI de una proteína observando los cambios de solubilidad que se producen cuando la proteína se encuentra en varias soluciones que tienen pH conocidos. II. Aprovechando este comportamiento.0 1. del tubo N° 2 y transferir al tubo N° 3. Cuando una proteína se encuentra en diferentes soluciones que tienen valores de pH menores.0 1. Al contenido anterior del sistema agregar rápidamente 1 ml.NaOH al 10%.0 VII 5. CUESTIONARIO: 1. .1 N en todos los casos.1 N. 3. I II III IV V VI VII VIII IX Emplear los símbolos siguientes : O = no cambia + = opalescencia. 4.1 TUBO N° 3 = pH 4. que encontró en su experimento. de ácido 1 N (16 ml. Indique el punto isoeléctrico aproximado a la proteína.  Calcular el pH de cada uno de los tubos aplicando la Ecuación de Henderson ± Hasselbach. Ver ejemplo. Cálculo de pH para el tubo N° 3: pH = pK + log. TUBOS N°. [ Ácido ] pK del Ácido Acético = 4. 0. de acetato de sodio 0.8    Observar el efecto inmediato que se produce en la solubilidad de la proteína en los diferentes tubos. Etc. la concentración de ácido acético varía. En el tubo N°2 la concentración de ácido acético es de 8 ml.1 N. verificar el pH de cada uno de los tubos con el indicador de pH. ¿Cómo interpreta el resultado obtenido del punto isoeléctrico? ¿Qué es el pK? El pH neutro del medio ¿es igual al pH isoeléctrico? De sus razones.  Luego de transcurridos los 30 minutos de reposo. Ecuación de Henderson ± Hasselbach [ sal ] pH = pK + log. Anotar los resultados en la columna respectiva del cuadro anterior. 0. x = precipitado EFECTO INMEDIATO EFECTO DESPUÉS DE 30 MINUTOS CÁLCULO DEL pH  Determinar el tubo que presenta el máximo de precipitación. En el tubo N° 3 la concentración de ácido acético es de 4.0 ml. Así en el tubo N° 1 es de 1. debe calcularse el pH de cada uno de los tubos IV. 2.6 = 4.7 ± 0. Anotar en el cuadro que se da a continuación Observar después de 30 minutos de reposo y anotar también en el cuadro respectivo. 1 = 4. lo cual se producirá en el tubo que tiene pH próximo a la solubilidad mínima de la proteína.7 Ejemplo : Si la concentración de la sal es de 1 ml.6 ml.1N). al 0.1 4 NOTA: De la manera indicada en el ejemplo. 9 5. Si la concentración de ácido acético en el tubo II es 8 ml a 0.1 N ¿Cuál es el pH de la solución en 1 ml? . El pH. deben establecerse: .10 REUNION DE LABORATORIO N° 02 PRACTICA N° 04 CUANTIFICACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Y DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE LAS ENZIMAS I. En éste último caso y siempre que se conozca un peso molecular se puede definir otra unidad ³LA ACTIVIDAD MOLECULAR O MOLAR O NÚMERO DE RECAMBIO´ (ÍNDICE CATALÍTICO). se recurre a la medida de la velocidad de la reacción que cataliza. o cualquier otra molécula en la cual son atacados más de una unión. Se denomina Actividad Específica a la cantidad de una enzima expresada en términos del contenido de proteína de la preparación. Esto es posible debido a que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la cantidad de enzima. . Es decir en los ejemplos mencionados más que el numero de moléculas completamente hidrolizados. entendiéndose por unidad de una enzima a la cantidad de ella que produce cierta velocidad de reacción bajo determinadas condiciones. Esa velocidad de reacción se expresa como la cantidad de sustrato transformado en cierto tiempo. . definible como el número de moléculas de sustrato transformado por minuto y por molécula de enzima (ó por un solo centro activo) en condicionales experimentales tales que se esté midiendo la velocidad máxima (concentración saturante del sustrato). . Entonces la actividad específica además de cuantificar la enzima.La concentración del sustrato o los sustratos y cofactores. . A fin de evitar ambigüedades surgidas de la utilización de distintas unidades para expresar la cantidad de sustrato y el tiempo se ha definido por convención una unidad que puede ser aplicada a casi todas las enzimas y que permite comparar las actividades de enzimas diferentes. Esta aumenta durante el proceso de purificación de la enzima en los homogenizados biológicos y llega a ser máxima y constante cuando la enzima se halla en estado puro. se toma como medida de la reacción el número de uniones peptídicas o glicosídicas atacadas respectivamente. y se expresa como el número de unidades de la enzima por miligramo de proteína. Dos casos merecen aclaración especial: . o un polisacárido. La definición recomendada por la Unión Internacional de Bioquímica a través de su comisión de enzimas es la siguiente: ³Una Unidad Internacional (UI) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol (Q mol) de sustrato por minuto bajo condiciones definidas de medida´. INTRODUCCION: Al no ser posible medir la cantidad de enzima directamente en las estructuras biológicas. De esta manera se puede expresar la cantidad de una enzima en términos de unidades enzimaticas.Cuando el sustrato es una proteína. y en general de todos aquellos factores que de una u otra manera pueden modificar la actividad de la enzima. ACTIVIDAD ESPECÍFICA. constituye una medida del grado de pureza de la enzima durante el proceso de purificación.La temperatura a la cual se define la Unidad.En casos de reacciones bimoleculares del tipo: 2 A ----. una Unidad será la cantidad de enzima que cataliza la transformación de dos Q Moles de sustrato por minuto. En cuanto a las mencionadas condiciones de medida.B + C en que dos moléculas reaccionan entre si. se debe reemplazar la definición de un Qmol de sustrato por un microequivalente (Q eq) del grupo involucrado. 0 y Sacarosa 0.0 Incubar a 37°C.11 Actualmente la Unión Internacional de Bioquímica.0 ml. 8.2 ml. 0. 0.2 ml.5 ml. 2 minutos 0. Mezclar: Separar el precipitado de proteínas filtrando o centrifugando por 10 minutos. DETERMINACIÓN DE PRODUCTOS DE LA REACCIÓN (azúcar reductor) Se empleará los filtrados libres de proteínas del paso anterior y se determinará azúcar reductor mediante el siguiente procedimiento: .5 ml.5 ml. 0. II.67 nanokatales La Actividad Específica se expresa en esta nueva unidad como Katales por kilogramo de proteína (ó Microkatales por miligramo de proteína) y la actividad molar en Katales por mol de enzima. La finalidad del presente trabajo experimental es cuantificar la Actividad Enzimática determinando la actividad específica.3 ml.0 ml.02M pH 5. 0. recomienda el uso de una nueva unidad EL KATAL (Kat) que se define como la cantidad de enzima que transforma un mol de sustrato en producto por segundo. 0.3 ml.3 N Sulfato de Zinc 5 % Sacarosa 0.3 N y Sulfato de Zinc al 5 % y Solución fosfomolíbdica y solución cúprico alcalina y Reactivo de Biuret III.01667 microkatales = 16. 8. 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: y Armar el siguiente sistema: SISTEMA DE INCUBACIÓN COMPONENTES Sacarosa 0.17M y Hidróxido de bario 0. Su relación con la Unidad Internacional es la siguiente: Un Katal es igual a 6 x 10 7 Unidades Internacionales. Una Unidad Internacional es igual a 0.5 ml. 0. Detener la reacción empleando: Hidróxido de bario 0.5 ml.5 ml. (Pre ± incubación) Preparado enzimático Mezclar e incubar a 37°C.17 M Agua destilada y y TUBOS DE ENSAYO I II 0.02 M pH 5. REACTIVOS A UTILIZAR: y Preparado enzimático (homogenizado celular de Fusarium moniliforme) y Buffer de acetato 0.17 M Buffer acetato 0. 20 minutos 0. I) x Factor = mg. Cálculos de la concentración de los productos (hexosas) [(Lect..045 uM/ml.8 ml.0 ml... I II 0..5 ml.. 0.5 ml.5 ml.. = Micromoles de Hexosas / 2 Minutos Tiempo de incubación en minutos (20 min). 4..0 ml. Leer a 540 nm Para el espectrofotómetro. II 0. de proteínas por ml. 0. Mezclar y dejar en reposo por 30 minutos. 0.. II ± Lect. y CÁLCULO DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA U A.. 0. III 1. y y y CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Determinación de la concentración de proteínas en el preparado enzimático: (Reacción de Biuret) COMPONENTES Preparado enzimático Agua destilada Reactivo de Biuret 1.2 ml. 0. Cálculo de las Unidades (U) (U) = uM de sustrato transformado x ml.. de Proteínas .. = mg.12 TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES Filtrado I Filtrado II Agua destilada Solución cúprica alcalina I 0. Mezclar y dejar en reposo durante 20 minutos.E. II ± Lect.5 ml.. Colocar en un baño de agua hirviendo durante 8 minutos Enfriara al chorro de agua Solución fosfomolíbdica y 1.... 1. 1. Leer a 420 nm. I ± Lect.. agregar 7.0 ml.0 ml. el factor es. Mezclar. 0.5 ml. del blanco)] x Factor = uMoles de Hexosas por ml. 4. del blanco) ± (Lect. de agua destilada..5 ml.. Factor = 0.0 ml.0 ml.0 ml... CÁLCULO: (Lect.0 ml.5 ml. 4. 5. 2. para calcular la Actividad Específica? ¿Por qué se utiliza el reactivo de Biuret? ¿Por qué una enzima se cuantifica en función de su actividad enzimática y no por el peso de la proteína (enzima)? Si en dos preparados biológicos A y B la actividad específica de una determinada enzima es: (en uM/mg. 3.5 x 10-4 ¿En cual de los dos preparados hay mayor cantidad de enzima? 6. Cuándo determina el azúcar reductor de una reacción. ¿Cómo explica la aparición de la coloración al final del sistema? ¿Por qué es necesario conocer previamente la concentración de proteínas del preparado enzimático y determinar la unidad de enzima (U). proteína) a.13 IV. CUESTIONARIO: 1. . A = 1 x 10-3 y B = 1. de tal manera que la investigación del factor variable no se vea afectada por la variación que pudieran sufrir los otros.0 1. tomando como ejemplo la hidrólisis enzimática del almidón y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los productos de la reacción enzimática.0 5.4 VIII 1. PH.1M pH 9.0 5.6 Buffer borato 0. Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes.0 1. TIEMPO TEMPERATURA.0 5.0 1. varia en forma característica para cada enzima en particular.) Solución de almidón al 1 % Buffer acetato 0. Tomando una determinada enzima como patrón es posible tener una idea más o menos clara de la influencia de los factores (Tiempo.Amilasa salival dializada al 0.0 5. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml. Estos factores se investigan teniendo en cuenta la velocidad de la reacción enzimática sobre un sustrato adecuado y en determinadas condiciones. concentración de enzima. pH. III.0 5.4 2. como se comprenderá.6 .05N .0 1. etc).4 2.0 3.4 1. tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática.Solución de almidón al 1 % . concentración de sustrato.0 . . independientemente del tipo de reacción que catalizan. INTRODUCCION: En general. REACTIVOS A UTILIZAR .4 2. sobre la serie infinita de enzimas que se conoce.0 5.14 PRACTICA N° 05 FACTORES FÍSICOS-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS PARTE I: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMAS.0 V 1.0 5.Buffer acetato 0.1M pH 9.0 IV 1.0 1.Ácido clorhídrico 0. IONES INORGÁNICOS I. Este patrón general. iones.0 1. retardando o i pidiendo m su actividad.25 % . II.1M pH 6.Solución fosfomolíbdica.Solución yodada (yoduro de potasio + yodato de potasio) .4 2.0 VI 1.6 II 1. concentración de sustrato.4 2. La finalidad de este experimento es observar el efecto de iones activadores.4 2.6 . temperatura. pH. concentración de enzima.Solución de cloruro de sodio al 2 % .0 Solución de ClNa al 2 % Agua destilada I 1.1M pH 6.0 . todas las enzimas.1M pH 4.4 III 2.1M pH 4.6 Buffer fosfato 0.Buffer fosfato 0.Buffer borato 0. presentan características comunes en cuanto a los factores que intervienen favoreciendo.0 VII 1.Solución cúprico alcalina.0 5.0 1. TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.5 0. I 0. 1.0 II 0.5 0.5 5. TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.0 0.0 0. del incubado de su correspondiente tubo.15 .) Preparado enzimático (en ml. para el equilibrio de la temperatura.5 0.0 0.6 III 0.) I II III IV V VI VII VIII Incubado correspondiente de 0.0 0.6 VI 0. maltosa) de la siguiente manera: Esta determinación sólo se hará en los tubos III y V del incubado a los 20 minutos.0 0.El control del sustrato no transformado se realiza por la reacción del yodo.El Control de los productos formados se hará en base a la capacidad reductora de estos (glucosa. .5 Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos.0 ml.5 5. Cumplido los 8 minutos sacar los tubos y enfriar con agua corriente y AGREGAR: . Armar el siguiente sistema: COMPONENTES III Incubado correspondientemente a los tubos III y V Solución cúprico alcalina 1. . por cinco minutos.6 V 0. según se indica y tomar el tiempo. sin color) en el cuadro final. Mezclar y poner en baño maría hirviendo por 8 minutos.0 ml.5 0.Realizar controles de la actividad enzimática.5 5.5 ml.0 0. TUBOS V 1. y CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS .5 5.0 Solución iodada 0. 0. valorando los cambios de coloración (azul oscuro. de la siguiente manera: Cumplidos los 20 minutos de incubación sacar los tubos del baño maría y luego armar una serie paralela de tubos marcados del I al VIII.5 5.0 0. 1.0 ml. .5 0.El tubo VIII mantenerlo en agua helada entre 0 °C y 4 °C durante cinco minutos.Agregar el preparado enzimático a los tubos: II al VIII.5 cada uno de los tubos HCl 0.6 VII 0.5 0. agregando a cada tubo marcado. de acuerdo a los sistemas que a continuación se presentan: y CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL . azul claro.05N 5.6 IV 0.0 ml.2 VIII 0.5 0.6 (Computar el tiempo desde el momento en que el preparado enzimático fue agregado a cada tubo) y Mezclar y continuar la incubación por 20 minutos.5 5.Mezclar y colocar los tubos: del I al VII al baño de agua a 37 °C.5 5. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 4.0 ml. 1. CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA POR E L SUSTRATO RESIDUAL: (cambio de color) A los 20 minutos: I II III IV V VI VII VIII CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (cambio de color) A los 20 minutos III V IV.0 ml. 5. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción enzimática? 5.0 ml.16 COMPONENTES III Solución fosfomolíbdica Agua destilada TUBOS IV 1. ¿Cómo se determina el sustrato residual y los productos finales cuando se usa almidón como sustrato? 3. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuáles son los factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas? 2.0 ml. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la presencia de un ión activador sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? . Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de tubos valorando los cambios de coloración (azul oscuro. azul claro. 5. ¿Cómo puede demostrar el efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 6. sin color) en el cuadro final. II. Con un incremento ulterior en la concentración de sustrato.6 Tungstato de sodio al 10 % Ácido sulfúrico 2/3 N III. Desde el punto de vista operacional la constante de Michaelis (Km). Sin embargo. debido a que la velocidad de colisión entre los reactantes es proporcional a la concentración de cada uno de ellos. y se dice que la enzima está siendo saturada con su sustrato. Las reacciones catalizadas por enzimas son algo diferentes. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: . DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD MÁXIMA Y KM. la velocidad inicial se incrementa con menor intensidad. INTRODUCCION: En las reacciones no catalizadas. se define mejor en términos de la concentración de sustrato necesario para obtener una velocidad inicial de reacción igual a la mitad de la velocidad máxima. PARTE II: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO. en esta zona la reacción es de orden mixto. I. la velocidad de la reacción llega a ser esencialmente independiente de la concentración del sustrato y asintóticamente alcanza una velocidad constante. A baja concentración de sustrato la velocidad inicial de la reacción es directamente proporcional a la concentración del sustrato y la reacción es de primer orden con respecto al sustrato.005 M Urea 0.17 REUNION DE LABORATORIO N° 03 PRACTICA N° 06 FACTORES FÍSICO-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS.1 M pH 6.075 M Solución de ureasa cristalina en Buffer fosfato 0. de modo que no es tan directamente proporcional a la concentración del sustrato. la velocidad de reacción siempre es proporcional a la concentración de cada uno de los reactantes. La finalidad de la presente práctica es demostrar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción enzimática y hallar la velocidad máxima y el Km de la reacción.1 M pH EDTA 0. cuando la concentración del sustrato es incrementada. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato 0. En este rango de concentración de sustrato la reacción es esencialmente de orden cero con respecto al sustrato. 5 2.M¶ Ejemplo: Concentración de úrea en el tubo I.5 VII 0.  Encontrar la concentración de amoníaco producido por ml.MEZCLAR Transferir 1ml.18 COMPONENTES Buffer fosfato pH 6. V¶ = 4 ml. empleando la concentración de amoníaco producido por ml. dividido entre el tiempo de incubación (15 minutos).5 0.5 1.5 0.5 V 0.5 0.M.5 0.5 V 1. Para ello multiplicar la diferencia anterior por el factor de calibración empleado (1660) = µmoles de NH3 /ml.5 0.5 0.0 1.5 3. ésta debe agregarse con intervalos de 1 a 2 minutos a cada tubo de tal manera que permita un fácil manejo de los mismos al final de cada tiempo.5 II 2. Luego:  Realizar las lecturas en el espectrofotómtero a 540 nm en cada uno de los tubos.05 % I 3.0 0.5 II 0.0 8.0 0.0 1.075 M Ureasa 0.5 VI 0.0 0.5 ml.5 0.5 0.5 III 0.0 8.0 - Pre incubar a 37 °C durante cinco minutos Incubar cada uno de los tubos exactamente 15 minutos 37°C ES FUNDAMENTAL: Medir exactamente el tiempo de incubación para cada tubo.0 II 1.  Calcular la concentración de sustrato (concentración molar) en cada tubo de incubación empleando la siguiente fórmula: V.5 VI 0.0 VI 1.5 MEZCLAR y dejar en reposo por cinco minutos.5 0.0 1.0 1.  Hallar la diferencia de cada uno de los tubos.5 3.0 IV 1.0 1. Datos: V = 0.  Calcular la velocidad de reacción para cada uno de los sistemas enzimáticos preparados. Transcurridos los 15 minutos agregar rápidamente: COMPONENTES H2SO4 2/3 N Tungstato de sodio 10% Ureasa .0 8.5 IV 1.0 8. = V¶.0 2.0 1. de cada uno de los siguientes incubados a tubos de ensayo de una segunda serie siguiendo el siguiente esquema: COMPONENTES Del incubado anterior Agua destilada Reactivo de Nessler I 1.0 8.0 0.0 V 1.5 III 2. Para ello se medirá el tiempo de incubación inmediatamente después de agregar la enzima.0 1.5 VII 0.0 1. .6 Urea 0.5 0. con respecto al tubo blanco (tubo VII).0 VII 1.5 IV 0.0 8.5 0.0 I 0.0 8.0 III 1. IV.  Anotar los resultados de cada uno de los tubos (concentración del sustrato y velocidad de la reacción).5 ml x 0. ¿Qué establece la ecuación de Micahelis Menten? 3. ¿Para que sirve la ecuación de Lineweaver? 6. Calcular en la gráfica obtenida la velocidad máxima y la Km. En la curva trazada calcular la Km e indicar la Vmax.075 M M¶ = ? M¶ = 0. ¿Qué importancia tien el Km? 5.  Utilizando papel milimetrado.19 M = 0. aplicar la ecuación de Lineweaver Burk a los resultados obtenidos. ¿Cómo afecta la concentración del sustrato la velocidad de la reacción? 2. Construir una gráfica en un sistema de coordenadas teniendo como parámetros la inversa de la concentración del sustrato (1/S) (abscisas) en función de la inversa de la velocidad inicial de la reacción (ordenada).075 M = 0. ¿Qué métodos conoce para determinar el Km? .  