Guia Pract. Microbiologia 2014-2-FN Final

Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTEDocentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden UNIVERSIDAD DE SAN MARTÍN DE PORRES FACULTAD DE MEDICINA HUMANA MICROBIOLOGÍA MANUAL DE PRÁCTICAS 2014 Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden MANUAL DE PRÁCTICAS Microbiología. Universidad de San Martín de Porres. Facultad de Medicina Humana. Chiclayo – Perú. Dr. José Huapaya Yaya, © 2007. Primera Edición. Derechos Reservados. Prohibida la reproducción total o parcial de esta obra, por cualquier medio, sin autorización escrita de los autores. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden PRACTICAS TIPO DE ASIGNATURA : Teórico – Práctico UBICACIÓN : 2 do Año DURACIÓN : Semestral SEDE : Facultad de Medicina Humana Filial Norte CRÉDITOS DE LA ASIGNATURA : 05 CARÁCTER : Obligatorio CÓDIGO : Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden INTRODUCCIÓN El Manual de Prácticas de Microbiología tiene como objetivo orientar a los alumnos a un mejor conocimiento y aplicación de los procedimientos de identificación y aislamiento de la variada flora microbiana de importancia en medicina humana. La microbiología es una disciplina que estudia la biología de los microorganismos capaces de producir enfermedad. Desde que se describiera por primera vez la morfología de las bacterias (Leewenhoek - Siglo XVII), luego el aislamiento y diagnóstico de distintos microorganismos sobre todo en las dos últimas décadas del Siglo pasado en que se inicia la denominada “Época dorada de la bacteriología“ esta ha evolucionado tremendamente. Continuamente se describen procesos infecciosos así como situaciones nuevas en los pacientes motivando ello la disponibilidad de información científica relacionada con la microbiología clínica y la infectología. Los avances tecnológicos, con un aumento de la automatización, el desarrollo de la biología molecular, la química de los ácidos nucleicos, los avances en inmunología clínica y los conocimientos de la patogenicidad microbiana hacen necesario la revisión continua de los textos de microbiología. Tenemos el convencimiento que ésta orientación académica proporcionará a los alumnos de la Asignatura de Microbiología los recursos para prever el inicio del padecimiento. Así como la base para el diagnóstico terapéutica e investigación de las enfermedades infecciosas. Se da una relación concisa de los métodos de laboratorio empleados en el estudio de las bacterias, hongos, rickettsias y virus. Con tal motivo serán expuestos conceptos y ejercicios fundamentales, con lo que esperamos uniformar criterios, acorde con la actualizada tecnología. Los trabajos de laboratorio se han ordenado metodológicamente a fin de facilitar la aplicación de los conceptos básicos y así llegar al diagnóstico de los diferentes procesos infecciosos en humanos. El objetivo de estas prácticas consiste en familiarizar al alumno con algunas de las técnicas más comúnmente utilizadas en los laboratorios de Microbiología y permitir la observación experimental de los conceptos aprendidos durante las clases teóricas. Debemos dejar establecido que el presente Manual de Prácticas, no es una compilación amplia del tema, sino más bien un Manual que contiene los requerimientos básicos, orientación, adecuando los recursos y procedimiento que contribuirán a cimentar la formación integral del médico humano. Como docentes, nos sentiremos satisfechos si al final del curso se han cumplido los objetivos, utilizando los elementos y procedimientos de diagnóstico en el proceso enseñanza - aprendizaje. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden GENERALIDADES El estudio de las bacterias y de su estructura es particularmente difícil, debido al tamaño que presentan, siendo éste entre 1 y 6 micras. Para su observación se requiere el empleo del microscopio de luz; sin embargo, esto no proporciona el suficiente poder de resolución que permita observar las diferentes estructuras de las bacterias lo que hace necesario el uso del microscopio electrónico. Para la observación y estudio de las bacterias se utilizan diversos métodos. El más simple de ello consiste en la observación en fresco, de esta manera se visualizan características someras que proporcionan una idea del tamaño, forma y en ciertas especies la movilidad; estos aspectos pueden mejorarse con el empleo del microscopio de contraste de fase. Otra tecnología que permite observar con mayor claridad a las bacterias lo constituye los métodos tintoriales, que facilitan el estudio de la forma, agrupamiento y la afinidad a diversos colorantes. Entre las técnicas de mayor utilidad destaca según su afinidad tintorial en Gram positivas y Gram negativas. Existen grupos bacterianos que para su observación requieren otras técnicas como la de Ziehl-Neelsen, la cual identifica a las bacterias ácido - alcohol resistente. Algunas bacterias poseen ciertas estructuras importantes que pueden ser evidenciadas mediante técnicas de coloración especiales, como por ejempl o, para observar cápsula, esporas flagelos etc. Para el diagnóstico de hongos y virus existen técnicas particulares las mismas que serán descritas en el capitulo correspondiente Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden ROL DE PRÁCTICAS SEMANA FECHA TEMA 1 ra 14 agosto Practica N° 1 Bioseguridad Practica 2 da 21 agosto N°2. Obtención y manejo de muestras clínicas 3 ra 28 agosto Practica N°3. Preparación, fijación y coloraciones bacterianas (coloración simple y coloración diferencial: Gram y Ziehl Neelsen ) 4 ta 4 septiembre Practica N°4. Medios de Cultivo, Métodos de siembra y aislamiento bacteriano 5 ta 11 septiembre Practica N°5. Pruebas bioquímicas para bacterias grampositivas 6 ta 18 septiembre Practica N°6.Actividad antimicrobiana in vitro: Antibiograma 7 ma 25 septiembre PRIMER EXAMEN PRACTICO 8 va 2 octubre Practica N°7. Pruebas bioquímicas para bacterias gramnegativas 9 na 9 octubre REVISION 1 DE TRABAJOS DE INVESTIGACION 10 ma 16octubre Práctica de Laboratorio Nº 8 Identificación y aislamiento de Mycobaterium. Coloración de Ziehl- Neelsen 11 va 23 octubre Práctica de Laboratorio Nº9: Cultivo de muestras clínicas: Urocultivo, Coprocultivo 12 va 30 octubre Práctica de laboratorio Nº10: Diagnóstico micológico: hongos ambientales. Práctica de Laboratorio N°11 Técnicas de diagnóstico micológico: Diagnóstico de micosis superficiales y cutáneas. 13 va 6 noviembre Práctica de Laboratorio N° 12: Técnicas de diagnóstico micológico: Diagnóstico de micosis subcutáneas, sistémicas y oportunistas. 14 va 13 noviembre Práctica de Laboratorio N° 13: Diagnóstico virológico 15 va 20 noviembre SUSTENTACION Y PRESENTACION DE TRABAJOS DE INVESTIGACION 16 va 27 noviembre EXAMEN FINAL INSTRUCCIONES PARA LA PRESENTACIÓN DEL INFORME DE CADA PRÁCTICA 1. Leer detenidamente los fundamentos teóricos de la práctica y complementarlo con la bibliografía adicional de la practica a realizarse. 2. Presentar adecuadamente los resultados, toda observación microscópica deberá contener el aumento respectivo, tipo de coloración realizada, tipo de muestra y deberá señalar la estructura que se observa. Cabe resaltar que los resultados serán presentados en su guía respectiva al finalizar la sesión práctica al profesor de mesa encargado. 3. En cada práctica a de realizarse un comentario y/o discusión además de las conclusiones de cada practica con la debida referencia bibliográfica, Todo esto será presentado y redactado a mano la semana siguiente de realizada la práctica a su profesor de mesa. 4. Las evaluaciones o cuestionarios que se encuentran en cada práctica de la guía deberán ser resueltas antes de la ejecución de la practica, ya que formarán parte de la evaluación (durante le ejecución de la práctica). 5. El alumno podrá hacer llegar las sugerencias que contribuyan al mejoramiento de las prácticas. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden MATERIAL Y EQUIPO BÁSICO EN LAS PRÁCTICAS MICROBIOLÓGICAS En el campo de la microbiología médica se requiere de conocimientos básicos, indispensables para facilitar el estudio de los diferentes microorganismos; por tal motivo es necesario que el alumno se familiarice desde el principio con el material y equipos empleados en el aislamiento e identificación de los microorganismos (bacterias, hongos y virus). Ellos deben ser debidamente preparados y posteriormente esterilizados para asegurar que los ejercicios reúnen los requisitos exigidos para el trabajo microbiológico. A continuación se describen algunos de ellos: Placa de Petri  Recipiente de vidrio o plástico que, en general se usa para contener medio de cultivo y proporciona una suficiente área para el crecimiento bacteriano. Asa y aguja para siembras  Muy usada en la práctica bacteriológica; hecha de alambre de platino o de otro material se inserta en un mango que facilita su manejo. El alambre puede ser recto o terminar en forma de pequeño anillo. Portaobjetos  Laminilla de vidrio que se utiliza para preparar frotis bacterianos. Gradilla  Soporte para tubos de ensayo. Pipetas  Son tubos cilíndricos de diversos materiales, puede ser graduadas y sirven para medir volumen conocido de líquido. Otras no son graduadas y se utilizan para la transferencia de líquidos. Pipetas Pasteur  Varillas de vidrio de 4 mm de diámetro y de 20 a 30 cm. de longitud. Se las emplea para la toma de pequeños inóculos de siembra. Pipeteadores automáticas  Pipetas que absorben en forma automática sin necesidad de uno aspirar, pequeños volúmenes (1 µL a 1000 µL) de muestras. Crioviales  Pequeños tubos cónicos de polipropileno resistentes a muy bajas temperaturas (-4° C) usados para guardar muestras en la congeladora. Ej. Suero, cepas virales. Matraces y balones  Recipientes volumétricos de gran utilidad para la preparación y almacenamiento de soluciones, colorantes, reactivos, medios de cultivo, etc. Los balones se diferencian de los matraces por tener una base esférica con fondo plano. En ambos los cuellos terminan en un discreto reborde lo que les confiere resistencia. Medios de cultivo  Mezcla de nutrientes esenciales para el crecimiento de microorganismos; en su composición se incluyen un número balanceado de nutrientes y un determinado volumen de agua. De acuerdo a su consistencia pueden ser líquidos, semisólidos y sólidos. Se presentan en forma deshidratada. Mechero de Bunsen  Mechero de gas en el que este se mezcla con aire antes de producir la flama. Se utiliza para esterilizar el alambre de platino. Estufa  Aparato de dimensiones diversas, donde incuban los cultivos, generalmente a 37º C. Autoclave  Aparato para esterilización por vapor bajo presión, provisto de un manómetro y una llave que regula la presión y la temperatura a la que desea esterilizar. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden Microscopio  Instrumento óptico utilizado para la observación de microorganismos que no son visibles a simple vista. Centrifuga  Aparatos diseñados para acelerar la separación de partículas sólidas suspendidas en líquidos. Filtros esterilizantes  Para dejar libre de contenido microbiano a productos en estado líquido, los que por su naturaleza no pueden ser sometidos a la acción del calor en sus diferentes modalidades Jarra de anaerobiosis  Instrumento útil para el aislamiento de bacterias anaerobias ya que permite un cierre hermético no dejando ingresar oxigeno. Contador de colonias  Sirve para contar electrónicamente y de forma exacta las colonias de microorganismos. Flujo laminar  Equipo que proporciona área estéril, para los trabajos microbiológicos, en especial cultivo, evitando la interferencia de los microorganismos de contaminación ambiental. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden Microscopio Estufa Autoclave Horno para Esterilizar Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden Centrifuga Cámara de flujo laminar Contador de Colonias Jarra Gaspak Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden PRACTICA N° 1 BIOSEGURIDAD OBJETIVOS  Reconocer Situaciones De Riesgo y prevenir Los Accidentes Laborales  Aplicar las Precauciones Estándar  Producir Cambios de Actitud  Establecer Normas de Bioseguridad INTRODUCCIÓN  Por las características de nuestra labor (trabajo con enfermos y/o sustancias y materiales que potencialmente pueden causar daño), los trabajadores de salud estamos en permanente exposición a las enfermedades y a daños accidentales a sido necesario buscar medidas de prevención, tales medidas que tienen como objetivo proteger la salud y la seguridad del personal, de los pacientes y de la comunidad; frente a diferentes riesgos producidos por agentes biológicos, físicos, químicos y mecánicos; las llamamos MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD.  FACTOR DE RIESGO: Objeto, sustancia, forma de energía o característica de la organización del trabajo hospitalario, que puede contribuir a provocar un accidente de trabajo, a gravar las consecuencias del mismo o provocar, a largo plazo enfermedades ocupacionales.  RIESGO BIOLOGICO: Es la probabilidad de sufrir cualquier tipo de infección, alergia, o toxicidad por una exposición no controlada a agentes biológicos.  PRINCIPIOS BASICOS DE BIOSEGURIDAD: UNIVERSALIDAD: “Todos los pacientes, sus muestras clínicas y sus fluidos corporales independientemente del diagnóstico de ingreso o motivo por el cual haya entrado al hospital o clínica, deberán ser considerados como potencialmente infectantes y se debe tomar las precauciones necesarias para prevenir que ocurra transmisión.” PRECAUCIONES ESTANDAR: Buscan la disminución del riesgo de transmisión de microorganismos de cualquier fuente hospitalaria. Incluyen: Barreras de Contención, Desinfección y Esterilización, etc. BARRERAS DE CONTENCION PRIMARIA: Protección del personal (incluye vestimenta e incluso vacunas) y del medio ambiente inmediato contra la exposición a agentes infecciosos y/o productos químicos de riesgo. BARRERAS DE CONTENCION SECUNDARIA: Es la protección del ambiente externo contra la exposición de material infeccioso. DESINFECCION:  Es el proceso intermedio entre limpieza y esterilización, sobre objetos inanimados  Se efectúa utilizando agentes químicos  Depende de concentración desinfectante, el agente y tiempo exposición ESTERILIZACION: Proceso eliminar toda forma de vida microbiana. Métodos: Vapor saturado o presión (autoclave), Calor seco (horno), Incineración, Agentes químicos (líquido, gas)  NIVELES DE BIOSEGURIDAD Nivel 1: Incluye la manipulación de microorganismos no patógenos o no se conozca que causen enfermedad o muerte a adultos sanos. Ejemplo: Bacilllus subtilis, Enterobacterias, BGNNF, S. aureus, etc. Las Medidas son las practicas Microbiológicas estándar y no requiere equipos de seguridad Nivel 2: El riesgo individual es moderado y el riesgo poblacional bajo. Incluye Microorganismo de riesgo moderado asociados con enfermedades humanas por lastimadura de piel, ingestión o exposición de membranas mucosas. Ejemplo: Salmonella, Hepatitis B Viral. L La as s Medidas Microbiológicas son estándar y el acceso es restringido, etc. Nivel 3: El Riesgo individual es elevado pero el riesgo poblacional es bajo. Los Microorganismos que pueden producir la muerte o aquellos de riesgo moderado que incluya la infección por aerosoles. Ejemplo: Virus influenza, HIV, Brucella, Tuberculosis. Se aplicaran medidas de bioseguridad del Nivel 2, acceso Controlado, descontaminación de todo desecho, etc. Nivel 4: Riesgo individual y poblacional elevado. Los Microorganismos altamente patógenos y mortales que no se conoce bien su forma de trasmisión. Ejemplo: Virus Ebola, etc. Se aplicaran m medidas del nivel 3, Cambio de ropa antes de entrar, Ducha a la salida, etc. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden A continuación se presentan algunas normas de Bioseguridad que deberán cumplirse durante le ejecución de las prácticas: INSTRUCCIONES DE BIOSEGURIDAD PARA LOS ESTUDIANTES DURANTE EL DESARROLLO DE LAS PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA: 1. No será permitido ingresar a la Sala de Prácticas sin el respectivo guardapolvo blanco, guantes, mascarilla y lentes de protección como medida de precaución, además no se permitirá dejar sobre las mesas de trabajo prendas de vestir o cualquier otro objeto diferente al material asignado para el ejercicio. 2. Esta prohibido correr, jugar, comer, beber y/o fumar, ni aplicarse cosméticos durante las clases prácticas, así como llevarse el lápiz, dedos o cualquier otro objeto a las proximidades de la boca y ojos. 3. Antes de cada trabajo, limpiar el área con desinfectante y luego lavarse las manos. Hacer lo mismo al finalizar la práctica. 4. Por razones de seguridad, ningún material de prácticas saldrá de la sala de trabajo. En caso que se rompa algún material de vidrio con cultivo bacteriano, avisar de inmediato al Profesor para que disponga la inmediata desinfección y la limpieza. 5. Uno de los instrumentos de trabajo, el asa o mango de Kolle, terminado el ejercicio programado deberá ser esterilizado mediante flameado, de acuerdo con las instrucciones dadas por el profesor. 6. Todo material de trabajo como son: láminas, laminillas o pipetas deberán ser depositados en los bocales de vidrio con solución desinfectante, los que estarán a la vista en cada mesa. Si fuera material de desecho, como restos de algodón, papel etc., depositarlos en los baldes de basura, nunca en la mesa de trabajo ni en el suelo. Los tubos, placas de Petri o frascos de cultivo se dejarán en canastillas o depósitos destinados para ser esterilizados. 7. Los profesores estarán en todo momento atentos para orientar y/o resolver cualquier duda que se presente en el desarrollo de las prácticas. 8. En caso de accidentes como rasguños, cortaduras o quemaduras, reportar inmediatamente al profesor. 9. Cada alumno debe disponer obligatoriamente del Manual de Prácticas, el cual le servirá de guía que han de revisar con anterioridad a cada ejercicio, de forma tal que tenga conocimiento previo de los ejercicios que se van a presentar. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden PRACTICA N° 2 OBTENCIÓN Y MANEJO DE MUESTRAS CLÍNICAS OBJETIVOS  Conocer las técnicas de toma de muestra y manejo de las diferentes muestras clínicas para su óptimo procesamiento.  Conocer las precauciones para el manejo y transporte de muestras clínicas. INTRODUCCIÓN  En términos de la efectividad del laboratorio de microbiología, nada es más importante que la apropiada selección, colección y transporte de las muestras clínicas. Estos procedimientos quedan inutilizados muchas veces por falta de cuidado y métodos defectuosos usados en la recolección y el manejo de las muestras.  Independientemente del hecho de que algunos tipos de muestras requieren metodología de colección muy especiales, podemos enumerar algunos aspectos generales que deben ser tenidos en cuenta al coleccionar las muestras clínicas:  La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso.  Cuando se va a proceder a tomar un espécimen clínico, es importante evitar la contaminación con microorganismos saprofitos del área. Esta flora normal puede interferir con la interpretación del cultivo y enmascarar la presencia del verdadero agente etiológico de la enfermedad.  Seleccione el tipo anatómico correcto donde se obtendrá el espécimen, y utilice la técnica apropiada y los instrumentos o elementos adecuados para su obtención. Especialmente en el caso de investigar microorganismos anaeróbicos.  Nunca refrigere una muestra por anaerobios.  Coleccione un apropiado volumen de muestra.  Insuficiente material puede ser causa de resultados falso-negativos.  Identifique cada muestra con el nombre del paciente, número de identificación personal, procedencia, tipo de muestra, fecha de colección, diagnóstico clínico, duración de la enfermedad, prueba requerida. e iniciales del funcionario que tomó la muestra.  Obtener en lo posible muestras antes de administrar antibióticos a agentes antimicrobianos. Si se han administrado informar de ello al laboratorio. A menudo un LCR no revela patógenos bacterianos en frotis ni cultivo cuando se ha tomado un antibiótico en las 24 horas anteriores.  Coloque la muestra en un recipiente estéril y adecuado para su transporte con el fin de asegurar la sobrevivencia del posible agente infeccioso, evitar derrame del espécimen y mantener las medidas de bioseguridad apropiadas.  Ordene siempre un frotis por gram para los especimenes que proceden de cavidades asépticas, y anote su interés en determinado microorganismo. LAS MUESTRAS MÁS FRECUENTES EN LOS ESTUDIOS MICROBIOLÓGICOS SON: ORINA  En las muestras de orina se pueden realizar diferentes análisis entre lo cuales tenemos a: examen microscópico de orina, urocultivo, determinación de algunos residuos de medicamentos (Doping) e investigación de microorganismos especiales como Leptospira. El éxito de estos exámenes dependerá de la técnica con que se tome la muestra y muy especialmente del tiempo transcurrido entre la toma y el análisis, ya que el proceso de descomposición que se sucede en la orina por acción de las bacterias allí presentes, modifica los parámetros de los componentes y muy especialmente altera la carga microbiana. Procedimiento  Lávese las manos  Los pacientes mujeres deben de realizar previamente el lavado de los genitales externos, con agua y jabón y de adelante hacia atrás, mientras que los hombres solo lo realizaran en caso de solicitarse cultivos.  Séquese con un apósito estéril  Las muestras deben colectarse en frascos de boca ancha y tapa de rosca, estériles, depositar aproximadamente entre 30 - 40 mL de preferencia la primera muestra de la mañana a través del chorro medio (orinar una buena cantidad en el water y luego en el envase) .  En mujeres la micción debe ser separando los labios mayores de la vulva.  En hombres se hace la retracción del prepucio de manera que el chorro de orina salga directamente  Tape el frasco con precaución, evitando contaminar la muestra y/o derramarla.  En caso de niños pequeños utilizar bolsas colectoras adheridas a los genitales.  La muestra debe ser enviada inmediatamente al laboratorio. En el caso de no ser posible refrigerarla no más de 4 horas. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden HECES  Las muestras de heces se solicita para examen bacteriológico, virológico, bioquímico y para la búsqueda de parásitos  Las muestras de heces de un paciente sospechoso de enfermedades diarreicas debe colectarse antes de la administración de cualquier antibiótico. Procedimiento  Muestra evacuada: La persona debe defecar en un recipiente limpio y seco, teniendo cuidado de no miccionar y que esta no se mezcle con orina.  Hisopado rectal : La muestra se obtiene con un hisopo de algodón estéril, el cual se desenvuelve y se lubrica previamente a su uso, introduciéndolo en el medio de transporte de preferencia Cary Blair, y luego se introduce en el recto, unos 3 cm, mediante movimientos de rotación. El hisopo con la muestra se introduce hasta el fondo del tubo que contiene el medio de transporte (Cary Blair o Amies)  El frasco con la muestro o el tubo con el medio de transporte se puede conservar a temperatura ambiente hasta sus procesamiento o envió al laboratorio, no mas de 12 hrs.  No se debe refrigerar la muestra HEMOCULTIVO  La sangre de los individuos sanos es estéril. Una afluencia repentina de bacterias habitualmente es eliminada del torrente circulatorio en un periodo de tiempo corto, de minutos a horas, excepto cuando existe una infección masiva o está presente un foco intravascular infectado. Básicamente cuando las bacterias se multiplican a tasas que exceden la capacidad del sistema reticuloendotelial para eliminarlas se habla de BACTERIEMIA. El término FUNGEMIA se utiliza para designar la presencia de hongos en sangre.  Siempre que exista una razón para sospechar una bacteriemia se debe practicar el cultivo de la sangre o hemocultivo Procedimiento  Los hemocultivos se obtendrán antes de iniciar la terapia antibiótica, el incumplimiento de este punto puede dar lugar a resultados falsamente negativos pudiendo comprometer la vida del paciente.  Los microorganismos de la piel pueden contaminar la sangre durante la extracción dificultando la interpretación de los resultados. Además algunos contaminantes actúan como patógenos oportunistas, por lo que debemos ser muy cuidadosos durante la extracción.  La toma debe realizarse por venopunción y para ello, debe hacerse:  Lavado de manos y utilización de guantes estériles.  Limpiar con jabón líquido o alcohol el lugar de punción.  Aplicar durante 1 minuto povidona yodada, dejar secar.  Desinfectar los tapones de los frascos.  Efectuar la extracción.  No airear los frascos.  Nunca debe hacerse la extracción a través de catéteres, salvo en aquellas circunstancias en que se indica específicamente.  Cuando la extracción se haga con adaptador, este debe esterilizarse o ser de un solo uso. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden MUESTRAS FARINGEAS Y AMIGDALARES:  Más del 70% de procesos están ocasionados por virus: Rinovirus, Coronavirus, Adenovirus(3,4,7,14,21), virus Parainfluenza, virus de la Gripe, Virus Coxsackie A y otros Enterovirus, virus Epstein-Barr y virus Herpes Simple tipo I.  Entre el 10-20% de las faringitis agudas en niños de 5-10 años, están ocasionadas por Streptococcus pyogenes. Otras bacterias patógenas son: estreptococos grupos C o G, C.diphteriae, A. haemolyticum, N. gonorrhoeae, H.influenzae (epiglotitis) Procedimiento  Las muestras de exudado faringo-amigdalar se obtienen con la ayuda de un depresor lingual, tocando con la torunda todas las partes con exudados, membranas o inflamación. Se deben frotar las criptas tonsilares y la faringe posterior. No se requieren medidas especiales para su transporte y conservación.  En la toma de muestras de la epiglotitis, debido al riesgo de complicaciones, se hace por un especialista en las condiciones adecuadas. Es recomendable realizar hemocultivos. MUESTRAS NASALES Procedimiento  La muestra se obtiene introduciendo una torunda para cultivo, previamente humedecida, unos 2 cm en la nariz, y girando suavemente contra la mucosa de la superficie nasal. CATETERES  El estudio bacteriológico de los catéteres, nos va a permitir en ocasiones conocer el agente causal de una bacteriemia relacionada con el catéter y por otra parte, prevenir que aparezca dicha bacteriemia. Para valorar su importancia, podemos decir que de una u otra forma el 82% de las bacteriemias nosocomiales se relacionan con la presencia de catéteres.  Vías de infección: a) Piel y catéter. En los catéteres periféricos y de corta duración. b) Endoluminal. En las vías centrales tunelizadas. Procedimiento  Una vez extraído el catéter, cortar 3 o 4 cm de la porción distal en condiciones asépticas. Depositar en frascos estéril sin conservante y transportar de inmediato. Si ello no fuera posible conservar a 4ºC. LIQUIDOS ESTÉRILES  El fundamento es la búsqueda de los microorganismos patógenos u oportunistas que pueden estar presentes en los líquidos o fluidos orgánicos. En este grupo incluimos líquidos producidos, ya sea de forma espontánea o bien provocada a nivel de serosas, en las que habitualmente no existen microorganismos y son presumiblemente estériles. Su buen manejo presenta un triple interés por:  La trascendencia de esta patología por su elevada morbilidad y mortalidad.  Dificultad en diferenciar patógenos y oportunistas como consecuencia de cuidados terapéuticos instaurados o prótesis aplicadas previamente.  Posibilidad de contaminación exógena, sea en la obtención o en su manipulación, siendo por ello muy importante extremar las medidas de asepsia de recogida y procesamiento. Muestras  Líquido ascítico o peritoneal Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden  Líquido articular o sinovial  Líquido pericardio  Líquido pleural Procedimiento  Tras la obtención mediante punción en condiciones asépticas por personal especializado y en cantidad suficiente, se depositará el líquido obtenido en frasco estéril, a ser posible con tapón de rosca y fondo cónico y se remitirá de forma inmediata al laboratorio.  Una alternativa es la inoculación directa del líquido biológico en frasco aerobio y anaerobio de hemocultivos. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO  La meningitis es un proceso inflamatorio del Sistema Nervioso Central que afecta a las leptomeninges y al líquido cefalorraquídeo. Se trata de una urgencia médica y requiere un diagnóstico y tratamiento precoz. Su morbimortalidad, en meningitis agudas bacterianas, se relaciona directamente con el retraso en el inicio de la terapéutica.  Los casos esporádicos de meningitis agudas bacterianas aparecen en edades extremas de la vida, aún cuando globalmente el 75% de los casos ocurren en menores de 15 años. Muestra  La toma de muestra lo realiza el medico tratante o el patólogo clínico del laboratorio.  Se obtendrá antes de instaurar cualquier terapia antimicrobiana siempre que las condiciones lo permitan.  LCR se obtiene por punción lumbar  Generalmente se obtendrán dos tubos, el primero se enviará para el estudio bioquímico, el segundo para el estudio microbiológico con el mayor volumen posible. El tubo más turbio se enviará a Microbiología.  