Construir una gráfica en el sistema de coordenadas teniendo como parámetros : La concentración del sustrato (abscisa) en función de la velocidad de la reacción (ordenada). CUESTIONARIO: 1.0093 M 4ml. ¿Qué es el Km? 4. eliminamos por algún método. que se pueden distinguir en base a un criterio experimental. Aquí el inhibidor se une a la enzima en otro sitio que no es aquel por el cual se une al sustrato. se agrega malonato como inhibidor. . Los inhibidores enzimáticos se clasifican en reversibles e irreversibles. que es cataliticamente inactivo y no puede escindirse en productos de la reacción y complejo-enzima-inhibidor. El inhibidor se combina reversiblemente con la enzima en el sitio por el cual se debería unir el sustrato impidiendo por lo tanto la formación del complejo activoenzima-sustrato. La inhibición acompetitiva. los cuale enlazan iones metálicos necesarios para la actividad enzimática. el exceso de inhibidor. y la enzima recupera su actividad original. Los dos tipos más comunes son: las inhibiciones reversibles competitivas y las inhibiciones reversibles no competitivas. pudiéndose formar entonces un complejo ternario enzima-sustrato-inhibidor. Estas sustancias se conocen como los inhibidores enzimáticos. Si después de hacer actuar el inhidor sobre la enzima. si la enzima continúa inhibida después de la reacción del inhibidor. si el sistema deshidrogenasa succínica+succinato. De allí el nombre de competitivo. se dice que el inhibidor es irreversible. se dice que el inhibidor es reversible. Ejemplos de este tipo de inhibición son los causados por el N-etilamida. entonces la inhibición será de tipo no competitiva. a las que se pueden agregar las inhibiciones reversibles acompetitivas. EDTA. cloruro de mercurio. inhiben metaloenzimas por enlazarse al ión metálico. Respecto de los inhibidores reversibles es importante destacar que la interacción entre inhibidor y enzima se traduce en varios tipos de inhibición perfectamente diferenciados experimentalmente. Excluyéndose de ésta categoría aquellos agentes como los ácidos fuertes. por que efectivamente tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio y tratan de desplazarse mutuamente de la enzima. Si la inhibición no se revierte al agregar sustrato (succinato). Experimentalmente se puede identificar si un inhibidor cualquiera es o no competitivo. Si el efecto inhibidor se revierte al incrementar la concentración del sustrato (succinato) entonces se podrá afirmar que el inhibidor es de tipo competitivo. NO y CO. La inhibición no competitiva se caracteriza por que no puede ser revertida por un aumento de la concentración del sustrato ya que este último no puede desplazar al inhibidor unido a la enzima. Quedando por demostrar si este tipo de inhibición es reversible o no. de este tipo de inhibición es el que presenta la succinato deshidrogenasa que tiene como sustrato el succinato y puede ser inhibido por sustancias estructuralmente parecidas a dicho ácido como son el malato. En la inhibición competitiva se dice que un inhibidor obra por competencia si su acción inhibidora se revierte al aumentar la concentración de sustrato. Por esta razón la unión de este último con la enzima no es afectada por la presencia del inhibidor. Un ejemplo clásico.20 REUNION DE LABORATORIO N° 04 PRACTICA N° 07 ACCION DE LOS INHIBIDORES COMPETITIVOS Y NO COMPETITIVOS SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I. INTRODUCCION: Existen sustancias cuya acción sobre una enzima es la disminución de su actividad. es otro tipo de inhibición reversible. alcoholes y calor que producen alteraciones en la estructura espacial de la molécula proteica que conduce a la desnaturalización. común en sistemas más complejos en el que el inhibidor se une exclusivamente al complejo enzima -sustrato para dar un complejo enzimasustrato-inhibidor incapaz de transformarse en otro producto. Por ejemplo. A la inversa. ácido oxálico y glutarato. 2 1.0 V 1.Succinato de sodio 0.2 ± 6 Diclorofenolindofenol .3 0.Cloruro de mercurio . ¿Por qué el malonato es inhibidor competitivo? 2.0 1.1 M 2 ± 6 diclorofenolindofenol Homogenizado 10 % I 2.5 M .2 Anotar y luego agregar a los tubos II.0 1.Malonato de sodio 0.2 Succinato de sodio 0. pH 7.Buffer fosfato 0.0 1. ¿Por qué el cloruro de mercurio es inhibidor no competitivo? 3.5 M Buffer fosfato 0.0 1.5 1. Observar los resultados en cada uno de los tubos (cambio de color).0 IV 1. REACTIVOS A UTILIZAR .0 1.0 1.1 M Malonato de sodio 0.2 0. II 0.3 0. que el malonato es un inhibidor competitivo y que el cloruro mercúrico es un inhibidor no competitivo.Homogenizado hepático 10 % III.5 IV 0.21 La siguiente práctica tiene por finalidad demostrar en el sistema enzimático Deshidrogenasa succínica+succinato: que el malonato y el cloruro mercúrico producen inhibición de este sistema. ¿Cómo podría usted demostrar que la inhibición producida por el cloruro mercúrico es o no reversible? .1 M Succinato de sodio 0.5 1. III.5 III 0.2 0.0 III 1.0 Dejar en reposo por 30 minutos a la temperatura ambiente.2 .5 1.5 - IV.1M pH 7.5 M Cloruro de mercurio 0.8 0. COMPONENTES Succinato de sodio 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA: TUBOS COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0.0 II 1.0 0.1 M .1 M . II. CUESTIONARIO: 1.5 0. Dejar en reposo 15 minutos a la temperatura ambiente y luego observar los resultados y anotar.Succinato de sodio 0. IV.1 M.1M pH 7. Señale por lo menos tres ejemplos de sustancias que pueden producir inhibición no competitiva reversible. 6. De por los menos dos semejanzas entre la inhibición no competitiva reversible e inhibición alostérica. además del malonato utilizado en el presente experimento. . sin considerar el cloruro de mercurio.22 4. ¿Qué diferencias puede usted establecer entre la inhibición competitiva y la inhibición alostérica? 7. De usted por lo menos dos ejemplos de sustancias que producen inhibición competitiva en el sistema Deshidrogenasa succínica ± succinato. 5. que al reducirse (recibir electrones) se decoloran. es otro indicador que actúa como sustrato. Por su acción cercana en el primer sitio de la desfosforilación se les suele denominar inhibidores del sitio I. Un segundo grupo de sustancias actúan bloqueando la transf rencia de electrones e entre los citocromos b y c. Si al administrar un inhibidor de la cadena. comprenden el cianuro. etc. Los inhibidores más comúnmente usados pueden reunirse en tres grupos principales según el sitio de la cadena respiratoria donde actúan. entonces podemos deducir que el mencionado inhibidor actuará en algún sitio comprendido entre la CoQ y el citocromo B inclusive (cercano al sitio II de la cadena). En la cadena REDOX. Existen diversas sustancias que actúan como inhibidores de la cadena respiratoria.23 PRACTICA N° 08 EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA CADENA DE ÓXIDO-REDUCCIÓN I. los esteroides. sitio II y sitio III. Como hay flujo de electrones en la cadena. el citocromo C actuará como primer aceptor de electrones que provienen de la p-fenilendiamina. entonces podemos deducir que el sitio de inhibición estará en alguín sitio posterior a la CoQ inclusive. es decir que es capaz de ceder electrones. INTRODUCCION: Los equivalentes de reducción. éste impide que el 2-6 diclorofenolindofenol se reduzca (se decolore). el monóxido de carbono. Este sistema está localizado en la membrana mitocondrial interna y se caracteriza por la cohesión física con la cual sus componentes se encuentran unidos entre si e integrados en la membrana. Inhibidores de localización son: el amital. algunos anestésicos volátiles como el halotano. barbital sódico y azida de sodio. se les denomina inhibidores del sitio II. la p-fenilendiamina no se oxidará (no cambia de color). así por ejemplo el 26 diclorofenolindofenol y el azul de metileno son sustancias indicadoras de color azul en estado oxidado. mediante el uso de indicadores conocidos como 2 ± 6 diclorofenolindofenol y p ± fenilendiamina. entonces podemos deducir que el inhibidor actúa en algún sitio anterior al citocromo o de la cadena. Si se administra un inhibidor que impide el flujo de electrones en algún punto de esta porción de la cadena. Un primer grupo de inhibidores actúa sobre la NADH-deshidrogenasa. los detergentes. El ejemplo clásico de este grupo es la antimicina. pero si el indicador se decolora. el BAL y barbiturato de sódio. actúan en las regiones cercanas al sitio I. etc. Para poder determinar la permeabilidad de la cadena de oxidoreducción al paso o no de electrones. Cuando se oxida (cede electrones) cambia de color (a marrón oscuro). Los más representativos de este grupo son la rotenona y la piericidina. átomos de hidrógeno o electrones. La p-fenilendiamina. es o no permeable al flujo de electrones que provienen del indicador. bloqueando el transporte de electrones entre la flavina y la ubiquinona. ésta cede sus electrones a los indicadores entre la FMN y la CoQ. A estos se les denomina inhibidores del sitio III. provenientes de la deshidrogenación de los sustratos del ciclo de Krebbs y otros metabolitos son transferidos al oxígeno por un sistema multienzimático denominado cadena respiratoria. Si el inhibidor no impide la oxidación del indicador. De esta manera se puede verificar si la cadena comprendida entre el citocromo C y el oxígeno. . la azida. Un grupo de inhibidores actúa sobre el Hemo a3 de la citocromo oxidasa impidiendo su interacción con el oxígeno. quiere decir que dicho inhibidor estará actuando en alguna región anterior a la FMN. La presente práctica tiene por finalidad demostrar que los inhibidores: rotenona. se utilizan sustancias indicadoras artificiales que cambian de color cuando se oxidan o se reducen. respectivamente. inclusive de la cadena (región que incluye el sitio I). Si se administra un inhibidor que no impide la oxidación de la p-fenilendiamina y que tampoco impide la reducción del 2-6 diclorofenolindofenol. Este mismo sistema multienzimático es también conocido como cadena de transporte de electrones. inhibidores similares son la hidroxiquinolina N-óxido. denominación que pone énfasis en que las oxidaciones reducciones son fenómenos caracterizados por la pérdida o ganancia de electrones. 5 0. ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA: TUBOS COMPONENTES (en ml.5 0.0 V 1.1M pH 7.0 1. I 2.5 0.1M Barbiturato de sodio 0. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato de sodio 0.4 2.5 0.) Buffer fosfato de sodio 0. dejar en 10% ambiente por 20 0.0 0.5 1.24 II.5 1.5 0.1M pH 7.5 0.02 % p-fenilendiamina 1% Malato de sodio 0.1M Rotenona 0. barbital sódico y azida de sodio.1M Azida de sodio Fracción mitocondrial 10% (hígado de rata) III. verificar el efecto de los inhibidores rotenona.5 reposo a temperatura minutos.5 0.02 % Malato 0.5 0.2 1.5 0.5 IV 0.5 1.5 0.1M Rotenona 0.1M Rotenona 0. verificar el efecto de los inhibidores: rotenona.5 0.0 0.5 0.0 0.6-diclorofenolindofenol 0.4 2.1M Barbiturato de sodio Azida de sodio Homogenizado mitocondrial 10% I 1.) Buffer fosfato 0.0 IV 1.5 II 1. pH: 7.0 .5 VI 0. Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos).5 0.5 1.2 III 1. En el sistema p±fenilendiamina + cadena rédox mitocondrial.0 II 1.5 III 1.0 0. barbital sódico y azida de sodio.5 V 0.1M.0 0.4 Azida de sodio Barbiturato de sodio 0.0 0.5 Mezclar. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) En el sistema Deshidrogenasa málica + malato + cadena rédox mitocondrial. dejar en reposo a temperatura ambiente por 20 minutos.5 0. 6-diclorofenol indofenol 0.2 0.2 0.1M P±fenilendiamina 1% Homogenizado de mitocondrias Mezclar.2 0.2 0. TUBOS COMPONENTES (en ml. Indique usted los sustratos y enzimas que intervienen en los sistemas realizados en la práctica. ¿Si utiliza el indicador rédox 2. 5. barbiturato de sodio y azida de sodio? 3. barbiturato de sodio y azida de sodio? 4. ¿Si utiliza el indicador p±fenilendiamina en un sistema con cadena respiratoria. ¿Qué inhibidores de la cadena de óxido reducción conoce y a qué nivel actúan? 2. la acción de los inhibidores e indicadores utilizados en el experimento. . CUESTIONARIO: 1.6-diclorofenolindofenol en un sistema con cadena respiratoria.25 Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos). Grafique usted en una cadena de óxido reducción biológica. que cambios observaría con la rotenona. que cambios observaría con la rotenona. IV. La finalidad del presente trabajo es objetivizar la distribución intracelular de las enzimas de óxido . aminoácidos y algunas otras sustancias sufren oxidaciones en el organismo mediante sistemas enzimáticos simples o complejos. hallándolas de modo fundamental en una subestructura celular en donde la energía derivada de las oxidaciones es "capturada" en la forma del intermediario macroérgico ATP.6 diclorofenilindofenol y p . las enzimas que intervienen en estos pr cesos se encuentran o clasificadas en diversos grupos y tienen denominaciones particulares dentro de la literatura enzimológica. II. Se hace presión manualmente con el embolo girando hacia el fondo.154 M III. El sedimento constituye la fracción nuclear y se coloca en un beaker de 100ml. inmediatamente se hara un corte longitudinal en el abdomen procediendo a extraer el hígado.02 % Succinato 0.fenilendiamina y los componentes celulares de un homogeneizado de hígado de rata obtenidos por centrifugación dif rencial mediante el método de e Schreider y col.26 PRACTICA N° 09 DISTRIBUCIÓN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE ÓXIDOREDUCCIÓN I. Las enzimas de óxido . previa calibración en la balanza. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Fraccionamiento Celular Cada grupo recibirá una rata albina (Rattus rattus var.reducción usando los indicadores redox 2 . se emplea una centrífuga refrigerada. Todo debe trabajarse entre 0 y 4ºC.4 2.reducción tienen una distribución característica intracelularmente. fosfolípidos. De acuerdo a su estructura y función.154 M. Estos sistemas están constituidos por proteínas. Homogenizado al 10%: se pesa 10gr de hígado y se corta en fragmentos pequeños y se coloca en el homogenizador potter y se le agrega solución de KCl 0. El sedimento se separa en otro beaker y constituye la fracción mitocondrial. El sobrenadante es separado en un beaker de 500ml. Se separa el sobrenadante en un beaker. ácidos grasos. El homogenizado es centrifugado a 800 revoluciones por 10 minutos colocándolo en tubos de polietileno. El animal será sacrificado.1M p±fenilendiamina 1% Homogenizado total de hígado de rata en sucrosa 0. albicans).1M pH: 7. Fracción mitocondrial del homogenizado. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato de sodio 0.6-diclorofenolindofenol 0. Se coloca el hígado en un petri se elimina la cápsula del hígado y otros tejidos periféricos. INTRODUCCION: Los carbohidratos. Fracción microsomal soluble del homogenizado. grupos prostéticos y átomos metálicos. KCl 0.25 M Fracción nuclear del homogenizado. El sobrenadante anterior es centrifugado a 15000 revoluciones por 15 minutos en la centrífuga refrigerada. - - . constituyendo la fracción microsomal con el citosol. 5 0.2 0.0 0.5 1. ¿Qué es el p-fenilendiamina y cómo actúa en la cadena respiratoria? 3. Haga un esquema de la centrifugación diferencial .0 0. pH 7. para interpretar los resultados.0 0.27 Armar el siguiente sistema: COMPONENTES Buffer fosfato 0.1M.5 - Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente.6-diclorofenolindofenol y cómo actúa en la cadena respiratoria? 2. ¿Qué es el 2.5 0.0 0.5 4 1.0 0.5 1.0 0.4 2 ± 6 diclorofenolindofenol Succinato de sodio 0. ¿En que fracciones celulares se encuentran las enzimas de óxido ± reducción? 6. CUESTIONARIO: 1.1M.5 2 1.5 0.5 0.0 0. pH 7.5 3 1.0 1.0 0.5 Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador.1M Fracción nuclear Fracción mitocondrial Fracción microsomal -soluble Homogenizado total I 1.2 0. ¿Qué es un homogenizado de hígado y cómo se obtienen las fracciones celulares por centrifugación diferencial? 5.2 II 0.0 0. Grafique usted en una cadena de óxido ± reducción biológica la acción de los indicadores rédox 2.5 1.4 P ± fenilendiamina 1% (sustrato + indicador) Fracción nuclear Fracción mitocondrial Fracción microsomal ±soluble Homogenizado total 0.5 V 0.5 1.5 IV 0.2 0. empleando: COMPONENTES Buffer fosfato 0. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador. IV. Armar otro sistema. para interpretar los resultados.6 diclorofenolindofenol y p±fenilendiamina. 4.5 5 1.2 0.5 1 1.5 III 0. La amilasa comprende a sólo el 20% del almidón y es soluble en agua. mide la cantidad de almidón hidrolizado y por ende la actividad de amilasa de la muestra. En obstrucción de los conductos puede elevarse. con frecuencia 2-3 días después. INTRODUCCION: La amilasa es una enzima que hidroliza el almidón. en el que la cantidad de almidón y tiempo de incubación son ajustados de manera que sólo una porción de almidón es hidrolizado cuando la reacci n ó es parada por la adición de yodo. pero al año de edad la actividad es igual a la del adulto. Es posible encontrar valores más altos. encefalitis viral. la amilisa sérica se altera. trombosis mesentérica. uremia después de la administración de codeína. músculo estriado. Para la determinación de amilasa usamos el método de Caraway. Si liberan alfa o beta maltosa. La amilasa salival y pancreática humana esta dentro del grupo de las primeras. difiere de la amilasa porque contiene además enlaces alfa 1-6 glucosídicos frecuentemente ramificados. El origen de la amilasa sérica humana incluye al páncreas y glándulas salivales. se les clasifica en alfa y beta amilasa. La elevación puede ocurrir en otras condiciones que incluyen enfermedad de las glándulas salivales (pancreatitis).28 PRACTICA N° 10 DETERMINACION DE AMILASA SERICA I. Se ha reportado incremento después de la ingestión de alcohol. En la bilis no hay actividad. En el suero humano. peritonitis. . Otras fuentes incluyen el hígado. las cuales explicarían probablemente menos del 25% de la actividad sérica normal. trompa de Falopio y tejido adiposo. La alfa amilasa actúa rompiendo los enlaces alfa 1-4 glucosídicos en la parte central de la amilasa formando una mixtura de pequeñas dextrinas + maltosa. También ha sido informado en leche y en el semen humano. La amilasa es un poliglucósido de configuración lineal de unidades de glucosa unidos por enlace alfa 1-4 glucosídicos. La diferencia entre la cantidad de color azul formado en la muestra incubada y el blanco incubado por la adición de suero después de la incubación. En algunas de estas condiciones. La amilasa puede ser detectada en niños desde 1 a 2 meses de edad y los valores son más bajos que en el adulto normal. después de la administración secretina. El presente experimento tiene por finalidad determinar la amilasa sérica en personas normales y/o con alteraciones patológicas especialmente del pancreas. las elevaciones son (con excepción de los niveles obtenidos después de la administración de opiáceos) menos de 500 unidades. amilasa y amilopectina producen sólo B-glucosa por hidrólisis. obstrucción intestinal. en pacientes con insuficiencias pancreática. enfermedad séptica aguda del coledoco. En pancreatitis se llega hasta 2000 a 3000 unidades. diuréticos tiazídicos. la amilasa se encuentra grandemente incrementada y retorna a los valores normales lentamente. En los casos señalados se ha propuesto la prueba funcional de la amilasa sérica después de la administración de secretina y morfina. Muy raramente permanece elevada 4-6 días. En otros. morfina. Si dentro de 24 horas no se eleva. no es probable el diagnóstico de pancreatitis aguda. así como en la orina existe actividad amilásica. úlcera duodenal o gástrica penetrante o perforada. edema y pancreatitis están presentes indudablemente. Ambas. Para la mayor parte. el resto es una fracción inosoluble llamada amilopectina. Entre 2 ± 12 horas después de producida la pancreatitis aguda. después de ruptura esplénica. la explicación no es clara. Bajos niveles pueden encontrarse en pancreatitia crónica y en carcinoma pancreático cuando el daño es extenso y hay insuficiencia de las acinos glandulares. Después de la administración de morfina en normales se incrementa la amilasa sérica. Los valores normales de amilasa por el método de Caraway calibrado en unidades Somogy es de 60 a 180. cirrosis. En normales. carcinoma bronconígeno y en neumonía. después de colangiografía. debido a que las proteínas séricas disminuyen la cantidad de color producido por el complejo yodo ± almidón y este podría ser diferente).0 : y Solución Stock de iodo : y Solución iodada de trabajo: III. REACTIVOS A UTILIZAR: y Sustrato de almidón Bufferado. 3. en CÁLCULO Absorbancia del _ Absorbancia del blanco problema _______________________________________ X Absorbancia del blanco 5.29 II.1 ml.0 ml. IV. Leer 660 nm.0 ml. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento): Armar el siguiente sistema: (Utilizar dos frascos volumétricos ± Erlenmeyer de 50 ml. De qué manera el ión cloruro activa a la amilasa ¿Qué semejanza o diferencia puede establecer usted entre amilasa dializada y no dializada.1 ml. 0. 0.5 minutos exactamente 800 = Unidades de amilada por 100 ml (Se requiere un blanco por cada muestra de suero. en función de la actividad enzimática? ¿Cómo explica usted el diferente comportamiento de la amilasa hepática y pancreática sometidas a electroforesis? ¿Por qué la concentración de amilasa sérica es menor durante los primeros meses de vida lactante? . Mezclar bien. 35 ml. II BLANCO 5.0 ml. 2. CUESTIONARIO: 1.) I PROBLEMA Sustrato de almidón Bufferado Retirar los frascos y agregar suero Retirar los frascos y agregar suero Agua destilada Solución iodada de trabajo. pH 7. 4.0 ml. 35 ml. 5. espectrofotómetro a Incubar a 37°C durante cinco minutos ambos frascos Mezclar e incubar a 37°C durante 7. 5. 30 . 31 II UNIDAD METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS REUNION DE LABORATORIO N° 05 PRACTICA N° 11 DEMOSTRACION DE LA DIGESTION Y ABSORCION DE LOS CARBOHIDRATOS: GLICEMIA PRE Y POST-PRANDIAL. producción endógena de glucosa así como la utilización y excreción de la misma. con el método de la glucosa oxidasa la concentración varía entre 70 ± 110 mg/dl. el transporte de glucosa al interior de las células es por difusión pasiva. siendo el hepatocito permeable para este metabolito. contribuyen a mantener constante la concentración de glucosa en sangre. I. En casi todos los demás tejidos la glucosa no puede penetrar en el interior de las células por simple difusión. que proviene del hígado por glucogenólisis. se llama cotransporte. Por todo esto. En el caso del hígado. Varía entre los 80 ± 120 mg%. sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos estados patológicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento. Diversos factores que inciden sobre la absorción. Los valores normales de glucosa en sangre son variables de acuerdo al método utiizado. El mecanismo por el cual ocurre este pasaje activo de la glucosa a través de las células de la mucosa intestinal no es muy conocido. En el cerebro y los glóbulos rojos es la única fuente de energía. La entrada de la glucosa en estas células está supeditada a que. sino que lo hace por un mecanismo de difusión controlada. el corazón y el músculo esquelético. el sodio. el organismo dispone de una compleja maquinaria metabólica que permite asegurar la constancia de la concentración de glucosa en la sangre y. INTRODUCCION: La glucosa sanguínea es una de las fuentes de energía más importantes en el organismo y en algunos tejidos altamente especializados. hay gasto de glucosa cuando es removida de los tejidos periféricos (para su consumo) y por excreción renal por la orina. En este caso la glucosa entra en la célula. con ella. La glucosa en sangre. Este es un caso interesante en que un sistema de transporte a través de la membrana favorecería a otro. A su vez. y de origen endógeno. en particular en el tejido adiposo. Por otra parte. volvería a salir de la célula. Según el método l de Folin Wu. Este proceso. por la bomba de sodio y potasio. posiblemente porque se une a la misma proteína transportadora que lleva el sodio. por ello. por lo tanto la concentración de glucosa en sangre depende del balance entre el aporte y el gasto de la misma en el organismo. . El conocimiento de la glicemia es importante no sólo porque permite tener una idea integral del mecanismo de homeostasis metabólica existente. proviene de dos orígenes: de origen exógeno de los alimentos. Se cree que está íntimamente ligado al transporte de sodio. y depende de su funcionamiento de que exista una alta concentración de sodio en fluído extracelular. al salir del Na+ mantenga alta concentración en el líquido extracelular. la constante disponibilidad de este sustrato a los tejidos. Este mecanismo requiere ATP como fuente de energía. como máximo. ----20 ul ----2 ml Dpost. y con aguja N° 20. CUESTIONARIO: 1. con jeringa hipodérmica de 10 ml. Cálculo de los resultados : Glucosa (g/l) = D x f donde 1. tanto en personas normales como en casos patológicos. Mezclar por inversión sin agitar. En esos momentos. La determinación de la glicemia se realizará por el método Enzimático de la glucosa oxidasa. Restar a D el Blanco (B) y el resultado se multiplica por f. colocar: COMPONENTES Standard Muestra (suero preprandial) Muestra (suero postprandial) Reactivo de trabajo B ------------2 ml S 20 ul --------2 ml Dpre. (Desconocido post prandial). cuál es el rango considerado normal para la glicemia basal? Explique las variaciones en los valores.Reactivo 4. Colocar las muestras en tubos de ensayo. S (Standard). --------20 ul 2 ml Incubar todos los tubos 10 minutos en baño de agua a 37 ºC Leer en Espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con el blanco. . luego se centrifuga a 3000 RPM por 10 minutos. Rotular y fechar.GOD/POD: Solución de glucosa oxidasa (1. REACTIVOS A UTILIZAR . IV. Utilizar 4 tubos de ensayo: B (Blanco). después de la ingesta alimenticia. de sangre de la flexura del codo. Dpre.000 partes con agua destilada.32 La finalidad de la siguiente práctica es demostrar la digestión y absorción de la glucosa. ¿Actualmente. 50 partes de Reactivo Fenol y llevar a 1. por el método de Glucosa oxidasa. cuantificando la glicemia pre y postprandial.000 U/ml) y Peróxidasa (120 U/ml). 50 partes de Reactivo 4. III.AF: Solución de 4 ± aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0.92 mol/l. que usted puede encontrar por ejemplo en una intolerancia a la glucosa. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES : Se tomarán dos muestras de sangre : La primera: La persona debe mantener de 4 a 8 horas de ayuno al momento de obtener la muestra. . . (Desconocido preprandial) y Dpost. Separar el suero. Agregar 3 partes de enzimas GOD/POD previamente homogenizadas.Reactivo Fenol: Solución de Fenol 55 mmol/l. Antes de multiplicar D x f. y Dpost.Preparación del Reactivo de trabajo: 500 partes de agua destilada. se deja reposar 10 minutos. se extraerán 5 ml. II.Estándar: Solución de glucosa 1 g/l . La segunda: Esta muestra se tomará después de una hora.00 g/l f = ----------- S y D = Dpre. .AF. . La acción de la beta amilasa también rinde una dextrina límite.H2S04 concentrado. La finalidad de la siguiente práctica es cuantificar el glucógeno en ayunas y después de la uingesta de alimentos y evaluar los valores encontrados relacionados con los factores que determinan sus síntesis y degradación II. INTRODUCCION: El glucógeno está presente en el citosol en forma de gránulos los que contienen las enzimas glucógeno fosforilasa. ¿Cuál son los criterios bioquímicos.Homogenizado de hígado de rata al 10 % (pesar 10 g.Na2S04 solución saturada. ¿Qué variaciones fisiológicas de glicemia puede usted señalar? PRACTICA N° 12 INFLUENCIA DE LA DIETA EN LA FORMACIÓN Y ALMACENAMIENTO DEL GLUCÓGENO HEPÁTICO I. Se encuentra glucógeno o se puede sintetizar en cualquier célula del organismo. 3.5 . EXTRACCION DE GLUCOGENO HEPATICO (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) Homogenizado de hígado en ayunas Homogenizado de hígado post prandial I 0. REACTIVOS A UTILIZAR . de hígado y homogenizar con agua destilada.KOH al 60 % .Alcohol absoluto.Fenol al 80 % . glucógeno sintetasa y algunas otras que regulan la síntesis y degradación. ¿Conoce otros métodos para determinar la glicemia? Explique su fundamento 4.) III.4 y alfa 1.5 --II --0. relacionados con la glicemia.4 y las ramificaciones se forman por enlaces glucosidicos alfa 1. El glucógeno es una forma de almacenamiento de glucosa de fácil disponibilidad. La mayoría de los residuos de glucosa en el glucógeno están ligados por enlaces glucosídicos alfa 1. ¿Cómo esperaría encontrar los valores de la glicemia dosada en la sangre venosa y en la sangre arterial? Fundamente las variaciones que se pueden encontrar. El glucógeno es también fácilmente hidrolizable por alfa y beta amilasa para rendir glucosa y maltosa respectivamente. En cambio el glucógeno post prandial es debido a que la glucogénesis se incrementa cuando las concentraciones en sangre alcanzan valores de 150 mg/100 ml ó más.33 2. .6 los cuales se presentan con frecuencia aproximada de uno por cada 10 residuos. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. lugares principales de almacenamiento. pero las concentraciones varían en los diferentes tejidos correspondiendo las concentraciones más altas del hígado y al músculo esquelético. El glucógeno puede ser aislado de los tejidos por digestión con soluciones de hidróxido de potasio caliente en los cuales los enlaces no reductores alfa 1. .6 son estables. para el diagnóstico de diabetes mellitus? 5. En el hígado el glucógeno se incrementa después de la ingesta de alimentos (período post prandial) llegando a los límites máximos cuando la dieta es abundante y/o en base a carbohidratos. 1 0. 540 n m.I ± Lect. 0. Alcohol al 98 % 5. Explique los mecanismos que regulan la homeostasis de la glucosa y el rol del glucógeno durante el ayuno prolongado.0 5.0 Fenol al 80 % 0. . Leer en el fotocolorímetro con filtro verde.1 0. ¿Cómo espera encontrar las concentraciones de glucógeno en la muestra de hígado de rata en condiciones de ayuno? Dé usted las razones metabólicas que expliquen su resultado. CUANTIFICACION POR METODO COLORIMETRO DEL GLUCOGENO EXTRAIDO Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml)) I II BLANCO Muestra del tubo I del Sistema anterior««««««« 1.34 KOH al 60 % 0. Centrifugar a 3500 RPM por 10 min.0 --Muestra del tubo II.1 Mezclar. Reposo por una hora. ¿Qué relaciones metabólicas puede usted establecer entre los valores de glucógeno obtenidos en ambas muestras de hígado de rata. Eliminar el sobrenadante y colocar boca a bajo los tubos sobre papel de filtro por 5 minutos.0 5. y sin retirar los tubos del baño helado: Agregar H2S04 cc.0 5. Blanco) x Factor IV. motivo del experimento? 4.0 -Agua destilada 1.0 Na 2SO4 solución saturada.5 Calentar los tubos en baño maría a 100 C por 10 min. Agregar agua destilada 5.0 Disolver el precipitado por agitación.1 0. ¿Porqué mecanismo metabólico el glucógeno incrementa cuando la concentración de glucosa en sangre es mayor de 150 mg/dl? 5.0 1.5 0. CUESTIONARIO: 1. ¿Cómo espera encontrar las concentraciones de glucógeno en la muestra de hígado de rata en condiciones post prandial? 3.0 Mezclar y dejar en el baño de agua helada durante 5 minutos más.0 5. 2. Colocar los tubos en agua helada durante 5 min.1 Mezclar. gota a gotaen el centro de c/tubo 5. CALCULOS: Factor Espectrofotómetro = 7 g % de glucógeno = (Lec.0 2. del Sistema anterior« -1. a la vez que acelera la oxidación de glucosa en diferentes tejidos. INTRODUCCION: La glucosa sanguínea proviene de: glucógeno hepático. de peso corporal sometidos a ayuno de 8 horas.Conejos adultos de más de 2 kg. de modo que el mantenimiento de la glicemia en niveles normales depende del equilibrio entre la producción y la utilización de la glucosa sanguínea. la glicemia es muy constante. Los mecanismos reguladores de la concentración de glucosa son nerviosos y endocrinos y es muy posible que los primeros actúan en realidad mediante modificaciones en la entrega de hormonas por las glándulas de secreción interna. . el efecto se debe fundamentalmente a que la hormona favorece la formación de glucógeno en el hígado y en el músculo. La insulina también favorece la conversión de los hidratos de carbono en ácidos grasos y por otro lado inhibe la gluconeogénesis a partir de los aminoácidos. La secreción de insulina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de glicemia. REACTIVOS A UTILIZAR . lipogénesis y otras semejantes. Se explica así que la falta de insulina determina una hiperglicemia que es el signo fundamental del cuadro denominado Diabetes. II. La administración de insulina va seguida de la glicemia (hipoglicemia) cuya magnitud depende de la dosis administrada. una excesiva excreción de glucosa por la orina (glucosuria) y un reducido nivel de glucógeno en el hígado. otros carbohidratos y de glucosa absorbida por el intestino. La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de administración de insulina.Glucómetro. La insulina ejerce efectos sobre el metabolismo de la glucosa y otros nutrientes. En condiciones normales. Esta hormona es producida por las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas y es secretado en respuesta directa al incremento de glucosa en la sangre. . . Siendo en la sangre arterial mayor que en la venosa.Jeringas hipodérmicas de 1 cc. en ayunas. El efecto más importante de una deficiencia insulínica es el de un nivel sanguíneo de glucosa elevado (hiperglicemia).Solución de insulina cristalizada (Lilly): I Unidad por ml. de manera que cada vez se eleva la glicemia. pues es utilizada por todas las células para producir energía y por algunas células para funciones más especializadas por ejemplo glucogénesis. se produce más insulina que tiende a aminorarla. La glicemia se eleva después de la ingestión de un alimento rico en hidratos de carbono para luego descender poco a poco de modo que una hora y media o dos horas después de la ingestión vuelve al nivel de ayunas. cuya sensibilidad está regida en medida importante por el balance entre la insulina por un lado y las hormonas suprarrenales y de la adenohipófisis por el otro. aminoácidos. . La glucosa de la sangre es distribuida a los tejidos.35 REUNION DE LABORATORIO N° 06 PRACTICA N° 13 REGULACIÓN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUÍNEA ACCION DE LA HORMONA INSULINA I.  Luego extraer muestras de sangre a los 15 . de la tasa de llegada e índice de salida de la glucosa de la sangre.36 III. Explique brevemente la regulación de la glicemia. Dosis de la solución de insulina cristalina (I Unidad por ml) inyectar I Unidad por Kilogramo de peso corporal. EXTRACCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE INSULINA. Utilizar una jeringa hipodérmica de 1 ml. 30 y 60 minutos después de inyectada la insulina. Hacer una gráfica de glicemia vs tiempo       IV. en términos generales. como resultado. Explique cómo y porqué se producen los signos y síntomas del cuadro clínico de hipoglicemia. que facilita la medida de la dosis. lo que hace un total de tres muestras en una hora. 3. 4. 2. y y Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de insulina a inyectar. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. Explique el mecanismo de acción de la insulina en la homeostasis de la glucosa.  Extraer una primera muestra de sangre del pabellón auricular del conejo. CUESTIONARIO: 1. Explique la naturaleza química y las acciones biológicas de la insulina. ¿Cuáles son las hormonas contrarreguladoras y su mecanismo de acción? 5. . Anotar los resultados en relación al tiempo. La que servirá para establecer los valores basales de glicemia.  Inyectar por vía intraperitoneal la cantidad calculada de insulina. Con cada una de las citadas muestras realizar los dosajes de glucosa según el método de Glucocinta 5. Extraer una primera muestra de sangre. CUESTIONARIO: 1. tomando las variaciones en relación al tiempo.25 ml de la solución a utilizar por kg de peso. II.  Dosis de la solución de adrenalina (0. 2.025 mg por cada kilogramo de peso corporal que corresponde a 0. III. 3. 30 y 60 minutos después de inyectada la adrenalina. EXTRACCION DE ADRENALINA. . por la ausencia en este de la glucosa 6. ¡ ¡ ¡ IV. La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de la administración de adrenalina. ¿Cuál es el mecanismo de acción hormonal de la adrenalina a nivel de sus órganos blanco? Explique de manera suscinta el efecto de la adrenalina sobre la glicemia. ACTIVIDADES INTRUCCIONALES: Procedimiento  Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de adrenalina a inyectar. Utilizar una jeringa hipodérmica de tuberculina que facilita la medida de la dosis. del pabellón auricular del conejo. Explique la naturaleza química y las acciones fisiológicas de la adrenalina. construir una gráfica. ¿Cuál es el efecto metabólico de la adrenalina sobre el hígado y sobre el tejido muscular y que efecto produce sobre la glicemia? . la glucogenólisis se realiza con la formación de lactato el que va ha contribuir directamente a la formación de glucosa y glucógeno en la célula hepática por los mecanismos gluconeogenéticos.fosfatasa. hormona secretada por la médula suprarrenal. si l aparece hipoglicemia se segrega más adrenalina y glucagón que aceleran la regulación que espontáneamente debe realizar el hígado. además de actuar en el músculo. Luego extraer muestras de sangre a los 15 .37 ACCION DE LA HORMONA ADRENALINA I. con especial referencia al metabolismo de los carbohidratos.Conejos adultos de más de 2 kg de peso corporal. 4. La secreción de adrenalina parece estar condicionada en forma importante por el nive de glicemia. . REACTIVOS A UTILIZAR . INTRODUCCION: La adrenalina.Solución de adrenalina 0.Jeringas hipodérmicas de 1 cc. Inyectar por vía intraperitoneal la cantidad calculada de adrenalina según el peso del animal. 4. tiene acción hiperglicemiante. Anotar los resultados en relación al tiempo. Servirá para establecer los valores basales de glicemia. 3.Glucómetro. LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE 1. ello se debe a que favorece la conversión del glucógeno en glucosa (glucogenólisis) en el hígado. 2.1 mg/ml) inyectar 0.1 mg por ml. El efecto glucogenolítico de la adrenalina es debido a que activa a la fosforilasa. lo que hace un total de tres muestras en una hora. Con los resultados así obtenidos. . sometidos a ayuno de 8 a 12 horas. Por el contrario. Los iones hidrógeno removidos se combinan con el oxígeno atmosférico y forman peróxido de hidrógeno (H2O2). b) Otros compuestos orgánicos: ácido homogentísico. sin tomar en cuenta su acción en el metabolismo hidrocarbonado? REUNION DE LABORATORIO N° 07 PRACTICA N° 14 DETERMINACIÓN CUALITATIVA Y SEMICUANTITATIVA DE GLUCOSA EN ORINAY SU DIFERENCIACIÓN DE OTROS AZUCARES REDUCTORES I. INTRODUCCION: En la orina de sujetos normales no existen cantidades detectables de azúcares en orina. en presencia de glucosa (sustrato) de la orina remueve de éste 2 iones hidrógeno (2H+) formando gluconolactona). La prueba está basada en que la glucosa urinaria en presencia de oxígeno. la orina en glucosa aparece aunque ésta se encuentre en concentraciones normales en la sangre (diabetes insípida). etc. La glucosa oxidasa. es posible encontrar cierta cantidad de elementos reductores que se eliminen diariamente entre 0. c) Algunas drogas y/o sus catabolitos: salicilato cloral. La glucosa puede ser determinada de manera específica utilizando como reactivo básico la glucosa oxidasa (método enzimático). REACTIVOS A UTILIZAR .5 y 1. pero cuando la glicemia supera los 180 mg % se puede producir glucosuria (presencia de glucosa en orina) porque en estas condiciones se supera la capacidad del riñón para reabsorverla (dintel renal). En la orina. y por tanto es explicable que no aparezca glucosa en orina. fructuosa. el cual es hidratado a ácido glucónico. ¿Qué efectos tiene la adrenalina. pero como anotamos éste identifica a las sustancias con capacidad reductora y por tanto es de carácter inespecífico.5 g/l. de uso generalizado en clínica. Todas ellas pueden dar resultado positivo con el reactivo de Benedict que con relativa frecuencia se utiliza para determinar glucosa en orina. en presencia de peroxidasa produce 0-tolidina oxidasa (de color azul) más agua. ácido úrico. puede eliminarse muchas otras sustancias reductoras entre las que podemos señalar: a) Otros azúcares reductores: lactosa. utilizando un método específico a base de glucosa oxidasa y otro inespecífico en base al reactivo de Benedict. ácido glucorónico. por acción de la glucosa oxidasa produce ácido glucorón más peróxido de ico hidrógeno. El peróxido de hidrógeno en presencia de peroxidasa oxida a la 0-tolidina y toma color azul. II. cuando existe insuficiencia renal (menor filtración) no aparece glucosa en la orina aunque la concentración de glucosa se encuentra elevada por encima de 180 mg %. galactosa y pentosas. La glucosa del filtrado glomerular renal se reabsorbe en su totalidad en los tubos contorneados proximales. formaldehído. Los azúcares forman más o menos la décima parte de dicha cantidad y de ella no puede decirse que su totalidad esté constituída por glucosa. La finalidad del presente experimento es identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras. Este. Cuando la capacidad de reabsorción renal disminuye. además de glucosa. creatinina.38 5. Sin embargo. ácido ascórbico. en relación a la glicemia del paciente podría plantear? Explique el fundamento del método de a glucosa oxidasa para la detección de glucosuria. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. Determinación de sustancias reductoras en orina mediante el reactivo de Benedict. Para identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras. Explique que es el umbral renal de la glucosa. Tiras impregnadas de glucosa oxidasa prefabricadas (Glucocinta Lilly). primero con el reactivo de Benedict y luego por el método de la glucosa oxidasa Que presunciones plantearía si una muestra de orina tratada primero con el reactivo de Benedict da resultado positivo y sin embargo. 3. Agitar para evitar que el líquido se proyecte hacia fuera del tubo. Cuidar que la llama incida en la parte media y superficial del líquido contenido en el tubo. la reacción demuestra la presencia de sustancias reductoras. Fundamente la utilización del reactivo de Benedict para la detección de sustancias con capacidad reductora. . Observar si a los 60 segundos. Si aparece un precipitado de color rojo ladrillo. 2. Observar si hay cambio de color y precipitado. 4. Agregar orina problema: 5 gotas. 1. 2. 2. 3. realizamos la siguiente determinación con la misma muestra de orina. al ser tratada con el método de la glucosa oxidasa. IV. Introducir la tira impregnada de glucosa oxidasa (Glucocinta) en la orina recién emitida contenida en un depósito de 5.10 ml.39 - Reactivo de Benedict. Determinación enzimática de la glucosa en orina (Método de la glucosa oxidasa). Llevar al baño de agua hirviendo por 5 min o exponer el tubo al fuego directo hasta que hierva por 1 min. Compare la intensidad de la coloración azulada con una escala adjunta que representa aproximadamente las concentraciones preestablecidas de glucosa. 6. Colocar Reactivo de Benedict en un tubo: 5 ml. incluida la glucosa Que resultados podrían obtenerse al tratar una muestra problema de orina. 5. CUESTIONARIO: 1. III. después de humedecida la cinta. da negativo Ante una prueba positiva de glucosa en orina: ¿Qué presunciones diagnósticas. Colocar en baño de agua hirviendo por 5 min o exponer al fuego directo hasta ebullición por 1 min. 3. Procedimiento: 1. 4. adquiere o no color azul. 40 . Un resultado positivo por este procedimiento debe ser confirmado y cuantificado por columna cromatográfica ó utilizando la reacción de precipitación con cloruro de cetil piridium. Si un resultado cualitativo para investigar mucopolisacáridos en orina ha sido positivo ¿Porqué debe ser confirmado y cuantificado por cromatografía o precipitación? ¿Cuál es la constitución química básica de los glicosaminoglicanos (mucopolisacáridos)? ¿Cuál es la constitución química básica de los proteoglicanos? Cite 5 ejemplos de éstos. INTRODUCCION: Determinar desórdenes genéticos puede involucrar los sistemas enzimáticos esenciales del metabolismo de los mucopolisacáridos. RESULTADOS Positivo: aparición de un color púrpura. 