Se debe solicitar simultáneamente hemocultivos, porque las meningitis suelen ir acompañadas de un proceso bacteriémico.  Volumen mínimo: Para el estudio bacteriológico rutinario es suficiente al menos 1ml. aunque es preferible disponer de volúmenes superiores.  La muestra debe enviarse inmediatamente al laboratorio, pues algunos agentes etiológicos, como S. pneumoniae pueden lisarse rápidamente a partir de la primera hora de su recogida.  Si no fuera posible se mantendrá en estufa a 35 - 37º C y una parte se incubará en frasco de hemocultivo, que se mantendrá en idénticas condiciones.  Si no se dispone de estufa se mantendrá a temperatura ambiente. Nunca se refrigerará pues se afectará la viabilidad de N. meningitis y H. influenzae. Procesamiento del LCR.  Centrifugar a 1.500- 3.000 revoluciones durante 15- 20 minutos.  En caso de líquidos muy purulentos no será necesario centrifugar.  Recoger el sobrenadante con pipeta de Pasteur estéril y conservarlo a 4ºC en frigorífico.  Sembrar el sedimento con pipeta de Pasteur en: Agar sangre: (35-37ºC) atmósfera de CO2 . Agar chocolate (35-37ºC) atmósfera de CO2, Tioglicolato o B.H.I. ( 35-37ºC) (72 horas).  Se harán tres extensiones para tinción: Tinción de Gram, azul de metileno, col. Wright. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden MATERIALES  Guantes quirúrgicos estériles  Hisopos estériles  Laminas porta objetos  Mechero de alcohol  Mechero de gas METODOLOGÍA HISOPADO FARÍNGEO 1. El profesor, con la colaboración de un alumno, enseñara a tomar una muestra de exudado faringeo. El paciente (en este caso un alumno), se sentará cómodamente de frente al profesor; el área debe tener buena iluminación para que permita visualizar adecuadamente el sitio anatómico a examinar. 2. Indicar abrir la boca y mediante el bajalenguas se deprime la misma para favorece que la faringe quede expuesta con una hisopo estéril se frotará firmemente la pared posterior de la faringe y las amígdalas, particularmente en donde existan puntos blancos o áreas que presente signos de inflamación, o sangrado. 3. Cuando el paciente no tenga amígdalas, la muestra se obtendrá del fondo de las fosas amigdalinas. Al retirar el hisopo se deberá tener la precaución de no hacer contacto con ninguna otras áreas de la boca. 4. A partir de las muestras tomada se realizara el aislamiento por el método de estría en placa, se usaran placas de agar sangre, agar chocolate y agar manitol salado. 5. Antes de eliminar el hisopo, elaborar 2 frotis, fijarlos al calor y teñir uno con la técnica de Gram y el otro para observar cápsulas. Frotis de hisopado faríngeo : Coloración simple : Azul de Metileno (Práctica 3) Coloración compuesta: Tinción Gram (Práctica 3) Hisopo Lámina portaobjetos Aislamiento en estría Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden RESULTADOS: Graficar lo realizado en práctica DISCUSION: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… CONCLUSIONES: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden PRACTICA N°3 PREPARACION, FIJACIÓN Y COLORACIONES BACTERIANAS SIMPLES Y COMPUESTAS OBJETIVOS  Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, fijación y coloraciones más utilizadas en el estudio microbiológico ya sea a partir de muestras directas o de cultivos bacterianos.  Identifique las diferentes formas bacterianas y de importancia clínica.  Conocer el fundamento de las respectivas coloraciones asi como la aplicabilidad de las mismas. INTRODUCCIÓN  Debido al pequeño tamaño de los de microorganismos se requiere de un microscopio óptico, ya sea de campo claro (lo mas usado) o de campo oscuro para hacer la descripción morfológica de estos. La observación de los frotis teñidos es lo más recomendable. El frotis se prepara haciendo una extensión de los microorganismos sobre una superficie transparente, en la cual se fijan y tiñen los microorganismos.  Las coloraciones son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del colorante. Estos colorantes pueden ser de distintos tipos: a. Catiónicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células y las tiñen. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina. b. Aniónicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tiñen las células, sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos: Eosina, Nigrosina. c. Liposolubles. Se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen. Ejemplo: Negro sudán. Por otro lado las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos métodos.  Los colorantes aumentan el contraste combinándose químicamente con el protoplasma microbiano y permiten localizar estructuras específicas del microorganismo y diferenciarlos en su forma, tamaño, agrupación y afinidad a ciertos colorantes. Las bacterias pueden presentar las siguientes formas: esféricas (cocos), estos a su vez pueden disponerse en cadenas (estreptococos), en pares (diplococos), o en racimos (estafilococos), sarcinas, en formas alargadas cilindricas (bacilos) y espiralas (espiroquetas y espirilos)  De acuerdo al numero de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como son: • Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tiñe las células (Azul de metileno, Safranina) o no (Nigrosina). • Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción. En este apartado están dos tinciones de importancia taxonómica y médica: la tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan más de un colorante. • Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizarse uno o más colorantes. MATERIALES  Muestra de secreción faringea  Asa bacteriológica.  Equipos de coloración para tinción simple y Gram.  Mechero, portaobjetos y puentes para tinción.  Microscopio. METODOLOGÍA Preparar un frotis a partir de hisopado faríngeo de la práctica anterior Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden COLORACIÓN SIMPLE CON AZUL DE METILENO  Es un tipo coloración simple, la cual solo permite observar ausencia o presencia de microorganismos, y distinguir algunas formas bacterianas (cocos, bacilos, espirilos).  Para este tipo de coloración se usa el colorante azul de metilenos, el cual se agrega sobre la extensión por 1 minuto, transcurrido este tiempo se enjuaga, se deja secar a temperatura ambiente y se observa al microscopio con el lente de mayor aumento. COLORACIÓN COMPUESTA: GRAM  Descrita por Christian Gram en 1884, permitiendo dividir a las bacterias en 2 grupos taxonómicos: Gram (+) y Gram (-). En esta técnica se debe tener en cuenta tres aspectos fundamentales: (a) las bacterias Gram positivas retienen firmemente el colorante inicial; (b) al añadir el mordiente se forma un complejo molecular de gran tamaño; y (c) la penetración esta condicionada por la permeabilidad de la pared celular.  Al finalizar la coloración las bacterias Gram positivas quedan teñidas con el cristal violeta (morado), mientras que las bacterias Gram negativas quedan teñidas con el colorante de contraste Safranina (rojo). Técnica de Coloración Gram  Cubrir las preparaciones con cristal violeta durante un minuto; lavar ligeramente con agua corriente.  Cubrir con lugol durante un minuto; lavar ligeramente con agua corriente.  Decolorar con la mezcla alcohol - acetona (escurrir 5 a 6 gotas); lavar con agua corriente.  Cubrir con safranina durante 30 segundos; lavar con agua corriente y dejar secar.  Colocar sobre la coloración una gota de aceite de inmersión.  Observar al microscopio con el lente de mayor aumento. 1. Cubrir con Azul de metileno 2. Lavar con agua OBSERVAR Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden 1. Cubrir con cristal violeta (1 minuto) 2. Lavar con agua corriente 3. Cubrir con lugol (1 minuto) 4. Lavar con agua corriente 5. Decolorar con alcohol acetona (5 a 6 gotas) 6. Lavar con agua corriente 7. Cubrir con safranina (30 segundos) 8. Lavar con agua corriente SECAR A T° AMBIENTE Y OBSERVAR Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden RESULTADOS Graficar lo observado al microscopio TINCION GRAM TINCION SIMPLE Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden DISCUSION: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… CONCLUSIONES: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden PRACTICA N°4 MEDIOS DE CULTIVO, MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO OBJETIVOS  Comprender la utilidad de los medios de cultivo en el trabajo microbiológico.  Diferenciar los distintos medios de cultivo de acuerdo a su consistencia y función.  Conocer y realizar las diferentes técnicas de siembra y aislamiento bacteriano  Observar el desarrollo de bacterias aisladas a partir de un cultivo mixto. INTRODUCCIÓN  Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Puesto que la diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, la variedad de medios de cultivo es también muy grande. La mayoría de los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso rehidratar. La preparación de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de medio y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los componentes previamente esterilizados en el autoclave. CONDICIONES GENERALES  Presentar todos los elementos necesarios y en sus proporciones y/o cantidades necesarias.  pH adecuado.  Condiciones osmóticas adecuadas.  Estéril y preservado de cualquier contaminación.  Medio fresco (ya que se desecan y pierden humedad, concentrándose el resto de componentes). COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO  Agua (Destilada o desionizada),  Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacárido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo.  Azúcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los más empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa.  Extractos. Son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta, etc.  Peptonas. Son proteínas hidrolizadas, se obtienen por digestión química o enzimática de proteínas animales o vegetales.  Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo son añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patógenos.  Sistemas amortiguadores. Son sales que se añaden al medio para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Ej.: fosfatos bisódicos o bipotásicos.  Indicadores de pH. Son indicadores ácido-base que se añaden para detectar cambios de pH en el medio.  Agentes reductores. Sustancias que se añaden al medio para crear las condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios. Ej.: cisteína y tioglicolato. CLASIFICACIÓN Por su consistencia:  Medios de cultivos líquidos: caldo nutritivo, caldo selenito, caldo peptonado  Medios de cultivos semisólidos: agar SIM, agar MIO  Medios de cultivos sólidos: agar sangre, agar MacConkey, agar manitol salado Por su función o fines especiales:  Medios nutritivos (simples): con nutrientes mínimos para que bacterias poco exigentes desarrollen. Ej: caldo y agar nutritivo  Medios nutritivos enriquecidos: son medios simples a los que se añaden ciertos productos a manera de suplemento nutritivo que permiten el aporte de factores de crecimiento. Ej: agar sangre, agar chocolate, etc. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden  Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que por su composición química favorecen o permiten la multiplicación de unos microorganismos, inhibiendo parcialmente la de otros. Ej: caldo selenito, caldo peptonado alcalino.  Medios selectivos: permiten el crecimiento solo de la especie que se desea aislar, para lo cual se les agrega colorantes bacteriostáticos (azul de metileno, verde de malaquita, verde brillante, etc.). Ej: agar Mac Conckey, agar Salmonella-Shigella (SS), agar manitol salado.  Medios diferenciales: contienen sustancias nutritivas y un indicador de pH que permite detectar las reacciones bioquímicas específicas de los microorganismos: Ej: agar triple azúcar (TSI), agar urea, agar citrato, etc.  Medios de transporte: permite mantener viables a los microorganismos durante el traslado al laboratorio: caldo hafna, Cary Blair, Stuard, etc. MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO:  En Microbiología se entiende como siembra al proceso mediante el cual se lleva una porción de una población de microorganismos, denominada inóculo, de un cultivo crecido a un medio nutritivo para su crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios previamente esterilizados y siguiendo las instrucciones de los monitores de prácticas. La principal advertencia consiste en trabajar siempre próximos a la llama del mechero que, debido a las corrientes de convección verticales que genera, es capaz de crear un ambiente estéril en la zona inmediatamente alrededor y debajo de la llama.  Para realizar un cultivo de microorganismos es necesario que el número de células bacterianas (inoculo) sea transferido (inoculado) a un medio de cultivo estéril. Al querer aislar una especie en particular a partir de una muestra con mezcla de microorganismos deben emplearse técnicas de aislamiento lo que permiten obtenerlas en forma pura. Esto implica la utilización de medios tanto simples como especiales, mayormente sólidos de acuerdo a la naturaleza del microorganismo.  Las técnicas de cultivo se realizan por siembra o diluciones sucesivas. 1. Por Siembra: es el procedimiento por el cual se pone en contacto al microorganismo con un medio de cultivo, para que en condiciones optimas de temperatura y tiempo de incubación pueda desarroll ar y multiplicarse in vitro. La finalidad es el aislamiento para obtener un cultivo puro de bacterias a partir de una muestra problema (orina, heces, secreciones, aguas servidas, etc). La siembra puede ser: - Por inoculación - Por estrías simples - Por dispersión o agotamiento - Por puntura 2. Por diluciones sucesivas: que consiste en hacer diluciones seriadas de la muestra o del inóculo, es decir esta se utiliza cuando se tienen muestras líquidas (orina, agua, etc) y como su nombre lo indica se realiza haciendo diluciones a las muestras (1:100, 1:1000, 1:10000, etc). Posteriormente se siembra cada dilución en placas petri con medios de cultivo.  Una vez obtenidos los cultivos puros, pueden procederse al examen microscópico (tinciones específicas), al examen macroscópico (morfología de las colonias) y posteriormente al estudio de las actividades bioquímicas o características inmunológicas de los microorganismos aislados. Todos los procedimientos mencionados permitirán lograr la identificación precisa de las bacterias. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden MATERIALES  Caldo nutritivo: en matraz y tubos  Agar nutritivo: en matraz, placa y tubos  Agar Mac Conckey, Agar Salmonella Shígella (SS), Agar Manitol Salado, Agar Sangre, Agar Chocolate, TSI, Citrato, Urea, SIm.  