300 ml . 20 ml. Síndrome de Hurler. IV.Poner una gota de orina al centro de un papel de prueba con Azure-A. Sacar y secar la tira de papel en estufa a 80º C o con aire caliente. Los individuos con MPS secretan grandes cantidades de mucopolisacáridos. III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. Síndrome de Sanfilippo. Dejar 3 min. Transferir a una caja Petri llena de solución de lavado.41 PRACTICA N° 15 IDENTIFICACION DE MUCOPOLISACARIDURIA I. los cuales son excretados anormalmente en grandes cantidades en las mucopolisacaridosis (MPS). Negativo: aparición solamente de un color azul pálido. REACTIVOS A UTILIZAR . 2. Dejar por 20 min. en contacto con mucopolisacpáridos forma un complejo de color púrpura metacromático. heparán sulfato y queratán sulfato. . La finalidad del experimento es determinar cualitativamente en orina la excesiva excreción de mucopolisacáridos. III y IV. cerca de 100 mg/día. La presencia de mucopolisacáridos en orina puede detectarse por un simple procedimiento o Test de Identificación de Mucopolisacáridos que se basa en que el papel Whatman I impregnado con el colorante AZURE-A. II. Estas son subdividas en varios grupos tales como : Síndrome de Morquiolo.La orina turbia debe ser filtrada o centrifugada previamente. 3. resultado obtenido cuando la excreción está sobre el límite superior normal de 15 mg/día. Los mucopolisacáridos son sustancias de gran peso molecular que se encuentran en varios tejidos: Conectivo. II. aorta. De acuerdo a su composición química los mucopolisacáridos están agrupados en dermatán sulfato. . cartílago. 0. llamados también MPS I.Usar orina fresca o de 24 hrs conservadas en refrigeración (no usar preservantes). CUESTIONARIO: 1.Solución de Lavado :  Metanol  Acido acético glacial  Agua destilada. válvulas del corazón y son responsables de las características físicas de estas estructuras. cantidad que es bastante elevada si se compara con los 15 mg/día que excretan las personas normales. cordón umbilical. Síndrome de Hunter.Papel Whatman I impregnado con Azure-A . .1 ml. 42 4. ¿Cuál es la importancia biológica del ácido hialurónico, condroitina y heparina? III UNIDAD METABOLISMO DE LIPIDOS REUNION DE LABORATORIO N° 08 PRACTICA N° 16 DEMOSTRACIÓN DE LA DIGESTION DE LAS GRASAS IN VITRO. ACCION EMULSIFICANTE DE LAS SALES BILIARES SOBRE LAS GRASAS. ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA SOBRE LOS TRIGLICÉRIDOS Y EFECTO DE LAS SALES BILIARES I. INTRODUCCION: Los triglicéridos son los principales lípidos de la dieta. En el estómago ocurre la acción de la lipasa gástrica y la licuefacción de la masa de lípidos de los alimentos por contraccion peristálticas. La es principal digestión ocurre en el duodeno, tiene lugar en la interfase agua-lípido y su velocidad depende del área de superficie de la interfase, la cual es grandemente incrementada por el movimiento peristáltico del intestino combinado con la acción emulsificante de los ácidos biliares. Los ácidos biliares son moléculas anfipáticas sintetizados por el hígado a partir del colesterol y secretados como conjugados de glicina y taurina. La lipasa pancreática (Triacilglicerol lipasa) cataliza la hidrólisis de los triglicéridos en sus posiciones 1 y 3 para formar secuencialmente 1-2 diacilglicerol y 2 acilglicerol, junto con ácidos grasos. La actividad enzimática de la lipasa pancreática incrementa grandemente cuando contacta la interfase agua-líquido, un fenómeno conocido como activación interfacial. La unión a la interfase agua-líquido requiera la colipasa, una proteína de 90 residuos que forma un complejo 1:1 con la lipasa pancreática (449 residuos), con cambios conformacionales que f rma una o superficie hidrofóbica y deja libre el centro activo. La alteración en la digestión o absorción de las grasas produce esteatorrea La finalidad de la práctica es demostrar la acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas comparando su efecto con el agua y el cloroformo. Asimismo la acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y el efecto de las sales biliares. II. REACTIVOS A UTILIZAR III. Cloroformo Aceite vegetal, de olivo Solución de sales biliares Buffer fosfato 0.1M pH 8,0 Emulsificación de aceite vegetal Solución de fenolftaleina (Solución alcohólica) Hidróxido de sodio (NaOH) 0.1N ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento 43 y Acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas utilizando tubos de 15 x 125 mm. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES Aceite de olivo(gotas) Agua destilada (ml) Cloroformo (ml) Sales Biliares (ml) Agitar enérgicamente los tubos Dejar en reposo y anotar los resultados para interpretarlos Acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y efecto de las sales biliares sobre la reacción enzimática utilizando tubos de 20 ± 25 x 150 mm. COMPONENTES (ml) TUBOS Emulsificación de aceite vegetal Buffer fosfato 0.1M pH 8.0 Solución de sales biliares 1 % Solución de extracto pancreático 1 % Agua destilada I 2 2 2 3 II 3 2 2 2 III 3 2 2 2 IV 3 2 2 2 Tubo 1 3 5 Tubo 2 3 3 2 Tubo 3 3 2 - Mezclar los 4 tubos y llevar al baño maría a 37 °C , por 30 minutos, agitando de vez en cuando. Al finalizar el tiempo de incubación retirar los tubos y agregar a cada uno 3 gotas de fenolftaleína. Mezclar bien y luego realizar la titulación. TITULACION: Utilizando una pipeta graduada de 1 ml, dejar caer gota a gota NaOH 0,1N en el fondo de cada tubo del sistema, mezclar bien hasta la aparición de un color rosado tenue persistente. Anotar la cantidad de NaOH 0,1N gastados. Anotar los resultados para su interpretación. IV. CUESTIONARIO: 1. Explique lo que son sustancias anfipáticas. 2. Diferenciar emulsión de solución, acción de las sales biliares vs cloroformo. 3. ¿Cuántas clases de lipasa pancreática actuán en el intestino? 4. Cuál de los métodos para medir la actividad enzimática se ha empleado en esta práctica. Explique el papel de la fenolftaleína en la titulación. 5. Diferencie la absorción de los ácidos grasos según su tamaño. 44 PRACTICA N° 17 DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS PRE Y POST PRANDIAL EN SUERO HUMANO I. INTRODUCCION: Los lípidos de la dieta son principalmente triglicéridos. Son transportados junto a colesterol y fosfolípidos por los quilomicrones, formados en el enterocito. Los quilomicrones son las lipoproteínas más grandes, menos densas, ricas en triglicéridos, con la apoproteína apo B48. Por el conducto toráxico llegan a la circulación general. El pico máximo de lipemia postprandial se observa entre las 4 y 6 horas de la ingesta, y al cabo de 9 a 10 horas retorna a los valores basales de lípidos, especialmente de los triglicéridos. Los niveles de lípidos postprandiales, especialmente de los triglicéridos dependen de la cantidad de lípido de la dieta, de la digestión y absorción, de los niveles basales sanguíneos, de la acción de la lipasa lipoproteic en los tejidos extrahepáticos. La lipasa a lipoproteica actúa sobre los triglicéridos de los quilomicrones, liberando ácidos grasos que son captados por los tejidos extrahepáticos. Los quilomicrones son convertidos en remanentes de quilomicrones y captados por el hígado. Se ha considerado al incremento de la lipemia postprandial como un factor riesgo de aterogénesis. La finalidad de la práctica es demostra las variaciones de la concentración de trigliceridos en suero después de la ingesta de alimentos de alto contenido de grasas II. REACTIVOS A UTILIZAR - Reactivo enzimático para determinación de Triglicéridos ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Un alumno por cada mesa vendrá en ayunas de al menos 10 horas, a las 7 a.m. se les extraerá una muestra basal. Ingerirán una dieta rica en grasas conteniendo un vaso de leche, un huevo, 2 panes y 10 aceitunas. A las 4 y 7 horas de la ingesta, se obtendrá una segunda muestra. Se obtendrá el suero y se hará la determinación de triglicéridos. Armar el siguiente sistema. COMPONENTES BLANCO STANDARD DESCONOCIDO Muestra --------10 ul Standard ----10 ul ----Reactivo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar e incubar 10 minutos de 20« 25 ºC ó por 5 minutos a 37 ºC. Medir la absorbancia del Standard y de la muestra frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos ( A). Cálculos: III. C ! 200 v (ADesconocid o ?mg / dl A (AStandar 1.71 mmol/l 2.28 mmol/l C ! 2.28 v (ADesconocido ?mmol / l A (AStandar Valores Referenciales Sospechoso: sobre 150 mg/dl ó Elevado: sobre 200 mg/dl ó 2. 3. Alteración de la lipemia postprandial en diabetes y familiares de diabéticos. Explique porqué el incremento de la lipemia postprandial es considerado un factor de riesgo coronario. CUESTIONARIO: 1. 5. . Cuál es el efecto de la edad. Destino de los productos de acción de la lipasa lipoproteica sobre los triglicéridos. 4.45 IV. Grafique los cambios de triglicéridos postprandiales en función del tiempo. el ejercicio y el género sobre la lipemia postprandial. Nitroprusiato de sodio 10% 3 gotas Amoníaco (agregar lentamente por las paredes del tubo. REACTIVOS A UTILIZAR: . sin mezclar) 1ml _________________________________________________________________________ Anotar sus resultados. . hipertiroidismo.5 g Mezclar hasta disolver los cristales de Sulfato de Amonio. especialmente de acetona. el aumento de la lipólisis. Aumentan en sangre (cetonemia) y en orina (cetonuria) por condiciones fisiológicas como el ayuno prolongado. Procedimiento: Armar el siguiente sistema: COMPONENTES TUBO Orina 3 ml Cristales de sulfato de amonio 0. en la enfermedad de Von Gierke y otras glucogenosis. el ácido beta hidroxibutírico y la acetona. incluyendo el cerebro en el ayuno prolongado. Estos son el ácido acetoacético. En la Diabetes mellitus. de la siguiente manera: II. En condiciones patológicas como la Diabetes mellitus. DETERMINACION SEMICUANTITATIVA DE CUERPOS CETONICOS EN ORINA I. en toda hipercatabolia como la fiebre. en los vómitos. cristales. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento INVESTIGACION DE ACETONA . Los cuerpos cetónicos son eliminados por la orina y la a etona también por la c respiración. de la beta oxidación y de la cetogénesis. a nivel mitocondrial.Cloruro Férrico.Sulfato de amonio. rinde un color azul violeta. a l denominada cetoacidosis diabética. solución al 10% en H2O . INTRODUCCION: La beta oxidación de los ácidos grasos en el hígado. Los dos primeros pasan a la sangre y son fuente de energía en los tejidos extrahepáticos como el corazón y el músculo esquelético.46 PRACTICA N° 18 IDENTIFICACIÓN DE LOS CUERPOS CETONICOS EN LA ORINA.Disponer de dos tubos que contengan orina normal y orina patológica. el hiperinsulinismo. III. al superar la capacidad de oxidación de los tejidos extrahepáticos lleva a niveles aumentados de cuerpos cetónicos. Prueba de Rothera y Trabajar del tubo identificado como orina patológica y Utilizar nitroprusiato en polvo. produce acetil CoA que ingresa al Ciclo de Krebs y en parte se utiliza en la síntesis de cuerpos cetónicos (cetogénesis). Prueba de Legal El nitroprusiato de sodio diluido en presencia de cuerpos cetónicos. solución al 5% en H2O. . Dado que éstos son ácidos se produce acidosis metabólica. El diagnóstico y monitoreo de su tratamiento se hace con su determinación en sangre o/i orina. en la dieta pobre en carbohidratos. y en sangre hasta 1mg/dl. en el síndrome de Fanconi. Su concentración normal en orina es de 125 mg/ 24 horas.Nitroprusiato de sodio. 1 cc 0. se debe multiplicar por 10 el número de veces que se ha diluido ésta.9 cc 3. CUESTIONARIO: 1.Armar dos sistemas que contengan orina normal y patológica.47   En una lámina de porcelana con excavaciones colocar 0. cetoacidosis y de ejemplos de cada uno de ellos. INVESTIGACIÓN DE ACIDO ACETOACETICO . Observar la máxima dilución de la orina en el que aparece color azul violeta y multiplicar por el denominador de la dilución alcanzada por 10 y se tendrá la cantidad aproximada de acetona en mg por 100ml.1 cc 0. 50. Procedimiento (Se utiliza orina filtrada): COMPONENTES Orina filtrada Cloruro Férrico.2 g de reactivo sólido de nitroprusiato de sodio en cada una de éstas.9 cc 4. Se basa en que en presencia de cloruro férrico. 5. 1/20. 15.9 cc + + + + + ORINA 0. 3.1 cc DILUCION 1/10 1/20 1/30 1/40 1/50   Agregar una gota de cada una de las diluciones. estimando la concentración como negativo 5. el ácido acetoacético rinde una coloración rojo burdeos. 1/30. de la siguiente manera: AGUA 0. en cada una de las excavaciones que contiene el reactivo.9 cc 1. Compare los métodos para determinar los cuerpos cetónicos. 4.1 cc 0. Diluir la orina al 1/10. etc. Este método con sus dos variantes es posible aplicarlo al suero sanguíneo. 2.1 cc 0. Cuál es el mecanismo fisiopatológico de la cetoacidosis en un paciente que llega al hospital por alcoholismo agudo . Esperar 20 segundos. cetonuria.9 cc 2. leer en escala colorimétrico. para calcular la concentración en orina diluida. para investigar acetona y tener una cifra aproximada en su cuantía. Sumergir la tira en el frasco conteniendo la orina. Uso de tira reactiva. Cuál es la importancia de la cuantificación de los cuerpos cetónicos en el monitoreo de la cetoacidosis. solución 5% en agua TUBO 5 ml gota a gota hasta la aparición del Color rojo burdeos si existe ácido Acetoacético IV. Esto es debido a que el nitroprusiato de sodio en polvo da reacción positiva solo cuando en la orina sin diluir alcanza la concentración mínima de 10 mg% de acetona y por eso. Prueba de Cloruro Férrico o de Gerhart. Realice una comparación entre la síntesis de cuerpos cetónicos con la etapa inicial de la síntesis de colesterol Defina: cetonemia. 150 mg/dl. Reactivo Standard para colesterol 50 mg/dl. el hipotiroidismo. limítrofe de 150 a 199. severa 500 o más La hipercolesterolemia puede deberse a causas primarias o secundarias. ictericia obstructiva. incubar 10 minutos de 20«25 ºC ó por 5 minutos a 37 ºC. etc. la hiperlipidemia familiar combinada. REACTIVOS A UTILIZAR: . en el denominado síndrome metabólico. la disbetalipoproteinemia. La hipertrigliceridemia puede deberse a causa primarias o familiares. el síndrome nefrótico. o secundarias a otras enfermedades. En la presente práctica. resistencia a la insulina. alto o protector mayor o igual a 60. En el colesterol se considera 3 niveles: Deseable < 200 mg/dl. . INTRODUCCION: El colesterol es un componente importante de las biomembranas. cirrosis biliar.El III Panel de Expertos ha establecido los valores de referencia para el colesterol. limítrofe alto 200-239 y alto definitivo > 240 (Hipercolesterolemia > 200 mg/dl). Los triglicéridos an ayunas circulan unidas a las VLDL y son fuente de energía para los tejidos. . regulando su fluidez. la hipertrigliceridemia familiar. Hipertrigliceridemia moderada de 200 a 499. 5 niveles: Óptimo < 100 mg/dl. Es transportado principalmente por la LDL que es considerada aterogénica. Medir la absorbancia del Starndard y de la muestra frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos ( A) III. por el método enzimático y la determinación de HDL. la hiperlipidemia familiar combinada la hiperkilomicronemia. Son causas secundarias: la diabetes. La HDL realiza el transporte reverso del colesterol. la gota. . A partir de él se forman los ácidos biliares y las hormonas esteroideas. se realizará la determinación de colesterol sanguíneo. previa precipitación de las otras lipoproteínas. el uso de anticonceptivos orales. obesidad central.. El HDL colesterol. y el resto en la VLDL y HDL. hiperglicemia e hipertensión. Entre las hipercolesterolemias primarias se señalan: La hipercolesterolemia familiar. y el LDL. normal a 40 a 59. 3 niveles: Bajo o de riesgo < 40. El LDL colesterol. Entre las secundarias: La diabetes. II. el HDL. Son hipertrigliceridemias primarias. En los triglicéridos se considera: normal menos de 150mg/dl.48 REUNION DE LABORATORIO N° 09 PRACTICA N° 19 DETERMINACION DE PERFIL LIPIDICO I. el alcoholismo. el lipoteroidismo. La hipertrigliceridemia se asocia a disminución de HDL. de los tejidos hacia el hígado y es considerada antiaterogénica . clorhidrato de magnesio.Reactivo precipitante de HDL: ácido fosfotungstico. la hipercolesterolemia poligénica.Precipitante para semimicro ensayos (PRECb) ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACIÓN DE COLESTEROL SANGUÍNEO Armar el siguiente sistema: COMPONENTE BLANCO PROBLEMA ESTÁNDAR Suero ----10 ul ----Estándar 200 mg/dl --------10 ul Reactivo enzimático 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar.Precipitante para macro ensayos (PRECa) . su incremento también es considerado factor de riesgo coronario. comparando con el blanco.17 v ¢ ¢ muestra standard ?mmol/l A ¤ ¤ £ . CALCULOS: Concentración HDL-Colesterol: Macro método : ¤ C ! 150 v A Desconocid o A Standard mg/dl Semi  micro método : ¤ C ! 175 v A Desconocid o A Standard mg/dl TG 5 Concentración de LDL-Colesterol: VALORES DE REFERENCIA: HDL-Colesterol: Hombres LDL  C ! TC  HDL  C  ?mg/dlA Mujeres (mg/dl) ¢ standard £ ¢ ! 200 v muestra ?mg/dl A ó ! 5.49 CALCULOS VALORES REFERENCIALES: Sospechoso: sobre 220 mg/dl Elevado: sobre 260 mg/dl DETERMINACIÓN DE HDL -COLESTEROL: Armar el siguiente sistema: ó 5.7 mmol/l Componente Macro Semi-micro Suero 500 ul 200 ul PRECa 1000 ul ----PRECb ----500 ul Mezclar bien. Centrifugar for 2 minutos a 10000 RPM. Leer las absorbancias del desconocido y del Standard. respectivamente. dentro de 60 minutos ( A). incubar por 5 minutos a 37 ºC o 10 minutos a 20«25 ºC.7 mmol/l ó 6. alternativamente por 10 minutos a 4000 RPM Después de centrifugar separar el sobrenadante del precipitado y determinar la concentración de colesterol: Componente Blanco Standard Desconocido Agua Destilada 100 ul --------Standard ----100 ul ----HDL sobrenadante --------100 ul Reactivo de trabajo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar. incubar por 10 minutos a temperatura ambiente. 8. 4. 3. Señale la importancia clínica del colesterol. Realice una breve descripción de hipercolesterolemia familiar y su relación con la cardiopatía isquémica. Alteraciones del perfil lipídico en la diabetes y en el hipotiroidismo. Señale las principales causas de HDL disminuido. Realice una breve explicación del rol de la LDL en la aterogénesis. 5. . 6. Cuál es la importancia de la hipertrigliceridemia en la aterogenesis. 7. Cualés son las causas primarias de hipertrigliceridemia. 2. CUESTIONARIO: > 65 45-65 < 45 150 mg/dl 190 mg/dl 1. Señale la importancia fisiológica del colesterol.50 Normal > 55 Bajo riesgo 35-55 Riesgo elevado < 35 LDL-Colesterol: Sospechoso: Elevado: IV.  Dieta standard para ratas a base de maíz. o Las diez restantes conformaran el grupo experimental. Se compararán los valores de colesterol. REACTIVOS A UTILIZAR:  Ratas de peso aproximado de 200gr. Con la ayuda del personal de la sección. como parte del cambio de estilo de vida junto al ejercicio y control de peso. cada mesa obtendrá de cada rata control y experimental una muestra sanguínea de la cola antes del tratamiento y otra al final. Se considera aterogénicos el aumento del colesterol y de los tigliceridos. Se determinará el perfil lipídico antes y después del tratamiento y se compararan los resultados. LDL y triglicéridos entre ambas ratas. La dieta es importante en el control de la hiperlipidemia. etc. Una dieta rica en grasas saturadas aumenta el riesgo de hiperlipidemia y consiguiente mayor riesgo coronario. Las hiperlipidemias pueden ser primarias o familiares como la hipercolesterolemia familiar. hipotiroidismo. las que recibiran adicionalmente 2 cc de aceite preparado de sebo de pollo. aumento de las grasas monoinsaturadas y polinsaturadas. HDL. 1-2 representantes de cada mesa se encargarán del control de la dieta. Y secundarias a otras patologías como la diabetes.  Set de determinación de colesterol enzimático. La ATP III. bajo la supervisión del personal de la sección. INTRODUCCION: El aumento de los lípidos sanguíneos o hiperlipidemia constituye una situación metabólica de riesgo. Se dispondran de 20 ratas albinas adultas. disminución de las grasas saturadas. En el presente experimento.    . especialmente coronario.  Reactivo precipitante para HDL. III.  Set de determinación de triglicéridos enzimático. ha establecido los criterios para una dieta adecuada que incluye disminución de la ingesta de colesterol.51 PRACTICA N° 20 HIPERLIPEMIA EXPERIMENTAL I. El tratamiento será por 21 días. Extracción de las muestras. la hipertrigliceridemia familiar etc. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procemiento  Tratamiento experimental. la hiperlipidemia familiar combinada. puede producir el incremento de los lípidos sanguíneos. sidrome nefrotico. Las cuales se dividirán en dos grupos en forma aleatoria. Se extraera el suero y a cada una se determinara el perfil lipídico siguiendo el método enzimático empleado en la práctica anterior. o Diez de ellas constituirán el grupo control y seguiran su dieta habitual agua y alimentos (maíz) ad libitum.  Sebo de pollo. II. se busca mostrar como la ingesta de una dieta rica en grasa saturada con sebo de pollo por 3 semanas. 52 IV. CUESTIONARIO: 1. 4. Qué alimentos son ricos en colesterol. Qué alimentos son ricos en grasas monoinsaturadas. Qué alimentos son fuentes de omega 3. 3. 7. Qué alimentos son ricos en grasas saturadas. . Qué alimentos son ricos en grasas polinsaturadas. 2. 6. Qué alimentos son fuentes de fibra. 5. Señale en detalle la dieta recomendada por la ATP III. para el tratamiento de la hiperlipidemia. quimotripsina. triptofano y fenilalanina. La tripsina.Caseína al 1% en buffer fosfato 0. . La presente práctica tiene como finalidad demostrar la acción hidrolítica de las enzimas digestivas contenidas en el páncreas sobre la caseína o proteína de la leche.25% saturada con butanol. existe hipoproteinemia.Solución acuosa de ninhidrina al 0. INTRODUCCION: La digestión de las proteínas. REACTIVOS A UTILIZAR: . . quimotripsina. tripsina. es un proceso complicado que se realiza con el concurso de diversas enzimas proteolíticas Entre estas enzimas proteoliticas tenemos: a) de origen gástrico: pepsina y renina. c) de origen intestinal: aminopeptidasas. La elastasa tiene una especificidad amplia. . y azorrea (gran cantidad de productos nitrogenados en las heces). Son endopeptidasas: pepsina. alanina y serina. La falta de enzimas proteolíticas produce creatorrea (presencia de fibras musculares identificables en las heces. que provienen de la carne de los alimentos). Son exopeptidasas: carboxipeptidasa y aminopeptidasa. elastasas.1 M pH 8. con retardo marcado del crecimiento. o degradación hasta aminoácidos en el tubo digestivo. es activada por la enterocinasa en el intestino.Buffer fosfato 0.Acido tricloroacético al 10%. como la glicina. determinado los productos (aminoácidos) con ninhidrina II.1 M pH 8. elastasa y carboxipeptidasa.53 IV UNIDAD PROTEINAS Y ACIDOS NUCLEICOS: INTEGRACION DEL METABOLISMO REUNION DE LABORATORIO N° 10 PRACTICA N° 21 DIGESTION DE LAS PROTEINAS: ACCION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS PANCREATICAS SOBRE LA CASEINA I. La carboxipeptidasa hidroliza el enlace peptídico carboxiterminal en las cadenas polipeptidicas. y es específica de los enlaces peptidicos sobre el lado carboxílico de residuos de aminoácidos básicos: lisina y arginina solamente. En el lactante con ausencia congénita de tripsinogeno y por consiguiente por falta de activación de quimotripsinógeno y procarboxipeptidasa. b) de origen pancreático: tripsina. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) I II III III. .Solución de extracto pancreático. La quimotripsina es específica para los enlaces peptidicos de los aminoácidos sin carga como los aromáticos: tirosina. . dipeptidasas. ataca a los residuos pequeños. 3. Después del tiempo de incubado tomar 0. durante 3 a 5 minutos. Observa los cambios de color de cada tubo. CUESTIONARIO: 1. Observe las variaciones que se produce en cada tubo. Interprete todos los resultados encontrados en la práctica y explíquelos usando algunos dibujos.1 M pH 8. Luego a los tubos de incubación del primer sistema. Explique el sitio de producción y la acción de las hormonas que intervienen en el proceso de digestión y absorción de los aminoácidos. agregue gota a gota 1 ml de ácido tricloroacético al 10% agitando continuamente. II.54 Caseína al 1% Buffer fosfato 0. III).5 ml. Escriba dos esquemas mostrando dos ejemplos de transaminación y dos de desaminación con los nombres de aminoácidos y alfa cetoácidos que participan. agregar 1 ml de solución de ninhidrina. 2. En este nuevo sistema. de cada uno de los tubos y trasladarlo a otro sistema numerado (I. IV.0 Solución de extracto pancreático Agua destilada Pasos: * * * * * * * 1 1 1 --- 1 1 --1 --1 1 1 Mezclar y colocar al baño de agua a 37 ºC por 30 minutos. . 4. Elabore un esquema con la digestión y absorción de proteínas y aminoácidos. Mezclar y llevar a un baño de agua hirviendo (franca ebullición). El ovomucoide de la clara de huevo inhibe también de manera enérgica la tripsina.0 Proteína de soja cruda 30% Proteína de soja hervida 30% Solución de tripsina 20 mg% Pasos: a. Mezclar y centrifugar a 2500 rpm por 10 min. La finalidad del siguiente experimento es demostrar el efecto inhibidor del extracto de soya cruda sobre el efecto proteolítico de la tripsina. la alfa-1 antitripsina fecal (1-AT-Fecal) que es una glicoproteína.5 III 2.5 0.5 - . efecto que desaparece cuando la soya es hervida. . Digiere las proteínas desnaturalizadas y parcialemente digeridas.Proteína de soya cruda 30%. con mayor rapidez que las originales desdoblándose en polipéptidos de peso variable y algunos aminoácidos. REACTIVOS A UTILIZAR. INTRODUCCION: La tripsina actúa como una endopeptidasa e hidroliza prácticamente toda clase de proteínas.Proteína de soya hervida 30%. Algunos alimentos en estado natural poseen componentes perjudiciales para la nutrición. c.2 II 2.2 IV 2. .5 0.5 0. . Incubar en baño maría a 37°C durante 1 hora. ello explica en parte que el valor nutritivo del frijol de Soja aumenta considerablemente si se coce a ebullición por varios minutos.5 0. el gisipol.1 M pH 8.5 0. . Esta sustancia de naturaleza peptídica es inactivada por el calor.Buffer fosfato 0. I 2. Después del tiempo de incubación: agregar a cada uno de los tubos 2 ml de etanol absoluto. Por ejemplo el frijol de soja contiene un principio cuya actividad antitripsina dificulta la digestión de las proteínas.Los extractos de páncreas poseen también un péptido inhibidor de la tripsina. .5 0.1 M pH 8. b.0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0.Etanol absoluto III. II. . Es interesante también que el aceite de semilla de algodón posea un pigmento. secretada a la luz intestinal.Solución de ninhidrina 0.Solución de tripsina 20 mg%. con actividad antioxidante y antitripsina que disminuye el apetito y dificulta la digestión de las proteínas.25% saturada con butanol.55 PRACTICA N° 22 INHIBICION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS: ACCION DE LA SOYA HERVIDA Y CRUDA SOBRE EL EFECTO PROTEOLITICO DE LA TRIPSINA I. f. 4. 3.56 d. En otra serie de tubos numerados I . Someter los tubos a temperatura de ebullición del agua utilizando baño maría durante 5 minutos. Anotar los resultados. IV. II. e. 2. ¿Qué es el gisipol y cómo actúa en su acción antioxidante? Con dibujos represente la práctica realizada. Por qué razón el ovomucoide de la clara del huevo inhibe la acción de la tripsina.25%. CUESTIONARIO: 1. . III. Explique con sus propias palabras cuál cree que es el objetivo de la práctica que realizó. IV colocar 1 ml de sobrenadante de los tubos respectivos del paso anterior y agregar 1 ml de ninhidrina 0. cuya intensidad es provisional a la concentración de proteínas totales en la muestra. La concentración sérica de las proteínas totales es de 6. disminución de la formación en el hígado como en la cirrosis. en medio tamponado a pH3.1 a 7. conservación del equilibrio ácido básico. INTRODUCCION: Las proteínas plasmáticas son importantes para el organismo porque realizan diversas funciones: coagulación.57 REUNION DE LABORATORIO N° 11 PRACTICA N° 23 CUANTIFICACION DE PROTEINAS SERICAS TOTALES Y FRACCIONADAS I. Determinación de Albúmina: La albúmina reacciona específicamente sin separación previa con la forma aniónica de la bromo Cresolsulfon Ftaleina (BCF). Agammaglobulinemia y la analbuminemia son cuadros demasiado raros. la transferrina. Los bajos niveles de albúmina pueden ser debidos a: incrementadas pérdidas de albúmina en la orina. defensa contra las infecciones. respecto del Blanco del reactivo. excreción. REACTIVOS A UTILIZAR. etc. regulación del metabolismo. FUNDAMENTOS DEL METODO Determinación de Proteínas Totales: Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico. inmunodifusión o inmunoelectroforesis.5 a 4. El origen de las proteínas plasmáticas es hepático con excepción de las globulinas gamma que se forman en las células plasmáticas. en las colagenopatías.9 g/dl de las cuales albúmina: 3. insuficiente ingestión de proteína.1 g/dl. en el kala-azar. ceruloplasmina. globulina y fibrinógeno. transporte. Reactivo EDTA/Cu Reactivo BCF .. Las cifras de proteínas plasmáticas totales pueden aumentar (hiperproteinemia) con cociente A/G normal en la hemoconcentración.8 g/dl y globulinas: 2. para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540nm. haptoglobina. La presente práctica tiene por finalidad determinar las concentraciones séricas de proteínas totales y fraccionadas en personas normales y/o con procesos patológicos.Las fracciones globulínicas contienen varias proteínas específicas: inmunoglobulinas.8. en la macroglobulinemia de Waldenström. II. en la gastroenteropatía exudativa con pérdidas fecales de proteínas. por el método colorimétrico. Las proteínas plasmáticas por métodos químicos se clasifican en albúmina.6 a 3. con inversión de A/G por aumento de las globulinas: en el mieloma múltiple. etc. en presencia de un exceso de colorante. que se pueden determinar por electroforesis. regulación del equilibrio hídrico. etc. En el suero solo albúmina y globulina . es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra. en medio alcalino. El aumento de absorbancia a 625 nm. La disminución de proteínas totales (hipoproteinemia) son generalmente asociadas con HIPOALBUMINEMIA que a su vez están acompañadas con pequeños cambios en las globulinas. 2 . colocar: Componentes Muestra (ml) Standard (ml) Reactivo (ml) Blanco --------1. colocar: B S D Suero Patrón 10 ul Muestra 10 ul. 1 ml.2 ± 2.(g/dl) Relación A/ ! ¥ VALORES DE REFERENCIA: Albúmina = 3. Mantener los tubos entre 15 y 28 ºC durante 10 minutos. Reactivo BCF 1ml. El color resultante es estable por lo menos 30 minutos.0 g/dl Determinación de Albúmina.Alb. S (Standard) y D (Desconocido).0 a 8. Leer en espectrofotómetro a 625 nm o en fotocolorímetro con filtro rojo (620-650 nm) llevando a cero con el blanco de reactivo CALCULOS DE LOS RESULTADOS : Alb.0 Desconocido 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Determinación de Proteínas Totales PROCEDIMIENTO: En tres tubos marcados B (Blanco).0 Standard ----0. (g/dl).01 ----1.8 g/dl Relación A/G = 1.5 ± 4. Mezclar con varilla. ó 20 minutos a temperatura ambiente.0 Mezclar e incubar 10 minutos a 37rC.01 1. PROCEDIMIENTO: En tres tubos de fotocolorímetro marcados B(Blanco). S (Standard) y D (Desconocido).(g/dl) Albúmina (g/dl) ! D v f f! S Albúmina(g/dl) PT. CALCULOS: FACTOR ! Concentrac ión Standard Absorbancia Standard  Proteina Total (g/dl) ! Factor v Absorbancia desconocido VALORES DE REFERENCIA: 6.58 III. 1 ml. llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco de reactivo. Leer las absorbancias a 540 nm. 59 IV. Cuáles son las principales características de las proteínas plasmáticas. en clínica? ¿En qué se basa la determinación de las proteínas totales y fraccionadas en nuestro experimento? Elabore un esquema sobre el proceso fisiopatológico de un edema. 4. . 5. 3. CUESTIONARIO: 1. ¿Qué importancia clínica tiene la determinación de las proteínas séricas totales y las fracciones albúmina y globulinas? ¿Qué importancia tiene determinar la relación albúmina/ globulina. 2. aparece la proteína de Bence Jones. glomerulonefritis focales proliferativas. Se diluye con cloruro de sodio 0. albúmina. nefropatía lúpica. etc. síndrome nefrótico. nefropatía tóxica. COMPONENTE (ml) TUBO Muestra de Orina 5. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE LAS PROTEÍNAS EN ORI NA: Coagulación por el calor. Si aparece un precipitado o enturbamiento se puede deber a la presencia de proteínas o fosfatos. escapan en el filtrado de forma que los túbulos son incapaces de captar la gran cantidad de proteínas y resulta una masiva proteinuria. REACTIVOS A UTILIZAR. Las proteínas son casi completamente absorbidas en los túbulos. nefropatía diabética. la cantidad es pequeña alcanzando máximo de 150 mg en orina de 24 horas. Standard de proteína: Pueden usarse suero claro normal de concentración conocido o un suero control adquirido comercialmente.85% a una concentración final de 25 mg/ml. se trata de proteínas. algunas enzimas. moléculas proteicas de variado tamaño incluyendo las más largas. menos de 10 mg/dl. Cuando el glomérulo es dañado por alguna enfermedad.85%. se trata de fosfatos que se han disuelto en medio ácido. por ejemplo la proteína de Bence Jones. sin que exista evidencia de lesión renal. 12. febril.60 PRACTICA Nº 24 DETERMINACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE PROTEINAS EN ORINA I. Si la turbidez persiste. Esta dilución debe ser preparada el mismo día. . Añadir: Solución de ácido acético al 2% IV gotas Si desaparece la turbidez. En el mieloma múltiple y macroglubinemia de Waldestrom. Extrarrenal: proteinuria ortostática. Acido acético al 2%. La proteinuria puede ser renal o extrarrenal. luego las globulinas. riñón poliquístico etc.). El fibrinógeno es una molécula muy larga y escapa solo en enfermedad renal severa. tuberculosis renal. gravídica. INTRODUCCION: La orina normal contiene una pequeña cantidad de proteínas solubles (albúminas. La proteína de Bence Jones está constituída por las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas que constituye la proteína monoclonal. III. Acido tricloroacético. hemoglobina. se ha hace más intensa o se forma un precipitado.0 Someter a ebullición por 1 minuto. en la eclampsia. Son causas de proteinuria Renal: glomerulonefritis difusa.5% (en agua destilada) Cloruro de sodio 0. La presente práctica tiene por finalidad determinar la presencia de proteínas en la orina y de cuantificarlas en caso que estén presentes en casos normales y en estados patológicos. Las proteínas de peso molecular relativamente bajo y de pequeño tamaño pasan primero a través de los glomérulos injuriados. II. mieloma múltiple. La proteinuria fisiológica (proteinuria ortóstatica) se presenta después de ejercicios y de permanecer largo tiempo en posición de pie. orina Absorbancia del standard Volumen total en ml orina -----------------------------------. 2. mg/100 ml orina x 100 IV. 3. CALCULO: Desde que 4 ml de orina se trata igual que un standard de 4 ml conteniendo 25 mg/100 ml entonces: Calcular de la siguiente manera: Absorbancia problema ± Absorbancia blanco x 25 = mg/100 ml.0 1.0 4. Leer el standard (I) calibrando con agua destilada y luego a la lectura del problema (II) restar el blanco de la orina (III).0 II 1.61 DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS EN LA ORINA : Método turbidimétrico de Heavy. 5. . En tres tubos marcados previamente agregar: COMPONENTES (ml) /TUBOS Solución standard de proteína Orina previamente filtrada Agua destilada Acido tricloroacético 12. En qué consiste el método de Heavy para la determinación de proteínas ¿Cuál es el mecanismo por el cual un paciente con glomeruloesclerosis elimina mucha proteína por la orina? Señale algunas causas de proteinuria fisiológica y patológica.5% I 4.0 III 4. 4. NOTA: Antes de leer los tubos deben ser mezclados totalmente evitando que burbujas de aire puedan interferir con la lectura.= proteína total de orina de 24 H en mg. y leer en fotocolorímetro con filtro (420 um).0 Dejar reposar 5 a 10 min. ¿Cómo diferencia usted un precipitado en un tubo de ensayo que no c orresponde a proteínas en orina? Señale algunos tipos de proteínas anormales que pueden ser encontradas en la orina. CUESTIONARIO: 1.0 1. sacar diferencias y determinar una media que luego se multiplica por el factor determinado. Repetir las lecturas a intervalos de 60 segundos.1 Mezclar y transferir a la cubeta del espectrofotómetro. Reactivo para SGTP:  Buffer TRIS pH 7. INTRODUCCION: La transaminasa glutámica pirúvica. estas enzimas proveen un medio de interconversión de proteínas e intermediarios metabólicos de los carbohidratos y hacen disponibles las reservas proteicas almacenadas en el hígado al ciclo del ácido cítrico. en la hepatitis o en el infarto de miocardio.62 PRACTICA N° 25 CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ALANINA AMINOTRANSFERASA SERICA (ALT) o TRANSAMINASA GLUTAMICO PIRUVICA (SGTP) I. Con la aspartato transaminasa. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Reactivo reconstituido (ml) 1.glutamato. REACTIVOS A UTILIZAR.Piruvato + L . hasta por tres minutos. producto resultante después de la incubación. CALCULOS: Actividad ALAT (UI/l) = A/min x 1768 Nota: de las absorbancias... estas enzimas son liberadas dentro de la corriente sanguínea y pueden elevar sus niveles. se mide colorimétricamente por reacción con dinitrofenil hidrazina en medio alcalino. llamada también alanina aminotransferasa cataliza la reacción L-alanina + alfa-cetoglutarato .5  a-cetoglutarato  L-alanina  LDH  NADH III. Cuando se produce destrucción tisular de estos órganos como sucede por ejemplo. Leer la absorbancia inicial (A1) a 340 nm. En la presente práctica la glutámico pirúvico transaminasa (GPT) es determinada agregando suero a una solución bufferada conteniendo ácido alfa cetoglutarato y L-alanina y el ácido pirúvico formado. Incubar 60 segundos a la temperatura de reacción. VALORES DE REFERENCIA: Hasta 29 U/l a 30 ºC Hasta 45 U/l a 37 ºC . relativamente en bajas concentraciones pero en los tejidos están presentes en grandes cantidades. particularmente en el hígado y corazón. Las transaminasas están normalmente presentes en la sangre.0 Volumen de muestra (ml) 0. II. 6. colocando los nombres de las moléculas que participan. ¿Cuál es la importancia metabólica de la transaminasa glutámico pirúvico? 3. . ¿Cuáles serían las razones para solicitar.63 IV. 2. ¿Cuál es la ubicación intercelular de las TGP y TGO? 5. CUESTIONARIO: 1. TGO-S algunas veces separadas y otras veces juntas. Cuál es la utilidad práctica de la utilización del dosaje de transaminasas. Diga usted en que consiste el mecanismo de transaminación. Haga un esquema de una transaminación. en el diagnóstico diferencial clínico? 4. 45 0. INTRODUCCION: En condiciones normales. éstas. El color es estable sólo por 30 minutos. sube al máximo entre las 12 y 48 horas y suele volver a lo normal a los 4 ó 7 días. la glutámico pirúvica (TGP) y la glutámico oxalacética (TGO) o aspartato aminotransferasa (AST). Las enzimas con actividad en el suero sanguíneo (las que intervienen en la coagulación. II. sobre todo en la cogestión hepática. cuando sobreviene la mejoría clínica.64 CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ASPARTATO AMINOTRANSFERASA (AST) I. en general.1 0. La finalidad del presente trabajo experimental.4N (NaOH 0. El tejido miocárdico es muy rico en TGO y el ascenso de esta enzima acompaña a los procesos destructivos del corazón.40 0. REACTIVOS A UTILIZAR Sustrato AST: Buffer de DL-aspartato y -cetoglutarato pH 7.30 0.20 0. En las lesiones o hepáticas aumentan ambas transaminasas en el suero. Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente. proporcional a la extensión del infarto.50 0. las enzimas se sintetizan en las células y en la mayoría de los casos ejercen su función en su interior.0 0. preparar una curva de calibración para AST.4N diluido con agua destilada 1:10) Mezclar y reposar por 15 minutos a temperatura ambiente antes de leer. Leer a 505 nm.4 Reactivo de color: 2-4 dinitrofenilhidrazina Standard: Buffer piruvato pH 7. a veces proporciona datos positivos en casos con datos electrocardiográficos de difícil interpretación.1 0. En la clínica son importantes dos transaminasas.5 ml de reactivo de color. Agregar 5 ml de NaOH 0.1 0. las dos suben nuevamente. aunque se hallan en todos los tejidos se relacionan preferentemente con los procesos de ³escape´ de enzimas del mi cardio o el hígado.25 Standard 0.25 AST 0 22 55 96 150 212 Agregar 0. una vez sintetizadas.1 Sustrato AST (ml) 0. por ejemplo) y las enzimas de escape. como es el caso de: Las enzimas del tubo digestivo. si aparece una recaída. descienden en forma paralela y. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) : 1) CURVA DE CALIBRACIÓN: Antes de usar los reactivos por primera vez.1 0. .1 0.35 0.15 0.10 0. es la determinación por método colorimétrico de una de estas transaminasas de importancia clínica como es la aspartato aminotransferasa. El ascenso es.4 NaOH 0. salen de las células y funcionan fuera de ellas. pero tiene el inconveniente de elevarse en diversos cuadros.4N III.05 0. Armar el siguiente sistema: Tubo 1 2 3 4 5 6 Agua Destilada (ml) 0. Otras enzimas. presentes en cantidades muy bajas en el suero aun cuando en ciertas enfermedades suben considerablemente. Agregar 5 ml de Na OH 0. 3.Al cumplirse los 60 minutos. Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente. . Inmediatamente empezar el control de tiempo. CUESTIONARIO: 1.Incubar a 37 ºC durante 5 minutos. según instrucciones previas. . ¿Cuál es la utilidad y el comportamiento en sus concentraciones de la AST en casos de infarto agudo de miocardio? Interprete y explique todo lo actuado en la práctica. .4 N Mezclar y dejar reposar por 15 minutos antes de la lectura. .1 ml de suero.5 ml de sustrato AST en cada tubo.5 ml de reactivo de color. exactamente.65 Construir en papel semilogarítmico los valores de transmitancia en el eje vertical y en el eje horizontal las U/ml de AST 2) PROCEDIMIENTO DE LA MUESTRA (disponer de un tubo de ensayo): .Incubar a 37 ºC durante 60 minutos. .Obtener el valor de U/ml de AST a partir de la curva de AST de calibración.Colocar 0. . Haga un resumen de seis líneas sobre AST. agregar 0. .Agregar 0. IV. 2. Hemoglowiener reactivo Tubos de vidrio Lancetas Pipetas ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: COMPONENTES STANDARD hemogloWiener Reactivo 5 ml Con pipeta limpia y seca. tetramérica. Standard de Hemoglobina. da lugar a las diferentes tipos de porfirias. El defecto enzimático en algunas de las etapas de síntesis del grupo Hemo. La concentración normal es de 12 a 14 g/dl en mujeres y de 14 a 16 g/dl en varones en nuestro medio y a nivel del mar. produce disminución de su concentración dando lugar a la anemia por menor producción como en la anemia ferropénica. que también puede deberse a problemas en la maduración de los glóbulos rojos como la deficiencia de ácido fólico. utilizando el método enzimático de determinación de hemoglobina. con dos subunidades alfa y dos beta. por diferentes causas. II. Buffer/Ferricianuro: comprimidos estabilizados de ferricianuro de potasio y buffer de fosfatos.66 REUNION DE LABORATORIO N° 12 PRACTICA N° 26 CUANTIFICACION DE HEMOGLOBINA I. La disminución de la síntesis de hemoglobina. cuya función es el transporte de oxígeno. en niños existe variación con la edad. . menor de 13 g/dl. En la práctica médica es por ello importante determinar la concentración de la hemoglobina. REACTIVO MATERIAL Y EQUIPOS Tensioactivo/CNX: ampollas autorrompibles conteniendo solución estabilizada de tensioactivo/CNX. que es sin duda uno de los exámenes más solicitados. agregar: hemogloWiener Standard 20 ul DESCONOCIDO 5 ml ----Armar el siguient e sistema: III. En la hipoxia por altura por otro lado se produce aumento de su síntesis llevando a la policitemia. que puede tener también otras causas como la Policitemia Vera La OMS basa su definición de anemia en la concentración de hemoglobina. una causa pueden ser las hemoglobinopatías por defecto en la síntesis de una de las cadenas (talasemias) o de cambios en la estructura de una de las subunidades por mutaciones que cambian un aminoácido por otro como en la hemoglobina S. En este último grupo. de modo que en mujeres se considera si esta es menor de 12 g/dl y en varones. Pero la hemoglobina puede también disminuír por pérdida de sangre como en las hemorragias o por hemólisis (anemias hemolíticas). La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración de hemoglobina en sangre de personas normales. que termina con la adición del hierro por la ferroquelatasa. INTRODUCCION: La hemoglobina es una hemoproteína. Se sintetiza en la médula ósea por una vía común a la síntesis de porfirinas. Una anemia importante es la anemia de células falciformes: Haga un resumen de las causas de su etiología y su patogenía. llevando el aparato a cero con Reactivo CALCULO DE RESULTADOS: Hemoglobin a (g/dl) ! D v factor factor ! Standard (g/l) S VALORES DE REFERENCIA: . CUESTIONARIO: 1.Hombres: 13. Qué es la anemia. 4. 3. enjuagando tres veces en el propio reactivo antes de agregar cada muestra.0 g/dl IV. indicando sus aminoácidos importantes en cada polipéptido. Interprete y explique el procedimiento de la práctica.0 ± 18. 2.0 ± 16. el número de ellos y las interacciones del ión Fe++ dentro del grupo hemo.Mujeres: 11. . Mezclar y luego de 3 minutos leer en espectrofotómetro a 540 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520 -550). Cuál es la más frecuente y cuántos tipos de anemia conoce.0 g/dl .67 Muestra (sangre total) ----20 ul Medir primero el Standard y luego usar la misma micropipeta. Haga un esquema con la estructura de la hemoglobina. sólo reacciona después de agregar alcohol a la mezcla. después de un proceso de captación y conjugación con dos moléculas de ácido glucurónico por la enzima bilirrubina glucuronil transferasa.5 ml Reactivo Sulfanílico 200 ul --------Diazorreactivo ----200 ul 200 ul Mezclar de inmediato cada tubo por inversión. Luego de 5 minutos. siendo en su mayoría bilirrubina indirecta. la indirecta. Este pigmento insoluble en agua es transportado unido a la albúmina. y el origen de esta alteración obedece a causas de origen pre hepático. leer en espectrofotómetro a 530 nm o fotocolorímtero con filtro verde (520-550 nm). da color a las heces y ultrafiltra el glomérulo.Reactivo sulfanílico . II.5 ml 2. La manifestación clínica más importante de las hiperbilirrubinemias es la ictericia. Si lee antes. La hemoglobina es liberada y se separa la globina del hem. o en las enfermedades extrahepáticas obstructivas. Directa Bil. o de la bilirrubina conjugada en las hepatopatías. por el método enzimático de determinación de bilirrubina. que es finalmente excretada con la bilis al intestino por un proceso de transporte activo. Cada gramo de hemoglobina degradada origina 35 mg de bilirrubina. excepto para la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos. denominada bilirrubina directa o conjugada. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total de las fracciones de bilirrubina en el suero o plasma de personas normales y con ictericia. que varían con la edad de presentación y también en cuanto a su gravedad La bilirrubina directa da una reacción inmediata con el diazorreactivo. llevando el aparato a cero con agua destilada. al cabo de la cual son destruidos en el sistema retículo endotelial. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total y de las fracciones (bilirrubina directa e indirecta) en el suero de personas normales. ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Bil. que utiliza el diazorreactivo de Erlich. La hiperbilirrubinemia puede ser a predominio de la bilirrubina no conjugada como en las anemias hemolíticas o en los defectos congénitos de conjugación. hepático y post hepático. REACTIVOS . Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos. por el método de Malloy Evelyn.5 ml ----Desarrollador --------2. éste es convertido en biliverdina y luego en bilirrubina. habrá III. que no se excreta por orina. Total Muestra (suero) 200 ul 200 ul 200 ul Agua destilada 2. La bilirrubina indirecta o no conjugada llega al hepatocito y se separa de la albúmina.68 CUANTIFICACION DE BILIRRUBINAS SERICAS I. habrá subvaloración de los resultados por reacción incompleta. La concentración sanguínea de bilirrubina total es de 1 mg / dl. . Si se lee después.Desarrollador o solvente .Diazorreactivo: Mezclar: 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo sulfanílico. . INTRODUCCION: Los hematíes tienen una vida media de 120 días.Nitrito de Sodio .Bilirrubina Standard. se convierte en una forma soluble. donde el defecto limitante es la excreción. Bilirrubina Directa VALORES DE REFERENCIA: . 2.69 sobrevaloración porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre CALCULOS: Bilirrubina total (mg/l) = (Abs. Bil.Abs Blanco.Abs. total . Directa . ¿Cuáles son las causas de hiperbilirrubinemia conjugada? 4. Elabore un esquema con los tipos de ictericia que se pueden producir durante el metabolismo de la bilirrubina. CUESTIONARIO: 1. B. ¿Cuál es el riesgo de aumento de bilirrubina no conjuda en el recién nacido? 6. ¿Cuál es la acción bioquímica que realiza cada uno de los reactivos utilizados en la práctica? 5.) x F Bilirrubina Libre (indirecta) = Bilirrubina total . Blanco) x F Bilirrubina Directa (mg/l) = Abs.Adultos: o Directa: hasta 2 mg/l o Total: hasta 10 mg/l IV. ¿Cuál es el comportamiento de las bilirrubinas en caso de una insuficiencia hepática. Por qué? . ¿Cuáles son las principales causas de hiperbilirrubinemia no conjugada? 3. Un adulto normal produce unos 500 mg de ácido úrico por día. del grado de eliminación de ácido úrico. enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm). que es el más común de los desórdenes del metabolismo de las purinas. REACTIVOS A UTILIZAR. Como sucede con otros constituyentes séricos. Reactivo de fenol. o urea. los que se degradan y en un primer momento liberan los ácidos nucleicos de las proteínas.Muestra: suero o plasma heparinizado . Standar: solución de ácido úrico 100 mg/dl Uricasa: solución de uricasa mayor o igual a 3U/I Reactivo 4-AF/POD: frasco conteniendo más de 100 U de peroxidasa (POD). En condiciones patológicas.En tres tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas marcadas B (Blanco). el resto se degrada y es eliminado como CO2 y NH3. la concentración de ácido úrico en suero o plasma depende de un neto balance entre el grado de síntesis de purinas y fraccionamiento de nucleoproteínas por un lado y. En el hombre. por otro. policitemias. ocurre lo contrario. Los varones tienen niveles 1 mg/dl más altos que las mujeres. la uricemia se incrementa después de la ingestión de nucleoproteínas con los alimentos. el ácido úrico alcanza una concentración de 4 a 6 mg/dl. que circulan en la sangre (en el plasma y en los glóbulos rojos humanos) y es la orina su vía de excreción. etc. el pH ácido favorece la formación de ácido úrico no disociado y puede precipitar.70 PRACTICA N° 27 CUANTIFICACION DEL ACIDO URICO SERICO I. en alcalinidad. En orina. Retirar. . Aproximadamente 80 % de esa cantidad es excretada por orina. II.5 ml 2. S (Standard) y D (Desconocido). También existe hiperuricemia proveniente de la destrucción excesiva de células (material nuclear) en leucemias y linfomas.5 ml 2. Al pH sanguíneo predomina la forma desprotonada o urato. En el plasma. llevando el aparato a cero con el blanco. INTRODUCCION: El ácido úrico es un producto de la degradación hepática de las bases nitrogenadas purínicas adenina y guanina. diferencia que desaparece después de los 45-50 años de edad. III. a pH menores predomina la forma protonada no disociada o ácido úrico. cantidad que puede incrementarse con una dieta rica en purinas.5 ml Mezclar suavemente e incubar 15 minutos en baño de agua a 37 °C o 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 °C). más frecuente en hombres. colocar: B S D Standard 50 ul Muestra 50 ul Reactivo de trabajo 2. podemos encontrar concentra ciones incrementadas de ácido úrico sérico en la gota. La cantidad de uratos excretados varía normalmente de 250 a 750 mg / 24 hrs. La presente práctica tiene por finalidad cuantificar las concentraciones séricas de ácido úrico en personas adultas normales y / o con alteraciones patológicas mediante el procedimiento químico de Folin-Dennis que se basa en la acción reductora del ácido úrico en medio alcalino sobre el ácido fosfotúngstico. En las alteraciones renales severas son comunes los niveles altos de ácido úrico como resultado de una excreción disminuida. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento . CUESTIONARIO: 1. ¿Cómo explica el uso del alopurinol en el tratamiento de la gota? ¿Cuál es el proceso de la artritis y de la formación de los tofos en la gota? Explique por qué existe hiperuricemia en las enfermedades de leucemia. con ingesta normal de proteínas. el sexo y las diferentes dietas. IV. 4. Cómo se sintetiza el ácido úrico. se observan los siguientes rangos de valores: Hombres: 26-60 mg/l Mujeres: 20-50 mg/l Los valores de ácido úrico varían de acuerdo a la edad. Cuál es la fisiopatología de las hiperuricemias.71 - CALCULO DE RESULTADOS: Acido Urico (mg/dl) ! D v f donde " f " ! 100 mg/dl S - VALORES DE REFERENCIA: En adultos normales. Y dónde se realiza esta síntesis. 5. incluso se ha observado una variación estacional. . 6. 3. 2. Señale la deficiencia parcial enzimática que ha sido encontrada en algunos pacientes con gota. La cantidad eliminada por las personas del sexo masculino generalmente es más grande que en las de sexo femenino. y es excretada en una cantidad casi constante. La creatinina es fácilmente difusible y es igualmente distribuida en el agua corporal. .0 mol/l . aumenta en el cuerpo humano fundamentalmente por síntesis. siendo la producción endógena constante. . catabolismo de proteínas. Elevadas concentraciones se producen solamente cuando la función renal está muy alterada y aunque el mismo tipo de información acerca del diagnóstico y pronóstico se obtiene por la determinación de nitrógeno ureico o creatinina. las que pueden ser de origen pre renal como el shock o la insuficiencia cardíaca. 9 . Esto.Reactivo 1: Hidróxido de sodio 0. La determinación de hace de ordinario en un filtrado libre de proteínas obtenido a partir del suero. II. la cual puede alterarse por diversas causas. la cantidad total depende de la masa muscular. como las uropatías obstructivas La creatinina en medio alcalino reacciona con el ácido pícrico para dar un tautómero de picrato de creatinina de color anaranjado (reacción de Jaffe). INTRODUCCION: La creatina. La creatina fosfato se forma en los miocitos y es un compuesto importante como fuente de energía en la contracción muscular. esta última determinación se prefiere porque proporciona mayor información relacionada con el estado de la función renal. Aproximadamente 2% de la creatina fosfato muscular es convertida en creatinina diariamente.4 mg /100 ml. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento III.72 REUNION DE LABORATORIO N° 13 PRACTICA N° 28 DETERMINACION DE CREATININA SERICA EN PERSONAS SANAS Y NEFROPATAS I. La determinación de creatinina tiene utilidad en la práctica médica para la evaluación de la función renal. La concentración normal en suero varía de 0.16 mmol/l . precursora de la creatinina. renal. La creatinina es un constituyente habitual de la orina. La creatininuria es determinada mediante el método enzimático.Reactivo 2: Acido pícrico 4. las variaciones fluctúan entre 0. Usando métodos enzimáticos para determinar específicamente creatinina y comparando con los valores obtenidos por la reacción de Jaffe en personas normales y nefriticos se encuentra que la creatinina verdadera del suero comprende aproximadamente un 90% del total.Standard: Solución de creatinina 2 mg/l. edad. aunque una pequeña cantidad pre formada es ingerida con los alimentos. mientras que en eritrocitos sólo corresponde a un 40%.5 a 1. La concentración de creatinina en suero no es afectada por la dieta.5 g/24hs. ya que los niveles de creatinina sérica dependen del grado de excreción.1. El clearence de creatinina normal es mayor de 100 ml / min. sexo o ejercicios. El suero es depurado de creatinina en el riñón por filtración glomerular proporcionando una buena base para el test de clearance. hace remarcable la necesidad de usar suero y no sangre total para la determinación de creatinina por el método colorimétrico. como las glomerulonefritis o la nefropatía diabética o post renal. La creatinina urinaria disminuye en la insuficiencia renal y es útil para medir el grado de filtración glomerular y lo poco que es transferido a través de las células tubulares. REACTIVOS A UTILIZAR. Es excretada fundamentalmente por el riñón el cual clarifica el plasma de creatinina. CALCULOS: ¨A Muestra (A2-A1) y ¨A Standard (A2-A1) CALCULOS: SUERO/PLASMA : ¦ ¦ Creatinina(mg/dl)! ORINA : Creatinina(mg/dl)! Standard(mg/dl)A v? A Standard A Muestra A Muestra CLEARANCE DE CREATININA : /100 ?mg/min/1.9 ± 1. 3.6 ± 1. Incubar 1 minuto a 20-25 °C y leer A1. ¦ ¦ Standard(mg/dl)Av 50 v? A Standard 0. ¿Qué información o presunción obtiene al dosar la creatinina sérica? ¿Por qué se prefiere la determinación de creatinina urinaria a la de nitrógeno ureico? Interprete y explique el procedimiento de la práctica.3 mg/dl 11 ± 20 mg/kg/d 14 ± 26 mg/kg/d 95 ± 160 ml/min/1. Explique por qué se incrementa la creatinina en tres estados patológicos que conozca. S (Standard).73 m2 98 ± 156 ml/min/1. su determinación. M (Muestra) Componentes Blanco Standard Muestra Reactivo 1 1000 ul 1000 ul 1000 ul Muestra --------50 ul Standard ----50 ul ----Mezclar. 4. En tubos de ensayo marcados B (Blanco).73 m2 . Incubar exactamente por 2 minutos y leer A2.1 mg/dl 0. luego agregar: Reactivo 2 250 ul 250 ul 250 ul Llevar el espectrofotómetro a cero con el blanco. CUESTIONARIO: 1.73m2A ! mgcreatinina mlOrinav mlorina/24h mgcreatinina ml suerov 1440 /100 VALORES REFERENCIA: DE SUERO/PLASMA: Mujeres Varones ORINA: Mujeres Varones Clearance de Creatinina: Mujeres Varones IV. Incubar 5 minutos a 20-25 °C/30 °C/37 °C. 2. Mezclar. Haga dibujos del procedimiento.73 PROCEDIMIENTO En caso de que la muestra a utilizar sea en suero. 5. A que se denomina clearence de creatinina y que importancia tiene. es excretado casi enteramente por los riñones.74 PRACTICA N° 29 CUANTIFICACION DE UREA EN SANGRE I. es convencionalmente reportado co nitrógeno ureico. Los valores de urea se mo reportan siguiendo la siguiente fórmula: Nitrógeno ureico sanguíneo x 2.00 1. conociendo los valores de urea. La or importancia clínica de la urea viene del hecho de una elevada concentración sanguínea puede estar asociada con una mala función renal.00 1.14 = UREA En sentido inverso.00 Incubar 5 minutos a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C). La concentración de la urea en la corriente sanguínea es el resultado del balance entre el grado de degradación de las proteínas y el grado de eliminación por los riñones.01 ----Reactivo de trabajo (ml) 1. Agregar a cada tubo: Reactivo hipoclorito (ml) 1. . El grado de azoemia depende de la extensión y tipo de lesión renal. Este método es altamente específico y aunque está basado en reacciones de urea. II.00 1. suero o plasma.01 Standard (ml) ----0. se informa el BUN según la siguiente fórmula: Urea x 0. . La urea en el plasma es filtrada por los glomérulos renales. La ureasa descompone específicamente a la urea produciendo dióxido de carbono y amoniaco. La finalidad de la presente práctica es cuantificar la uremia por el método de la ureasa.Suspensión de ureasa.Reactivo de salicilato. ésta transforma a la urea en carbonato de amonio y con la adición del reactivo de Nessler el amoníaco liberado forma un compuesto de color amarillo bruno cuya intensidad se mide en fotocolorímetro. Los valores normales de urea en suero (como nitrógeno ureico sanguíneo o BUN) es de 9 ± 19 mg/100 ml.00 1. son muy similares. La uremia es determinada colorimétricamente por el uso de ureasa. o 3 minutos a 37 °C. Normalmente no tiene función útil en el organismo. REACTIVOS A UTILIZAR. es el principal producto final del catabolismo de las proteínas y se distribuye en todos los tejidos.Reactivo hipoclorito. . .4665 = Nitrógeno ureico sanguíneo Los riñones eliminan diariamente entre 20 a 40 gramos de urea. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento PROCEDIMIENTO Componentes Blanco Standard Desconocido Muestra (ml) --------0. Cuando el nitrógeno ureico es determinado por el método de la ureasa.00 Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente (20 a 25 °C) o 5 . éste reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina colorimétricamente. pero en condiciones normales aproximadamente el 40% de este filtrado regresa p difusión a la sangre.Solución standard III. Las concentraciones de urea en sangre total. en personas normales y / o con procesos patológicos. INTRODUCCION: La urea es sintetizada en el hígado. . Leer las absorbancias dentro del plazo de una hora CALCULOS: FACTOR ! 66 Absorbancia Standard Urea (mg/dl) ! Factor v Absorbancia desconocido VALORES DE REFERENCIA: SUERO/PLASMA: Urea : Nitrógeno Ureico ORINA: Urea : Nitrógeno Ureico IV. CUESTIONARIO: 1. 2. conocer las concentraciones séricas de úrea? ¿Qué influencia tiene la ingesta proteica sobre la concentración sérica de úrea? En relación a las concentraciones séricas de úrea y NH4+. : 4. 3. ¿Qué alteraciones en las concentraciones séricas de úrea y NH4+ podrían encontrarse en el coma hepático? ¿Cuál es la importancia metabólica de la existencia del ciclo de la ornitina en el hígado de los seres humanos? ¿Cuál es la importancia metabólica que en el hígado humano exista una relación entre el ciclo de los ácidos tricarboxilicos y el ciclo de la ornitina? 10 a 50 mg/dl : 15 a 30 g/24 hrs. 6. 4.5 a 22. ¿Qué importancia clínica tiene para usted. Señale las características comunes que se encuentran en los efectos enzimáticos hereditarios del ciclo de la úrea.7 mg/dl 7 a 14 g/24 hrs.75 minutos a 37 °C. 5. todo el nitrógeno amino proveniente de los aminoácidos que puede experimentar transaminación se puede concentrar en el glutamato.L-alanina: solución 0.Acido tricloroacético al 10% .76 PRACTICA N° 30 DEMOSTRACION DE LOS PROCESOS DE DESAMINACION OXIDATIVA DE LOS L-E-AMINOACIDOS I.5 1.0 3. La presencia de estos cetoácidos se debe fundamentalmente a los procesos de transdesaminación y desaminación del ácido glutámico (transdesaminación) que se estimula fundamentalmente y en mucha menor proporción por desaminación de la L-Alanina por la acción de la L-aminoácido. Dos sistemas enzimáticos de transaminación: la alanina piruvato transaminasa(ALT) y la glutamato alfa-cetoglutarato transaminasa (AST) catalizan la transferencia de grupos amino de la mayor parte de los aminoácidos para formar alanina a partir del piruvato o glutamato a partir de alfa-cetoglutarato.Buffer fosfato 0. Filtrar y medir a otros tubos previamente marcados: .NaOH: solución 2N .1M pH 7.1% en HCl 2 N.2M .5 TUBOS DE ENSAYO II 4. La finalidad de la práctica es demostrar los procesos de desaminación (oxidativa o no) que sufren los L aminoácidos en el hígado utilizando a la L-Alanina como un ejemplo de éstos y al 2-4 Dinitrofenilhidrazina como indicador de los cetoácidos formados provenientes de la desaminación.0 3. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente esquema de incubación: COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0. .0 1.0 1.0 1.5 III. Añadir ácido tricloroacético al 10% Mezclar y añadir agua destilada I 4.0 3.4 Solución L-alanina 0. INTRODUCCION: La remoción del grupo amino de las L-aminoácidos es el primer paso en la degradación metabólica general de estos compuestos (catabolismo).2-4-Dinitrofenilhidrazina: solución 0.Homogeneizado de hígado o riñón de rata 10% y conservado en baño helado. Puesto que la alanina es también sustrato para la reacción de glutamato transaminasa.4 .5 1. Si se agrega una determinada cantidad de L-alanina a un homogeneizado de hígado después de un período de incubación (30 minutos) podemos demostrar que se ha producido desaminación si encontramos determinada cantidad de cetoácidos (ácido pirúvico y ácido alfa-cetoglutarato) los que pueden ser identificados frente a una solución de 2-4 Fenihidrazina en medio alcalino. Esto es importante porque el L-glutamato es el único aminoácido en el hígado que experimentan desaminación oxidativa a una tasa apreciable y esta reacción se cataliza por la L glutamato deshidrogenasa. . II. REACTIVOS A UTILIZAR.2M Agua destilada Homogeneizado de hígado Colocar en baño maría a 37°C durante treinta minutos.0 0.5 1.1 M pH 7.5 III 4.0 0.0 0. 0 Señale los sistemas enzimáticos flavinodependientes que producen desaminación oxidativa de los aminoácidos.77 COMPONENTES (ml) Filtrado 2. De un ejemplo de desaminación oxidativa de un aminoácido. de los resultados de su práctica de laboratorio? .0 4.0 1.0 1. CUESTIONARIO: 1 2 3 4 5 6 I 4. NaOH 2N Dejar en reposo durante 10 minutos. IV. ¿Cuál es la razón por la que se utiliza 2. Realizar las lecturas con el espectrofotómetro.0 TUBOS DE ENSAYO II 4.4-Dinitrofenilhidrazina en el sistema? ¿Cómo explica usted los resultados fotocolorimétricos obtenidos en los tres diferentes tubos de experimentación del sistema? ¿Cuál es la importancia biológica de la desaminación oxidativa de los aminoácidos? ¿Qué conclusiones puede establecer usted.0 4.4-Dinitrofenilhidrazina solución al 1% Mezclar y dejar en reposo durante veinte minutos.0 1.0 4.0 III 4. 2 mg/100ml. una enfermedad caracterizada por debilidad. Esto puede ser hecho con un simple aparato para medir la presión sanguínea con la cual la presión dentro de los capilares se incrementa por la constricción de . hemorragias subcutáneas y sangrado de encías. Muchas de estas propiedades podrían depender de las propiedades reversibles de óxido reducción (redox) de esta vitamina (ácido ascórbico .2 mg/100ml o en glóbulos blancos a 8 mg/100 g indican una deficiencia importante que puede significar cicatrización tardía o dehiscencia de las suturas. La corteza suprarrenal. la hipófisis y el ojo son espacialmente ricos en vitamina C.78 V UNIDAD NUTRICION: REQUERIMIENTOS ENERGETICOS. Los síntomas son vagos y generalmente limitadas alteraciones del crecimiento de los dientes. VITAMINAS Y MINERALES REUNION DE LABORATORIO N° 14 PRACTICA N° 31 DOSAJE DE VITAMINA ³A´ El instructivo de la presente práctica se les proporcionará durante la práctica respectiva. Los nivelas ² plasmáticos en una población bien alimentada varían entre 5. Se presenta en alimentos frescos y en vegetales. Ciertas células sin vitamina C no son capaces de producir o mantener sustancias de importancia intracelular. En el escorbuto no tratado.5 mg para adultos es suficiente para prevenir síntomas de deficiencia.1 gm/100ml y en glóbulos blancos menos de 2 mg/100 g. Aunque no se conoce con seguridad sus funciones metabólicas precisas hay pruebas que señalan su requerimiento para el metabolismo de la tirosina .5 mg de ácido ascórbico para niños y 7. Se estima que una ingestión diaria de 2. En los leucocitos la concentración es mucho mayor que en el plasma (15 mg/100 g) de capa blanca leucocitaria. dolor de las extremidades. El principal resultado de tal deficiencia es el escorbuto. lesiones en las encías y ligera anemia. PRACTICA N° 32 DOSAJE DE VITAMINA ³C´ I. Se necesita también para la producción normal de fibrinas del tejido conectivo y de la sustancia del baso intercelular (por ello el aumento de fragilidad capilar en el escorbuto). La única acción en el cuerpo es debido principalmente a que es una clase especial de agente reductor que influye en los procesos de óxido reducción. el nivel plasmático de ácido ascórbico es inferior de 0.5 y 1. Las necesidades mínimas diarias de vitamina C son 10 mg y son preferibles 30 mg por día. el escorbuto clínico tarda 6 meses en manifestarse. En caso de alimentación deficiente. INTRODUCCION: La vitamina C o ácido ascórbico es hidrosoluble y antiescorbútica.ácido dehidroascórbico). PROTEICOS. La vitamina C es destruida rápidamente por el calor de cocimiento o la pasteurización. Un excelente test clínico para la deficiencia de vitamina C es la determinación del promedio de resistencia capilar. Casos subclínicos de deficiencia de vitamina C son muy comunes entre la población pobre de las grandes ciudades. Para ello es necesario que los. alimentos antes del cocimiento contengan 70 mg de vitamina C. Antes de la intervención quirúrgica las cifras plasmáticas inferiores de 0. Las intervenciones quirúrgicas dan lugar a disminuciones de 17 a 20% de contenido en el plasma y en glóbulos blancos. Hemorragias que en la piel aparecen con excesiva frecuencia podrían indicar fragilidad capilar.5 = mg/dl Abs.4 dinitrifenilhidracina al 2% en ácido sulfúrico 9 N.5 0.4 dinitrofenilhidracina. El ácido ascórbico es estable durante varias horas en el filtro.2 mg/dl pueden preceder en 2-3 meses a la aparición de un escorbuto clínico. y Acido sulfúrico al 85%.4 III 0. se tapan en tubos con papel parafinado y se colocan en baño de agua a 56°C durante una hora.4 0. Absorbancia se compara con patrones adecuados de ácido ascórbico.). En un pH ácido. CÁLCULOS: Abs. Para la determinación del ácido ascórbico en sangre.Blanco x 2. Del problema . Se utilizará el método de Roe y Kutcher modificado para la cuantificación del ácido del ácido ascórbico en sangre. La excreción normal diaria de vitamina C en orina de adultos varia entre 10 y 30 mg. REACTIVOS A UTILIZAR: y Acido tricloroacético al 10& (P/V). el acide dehisroascórbico se transforma rápidamente en ácido dicetoglucónico que se une a 2 dinitrofenilhidracina -4 para formar una hidrazona de color pardo.5 0. total o plasma. El propósito de la siguiente práctica es determinar la concentración de ácido ascórbico en el plasma de personas adultas normales o carenciales. 2 mi de ácido sulfúrico al Q5°o. y Agregar a cada tubo lentamente y mezclando. Agua destilada Reactivo de color combinado I II 1 0. y Agregar 1. Mezclar: COMPONENTES (ml) TUBOS Liquido sobrenadante de paso anterior Acido tricloroacético al 10% Standard de ácido ascórbico.79 la vena del brazo. y El ácido ascórbico utilizado para preparar la solución patrón debe ser de grado analítico. y 0. y Reactivo de color. 0. y Reactivos 2.5% III. enfriando el hielo.1 de la solución tioúrea. esta debe ser fresca (no después de 30 min. Del Standard .Blanco NOTA: y El ácido ascórbico es muy inestable.6 ml de agua destilada. Esta sufre rearreglo molecular en ácido fuerte dando un compuesto rojo. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento y Extraer más o menos 5 mi de sangre de la flexura del codo e introducirlos en frascos previamente oxalatados. y Los valores inferiores a 0. Se prepara en el mismo dia de uso. y Leer en fotocolorimetro (540 nm). por el método colorimétrico de Roe y Ructher modificado. Por ello es indispensable separa el plasma de ids glóbulos rojos y realizar el análisis sin tardar. .5 0. Por 6'ste procedimiento el ácido ascórbico del plasma o sangre es oxidado a ácido dehidroascórbico. y Solución de tioúrea al 10% en etanol al 50%.4 - y Se mezclan los reactivos. y Mezclar nuevamente. Transcurrido el tiempo se enfrian los tubos en baño de hielo durante 5 minutos.1 mil de la solución de sulfato cúprico. mezclando: 5 ml del reactivo 2. y Oxalato de litio al 6.5%. y Standard de ácido ascórbico 2 ml/100ml. y Solución de sulfato cúprico al 1.5 0. y Dejar los tubos en reposo por 30 min. II. ¿Qué relaciones metabólicas podría mencionar entre el ácido fólico y Fe+++ en la producción de anemia en el escorbuto? 3. .80 IV. lactancia e intervenciones quirúrgicas? 4. embarazo. ¿Por qué las necesidades de vitamina C deben ser satisfechas en la dieta normal? 2. Desde el punto de vista metabólico ¿Cómo explica que los requerimientos de vitamina C sean mayores en el curso de las enfermedades infecciosas. ¿Cómo explicaría que las dosis superiores a 1 g/dia pueden ocasionar hemolisis en portadores de deficiencia eritrocitica de G-6-P-deshidrogenasa? 5. neoplasias. hipertiroidismo. CUESTIONARIO 1. Mencione algunas funciones metabólicas importantes del ácido ascórbico. 50 Reactivo color (ml) ----0. así como de otras hemoproteínas como los citocromos ± componentes de la cadena respiratoria. sino que además es tóxico. Leer las absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm . ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACION DE HIERRO Armar el siguiente sistema Componentes Blanco (suero) Muestra Buffer Acido (ml) 2. dado que no sólo es relativamente insoluble. hidroxilamina clorhidrato. su disminución se asocia entre otras patologías a problemas de absorción y almacenaje. enzimas y varios tipos de proteínas. el hierro en uso. Buffer alcalino: buffer TRIS pH 8. defectos en el mecanismo de almacenaje.y la mioglobina. Prácticamente todo el hierro corporal se encuentra unido a proteína. INTRODUCCION: El hierro sérico es importante en el organismo porque es componente esencial de la hemoglobina encargada del transporte de oxígeno.81 REUNION DE LABORATORIO N° 15 PRACTICA N° 33 DETERMINACION DE HIERRO SERICO TOTAL Y TIBC I. El hierro es absorbido en el intestino delgado como Fe2+ y su regulación ocurre a ese nivel y es transferido a la transferrina para su transporte sérico.0 Reactivo color: ferrozina. etc. El hierro forma parte de los centros Fe-S de la cadena respiratoria. aumento de Capacidad Total de Fijación de Hierro y disminución de la Saturación de Hierro  Anemia por deficiencia de hierro: microcítica hipocrómica. lo que lleva a la disminución de la ferritina sérica  Disminución de hierro sérico. II. que se encuentra dentro de las células. REACTIVOS A UTILIZAR: Buffer ácido: buffer acetato pH 4. etc. hidroxilamina clorhidrato. La evaluación de la concentración de hierro sérico es de gran utilidad. La capacidad de fijación de hierro (TIBC) aumenta en casos de anemias ferroprivas y disminuye en las hemocromatosis.05 Mezclar e incubar a 37 °C por 10 minutos. Solución Standard: Fe (II) en hidroxilamina clorhidrato 500 ug/dl III. tumores. El 90 % de anemias en las mujeres es por deficiencia de Fe.50 0.5 2. La deficiencia de hierro pasa por tres estadios:  Deficiencia de los depósitos de hierro. y el circulante. El contenido de hierro en el cuerpo humano se encuentra distribuido en tres formas: el almacenado. dado que un aumento en sus niveles se encuentra asociado a diversas patologías tales como destrucción aumentada de los glóbulos rojos.0. fiebre reumática. etc. De la misma manera. que se encuentra en la hemoglobina.5 Agua Destilada (ml) --------Standard (ml) --------Muestra (ml) 0. 50 0. 4.Muestra Abs.82 Cálculos: Ferremia (ug/dl) ! Valores de referencia:  Varones: 50 .50 Reactivo color (ml) ----0.Reactivo v 500 Abs. 2.muestra Abs. CUESTIONARIO: 1.160 ug/dl  Mujeres : 40-150 ug/dl DETERMINACION PARA TIBC (capacidad de fijación de hierro) Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Muestra Muestra Buffer Alcalino (ml) 2.Muestra Abs.Bl. Leer las absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm Calculos: UIBC (ug/dl) ! 500  TI v 500 Abs. 3.50 Muestra (ml) 0.Standard Abs. : : : 100 ± 400 ug/dl 250 ± 400 ug/dl 20 ± 55 % Señale al menos 5 funciones del hierro Causas de deficiencia de hierro Informe sobre estructura de la ferritina ¿Qué exámenes solicitaría para evaluar la deficiencia de hierro? ¿Qué importancia tiene medir la saturación de hierro? ©¨ § (ug/dl) ! Ferremia(ud/dl) I (ug/dl) ©¨ v 100 .05 Mezclar e incubar a 37 °C por 10 minutos.50 0.Bl.reactivo Abs.Bl.00 Agua Destilada (ml) --------Standard (ml) 0.Bl.muestra % Saturación! Ferremia (ug/dl) TIBC (ug/dl) Valores de Referencia: TIBC: Hasta 6 años Sobre 6 años % Saturación IV. 5.standard Abs.00 2. 5) en la diabetes mellitus no controlada. REACTIVOS A UTILIZAR: . Medir en el transcurso de 60 minutos la absorbancia de problema y estándar. No exponer a la luz CALCULOS Lectura tandard   ! 355 v Lectura uestra ?mg/dlA  . después de incubar 5 minutos a oscuras. c) algunos tipos de enfermedad tubular renal con acidosis pueden producir incremento del cloruro sérico. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Antes de la determinación el estándar y las muestras de suero deben ser diluidas en relación 1/50 con agua destilada (20 µL de muestra/1 ml de agua). 6) dieta alta en grasas o en ayuno prolongado el cloro es desplazado por los cuerpos cetónico por sobre producción de estos. igualmente sucede en el ClK. 2) parálisis de los músculos respiratorios. Este tipo de alcalosis que es de tipo respiratorio resulta por hiperventilación que puede ser causada a su vez por: a) drogas. En el suero normal el cloruro se encuentra en concentraciones que varían entre 100 y 106 mEqL. todas estas alteraciones tienen exceso de C02 (que produce hipocloremia). INTRODUCCION: El ión cloro comprende aproximadamente el 65% del total de aniones del liquido extracelular. 7) en hiper o en s hipofunción de las glándulas adrenales (corteza).83 PRACTICA N° 34 DETEMINACION DE CLORO. tensión de oxígeno disminuida (altura).6 TPZ existente parcialmente como complejo Hg(II)+Sulfato de Hierro . II.Estándar de cloruro: 355 mg/dl III. 3) enfermedad pulmonar. SODIO Y POTASIO EN EL SUERO DE PERSONAS SANAS Y EN ESTADO PATOLOGICO DETEMINACION DE CLORO I. b) enfermedades que producen estímulo del centro respiratorio como: histeria. De todos los aniones es uno de los de más baja concentración en el líquido intracelular. d) excesiva ingestión de ClNH4 (cloruro de amonio) produce acidosis que puede ser seguida de altos niveles de cloruro sérico. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES ESTANDAR PROBLEMA Estándar diluido 20 ul --Suero diluido --20 ul Reactivo de color 1 ml 1 ml Mezcla. Se puede presentar concentración de cloruro disminuido (hipocloremia) en hipoventilación causada por: 1) depresión del sistema nervioso central.Reactivo de Color 2. ansiedad. fiebre. 4) enfermedad renal crónica. La concentración de cloruro se puede incrementar (hipercloremia) en muchos casos como resultado del déficit primario de C02.4. 84 VALORES NORMALES : 335 . CUESTIONARIO: 1. ¿Cómo explicaría usted.383 mg/dl. la deficiencia acentuada del cloro en la enfermedad de Addison? 3. (Convertir en mEq/l dividiendo entre 3. ¿Qué influencia tiene la Aldosterona en el metabolismo del cloro? 2. ¿Puede señalar cinco causas de hipercloremia? 4. ¿Puede señalar cinco causas de hipocloremia? 5 ¿Cual es la relación de las alteraciones de la cloremia con el equilibrio ácido básico? .55) IV. El estado clínico de hidratación es importante para evaluar el significado de los niveles séricos de sodio. Pequeñas cantidades aparecen también en las heces. pacientes con diarrea. sulfato y otros aniones (sales). Se observan concentraciones bajas si las concentraciones de sodio exceden a las del agua. Del total de sodio corporal hay un 18% que fundamentalmente se encuentra en los huesos. El ión sodio es importante en el mantenimiento del equilibrio ácido básico ya que constituye aproximadamente el 90% del total de cationes extra celulares. por peso corporal. La concentración sérica normal es de 135 a 145 mEq por L (310 A 340 mg%). sudor y saliva. es el principal factor de regulación de este ion corporal y de sus concentraciones. en mujeres hay sólo 39 mEq por kg. INTRODUCCIÓN Debido a la predominante concentración del ión sodio en el líquido extracelular éste influye sobre la presión osmótica que juega un rol preponderante en la distribución del agua entre el espacio extra o intra celular. con pequeñas diferencias debido al equilibrio de Donnan. tratado sólo con insulina y solución salina. Un adulto de 70 kg de peso contiene aproximadamente 80 g de sodio de los cuales 44 se encuentra en el % líquido extra celular y el 35% en los huesos. si el líquido ingerido es insuficiente por razones anormales. En el hombre adulto hay cerca de 43 mEq de sodio intercambiable por kg. El suero o plasma contiene más del 90% del sodio total de la sangre. La determinación del sodio de los fluidos biológicos se realiza sea por electrodo ión selectivo o menos frecuentemente por método colorimétrico II. La cantidad presente dentro de la célula no puede ser medida sin biopsio del tejido. como en el coma diabético. Son ingeridos cerca de 3 gr. Como sucede con el agua corporal los valores varían inversamente con la grasa corporal. El ion sodio es ingerido en los alimentos en combinación con el cloro fosfato. enfermedad renal con disfunción tubular. en diabetes mellitus no controlada. Se puede encontrar incremento de sodio con hiperosmolaridad en individuos con deficiencia predominante de agua corporal. El sodio se excreta casi exclusivamente en la orina. por ejemplo en pacientes con diabetes insípida no controlada. Puede ocurrir deshidratación con sodio sérico elevado.diariamente. En el suero. es aparentemente inerte (no ionizable). REACTIVOS A UTILIZAR:  Reactivo precipitante: Acetato de uranilo más acetato de magnesio  Reactivo de color: tioglicolatop de amonio  Standard de sodio: 50 mmol/l . La concentración sérica es representativa de toda la concentración celular.85 DETERMINACION DE SODIO I. en pacientes con diarrea. cuando el líquido ingerido no es suficiente para eliminar la sobrecarga de solutos por el riñón. hay por lo tanto un 82% del total que es capaz de recambio y participa en las reacciones fisiológicas. El exceso de sodio se elimina por el riñón. Tales valores no dan información acerca del volumen y distribución de la cantidad total presente ni de la cantidad intracelular existente. alimentación nasogástrica con alto contenido de proteínas. y en niños es mayor. Algunos pacientes con enfermedad cerebral. el sodio esta en equilibrio con el del líquido intersticial. En condiciones anormales pueden ser muy considerables las pérdidas de agua por el sudor u otr s o fluidos. El riñon puede regular la excreción de sodio y agua por lo tanto. Diariamente y tiene acceso al suero por difusión a través de la mucosa intestinal o sea que cerca del 4% del sodio corporal total se recambia. fístula intestinal. ¿Cuál es la importancia biológica del ion sodio? 2. ¿Qué semejanza existe en la absorción intestinal de este ion y la glucosa? 4. Dejar reaccionar durante 30 minutos Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm). ¿Por qué la clasificación de deshidratación por alteración de la osmolaridad. Dejar reaccionar durante 5 minutos Agitar fuertemente por 50 segundos. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (PROCEDIMIENTO) Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco de Standard Problema Reactivo Standard 20 ul Problema 20 ul Precipitante 1 ml 1ml Tapar los tubos y mezclar cuidadosamente. ¿Cuál es el principal factor de regulación del ion sodio corporal? 3.86 III. Después de 5 a 30 minutos medir las absorbancias contra agua destilada a 405 nm CALCULOS: Factor: 150 /Lectura Bco Reactivo-Lectura Standard Na (mmol/l)= (Lectura Bco Reactivo-Lectura Muestra) x factor IV. CUESTIONARIO: 1. 