Asa de siembra en aro y en punta  Tubos de vidrio 16 x 150 mm  Tubos de caldo nutritivo con cultivo mixto bacteriano (Staphylococcus aureus y Escherichia coli)  Placas con agar nutritivo, agar sangre y agar manitol salado  Tubos con caldo y agar nutritivo  Suero fisiológico estéril  Mechero de Bunsen METODOLOGÍA  Observar y diferencias los distintos medios de cultivo proporcionados en la practica Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden Manejo del asa bacteriológica  El profesor demostrará el manejo adecuado del asa y explicará las precauciones que se deben tener en la toma de la muestra, tales como: esterilizar el asa, dejaría enfriar para evitar al quemar a las bacterias.  Sumergir el asa hasta el fondo del cultivo líquido (ya que este sitio se encuentra una mayor concentración de microorganismos) y observar que el asa al retirarle del tubo esté cubierta por una película líquida. Método de siembra por agotamiento: aislamiento a partir de un cultivo mixto 1. Tomar un lápiz graso y marcar por detrás de la caja que contiene el agar, las líneas, como está indicado en la figura 1, quedarán tres sectores, el sector número 1 es más pequeño que los otros dos y servirá para descargar el asa. 2. Esterilizar el asa y obtener una asada de cultivo del medio líquido (como se indicó previamente). Cerrar el tubo y colocar en una gradilla. 3. Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la caja de Petri y sembrar trazando una serie de líneas en zigzag muy cerradas a todo lo ancho del sector 1. (Esto mismo se puede hacer colocando la caja de Petri sobre la mesa y con la palma de la mano, hacer un movimiento rápido para levantar el fondo que contiene el medio de cultivo, como indicará el profesor). 4. Esterilizar el asa en el mechero. Girar la caja 90 grados hasta que el sector 1 quede a la izquierda y el sector 2 hacia arriba. Sin volver a tomar inoculo, trazar un zigzag un poco más abierto en el sector 2, invadiendo el sector 1 en las primeras líneas de zigzag, pero no en las últimas. 5. Girar nuevamente la placa 90 grados, ahora el sector 2 estará a la izquierda y el sector 3 hacia la derecha. 6. Hacer un nuevo zigzag en el sector 3, invadiendo el sector 2. Este paso puede repetirse, sembrando un cuarto sector. 7. Incubar las cajas a 37° C durante 24 horas. Las cajas ya sembradas deberán colocarse con la tapa hacia abajo y la parte que contiene el agar sembrado, hacia arriba. Método de siembra en Caldo de cultivo:  Coger el asa de siembra en aro, esterilizarla al mechero al rojo vivo y dejarla enfriar por unos segundos.  Abrir una placa con medio de cultivo y cultivo bacterianos y coger una colonia bien aislada, con ayuda del asa de siembra.  Luego destapar un tubo con Caldo de cultivo cogiendo la torunda con el dedo meñique de la mano con que se esta cogiendo el asa de siembra con la colonia. El asa de siembra se toma del mango como si fuera un lápiz El tapón del tubo se toma con el dedo meñique de la mano derecha La boca del tubo se flamea después de abrirlo y antes de cerrarlo Figura Nº 1 Figura Nº 2 1 2 3 1 2 3 Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden  Introducir el asa de siembra en el tubo y agitar suavemente hasta que se desprenda la colonia del asa de siembra.  Tapar el tubo con la torunda, llevar a esterilizar el asa de siembra y homogeneizar bien el Caldo.  Llevar a incubar a 37 ° C por 12 hrs. Transcurrido el tiempo de incubación, observar el desarrollo bacteriano en los medios de cultivo liquido, sólido  Medio líquido la turbidez indica desarrollo  Medio sólido: presencia de colonias Figura Nº1 Figura Nº2 Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden RESULTADOS: ■ Medios Simples : ■ Medios Enriquecidos : Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden ■ Medios Selectivos : ■ Medios Selectivos : Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden RESULTADOS Realizar la lectura, observar y graficar los resultados . ▪ Staphylococcus aureus ▪ Escherichia coli Agar Nutritivo Agar Sangre Agar Manitol Salado Agar Nutritivo Agar Sangre Mac Conkey Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden DISCUSION: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… CONCLUSIONES: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden PRACTICA N° 5 DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS OBJETIVOS  Reconocer las características morfológicas y en los cultivos de las bacterias gram positivas.  Aislar e identificar bioquímicamente las diferentes bacterias gram positivas de importancia clínica. INTRODUCCIÓN  Existen una gran variedad de bacterias Gram positivas de importancia clínica con formas de cocos Ejm: Staphylococcus aureus, especies de Streptococcus, principalmente S.pneumoniae y cocos anaerobios (Peptostreptococcus)  Entre los bacilos Gram positivos patógenos más comunes tenemos: Ejm Bacillus anthracis, Clostridium, Gardnerella, Listeria, Corynebacterium  Todas estas bacterias se encuentran causando procesos infecciosos en los seres humanos y en algunos casos estas se encuentran colonizando alguna parte del cuerpo junto con bacterias de la flora normal. Por eso se hace necesario para su aislamiento e identificación realizar tomas de muestras y procesamiento bacteriológico correctos.  Dentro de los gram positivos los cocos y en especial las especies de estreptococos y los estafilococos son los más fáciles de aislar e identificar mediante observación de hemolísis, pruebas bioquímicas o diferenciales especificas como prueba de catalasa para diferenciar estafilococos de estreptococos, la prueba de coagulasa para diferenciar estafilococos patógenos de los no patógenos, la reacción de Quellung para distinguir Neumococos, etc. MATERIALES  Cultivos de Streptococcus pneumoniae en agar sangre  Cultivo de Staphylococcus aureus en agar manitol salado y agar sangre  Tubos con plasma (1 mL) y pipetas graduadas de 1 mL estériles  Reactivo de peróxido de hidrogeno  Kit de Coloración Gram  Laminas portaobjetos  Asas bacteriológicas, mecheros  Microscopios METODOLOGÍA Pruebas bioquímicas para Staphylococcus y Streptococcus 1. Observar el tipo de hemolísis que se forma en las placas de agar sangre 2. Realiza la prueba de catalasa con una colonia de la placa de agar sangre (AS) y con una del manitol salado (MS). 3. Para la prueba de coagulasa, en dos tubos con un mL de plasma cada uno, depositar en uno 0,5 mL del cultivo de Staphylococcus aureus y en otro un mL de S.epidermidis. Incubar 30 minutos a 37º C. 4. Prepara frotis de las colonias que han desarrollado en AS y en MS. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden Preparación de Frotis : METODOLOGÍA  La identificación inicial de estreptococos, estafilococos, se basa en la morfología colonial de los cultivos primarios y el tipo de hemólisis en agar sangre. Sin embargo, para evitar errores de interpretación, se emplean pruebas bioquímica como: Prueba de catalasa  La catalasa es una enzima que cataliza la descomposición el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. Se encuentra presente en la mayoría de los microorganismos aeróbicos y anaeróbicos facultativos, excluyendo los estreptococos.  La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rápida con desprendimiento de burbujas: la enzima catalasa convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno molecular. Esta prueba se emplea para diferenciar los géneros Micrococcus y Staphylococcus (catalasa positivo) del género Streptococcus (catalasa negativo). 1. Con el asa de siembra tomar una colonia de la placa de Petri 2. Extender la muestra sobre la lámina portaobjetos 3. Fijar el extendido con la llama del mechero Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden Fermentación del manitol  El agar manitol salado es un medio altamente selectivo para el aislamiento de estafilococos patógenos en cultivos mixtos, ya que se aprovecha la capacidad de los estafilococos de desarrollar en presencia de NaCl al 7,5% y la de fermentar manitol; en este caso se observará la formación de un halo amarillo en el agar circundante a las colonias. Coagulación del plasma  Staphylococcus aureus produce una proteína llamada coagulasa, capaz de aglutinar el plasma tratado con oxalato, citrato o heparina en presencia de un factor contenido en el suero.  Este factor sérico reacciona con la coagulasa, activando el fibrinógeno y produciendo un coagulo o trombo de fibrina. La coagulasa se presenta en forma unida (adherida a la célula) y en forma libre. El estudio de la actividad coagulasa se puede llevar a cabo en un tubo de ensayo (para coagulasa libre) y en portaobjetos (coagulasa nido), también llamado factor de agregación la prueba en tubo se hace poniendo 1 mL de plasma al que se le agrega una asada de un cultivo nocturno de S.aureus. Se incuba la mezcla a 37º C durante 4 horas y se considera positivo ante cualquier grado de coagulación. Peróxido de hidrógeno Figura Nº 1 Figura Nº 2 Figura Nº 3 (+) BURBUJEO : Staphylococcus (-) NO BURBUJEO : Streptococcus POSITIVO NEGATIVO Tomado de Diagnóstico Microbiológico de Bailey y Scott 11ª edición Con el asa de siembra se toma una colonia del cultivo del microorganismo y se coloca en la lámina Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden RESULTADOS DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS • Streptococcus Hemólisis Fermentación del manitol Prueba de catalasa POSITIVO NEGATIVO (+) PRUEBA POSITIVA Formación de coágulo Staphylococcus aureus (-) PRUEBA NEGATIVA No hay formación de coágulo Staphylococcus epidermidis Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden • Staphylococcus aureus • Staphylococcus epidermidis Fermentación del manitol Prueba de catalasa Prueba de coagulasa Fermentación del manitol Prueba de catalasa Prueba de coagulasa Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden DISCUSION: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… CONCLUSIONES: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden PRACTICA N° 6 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO: ANTIBIOGRAMA OBJETIVOS  Entender el fundamento del antibiograma, el modo que se realiza y las principales fuentes de error.  Conocer los principales métodos de susceptibilidad a un antimicrobiano.  Evaluar la sensibilidad o resistencia a diversos antibióticos de una bacteria de crecimiento rápido aislada en prácticas anteriores. El método utilizado es el de difusión en agar o de Kirby-Bauer INTRODUCCIÓN  La actividad de los antimicrobianos (antibióticos y quimioterápicos) debe ser evaluada “in vitro” para obtener la información que permita decir si un microorganismo es susceptible o resistente a determinado producto.  Los antimicrobianos actúan produciendo toxicidad selectiva; no actúan directamente sobre el huésped, sino que se combinan químicamente con determinados sistemas de los microorganismos, enfocando así la acción sobre los microorganismos más que sobre el huésped.  La determinación de la mínima concentración inhibitoria (MIC) nos proporciona la dosis mínima necesaria del quimioterápico para impedir el desarrollo bacteriano, lo que permite hacer estudios de uso clínico y detectar mutantes resistentes.  Dos son los procedimientos empleados para conocer ésta información, el método del tubo dilución y el del disco difusión en agar , a éste último se le denomina “antibiograma”. Acción de los Antibióticos  La actividad antimicrobiana in vitro determina: (a) la potencia de un agente antibacteriano en solución; (b) su concentración en los líquidos del cuerpo o en los tejidos; y (c) la sensibilidad de un microorganismo dado a concentraciones conocidas del medicamento.  Inhibición de síntesis de pared celular: por ejm. Penicilina, Cefalosporina, Bacitracina, Vancomicina, Novobiocina.  Alteración de permeabilidad de membrana celular: Anfotericina B, Colistina, Nistatina, Polimixina.  Inhibición de síntesis proteica: Aminoglucósidos (Kanamicina, Amikacina, Estreptomicina), Tetraciclinas, Cloranfenicol, Macrólidos (Eritromicina, Lincomicinas (Lincomicina, Clindamicina)  Inhibición de síntesis de ácidos nucleicos: Acido Nalidixico, Novobiocina, Sulfonamidas, Trimetropin, Rifampicina. Medición de la actividad antimicrobiana  Esta se determina mediante los métodos de dilución o difusión, utilizando un microorganismo standard y una cantidad conocida del antimicrobiano. Para ello se utiliza las pruebas de dilución en tubos y el método de difusión. Prueba de dilución  En éste ensayo se incorporan cantidades conocidas de antimicrobianos en medios líquidos; se inoculan después con las bacterias en prueba y se incuban. El punto final se toma cuando la cantidad de sustancias antimicrobiana es capaz de inhibir el crecimiento o de matar a las bacterias en prueba. MÉTODO DE DIFUSIÓN Preparación del inoculo  La técnica de antibiograma sólo es aplicable a especies bacterianas en cultivo puro. Por ello, previamente se procederá, si es preciso, a hacer un aislamiento en placa.  Cultivar la bacteria aislada en un tubo de medio líquido apropiado (caldo nutritivo, infusión cerebro-corazón) o preparar una suspensión directa a partir del cultivo en placa usando el siguiente método: Tomar de una colonia aislada con el asa y resuspender en el tubo de solución salina frotando en la pared del tubo. Homogeneizar bien y ajustar la densidad óptica con un patrón de turbidez n° 0.5 de McFarland (0,5 ml de cloruro de bario 0,048 M y 99,5 ml de ácido sulfúrico 0,36 M). Esto equivale aproximadamente a una densidad de 108 células/ml. Diluir si es necesario la suspensión o añadir más inóculo.  Impregnar una torunda con la suspensión del inóculo; escurrirla contra la pared del tubo y sembrar con ella toda la superficie de la placa, mediante estrías cruzadas en varias direcciones. Antes de 15 minutos deben colocarse los discos de antibióticos. Con pinzas flameadas y frías (o con un aplicador automático) se disponen los discos sobre las placas, de forma que disten unos 15 mm del borde de la placa y unos 30 mm Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden entre sí. En una placa de 9 cm caben 6 discos. Adherir cada disco al agar presionando ligeramente con las pinzas. A los 15 minutos se llevan a incubar, invertidas, a 37ºC .  Después de la incubación se mide el diámetro de la zona clara de inhibición que rodea el disco antibiótico. La dificultad principal de éste método está en las diferentes velocidades del crecimiento para los diversos microorganismos.  El uso de un disco para cada antibiótico estandarizado, permite el informe de S (sensible), I (intermedio) y R (resistente).  