5. Señale las concentraciones séricas normales. incluye básicamente las concentraciones de esté ion? . Emplear el sobrenadante Precipitante 20 ul Sobrenadante 20 ul Standard Sobrenadante 20 ul Problema Reactivo de color 1 ml 1 ml 1 ml Mezclar bien. Además de este rol pasivo. en alcalosis con hiperventilación. en íleo paralitico y anastomosis intestinal no funcionante. De potasio en forma de sal son ingeridos diariamente y recambiados con el potasio corporal. son perdidos a través del vómito. pues la falta de esferoides adrenales provocan retención de potasio sérico. Con ingestión calórica inadecuada y la utilización de proteínas celular para propósitos calóricos. En los niños donde la ingestión de potasio es relativamente más grande. cerebro y de los glóbulos rojos se recambia más lentamente que en otros órganos. Existe aproximadamente 130 gr. El potasio es rápidamente removido del líquido extracelular después que es ingerido. en insuficiencia de la corteza adrenal. en mujeres solamente 40 mEq por kilogramo de peso. El potasio del hueso. en hiperfunción adrenocortical o sobredosis de cortisona o ACTH. en administración continua de glucosa endovenosa y terapia salina. Se produce hiperpotasemia con pérdida intracelular de potasio cuando la permeabilidad de la membrana celular está alterada por lesión tisular.87 DETERMINACION DE POTASIO I. Los niños tienen relativamente menos contenido de potasio por kilogramo de peso debido a que la relación de agua intracelular/extracelular es menor que en adultos. El déficit de potasio celular es reflejado en los hallazgos séricos y bajo estas condiciones la regla es hipopotasemia debido a la elevada excreción urinaria de cloruro de potasio. el recambio diario es de 14%. INTRODUCCIÓN El potasio es el principal catión intracelular y por lo tanto es un factor importante de la presión osmótica que determina la distribución de agua entre las células y el líquido extracelular. Bajo condiciones de incremento de pH (alcalosis) asociado con la disminución de cloruros. se produce intercambio entre el sodio intersticial y el potasio intracelular.5 -5-3 mEq/L. Entonces el 2<26 del total del potasio corporal son recambiados diariamente. Bajo estas condiciones el potasio se eleva si el riñon no puede excretar esta sobrecarga. el potasio es liberado de las células y excretado dando como resultado hipopotasemia. El potasio se pierde en el cuerpo principalmente en la orina aunque pequeñas cantidades son perdidas en la respiración insensible. La concentración de potasio en el suero de personas normales es de 3. Excesiva cantidad de potasio puede liberarse del cuerpo bajo dos condiciones: primero cuando las secreciones intestinales con su contenido relativamente alto de potasio. en deshidratación. en la diabetes no controlada. Aproximadamente 293 gr. en intoxicación temprana con salicilatos. Hiperpotasemia se puede encontrar en: Shock o falla circulatoria de cualquier causa. asi mismo en algunos casos de insuficiencia renal se encuentra elevada la concentración de potasio. en fístulas gastrointestinales y vómitos. Del sue el ro potasio es transferido el líquido intersticial antes de penetrar a las células o al filtrado glomerular a través de la membrana de los capilares glomerulares del riñón. esto es debido a que la excreción de potasio por orina se mantiene constante. del cual el 98% es intracelular mientras que el 2% está presente en el liquido extracelular. en hipoventilación tanto central como periférica cuyo incremento de potasio es frecuente. Déficit de potasio corporal puede resultar en: Pobre ingestión de alimentos. así mismo en algunos casos de . Existe también una pérdida lenta de potasio de los glóbulos rojos hacia el suero cuando la sangre permanece guardada. varían entre 4-5. diarrea o fístula gastrointestinal segundo por excreción urinaria incrementada en individuos con anormalidades tubulares renales. Se debe evitar la hemolisis en la toma de muestras de sangre porque el potasio puede ser liberado de los eritrocitos lisados. la excesiva destrucción de células del cuerpo y la utilización de proteínas para propósitos calóricos se acompañaría de pérdida de potasio celular.9 mEq/L. influye activamente en el metabolismo celular ya que es cofactor de muchas reacciones enzimáticas intercelulares. El 95% del total del potasio corporal es intercambiable aunque el grado de recambio de cada tejido varía en los diferentes órganos. La concentración de potasio intracelular varia con los cambios del agua que gene ralmente acompaña a las alteraciones de los niveles de sodio extracelular. (3300 mEq) de potasio en un adulto de 70 kg. en adultos masculinos hay aproximadamente 46 mEq de recambio de potasio. en recién nacidos los niveles son algo más altos. 88 insuficiencia renal crónica. II. REACTIVOS A UTILIZAR:  Reactivo precipitante :ácido tricloroacético  Reactivo TPB-Na: tetrafenilborato de sodio  NaOH  Estándar de Potasio III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento): 1. Precipitación: en un tubo de ensayo pequeño añadir 50 ul de suero y 500 ul de reactivo precipitante. Mezclar cuidadosamente. Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm). 2. Armar el siguiente sistema: Componentes Reactivo de trabajo Standard Sobrenadante Standard 1 ml 100 ul 100 ul Problema 1 ml Para producir una turbidez homogénea el Standard y el sobrenadante transparente deben de ser agregados en el centro de la superficie del reactivo de trabajo Mezclar cuidadosamente Dejar reposar por lo menos 5 minutos Medir las absorbancias dentro de los 5 y 30 minutos CÁLCULOS: Factor: 5/Lectura del Standard Problema: lectura del problema x factor VALORES NORMALES: Suero de 3.5 a 5.5 mmol/l IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es el principio o fundamento del método de Hoffman para determinación del potasio sérico? 2. ¿Cómo explica metabólicamente la influencia sobre la concentración sérica de potasio producida por la administración de glucosa e insulina? 3. Explique usted los efectos metabólicos de la aldosterona en la excreción renal de potasio. 4. De ejemplos de hiperpotasemia y de hipopotasemia 89 PRACTICA N° 35 DETERMINACION DE CALCIO SERICO I. INTRODUCCION: El calcio sérico se encuentra en dos formas: Una combinada con proteínas séricas, inactivo e incapaz de difundir a través de las membranas de los capilares. Y la forma no unida a las proteínas, es principalmente iónico, difusible y activo. Varios factores influyen en la concentración de calcio sérico total. La hiperproteinemia está asociada con una elevación en los niveles de calcio, mientras que la hipoproteinemia se acompaña con disminución de la concentración de calcio; sin embargo la concentración de calcio ionizado no se altera. El calcio ionizado se altera en las siguientes situaciones: 1) Por variaciones del pH sérico; la alcalosis tiende a disminuir el calcio y la acidosis tiende a incrementarlo. 2) La ingestión de vitamina D aumenta el calcio ionizado a través de la absorción de calcio y por la excreción del fósforo. 3) La hormona paratiroidea es el factor más importante que controla los niveles de calcio sérico y su efecto es casi exclusivamente limitado a la forma iónica del calcio. La concentración del calcio sérico en individuos normales es de 9 a 11,5 mg por 100 ml Aproximadamente 4,5 a 5,5 mg% es ionizado y cerca de 0,5 mg% está presente como citrato de calcio y el resto se encuentra unido a las proteínas. El propósito de la presente práctica es determinar la concentración sérica de calcio total en personas adultas normales y/o en estado patológico por el método colorimétrico directo II. REACTIVOS A UTILIZAR: - Buffer alcalino: buffer lisina pH 11,1 - Reactivo de Color: 8-hidroxiquinolina, o-cresolftaleina-complexona, ácido clorhídrico - Solución estándar de calcio: 8 mg/dl III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Standard Muestra Muestra --------20 ul Standard ----20 ul ----Reactivo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar y medir la absorbancia de la muestra (¨A muestra) y del Standard (¨A Standard) contra el blanco en un lapso de 5 a 30 minutos CALCULOS: A muestra C ! 8v ?mg/dlA A standard VALORES DE REFERENCIA: Suero o Plasma: 8,1 ± 10,4 mg/dl   90 IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es la importancia biológica del calcio en el ser humano? 2. ¿Cuáles son las formas de calcio sérico? 3. ¿Cuáles son los factores que controlan los niveles de calcio sérico? 4. ¿Cuál es la concentración normal de calcio sérico total? 5. Señale algunas alteraciones fisiológicas y/o patológicas que producen alteraciones de los niveles séricos de calcio. . La presente práctica tiene la finalidad de: Verificar el desplazamiento de agua desde el medio extracelular hacia el medio intracelular y viceversa en los eritrocitos. Las células esferociticas se rompen más rápidamente que las demás y de hecho la prueba de la fragilidad osmótica puede ser considerada como un índice más sensible que la de la magnitud de eritrocitos a la lisis en solución hipotónica. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS ERITROCITOS : PRECAUCIONES: 1.91 PRACTICA N° 36 EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES I. Si utilizamos una serie de soluciones de CINa de concentraciones gradualmente progresivas es posible comprobar que la hemolisis de los eritrocitos se producen dentro de ciertos limites de hipotonicidad. La muestra de sangre debe ser obtenida con un mínimo de estancamiento y de trauma.86 g).5 . anemia falciforme y en la anemia hipocrónica ordinaria (ferropénica). REACTIVOS A UTILIZAR: EXPERIMENTO N°1 . Cuidar que las gotas de sangre caigan directamente en las soluciones salinas. Sin embargo cuando los eritrocitos son colocados en solución hipotónica aceptan líquido (hinchándose) hasta que se alcanza el equilibrio osmótico o hasta que se rompen.Solución salina amortiguada concentrada 10%. II. Utilizar heparina como anticoagulante de elección.NaCl al 4. 2.5% . Aunque en la prueba de la osmosis la ruptura de las células resulta de la alteración de su forma y disminución de su resistencia a las fuerzas osmóticas más que a un cambio en la composición de la célula o su osmolaridad.Heparina III.31 g).Cloruro de sodio (180 g). .NaCl al 8. es observada en la talasemia.Na2P04 (27. lo que se conoce con el nombre de fragilidad osmótica de los eritrocitos (0. . 4. La muestra debe ser procesada tan pronto como sea posible después de tomada. 3. Demostrar la fragilidad osmótica de los eritrocitos cuando éstos son colocados en diversas soluciones de CINa de diversas concentraciones. de allí que se emplee el término de fragilidad.5% EXPERIMENTO N°2 .NaH2 PO4. El uso de anticoagulantes del tipo de los oxalatos que comprende la adición de sales osmóticamente activas son indeseables.3%). no deben hacer contacto con las paredes de los tubos secos porque estos pueden causar .0. Sin embargo en ciertas anemias hemolíticas adquiridas.NaCl al 15%. la resistencia de los eritrocitos a las soluciones hipotónicas disminuye.2H2O (4. . Cuando éstos son colocados en una solución hipertónica pierden líquido arrugándose y destruyéndose hasta que se establece el equilibrio osmótico con el líquido circulante. cuando estos son puestos en soluciones hipertónica e hipotónica respectivamente. INTRODUCCION: La membrana de los eritrocitos es semipermeable. Se afora con 2 litros de agua destilada y se conserva a 0° C (dura varios meses). . Conviene preparar una solución al 1% a partir de la solución concentrada al 10% y armar la siguiente serie de tubos: N° de NaCl al 1% Agua destilada % de NaCl tubo (ml) (ml) 1 0.75 3.50 0.70 12 4. 3. 6.00 0.55 9 3.40 y 0. Colocar cantidades similares de sangre control del sujeto normal en cada uno de los tubos de una segunda hilera. objetivado por el color rojizo pálido que toma el líquido sobrenadante en los tubos centrifugados.75 2.50 3.75 0. con las precauciones señaladas.25 2.45% de NaCl).25 1.00 0. Mezclar el contenido de cada tubo antes de agregar la sangre.10 2 1. Mezclar correctamente cada tubo y dejar a temperatura ambiente por 30 minutos. con un algodón empapado en alcohol yodado.50 8 2.50 0.30 4 1. Utilizando con precisión una pipeta para hemoglobina o una pipeta Pasteur calibrada. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 1 y 3 de cada mesa de trabajo). LECTURA: Observar cuidadosamente y marcar los tubos donde se inicia la hemólisis.50 4. Proceder de la siguiente manera: Láminas (gotas) I II III .40 6 2. 4.50 1.65 11 3. EFECTO DE LAS SOLUCIONES HIPERTÓNICAS E HIPOTONICAS SOBRE LA INTEGRIDAD DE LOS ERITROCITOS: (Verificar por inferencia el desplazamiento del agua entre los medios intra y extracelular. 7.00 0. Marcar el tubo donde la hemólisis es completa (color rojo intenso).50 0. Observar que la fragilidad globular media de los eritrocitos se produce entre los tubos 5 y 6 (0.92 hemólisis.60 10 3. Volver a mezclar y luego centrifugar a 2000 rpm.25 0.75 0. por acción de soluciones salinas de diferente concentración). Utilizando lancetas descartables o lanceta de Link estéril pinchar el dedo.45 7 2.50 2. PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES Las diluciones se pueden preparar inmediatamente antes de la prueba: 1. añadir 0. 5. Anotar los resultados.00 3.35 5 2.00 0. Depositar una gota de sangre en cada una de las tres láminas porta-objeto. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 2 y 4 de cada mesa de trabajo). Se debe rotar cada muestra suavemente en el tubo hasta que el color sea rojo brillante (plenamente oxidado).00 1.50 0. en tubos heparinizados.80 2.02 ml de sangre del paciente a cada uno de los doce tubos de una primera hilera.20 3 1. Procedimiento: Realizar asepsia del pulpejo del dedo escogido de la mano.00 4.00 2. La sangre del paciente y del sujeto normal son tomadas.25 0. Señale causas de alteraciones en la fragilidad osmótica. ¿Cuál es la relación normal existente que permite la forma de disco bicóncavo del eritrocito? B. Establecer las comparaciones morfológicas y/o lisis de los glóbulos rojos en rel ción a cada tipo de a soluciones empleadas en cada caso. ¿Cuáles son las relaciones normales existentes para la formación de los esferocitos y de las células tipo tiro al blanco? (target cell). . Si el test de fragilidad osmótica de los eritrocitos de un modo general evalúa la relación entre el área superficial y el volumen de la célula. Anotar los resultados.5% Solución hipertónica de CINa 15% Solución hipotónica de CINa 4. CUESTIONARIO: 1. 2. así mismo el tubo en donde la hemólisis fue completa. 3. diga: A. IV.5% Mezclar bien. 4.93 Sangre del pulpejo de dedo Solución isotónica de CINa 8. señale los porcentajes de inicio y finalización (total) de la hemólisis. Según observación cuidadosa. De acuerdo a los valores normales del test de fragilidad osmótica de los eritrocitos. señale la concentración o porcentaje de NaCl del tubo en el cual empezó la hemólisis. 1 2 - 1 2 - 1 2 Utilizando el microscopio observar los eritrocitos de cada una de las láminas. Por lo tanto no es sorprendente que los anticuerpos IgM.1 Ugr de anticuerpos/ml de suero Las pruebas de aglutinación se utilizan rutinariamente en las pruebas cruzadas con sangre antes de administrar transfusiones endovenosas en pacientes. tanto para medir antígenos como para determinar las concentraciones de los anticuerpos. ambos tipos de reacciones se producen por medio de anticuerpos multivalientes que se combinan con partículas de antígeno formando complejos de antígeno anticuerpos. partículas de látex. pero en algunos casos se necesita el examen microscópico de la preparación estudiada. etc. La única diferencia entre una reacción de precipitación y otro de aglutinación es que los antígenos son moléculas pequeñas en tanto que los antígenos aglutinantes están asociados con partículas de mayor tamaño. en la Prueba de Weil Felix (en pacientes con enfermedades provocadas por Ricketsias. dirigidos contra el mismo antígeno. En general las pruebas de aglutinación son fáciles de prac ticar. Las pruebas de aglutinación tienen muchos usos en el laboratorio clínico. Estas partículas (bacterias. una baja concentración de anticuerpos IgM produce una reacción de aglutinación cuya intensidad es igual a la que se produce con una elevada concentración de anticuerpos IgG. en las condiciones empleadas en la prueba. La concentración del anticuerpo aglutinante se define como la mayor dilución de antisuero que aglutina el antígeno examinado. Algunas personas . bastante reproducibles y sumamente sensibles. Estas diferencias dependen principalmente de la valencia del sitio de fijación del antígeno en las diversas clases de los anticuerpos. en la Prueba de Paul-Bunnell (Prueba de aglutinación en pacientes con mononucleosis infecciosa). Al igual que las reacciones de precipitación las pruebas de aglutinación requieren de un pH apropiado y de la moralidad de amortiguadores salinos y debe existir una proporción adecuada de antígeno respecto del anticuerpo. En efecto dichas pruebas permiten habitualmente descubrir hasta 0. En la membrana de los glóbulos rojos de cualquier persona normal se pueden encontrar determinados antígenos (antígeno de superficie o determinantes antígenos). en la prueba del factor reumatoideo (en pacientes con artritis reumatoides). El mecanismo de una reacción de aglutinación es semejante al de las reacciones de precipitación. pueden quedar suspendidas en una solución salina y mezclarse con antisueros específicos. etc. Se denomina reacción de aglutinación al fenómeno en que la mezcla de las partículas de antígeno con los antisueros específicos provoca una agrupación de dichas partículas antigénicas. Los anticuerpos de las distintas clases de inmunoglobulinas difieren en su capacidad de producir reacciones de aglutinación. En otras palabras. eritrocitos. en pruebas inmunitarias del embarazo. en la Prueba de Widal (en pacientes infectados con bacterias gram negativas como Salmonella. para descubrir la presencia de anticuerpos del receptor. con cinco sitios eficaces de fijación de antígeno por cada moléculas de 19S tengan una actividad aglutinante superior a la de los anticuerpos IgG con dos sitios de fijación de antígeno por cada molécula. otras personas tienen otro tipo de antígeno de superficie que se llama antígeno B (eritrocitos tipo B). Pasteurella). Por lo general la aglutinación puede observarse a simple vista. en la superficie de los eritrocitos del donador (Prueba indirecta de Coombs). INTRODUCCION: Frecuentemente los antígenos se asocian con partículas que son demasiado grandes para formar soluciones o suspensiones coloidales en los medios acuosos. Brucella.). Algunas personas son poseedoras de un antígeno de superficie designado en forma arbitraria como antígeno A (eritrocitos tipo A). en el diagnóstico de las anemias hemolíticas por autoinmunidad (en la que los pacientes producen anticuerpos para las membranas de sus propios eritrocitos).94 PRACTICA N° 37 EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES I. como el tifus endémico). Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos tipo A sobre la gota de suero con marca 1 y mezclar. con hepsrina como anticoagulante. En cada extremo de una lámina porta objetos poner una gota del suero recientemente obtenido y marcar 1 y 2 respectivamente.  Identificación de isoaglutininas en suero: y De uno de los estudiantes de cada grupo (o masa) de trabajo. II. Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos tipo B sobre la gota de suero con marca 2 y mezclar.95 pueden tener ambos antígenos A y B (eritrocitos AB) y una cuarta posibilidad es que no tengan ninguno de los antígenos mencionados (eritrocitos tipo 0 o H). en el suero existe también normalmente anticuerpos contra los antígenos A y B. Los antígenos de superficie A y B son llamados también aglutinógenos y se ha estimado que pueden haber hasta un millón de sitios antigénicos A o B en un solo hematíe. Es un hecho bien conocido que muchas bacterias instestinales (salmonellas y shigellas) tienen antígenos que reaccionan en forma cruzada con los antígenos humanos AB0 (H). y y y y IV. III. aunque quizá sea más realista una cifra de 5000. Estos anticuerpos (isoaglutininas) son del tipo IgH y son poco detectables en los sueros de los recién nacidos. La misma lógica explicaría que una persona del grupo B forma sólo anti A y no anti B. Utilizando los símbolos (+ )= positivo y (-)= negativo complete el cuadro de aglutinación de los grupos sanguíneos ABO: . De acuerdo con esta hipótesis todos los recié nacidos n están expuestos a los antígenos A y B. llamados isoaglutininas. del tipo A y B en solución salina fisiológica. y Llevar los glóbulos rojos sedimentados con suero fisiológico por tres veces. Los antígenos aparecen a comienzos de la edad fetal en cuanto se forman los eritrocitos . Como existe un desarrollo gradual de estas isoglutininas.000. y Obtener muestras de sangre tipo A y tipo B. porque producen aglutinación de los glóbulos rojos que poseen el correspondiente antígeno y porque los antígenos son de origen humano (iso=de una misma especie). y Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos y descartar el plasma. tomar una muestra de sangre sin anticoagulante y obtener el suero por centrifugación. le ha conferido una tolerancia inmunológica específica hacia él. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. pero aumentan con rapidez su titulación en los primeros meses de vida. previamente identificadas. CUESTIONARIO: 1. para eliminar los anticuerpos inespecíficos adicionados a la superficie de los glóbulos rojos. y Preparar una suspensión al 5% de glóbulos rojos lavados. Observar si hay o no aglutinación de los glóbulos rojos en 1 y/o en 2 de isoaglutininas en el suero problema del estudiante y deducir el grupo sanguíneo que posee. Por otra parte. se ha sugerido que las inmunizaciones inaparentes durante la infancia y el comienzo de la niñez pueden ser responsables de la producción de anti A o anti B. Pero una persona del grupo A forma sólo anti B y no anti A. REACTIVOS A UTILIZAR: y Kit para identificar grupos sanguíneos (Diagnóstica). ya que su propio antígeno A. (G. En el siguiente cuadro anote los anticuerpos en el suero: GRUPOS SANGUÍNEOS ABO ANTIGENOS EN LOS POS ERITROCI. EN EL SUERO Anti Anti Anti Anti POSIBILIDADES DE TRANSFUSIÓN Puede recibir Puede donar De A AyO ByO O Todos (receptor Universal) A y AB B y AB Todos (donador Universal) AB 4.96 SUERO DEL GRUPO O B A AB ( ( ( ( AB ) ) ) ) ERITROCITOS DEL GRUPO A B ( ( ( ( ) ) ) ) ( ( ( ( ) ) ) ) ( ( ( ( C ) ) ) ) 2. ¿Qué aplicaciones de las reacciones antígeno anticuerpo puede señalar? 5. ¿Cuál es el fundamento de las reacciones antígeno-anticuerpo? . Diga usted ¿Por qué ya no es costumbre corriente utilizar sujetos de tipo O como ³donadores universales´ y personas de tipo AB como ³receptores universales´? 3. SANG) A B O AB ANTICUER.