Se ha señalado la existencia de factores que pueden afectar la actividad antimicrobiana in vitro, entre ellos están: - El pH del medio siendo que algunos antibióticos son más activos a pH ácido (ejemplo nitrofurantoina) otros a pH alcalino (ejemplo, aminoglucósidos, sulfanomidas). - Los componentes del medio, en este caso las proteínas séricas fijan a las penicilinas desde 40% para la meticilina y 98% para la dicloxacilina. - Estabilidad de los medicamentos, así a la temperatura de la incubadora varios agentes antimicrobianos pierden su actividad. - Cuanto más grande sea el inoculo bacteriano, mas baja será la sensibilidad del microorganismo. - Cuanto más tiempo se prolonga la incubación, mayor es la oportunidad que tienen de presentarse las mutantes resistente, igualmente los microorganismos que crecen rápido y activamente son más sensibles a la acción de los antibacterianos que aquellos que se encuentra en la fase de reposo. Dilución en tubo  Dan un resultado cuantitativo, destacando dentro de ello dos características o actividades importantes: - CMI o concentración mínima inhibitoria, que es la concentración mínima de antimicrobiano que inhibe el crecimiento de un microorganismo. - CMB o concentración mínima bactericida, que es la concentración que mata a los microorganismos. Normalmente, la CMI es suficiente para combatir una determinada infección ya que los mecanismos inmunitarios se encargan de eliminar al microorganismo, siendo el término que más se usa. MATERIALES  Caldos de cultivo con la suspensión bacteriana a la escala de turbidez de N° 0.5 de McFarland placas de petri con agar Mueller Hinton  Torundas estériles  Discos impregnados con diferentes antibióticos  Pinzas estériles METODOLOGÍA  Sumergir la torunda en caldo tripticasa soya con cepa bacteriana, escurrir en las paredes del tubo y extender uniformemente en la superficie de la placa de agar Mueller Hinton  Colocar con ayuda de pinzas los discos impregnados con diferentes antibióticos sobre la superficie del agar  Los discos deben quedar a una distancia de 20 mm entre ellos  Incubar a 37° C durante 24 horas Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden RESULTADOS  Realizar la lectura, observar y anotar los resultados. LECTURA de DISCOS DE SENSIBILIDAD  El diámetro de la zona de inhibición se mide con una regla milimetrada, colocada debajo de la placa de Petri.  El limite del área de inhibición esta dado por la inhibición completa del desarrollo tal como se puede preciar a simple vista.  Los milímetros de la lectura serán llevados a la tabla para traducir su interpretación en los términos susceptible (S), intermedio (I) y resistente (R). Escherichia coli ANTIBIOTICOS RESULTADOS GRAFICO S I R Staphylococcus aureus ANTIBIOTICOS RESULTADOS GRAFICO S I R Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden DISCUSION: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… CONCLUSIONES: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE Docentes: José Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutiérrez, Carlos Abanto Díaz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra, Max Siaden LECTURA DE HALOS DE INHIBICIÓN DE LOS DISCOS DE SENSIBILIDAD Quimioterápico Concentración del disco mcg Halo de inhibición de desarrollo Sensible Intermedio Resistente Ampicilina AM Amikacina AK Ac. nalidíxico AN Cefalotina CF Cefoxitina CTX Ceftriaxona CRO Cloranfenicol C Kanamicina K Nitrofuranos FD SulfatrimetoprimSXT Ciprofloxacina CIP 10 ug 30 ug 30 ug 30 ug 30 ug 30 ug 30 ug 30 ug 300 ug 231.2 ug 5 ug +17 14-16 - 13 +17 - 15 +19 14-18 - 13 +18 15-17 - 14 +21 16-20 - 15 +21 14-20 - 13 +18 15-18 - 14 +18 14-17 - 13 +17 15-16 - 14 +16 11-15 - 10 +21 16-20 -15 Método de difusión por discos Halos de inhibición Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores PRACTICA N° 7 IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS OBJETIVOS  Conocer los procedimientos de identificación bioquímica de las principales bacterias gram negativas.  Interpretar los resultados de las pruebas bioquímicas y correlacionarlas con las diferentes especies de bacterias gram negativas. INTRODUCCIÓN  Las bacterias gram negativos pueden presentarse como bacilos o cocos siendo los primeros los más abundantes tanto del hombre como de los animales. Varios de estos microorganismos pertenecen a la flora intestinal normal y otros están asociados a infecciones entericas y a otros procesos infecciosos (especialmente cuando estas bacterias invaden otros órganos o sistemas)  Es posible que las infecciones procedan de un reservorio animal, de un portador sano, o de la diseminación endógena de la bacteria en un sujeto susceptible, pudiéndose ver afectados casi cualquier órgano del cuerpo. Familia de Bacilos Entericos:  Esta familia, Enterobacteriaceae, incluye a varios patógenos que causan síndromes diarreicos. Un gran número de ensayos han sido desarrollados de manera de identificar rápidamente al patógeno, para que posteriormente el médico, con base al reporte, indique el tratamiento adecuado, o para que los epidemiólogos puedan localizar la fuente de la infección. Dentro de los bacilos gram negativos las enterobacterias son responsables del 30 al 35% de todas las septicemias, más del 70% de todas las infecciones del tracto urinario y muchas infecciones intestinales.  Dentro de las especies de enterobacterias que son los agentes etiológicos de infecciones entéricas, tenemos: Salmonella, Shigella y Escherichia coli. Estas pueden producir cuadros diarreicos e infección sistémica que son procesos infecciosos que se diseminan generalmente por vía sanguínea o linfática. Medios de aislamiento primario  Son medios selectivos porque permiten el desarrollo de algunas bacterias e inhiben el desarrollo de otros. Esta capacidad puede ser moderada (como en EMB y McConkey), alta (como en SS, desoxicolato y citrato) o completamente específica (sulfato de bismuto y verde brillante).  Algunos de los medios selectivos contienen lactosa y un indicador de pH, lo que permite desde un principio tener colonias aisladas de bacterias fermentadoras como Escherichia coli y no fermentadoras de la lactosa (como Salmonella y Shigella). Medios diferenciales (pruebas bioquímicas)  Son aquellos en los que se ponen de manifiesto las propiedades metabólicas de los microorganismos frente a diferentes substratos. Existen medios que permiten observar una, dos o más características metabólicas de la bacteria inoculada. Entre los más utilizados están: TSI (Agar hierro triple azúcar): Medio sólido que contiene glucosa, sacarosa, lactosa, hierro y un indicador de pH. Con este medio se puede conocer la capacidad de la bacteria para fermentar los carbohidratos. También se detecta la producción de H2S, así como de gas. El tubo se siembra por picadura y en estría, por lo que se debe observar tanto el fondo como la superficie del medio. LIA (Agar hierro lisina): Medio sólido que contiene lisina, sales de fierro, glucosa y un indicador de pH. Con este medio se determina la descarboxilación y desaminación oxidativa de la lisina, la producción de H2S y la fermentación de la glucosa. Se siembra igual que el TSI, por picadura y estría. MIO (Movilidad indol ornitina): Es una medio semisólido. Contiene ornitina, triptófano y glucosa. Las reacciones que se pueden presentar en el son: movilidad de la bacteria, descarboxilación de la ornitina, producción de indol a partir del triptófano y fermentación de la glucosa. Se siembra por picadura con asa recta. CITRATO DE SIMMONS: Medio sólido que contiene citrato de sodio, compuesto que puede ser utilizado como única fuente de carbono, por algunas bacterias. Se siembra por picadura y estría. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores  Existen más pruebas bioquímicas que pueden utilizarse como complemento a las ya descritas, como son: rojo de metilo, Voges Proskawer, hidrólisis de la urea. Utilización del malonato, entre otras; todas ellas ayudan a determinar la especie del microorganismo aislado. Sin embargo, en ocasiones a pesar de recurrir a diversas pruebas metabólicas, no se consigue la identificación, siendo necesario recurrir a reacciones inmunológicas para llegar al diagnóstico definitivo. BACTERIAS PIÓGENAS GRAM NEGATIVAS  Otro grupo menos abundantes en especies pero de gran importancia clínica son las bacterias piógenas gram negativas, estos pueden ser cocos o cocobacilos y las enfermedades que producen por lo general incluyen la acumulación de abundantes cantidades de pus y afectan frecuentemente el aparato genital o respiratorio. Dichas enfermedades comprenden uretritis purulenta (gonococos), meningitis, neumonía, bronquitis, sinusitis, otitis media, conjuntivitis, epiglotitis, etc.  Las bacterias piógenas gram negativas patógenas en humanos son: Neisseria, Haemphilus, Bordetella, Moraxella.  Las bacterias del género Neisseria son diplococos Gram negativos inmóviles, cuyos lados adyacentes son aplanados o ligeramente cóncavos. Solo dos especies de este género son patógenas exclusivamente de humanos: N. gonorroheae o gonococo, agente causal de una enfermedad de transmisión sexual, la gonorrea y la N. meningitidis e meningococo productos comensales para el hombre y que habitan principalmente el tracto respiratorio superior. Esporádicamente se pueden comportar como patógenos oportunistas N. sicca, N.mucosa, etc.  El diagnóstico definitivo de una infección gonocócica se hace por el aislamiento en cultivo de N.gonorroheae. Para el diagnóstico de la gonococia, el lugar de toma de la muestra dependerá de la edad, sexo y de las características de la infección.  La tinción de Gram es el método de elección para el examen directo de las muestras. Son oxidasa positiva. Para los cultivos, el medio debe ser de preparación reciente, bien hidratado y precalentados. Se utilizan medios selectivos como Thayer- Martín modificado. Se debe utilizar un medio no selectivo ya que algunas cepas pueden inhibirse por los antimicrobianos contenidos en los medios selectivos. Debe estar además en una atmósfera que contenga de 3 a 5% de CO2.  El diagnostico de la infección meningocócica, se hace con el aislamiento de N. meningitidis a partir de LCR, sangre, liquido sinovial, pleural o pericardio. Las más utilizadas son las dos primeras  Con la coloración Gram se observan como diplococos gram negativos, crecen en los medios de cultivo enriquecidos y su crecimiento se favorece con una atmósfera de CO2 . Son oxidasa positivo y fermentan los carbohidratos. MATERIALES  Placas con EMB sembradas con cepas problema  Placas con medio de MacConkey, EMB y SS  Tubos con medio TSI, Citrato, LIA, UREA, MIO (sin sembrar y sembrado con cepa problema)  Asas bacteriológicas  Reactivo de Kovacs  Laminas fijadas con frotis de Liquido cefalorraquídeo con coloración gram.  Microscopio  Aceite de inmersión.  Placas de cultivo con agar chocolate. METODOLOGÍA Enterobacterias :  En las prácticas se harán los trabajos de laboratorio que nos permitirán observar las características del cultivo y con ello su identificación:  A partir de uno de los tubos problema, tomar con el asa bacteriológica previamente esterilizada una muestra y sembrar por estrías en los medios EMB y SS. Incubar a 37° C por 24 hrs.  Transcurrido el tiempo de incubación, observar la morfología de las colonias de las placas sembradas (MacConkey, EMB y SS).  Seleccionar una colonia y realizar cultivos en los tubos de TSI, Citrato, LIA, y MIO esto se hace por puntura en los medio y luego en estrías en la parte de inclinación, como los indicara el profesor en cada medio. Llevar a incubar a 37° C por 18 a 24 hrs. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores  Hacer la lectura de pruebas bioquímicas. Interpretar y realizar la identificación del microorganismo proporcionado utilizando las tablas adjuntas. Interpretación bioquímica TSI  Fermentación de glucosa: en la picadura (fondo del tubo) el medio vira a amarillo. Es una reacción débil.  Fermentación de sacarosa: en todo el tubo el medio cambia a amarillo, principalmente en el fondo, donde intensifica el calor debido a la reacción de la glucosa.  Fermentación de lactosa: en la superficie el medio vira a amarillo.  Debido a la fermentación puede haber producción de gas, lo que se manifiesta por la presencia de burbujas en el medio.  Producción de ácido sulfhídrico (H2S): por degradación enzimática de aminoácidos que contienen azufre, originan un precipitado de color negro. La producción de SH2 tiene lugar en ambiente ácido, de ahí que el precipitado negro se concentre en el fondo del tubo, donde se generan ácidos a partir de la glucosa. Así, un fondo negro indica que existe acidez en el fondo del tubo, aunque el color amarillo se haya enmascarado con el precipitado negro. LIA  Descarboxilación de la lisina: el medio se alcaliniza y se observa lila o ligeramente morado en la superficie.  Fermentación de la glucosa: en el fondo del tubo el medio vira a amarillo.  Desaminación de la lisina: vira a color rojizo en la superficie del medio. Es característico en Proteus y Providencia.  Producción de H2S: precipitado de color negro (por el mecanismo citado anteriormente). CITRATO DE SIMMONS  Utilización del citrato como fuente de carbono: el medio vira a color azul. UREA  Los microorganismos que hidrolizan la urea hacen que el medio de cultivo tome color fucsia, debido a la alcalinización del mismo por producción de amonio a partir de la urea, que se pone de manifiesto por un viraje del indicador de pH (rojo de fenol).. MIO  Motilidad: La baja concentración de agar de este medio permite que las bacterias se desplacen si son móviles. Por ello, observando si el crecimiento está sólo en la picadura o se extiende a los lados de ella, se puede determinar si el microorganismo es inmóvil o móvil.  Indol: La aparición, transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en la interfase entre el reactivo y el cultivo indica la presencia de indol y, por tanto, la prueba se considera positiva. El indol es capaz de reaccionar con el grupo aldehído del reactivo originando un complejo de color rojo.  Producción de H2S: precipitado de color negro (por el mecanismo citado anteriormente). MENINGOCOCOS :  Observar las placas con medios para meningococos  Observar la morfología de las bacterias en las laminas fijadas RESULTADOS  Realizar la lectura e identificación de los microorganismos, observar y anotar los resultados. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores DIFERENCIALES SIN SEMBRAR TSI LIA Citrato de Simons SIM UREA Klebsiella sp. Diferenciales TSI LIA Citrato de Simons SIM UREA Reacciones se observan Lectura Proteus sp. Diferenciales TSI LIA Citrato de Simons SIM UREA Reacciones se observan Lectura Diferenciales TSI LIA Citrato de SIM UREA Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores Simons Reacciones se observan Lectura Salmonella sp. Diferenciales TSI LIA Citrato de Simons SIM UREA Reacciones se observan Lectura Shigella sp Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores Escherichia coli Diferenciales TSI LIA Citrato de Simons SIM UREA Reacciones se observan Lectura DISCUSION: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… CONCLUSIONES: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores ANEXO: Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores PSEUDOMONA Las especies pertenecientes al género Pseudomonas son ubicuos, se encuentran en la tierra, materia orgánica en descomposición, en la vegetación, en el agua. También podemos encontrar estos microorganismos en el ambiente hospitalario, en lugares húmedos, como comida, baños, respiradores. No forman parte de la flora normal del ser humano con excepción de los pacientes hospitalizados y en pacientes ambulatorios inmunodeprimidos. Debido a las sencillas necesidades de crecimiento y a la versatilidad nutricional , se logra su amplia distribución ambiental, siendo capaces de utilizar un gran número de compuestos orgánicos como fuentes de carbono y nitrógeno. Son bacilos Gram negativos móviles rectos o ligeramente curvos, que son aerobios estrictos, la mayoría de las cepas son móviles por medio de uno o más flagelos polares; utilizan glucosa y otros hidratos de carbono de manera oxidativa; y suelen ser citocromo oxidasa positivos El género Pseudomonasse divide en cuatro grupos : Grupo fluorescente, Grupo Stutzeri, Grupo Alcalígenes y Grupo con pigmento amarillo. Grupo fluorescente : Pertenecen a este grupo las especies : Pseudomonaaeruginosa, Pseudomonafluorescens y Pseudomonaputida , las cuales se caracterizan por la producción de un pigmento pioverdina hidrosoluble que da fluorescencia blanca a verde azulada bajo luz ultravioleta de longitud de onda larga (400 nm). Sólo una especie, Pseudomonaaeruginosa , produce el pigmento hidrosoluble azul llamado piocianina. Pseudomonaaeruginosa produce un aspecto característico cuando crece en una placa de agar sangre , se pueden observar grandes colonias grises y presenta beta hemólisis. Las colonias tienen un aspecto de piel de caimán y con brillo metálico. La exudación de pus azulado, con olor similar a las uvas , por la producción de piocianina es característico en las heridas infectadas por este microorganismo. La piocianina es un antibiótico que puede permitir que la Pseudomonaaeruginosa exista en la naturaleza, también puede desempeñar un papel en la nutrición , al funcionar como una forma de adquirir fosfatos inorgánicos. Se puede realizar una identificación rápida de Pseudomonaaeruginosa si se observan las siguientes características : morfología típica de las colonias, producción de pigmentos difusibles, olor a fruta y positividad en la prueba de oxidasa. CARACTERÍSTICAS DEL GRUPO FLUORESCENTE: PRUEBA Pseudomonaaeruginosa Pseudomonafluorescens Pseudomonaputida PIOVERDINA + + + PIOCIANINA + - - Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores PRACTICA N° 8 IDENTIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE MICOBACTERIUM Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS ANAEROBIAS: 1.- AISLAMIENTO DE BACTERIAS ANAEROBIAS: OBJETIVOS  Conocer las condiciones y exigencias para el cultivo de bacterias anaerobias. INTRODUCCIÓN  Los organismos que carecen de sistemas respiratorios no pueden utilizar el oxígeno como aceptor terminal de electrones. Tales organismos se llaman anaerobios, pero existen dos clases de anaerobios: los anaerobios aerotolerantes, que pueden tolerar el oxígeno y crecer en su presencia, aún cuando no pueden utilizarlo, y los anaerobios estrictos (u obligados) que mueren en presencia del oxígeno.  La razón por la que los anaerobios estrictos son destruidos por el oxígeno, es probablemente por que son incapaces de eliminar algún producto tóxico derivado del metabolismo del oxígeno. Cuando se reduce el oxígeno, se producen algunos elementos tóxicos tales como el peróxido de hidrógeno (H2O2), superóxido (O2-) y radicales hidroxilo (OH-). Muchos anaerobios estrictos son ricos en enzimas flavínicas, que reaccionan espontáneamente con el oxígeno para dar estos productos tóxicos. Por el contrario, los aerobios poseen enzimas que descomponen los productos tóxicos; tales enzimas no están presentes en los anaerobios.  Como ocurre con los aerobios, algunos de ellos pudieron tolerar la presencia de O2 y de substancias oxidantes, pero en la mayoría de los casos, el O2 se comporta como un gas tóxico que provocaba la oxidación de ciertos radicales libres altamente agresivos imposibles de neutralizar. Fusobacterium, Prevotella y Porphyromonas no sobreviven más de 10 a 30 minutos de exposición al aire. Actinomyces, Propionibacterium, Bacteroides y algunos Clostridium, son relativamente aerotolerantes. RECOLECCION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS CLÍNICAS :  Las muestras clínicas deben ser obtenidas del sitio infectado usando procedimientos que garanticen el mantenimiento de una atmósfera carente de oxígeno y eviten contaminación con flora endógena. En general el procedimiento recomendado es aspiración con aguja del material purulento o por biopsia después de desinfección apropiada.  Estas muestras deben ser procesadas en el laboratorio lo más rápido posible, manteniendo en todo momento su estado libre de oxígeno. La obtención de muestras son aceptables solo en casos de incluir un medio de transporte apropiado para anaerobios y sean sembradas antes de 30 minutos de obtenida la muestra. Las muestras para cultivos anaeróbicos nunca deben ser refrigeradas.  La aspiración directa con aguja es el mejor método de obtener una muestra representativa para cultivo. Los especimenes obtenidos de los líquidos normalmente estériles tales como sangre, líquido cefalorraquídeo o peritoneal, se recogen después de la descontaminación cuidadosa de la piel.  Los dispositivos del transporte contienen generalmente ambiente libre de oxígeno proporcionados por una mezcla del bióxido de carbono, hidrógeno, nitrógeno, más un indicador aerobio de la condición. Los especimenes se deben poner en un transportador anaerobio cuanto antes. Los especimenes se inoculan en un frasco anaerobio del transporte o una jeringuilla con aguja. Después de que se expelan todas las burbujas de aire, el extremo de la aguja se debe insertar en un tapón de caucho estéril, ya que el aire puede difundirse gradualmente a través de la pared plástica de la jeringuilla.  A pesar de que las bacterias aerobias y anaerobias son indistinguibles por la tinción, el frotis directo proporciona información preliminar importante con respecto a tipos de organismos presentes, sugiere terapia inicial apropiada y sirve como control de calidad. Estos anaerobios pueden mostrar un patrón morfológico típico que puede ser reconocido por un microscopista experimentado. Se recomienda especialmente el frotis directo por Gram de la muestra para ayudar a evaluar el cultivo posterior. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores Examen directo de los materiales clínicos: El análisis macroscópico de las muestras es importante para establecer la presencia de anaerobios, datos orientadores serán el hallazgo de un olor fétido, el aspecto purulento de muestras líquidas así como el hallazgo de tejido necrótico y gas. En los portaobjetos preparados para la tinción de Gram, es más útil la fijación con metanol que el calor; se deben observar características celulares y el fondo del frotis y en la tinción de Gram , observar la forma, tamaño, disposición de las bacterias y registrar el número de microorganismos presentes . Observar características morfológicas distintivas como : presencia de esporas, ramificaciones, filamentos con corpúsculos esféricos, formas granulares. La tinción de Gram permite determinar características celulares, las tinciones de Wright y Giemsa a veces pueden revelar información adicional. Las tinciones de naranja de acridina son las más útiles para detectar bacterias en hemocultivos, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido articular y exudados. Procesamiento de las muestras Las muestras para cultivos anaerobios pueden procesarse en la mesa de trabajo común con incubación en jarras o bolsas para anaerobiosis o en una cámara anaerobia. ■ Jarras para anaerobiosis : el sistema que más se utiliza para crear una atmósfera anaerobia es la jarra para anaerobiosis; para lo cual se utiliza una jarra plástica transparente ( disponible en el comercio) con una tapa que se cierra para hacerla hermética. Las condiciones de anaerobiosis pueden obtenerse mediante el uso de un sobre que se adquiere en el comercio, generador de hidrógeno y CO2, que se activa con el agregado de agua o con la humedad proveniente de las placas de agar. La anaerobiosis se alcanza luego de 1 a 2 horas. ■ Bolsas plásticas anaerobias : Es una bolsa de plástico transparente , de varios tamaños, con capacidad para una a tres placas de Petri de 100 mm de diámetro, un generador de gas H2-CO2 que produce una atmósfera cuando se le agrega agua, partículas de catalizador de paladio frío y resazurina como indicador. La bolsa se sella con calor luego de la activación del generador para permitir el mantenimiento de las condiciones anaerobias. Incubación de los cultivos En la mayoría de los casos, la temperatura adecuada es de 35 a 37°C, para el aislamiento primario de bacterias anaerobias a partir de muestras clínicas. Las placas inoculadas en las mesas de trabajo y colocadas en las jarras de anaerobiosis deben incubarse al menos 48 horas y reincubarse por otros 2 a 4 días para permitir que los microorganismos de crecimiento lento formen colonias; algunos anaerobios como ciertas especies de Actinomyces y Eubacterium, crecen más lentamente y las colonias no pueden detectarse si las jarras se abren antes. Si las jarras se abren pronto, algunos de los microorganismos de crecimiento lento pueden morir debido a la exposición de oxígeno. Debe evitarse la exposición prolongada de las placas recién inoculadas al aire ambiental, ciertos anaerobios encontrados en muestras clínicas como Peptostreptococcus anaerobius , pueden no crecer o mostrar un retraso prolongado en el desarrollo cuando las placas recién inoculadas se mantienen en el aire ambiental. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores MATERIALES  Laminas con frotis de bacterias anaerobias  Caldo tioglicolato con bacterias anaeróbias METODOLOGIA  Observacion macro y microscopica de las muestras anaerpbicas Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores RESULTADOS DISCUSION: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… CONCLUSIONES: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores 2. IDENTIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE MICOBACTERIUM OBJETIVOS  Conocer los riesgos y precauciones durante el procesamiento de muestra con micobacterias.  Conocer el procesamiento de las muestras para el estudio de micobacterias INTRODUCCIÓN  La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa producida por Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis, que están estrechamente relacionados por sus características bacteriológicas y similitud en su ADN, siendo la especie más frecuentemente aislada M.tuberculosis. Las fuentes de infección son a partir de los esputos secos del suelo y la leche contaminada y el mecanismo de transmisión se da a través de las vías respiratorias.  Las muestras necesarias para el aislamiento de M.tuberculosis son muy variadas, dependiendo de la localización de la lesión: esputos, aspirados bronquiales, orinas, LCR, biopsias, contenido gástrico, heces etc. Si no se puede procesar el mismo día será necesario guardarlas a 4º C de temperatura (refrigeradora) para impedir la proliferación de la flora secundaria. Para manipular las muestras y sobretodo los pasajes a otros medios de cultivos, es importante hacerlos en la cabina de seguridad.  Las micobacterias son microorganismos de forma bacilar que se caracterizan por contener un elevado porcentaje de lípidos, por lo que para su coloración se emplea la tinción de Ziehl -Neelsen (coloración ácido resistente). En los medios de cultivos desarrollan con lentitud y exigen que los medios sean altamente nutritivos.  El que no se pueda observar bacilos en una extensión no quiere decir necesariamente que no los haya, pues se considera que debe haber unos 10 000 bacilos por mL de muestra para que la microscopía no resulte positiva con una probabilidad del 50 por 100 bacilos por mL, aproximadamente. Es frecuente obtener cultivos positivos a partir de muestras cuya baciloscopía fue negativa.  En los medios de cultivo desarrollan con lentitud y exigen que los medios sean altamente nutritivos. Dentro de los medios de cultivo más conocidos tenemos el de Lowenstein-Jensen. La temperatura óptima de crecimiento es de 37° C. Se revisaran diariamente hasta un total de 60 días, pasados los cuales si no hay crecimiento se consideran negativos. LECTURA  Los bacilos aparecerán como bastoncillos delgados, ligeramente curvos, teñidos de rojo, aislados, en parejas o en grupos sobre un fondo azul claro.  Es aconsejable seguir una pauta uniforme de observación, leyendo de izquierda a derecha del extendido un mínimo de 100 campos útiles, equivalentes a 5 minutos. Los campos en que no aparezcan dichos elementos no deben contabilizarse en la lectura. Se recomienda la siguiente escala semicuantitativa: RESULTADO INTERPRETACIÓN (-) No se encuentran BAAR en 100 campos microscópicos observado (+) Menos de un BAAR por campo en 100 campos observados (de 10-99 BAAR) (++) Uno a 10 BAAR por campo, en 50 campos observados (+++) Mas de 10 BAAR por campo en 20 campos observados BAAR: Bacilo ácido alcohol resistente  Si en un frotis se encuentran de 1 a 9 bacilos en 100 campos observados, observar 100 campos más. Si persistiese el resultado, realizar otro extendido de la misma muestra e informar lo encontrado y solicitar nueva muestra. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN Fundamento  Las bacterias ácido - alcohol resistentes son aquellas que una vez teñidas no son decoloradas por el alcohol - ácido. Esta propiedad está relacionada con la existencia en la pared celular, de sustancias lipoides como la cera D, que ante la acción disolvente del fenol contenido en la fucsina ácida en presencia de calor, permite la penetración del colorante primario.  El enfriamiento de los compuestos mencionados impide que el colorante sea eliminado por la acción del decolorante. Material  Muestras de esputo inactivadas (autoclavadas) de pacientes Bk positivos.  Frotis fijos de Mycobacterium tuberculosis a partir de esputos  Tubos con medios de cultivo Lowenstein-Jensen mostrando colonias de micobacterias  Equipos de coloración para tinción de Ziehl-Neelsen  Mecheros  Portaobjetos 26 x 76 mm  Microscopios METODOLOGÍA 1. Realizar un extendido del esputo en una lamina portaobjeto limpia y sin ralladuras. 2. Dejar secar a temperatura ambiente antes de la tinción. 3. Cubrir con solución de fucsina de Ziehl y calentar hasta la emisión de vapores durante 3 minutos, cuidando que el colorante no hierva ni se seque. 4. Dejar enfriar, decolorar con la mezcla de alcohol- ácido, hasta que no escurra colorante; lavar con agua corriente. 5. Cubrir con azul de metileno durante 3 minutos; lavar con agua corriente y dejar secar. 6. Agregar una gota de aceite de inmersión y observar al microscopio con el lente de mayor aumento Las bacterias ácido - alcohol resistentes se tiñen de color rojo. Todos los elementos no ácido - alcohol resistentes se observan de color azul. 1. Cubrir con fucsina básica fenicada 2. Calentar suavemente con ayuda del hisopo (5 minutos) Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores 6. Cubrir con Azul de metileno (1 minuto) 5. Enjuagar con abundante agua 4. Cubrir con solución decolorante (3 minutos) 3. Enjuagar con abundante agua 7. Enjuagar con abundante agua Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores RESULTADOS Realizar la observación microscópica de las láminas y graficar los resultados. DISCUSION: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… CONCLUSIONES: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores PRACTICA N° 9 CULTIVO DE MUESTRAS CLÍNICAS OBJETIVOS  Conocer el procedimiento para el cultivo de una muestra clínica.  Identificar los microorganismos mas frecuentes causantes de patologías clínicas  Conocer las condiciones para una adecuada toma de muestra de para el cultivo de muestras clínicas CULTIVO DE ORINA (UROCULTIVO)  La infección del tracto urinario (ITU), se define como la presencia y multiplicación de microorganismos en el tracto urinario con invasión de tejidos adyacentes. La presencia de leucocitos en orina, indica respuesta inflamatoria del Tracto urinario, la mayoría de las veces debido a invasión tisular por bacterias. Por lo general la piuria esta presente en las ITU, lo que se considera un criterio diagnóstico de ITU.  La mayoría de la ITU, son causadas por bacilos Gram negativos de las enterobacterias, siendo Escherichia coli y Klebsiella sp., los más frecuentemente aislados, en infecciones no complicadas. También puede ser causa de ITU otros bacilos Gram negativos como Proteus sp., Enterobacter sp. y Pseudomonas aeruginosa sobre todo en pacientes sometidos a instrumentación, portadores de catéteres urinarios, con anomalías anatómicas o funcionales del tracto urinario y en pacientes hospitalizados.  Entre las bacterias Gram positivos pueden estar Staphylococcus epidermidis y Enterococcus sp. En la mayoría de las ITU, se recupera un único microorganismo en la orina. La presencia de más de una especie bacteriana puede deberse a contaminación de la muestra o en pacientes con infecciones complicadas como por ejemplo litiasis, abscesos renales o sondaje prolongado.  El diagnóstico definitivo de las ITU se hace mediante el cultivo de la orina (urocultivo). Hay que tener en cuenta que por cuidadosa que sea la técnica de toma de la muestra (salvo punción suprapúbica), es difícil excluir la contaminación de la orina con bacterias del tramo distal de la uretra lo que puede ser causa de interpretaciones erradas.  La orina de micción media es la más recomendada para el urocultivo. En mujeres es necesario el lavado de los genitales externos. En el hombre también retraer la piel del prepucio. La primera parte de la micción, casi siempre está contaminada con flora bacteriana uretral, esa es la razón por la que debe descartarse. La micción media se debe recoger en un envase estéril. Es recomendable obtener la primera orina de la mañana, donde se encuentra mayor número de bacterias.  El cultivo de orina se realizará para identificar y cuantificar el número de bacterias presentes por mL de orina, lo que se expresa en unidades formadoras de colonias por mL (UFC). La muestra de orina debe enviarse al laboratorio en el plazo más corto posible, puesto que la orina es un buen medio de cultivo para muchas bacterias y la multiplicación de los gérmenes entre el momento de la toma de muestra y el cultivo alterará los resultados.  Es recomendable que en todas las muestras de orina para urocultivo, se haga un examen microscópico cuantitativo para determinar el número de leucocitos por milímetro cúbico. MATERIALES  Frasco estéril x 100 mL  Asas de platino (calibrada 0,01 mL)  Pipetas graduadas x 1 mL estériles  Placas con Agar McConkey, EMB.  Laminas, laminillas.  Equipos de coloración para tinción de Gram  Centrifuga y microscopio METODOLOGÍA  Evitar que se contamine la muestra utilizando equipos estériles (frascos, pipetas, placas Petri, tubos de prueba estériles). 1. Examen Directo: Centrifugar aproximadamente 10 mL de orina por 3 min a 3000 r.p.m y luego decantar el sobrenadante y sedimento observar al microscopio a lente de 40x. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores 2. Cultivo  Con el asa de platino calibrada (0,01 mL), previa agitación de la muestra, tomar una asada de orina y sembrar por estría en agar McConkey, previamente dividida en cuatro cuadrantes, empezando las estrías por el primero y sin esterilizar el asa continuar la siembra en el II, III y IV cuadrantes.  Rotular la placa con nombre y grupo e incubar 24 horas a 37 °C RESULTADOS  Hacer la lectura de las placas y a partir de una colonia bien aislada realizar las pruebas bioquímicas para la diferenciación bioquímica.  Realizar el contaje de colonias para realizar el recuento total de UFC/ml. UROCULTIVO Orina: Sedimento urinario: AGAR SANGRE Mac Conckey: Cultivo a las 24 hrs Rec.Colonias: Pruebas Bioquímicas Lectura de las pruebas bioquímicas TSI CIT LIA SIM UREA Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores ANTIBIOGRAMA CULTIVO DE HECES (COPROCULTIVO)  La diarrea puede definirse como el proceso que va acompañado de eliminación frecuente de heces, disminución de su consistencia o ambas cosas. El diagnóstico etiológico de este padecimiento, se realiza mediante el cultivo de los microorganismos presentes en la materia fecal. A este procedimiento se le denomina coprocultivo y con él se logran, primero el aislamiento y posteriormente la identificación de las bacterias presentes en heces.  Las bacterias causantes de diarreas frecuentemente son: Salmonella, Shigella y Escherichia coli enteropatógenas. En la actualidad se han descrito otras bacterias también asociadas con cuadros diarreicos, como: Campylobacter sp., Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus y Clostridium difficile.  Para realizar con éxito este método se requiere que la muestra se colecte en el curso de la enfermedad., antes de instituir el tratamiento, y que se deposite en una frasco limpio y estéril, procurando no mezclarla con la orina. Las muestras de heces se procesarán para cultivo dentro de las 4-6 horas siguientes a su emisión. Si esto no es posible, es conveniente su conservación en un medio de transporte adecuado manteniéndose en refrigerador hasta su siembra MUESTRAS INACEPTABLES.  Muestras no conservadas de más de 4-6 horas.  Muestras múltiples en el mismo día.  Muestra contaminadas con orina. METODOLOGIA 1. Examen directo. El examen microscópico directo de las heces permite la observación de polimorfonucleares, que sugiere infección por un patógeno invasivo. 1.1. Examen en fresco y/o tinción con Azul de metileno de Loeffler. 1.2. Tinción de Gram: permite observar polimorfonucleares y flora predominante. 2. Inoculación. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores El coprocultivo se realiza a partir de las heces recién emitidas de preferencia. Sembrar en los medios para diferenciar los bacilos entéricos fermentadores de la lactosa (L+) de los no fermentadores (L-), al tiempo que se inhibe el crecimiento de flora Gram positiva aerobia. -- Agar MacConkey, Eosina Azul de Metileno. Usar Agar XLD (Xilosa-Lisina-Desoxicolato), SS. (Salmonella –Shigella) para inhibir el crecimiento de la mayoría de las Enterobacteriaceae mientras se permite el crecimiento de Salmonella spp y Shigella spp. Utilizar el medio Selenito F (medio líquido) para suprimir el crecimiento de la flora normal durante las horas iniciales de incubación. Se resiembran en medio sólido a partir de las 6 horas. Este medio sirve asintomáticos. En el caso que se sospeche de Vibrio spp: Agua de Peptona alcalina (medio enriquecido) a partir de 6 horas, subcultivar en TCBS (Tiosulfalfato Citrato Bilis Sacarosa) o de Campylobacter spp Medio Camp. RESULTADOS  Realizar la lectura de los medios de cultivo y las colonias sospechosas realizar las pruebas bioquímicas para diferenciar las especies de enterobacterias COPROCULTIVO Agar Salmonella Shigella (SS) Sin Sembrar Cultivo a las 24 hrs Pruebas Bioquímicas TSI CIT LIA SIM Lectura de las pruebas bioquímicas CULTIVO DE SANGRE (HEMOCULTIVO y MIELOCULTIVO)  La detección de microorganismos viables en muestras de sangre tiene una gran importancia diagnóstica. Cuando bacterias u hongos se multiplican a una razón que supera la capacidad del sistema reticuloendotelial de remover éstas del torrente sanguíneo, se produce bacteremia o fungemia. Bacteremia persistente o crónica ocurre cuando no se ha podido localizar el foco, o cuando no se ha podido drenar o tratar adecuadamente el foco de la infección.  La entrada directa de bacterias al torrente sanguíneo ocurre en infecciones intravasculares como: endocarditis, fístulas arteriovenosas, aneurismas micóticas, flebitis supurativas, catéteres intravenosos infectados, y catéteres arteriales permanentes. Es importante comprender las circunstancias en que puede ocurrir una bacteremia para planificar los métodos de diagnostico y la interpretación de los resultados. Las fuentes de bacteremia son: sistema genitourinario 25%; tracto respiratorio 20%; abscesos 10%; heridas quirúrgicas 5%; otros sitios conocidos 10%; y sitios desconocidos 25%  Siempre que exista una razón para sospechar una bacteriemia se debe practicar el cultivo de la sangre (periférica o medular). Ya que en muchas ocasiones solo se puede establecer el diagnóstico por este Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores procedimiento. El aislamiento de un microorganismo en los hemocultivos es transcendente porque establece el diagnóstico etiológico de la bacteriemia y permite elegir el tratamiento más eficaz.  Sepsis agudas, osteomielitis, meningitis, neumonía, pielonefritis: el hemocultivo en estos casos debe considerarse un procedimiento de urgencia. Bacteriemias continuas de origen intravascular como endocarditis, infecciones asociadas a catéteres, de origen desconocido, con sospecha de fungemia e inmunodeprimidos: se puede tomar en cualquier momento.  Bacteriemias intermitentes: lo ideal es realizarla cuando el paciente tiene escalofríos o poco después, o durante el pico febril. Entre el 14 al 25 % de los enfermos hospitalizados tienen sospecha de bacteriemia y en un 14% de los casos el hemocultivo establece el diagnóstico lo que repercute en la curación de los pacientes considerablemente. INDICACIONES: · Fiebre alta, aunque en neonatos y ancianos la bacteriemia puede cursar con hipotermia y deterioro general, shock no explicado, infecciones localizadas, leucopenia, leucocitosis o trombopenias no relacionadas con procesos hematológicos.  Siempre se deben realizar un mínimo de 2 hemocultivos NUNCA DEBE REFRIGERARSE ANTES DE SU ENVÍO, PODRÁ CONSERVARSE EN ESTUFA CULTIVO DE SECRECIONES EXUDADOS VAGINALES (EXOCERVICALES)  La mucosa vaginal tiene una flora microbiana normal, cuyo conocimiento y consideración debe tenerse en cuenta a la hora del estudio microbiológico de infecciones vaginales. Se pueden considerar tres situaciones: - Saber cuando se altera el equilibrio de esta flora colonizante. - Búsqueda de agentes exógenos, transmitidos normalmente por vía sexual. - Detección de portadoras de determinados microorganismos.  La mayoría de las situaciones clínicas que pueden ser objeto de estudios microbiológicos para el aislamiento ó visualización del agente etiológico son: 1. Vulvovaginitis: cuyos agentes etiológicos más frecuentes son Candida spp (principalmente C.albicans), Trichomonas vaginalis y Virus herpes simple. Asimismo la presencia de un cultivo puro de otros microorganismos observados en una tinción de Gram con leucocitos puede tener significación. 2. Vaginosis: estado caracterizado, desde el punto de vista microbiológico, por la ausencia o franca disminución de Lactobacillus spp y abundante flora mixta compuesta por Gardnerella vaginalis, anaerobios (Mobiluncus, Bacteroides, Cocos anaerobios...) y Mycoplasma hominis. 3. Infección gonocócica: La endocervicitis gonocócica aunque cursa con leucorrea, el exudado vaginal no es la muestra adecuada para su diagnóstico siendo recomendable la obtención de un exudado endocervical. TIPOS DE ESTUDIOS MICROBIOLÓGICOS  Cultivo bacteriano.  Cultivo de levaduras.  Despistaje de Streptococcus agalactiae.  Cultivo de virus Herpes simple (puesto que requiere toma de muestra y medio de transporte y cultivos especiales solo se hará por petición expresa del clínico y su protocolo de cultivo e identificación se recogerá en otro capítulo). TOMA DE MUESTRAS  No debe usarse antiséptico previo a la toma de la muestra. Si se utiliza espéculo, lubricar con agua caliente. Es recomendable tomar dos hisopados. Se introduce un hisopo estéril en la vagina y se recoge la muestra de la zona de mayor exudado, y en su defecto, del fondo del saco vaginal posterior. Se introduce el hisopo en medio de transporte.  El envío de la muestra al laboratorio debe ser inmediato siempre que sea posible. Cuando no pueda procesarse en el momento se mantendrá en frigorífico o a temperatura ambiente. Nunca refrigerar si existe sospecha de infección gonocócica. Tiempo máximo de procesamiento con medio de transporte: 24h. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA  Uno de los hisopos se empleará para el examen microscópico y el otro para el cultivo. 1. Examen microscópico: es el único método aceptado para el diagnóstico microbiológico de la vaginosis bacteriana. Se hará una extensión del hisopo en portaobjetos y tinción de Gram. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores 2. Cultivo: Pueden establecerse distintas combinaciones de medios en función de la orientación diagnóstica: - Agar sangre en atmósfera de CO2., agar Chocolate en atmósfera de CO2., Mc Conkey, Thayer Martin en atmósfera de CO2.. medio para Gardnerella en atmósfera de CO2., Sabouraud con antibiótico u otro medio para Candida, caldo para cultivo de Trichomona vaginalis. EXAMEN DE LA MUESTRA 1. Examen microscópico: En el exudado vaginal normal se observará flora regional con predominio de morfotipo Lactobacillus sp y células epiteliales. - La presencia de leucocitos. - La presencia de levaduras o pseudohifas. - La presencia única o abundante de cualquier otro microorganismo. - El exudado característico de la VAGINOSIS BACTERIANA: a) Presencia de Células “clue” (células epiteliales recubiertas de bacilos o cocobacilos Gram variables.) b) Ausencia o escasos Leucocitos. c) Flora mixta alterada (Ver Criterios de Nugent en tabla 1). Tabla 1: Interpretación de VAGINOSIS BACTERIANA mediante tinción de Gram Lactobacillus Puntuación CBGV (1) Puntuación BGNC (2) Puntuación INTERPRETACIÓN 4 (+) 0 4 (+) 4 3-4 (+) 2 Cuantificación: 4 (+) = > 30 org/campo (3) 3 (+) = 6-30 org/campo 2 (+) = 1-5 org/campo 1 (+) = < 1 org/campo 0 = ningún org/campo 3 (+) 1 3 (+) 3 1-2 (+) 1 2 (+) 2 2 (+) 2 0 0 Interpretación Puntuación De 0 a 3: No vaginosis bacteriana De 4 a 6: flora vaginal alterada De 7 a 10: VAGINOSIS BACTERIANA 1 (+) 3 1 (+) 1 0 4 0 0 (1): Cocobacilos Gram-variables (morfotipo Gardnerella/Bacteroides). (2): Bacilos Gram negativos curvados (morfotipo Mobiluncus). (3): Campo de máximo aumento (inmersión). 2. Examen en medios de cultivo: Examinar todos los medios a las 18-24 horas. . Agar sangre (S.pyogenes), Agar Chocolate (Neisseria y Haemphillus), Thayer Martin (Neisseria) Medio Gardnerella (Gardnerella vaginalis), Sabouraud (levaduras) SECRECION URETRAL  La uretritis es el síndrome más común dentro de las Enfermedades de Transmisión Sexual (ETS) aunque muestra un claro descenso en las últimas décadas en relación con otras ETS., tanto en España (ver tabla 1) como en otros países desarrollados. Atendiendo a su etiología se clasifican en uretritis gonocócica y no gonocócicas (UNG), siendo estas últimas las más frecuentes en países desarrollados.  N. gonorrhoeae es responsable en nuestro medio de menos del 25% de todos los episodios de uretritis. Los restantes están causados por C. trachomatis, por Ureaplasma urealyticum y por un número variable de otros potenciales patógenos en los que la asociación causa-efecto con la uretritis está menos aclarada . La asociación de más de un patógeno como causa de la uretritis es más que anecdótica y la más frecuente de ellas es la asociación de C. trachomatis y N. gonorrhoeae. Un dato significativo es la presencia de T. vaginalis como único agente encontrado hasta en un 4% de las uretritis no gonocócicas. Cuadros de uretritis pueden estar causados por la presencia de condilomas intrauretrales.  La gonorrea usualmente se desarrolla a los 2 ó 6 días tras la exposición, en tanto que la UNG es variable, desde 1 a 5 semanas. Tanto las uretritis gonocócicas como no gonocócicas producen supuración uretral, disuria y picor  El diagnóstico de uretritis se establece si al menos se dan dos de los siguientes supuestos: 1. Síntomas: historia de secreción uretral y/o disuria. 2. Examen clínico: presencia de secreción uretral purulenta, mucopurulenta o blanquecina 3. Demostración (tinción de Gram) de > de 5 leucocitos polimorfonucleares por campo de 1000 aumentos en el examen directo de la secreción uretral. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores  Los pacientes con síntomas de uretritis, sin secreción uretral visible, deben ser examinados, pidiéndoles que no orinen en las 4-8 horas previas a la toma de muestras. Se obtienen los 5-10 primeros ml de orina y tras centrifugación a 400 rpm se examinan al microscopio de 400 aumentos. La presencia de > de 15 leucocitos polimorfonucleares por campo confirma el diagnóstico de uretritis.  Los síntomas de la uretritis gonocócica pueden permanecer hasta más de 7 días, por ello la uretritis postgonocócica se suele diagnosticar después de transcurrido este periodo. En el examen con tinción de Gram la presencia de diplococos Gram negativos (DGN) intracelulares, establece el diagnóstico de uretritis gonocócica. La presencia de células inflamatorias en el exudado uretral en ausencia de diplococos gramnegativos y cultivo negativo para N. gonorrhoeae establece el diagnóstico de UNG.  El éxito del diagnóstico microbiológico de la uretritis gonocócica depende en gran medida de la correcta obtención, transporte y procesamiento de muestras. En cada muestra deben emplearse dos torundas, una para el cultivo y otra para la extensión del exudado uretral para realizar la tinción de Gram. Las muestras para cultivo deberán inocularse en medios selectivos, (Thayer- Martin modificado, Martin-Lewis ) e incubarse de modo inmediato a 35 -37º C durante 72 horas en una atmósfera de 3-10% de CO2 y humedad. Cuando esto no sea posible, es necesario inocular las muestras en medio de transporte (Stuart o Amies).  Examen microscópico: En la secreción uretral se debe observar presencia de células y bacteria especialmente diplococos gram negativos intra y extracelulares. Evaluar: La presencia de leucocitos Polimorfonucleares. 1. Examen en medios de cultivo: Examinar todos los medios a las 18-24 horas. Si no hay crecimiento de patógenos, incubar hasta las 48 h, . El Thayer Martín se incubarán, si es negativo, hasta 72 horas. Agar sangre: (Streptococcus pyogenes o S.pneumoniae), Agar Chocolate (Haemophilus sp). Thayer Martin (gonococo). 2. Pruebas bioquímicas: A todas las colonias sospechosas realizar pruebas bioquímicas Ejm. Prueba de oxidasa y fermentación de carbohidratos para el caso de Neisseria METODOLOGIA  Observar las láminas previamente fijadas y coloreadas RESULTADOS Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores DISCUSION: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… CONCLUSIONES: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores GLOSARIO Aerobio, microorganismo que requiere del oxigeno para su desarrollo. Aerogénico, que produce gas (CO2 y H2). Agar, polisacárido extracto de un alga roja que se utiliza como agente solidificante en medios de cultivo biológicos. Aguja de inoculación, pieza de platino fijado a un mango de metal que se utiliza para efectuar la estriación de un medio bacteriano o para recoger colonias para su transferencia. Aislamiento, método para obtener bacterias en cultivo puro, por medio de subcultivos de colonias discretas, utilizando diferentes tipos de medio. Anaerobio, microorganismo que sólo puede desarrollar en ausencia total o parcial de oxigeno. Anerogénico, que no produce gas (CO2 y H2) Antibiótico, sustancia química producida por un microorganismo y que tienen la capacidad de inhibir el desarrollo de otros organismos vivos sensibles. Antimicrobiano, agente biológico o químico que inhibe el crecimiento de microorganismos. Antisuero, suero que contiene anticuerpos para antígenos específicos Bactericida, sustancia o agente químico que resulta letal para las bacterias, es irreversible. Bacteriemia, presencia de bacterias en el torrente sanguíneo, acompaña a estados sépticos y también no infecciosos. Bacteriostático, sustancia o agente químico que inhibe el crecimiento bacteriano, es reversible. Bacteriuria, presencia de bacterias en la orina; puede presentarse en estados clínicos y subclínicos. Caldo, medio de cultivo líquido para bacterias heterotróficas, compuesto por elementos nutritivos esenciales. Cepa bacteriana, cultivo puro de bacterias formada por los descendientes de un solo aislamiento. Coliforme, bacilos gramnegativos aeróbicos y anaeróbicos facultativos, que no forman esporas y fermentan la lactosa con formación de gas.6 Colonia, crecimiento visible de microorganismos, en general en un medio sólido y derivado de la multiplicación de un solo tipo de organismo. Cromogénico, que produce pigmento. Cultivo, crecimiento de microorganismos. Cultivo mixto, crecimiento de dos o más microorganismos en el mismo medio. Cultivo puro, cultivo que contiene un crecimiento bacteriano específico de una sola especie de microorganismo Disentería, inflamación del intestino, caracterizada por dolor abdominal, tenesmo, y diarrea don sangre y moco en las heces. Entéricas, relacionado al tracto intestinal. Enterotoxina, toxina que produce cambios patológicos en el tubo digestivo, ejemplo toxina de cólera Esterilización, proceso químico o físico o químico, utilizado para eliminar todos los microorganismos. Extendido, preparado sobre un portaobjeto de una capa muy delgada de material para su examen con el microscopio. Halofílico, microorganismo que puede tolerar una alta concentración de sales, por lo general hasta un 10%. Hemólisis, presencia de una zona de eritrocitos hemolisados alrededor de una colonia cultivada en una placa de agar sangre. Incubación, mantenimiento de cultivos bacterianos en condiciones favorables para su crecimiento, especialmente temperatura. Indicador, sustancia que hace visible el final de una reacción. Compuesto que cambia de color con las variaciones del pH de una solución o medio. Infección, presencia de microbios vivos en tejidos. Infecciones asintomáticas, infecciones sin síntomas clínicos; si los microorganismos se van eliminando, tales infecciones también representan un estado de portador. Inhibición, disminución o suspensión de la función como prevención del crecimiento o la multiplicación. El crecimiento es inhibido por el agregado de sustancias químicas como los colorantes y los antibióticos a un medio de cultivo. Inoculación, introducción de un microorganismo o inoculo, en un organismo animal o en un medio de cultivo. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores Inoculo, material que contienen el microorganismo que va a ser introducido o transferido a un medio de cultivo. Latente, aparentemente inactivo. Medio de cultivo, mezcla de sustancias nutritivas en una forma sólida, semisólida o líquida, que llena los requerimientos para el crecimiento y reproducción de los microorganismos. Nutriente, material o sustancia que puede ser utilizado como fuente de alimento. Periodo de incubación, es el tiempo entre el momento de la inoculación y el crecimiento visible de bacterias en medios artificiales. Punción, cultivo en el cual los microorganismos son inoculados con una asa de inoculación en la parte superior del medio para permitir el posible crecimiento anaeróbico. Quimioterápico, compuesto químico sintético que actúa en forma bactericida o bacteriostática sobre los microorganismos, inhibiendo funciones vitales. Resistente, que soporta la acción o efecto a algo. Sensible, susceptible a la acción o efecto a algo. Septicemia, presencia de microbios en la sangre, relacionada con una infección o sepsis. Subcultivo, transplante de bacterias viables derivadas de otro cultivo. Tiempo de generación, es el tiempo que demora una bacteria en dividirse o lo que es lo mismo, una población bacteriana en multiplicarse. Depende de la especie bacteriana y las condiciones nutricionales y ambientales. Vector, agente animado o inanimado que lleva a un microorganismo patógeno de un huésped enfermo a uno sano, causándole infección. Virulencia, poder patógeno relativo de diferentes cepas de microorganismos dentro de una especie. Zoonosis, enfermedades de animales transmitidas al hombre. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores PRACTICA N° 10 DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO OBJETIVOS  Conocer las técnicas para la toma de muestra en el diagnóstico micológico.  Identificar los productos patológicos de donde se pueden aislar los agentes etiológicos de las micosis humanas.  Conocer las características de los exámenes directos, como de los cultivos de hongos. INTRODUCCIÓN  La mayoría de los hongos tienen un hábitat saprofítico presentan una variedad de morfología, desde las levaduras hasta los hongos filamentosos. Los hay comestibles, de interés para la industria alimentaria, química o farmacéutica y los venenosos. Del gran número de especies estudiadas hasta la fecha (más de 250,000) muy pocas son capaces de colonizar al ser humano inmunocompetente, produciendo en éstos casos las enfermedades denominadas micosis.  Los hongos que producen micosis en el ser humano se encuentran en dos estados morfológicos básicos: levaduras y mohos. Levadura  Puede definirse como un hongo unicelular, redondo u ovalado que se reproduce por gemación o fisión binaria. Una levadura también puede ser el estadio morfológico en el ciclo biológico de una especie filamentosa se denomina a esto dimorfismo. Mohos  Son hongos multicelulares cuya estructura filamentosa se forma por el crecimiento continuo a partir de una espora. El elemento tubular que emerge se denomina “hifa”, el que sigue creciendo y ramificándose llegando a formar un conjunto entrelazado al que se denomina “micelio” o “talo”. Parte de las hifas se introduce en el sustrato y forman el “micelio vegetativo” y las que se proyectan hacia el exterior constituye el “micelio aéreo” muchas levaduras, en determinadas circunstancias y dependiendo de la especie, pueden producir “pseudohifas”.  El micelio aéreo muestra macroscópicamente diferentes características, lo cual contribuye a la identificación primaria; pueden ser algodonoso, velloso, arrugado, polvoriento, cerebriforme, pigmentado o no, etc. En el se producen los elementos de propagación, las esporas y los conidios. Los micelios tienen la capacidad de germinar en nuevo sustrato y así producir un nuevo elemento. Este conjunto de características observadas sobre el medio de cultivo se denomina “colonia”.  Los hongos como células eucarióticas poseen núcleo, nucleolo, retículo endoplasmático, ribosomas, mitocondrias, vacuolas, cuerpos lipídicos y otras inclusiones. Rodeando el citoplasma existe una membrana y una pared celular con característica muy definidas. Se multiplican a través de estructuras que puede ser asexuales o sexuales previa fusión del protoplasma y núcleo de células distintas. También lo hacen mediante crecimiento vegetativo expansivo como ocurre de rutina en el laboratorio con levaduras o fragmentos de micelio.  Como en otras enfermedades infecciosas, las micosis se diagnostican en el laboratorio siguiendo el esquema clásico: examen directo, cultivos e inmunodiagnóstico. EXAMEN DIRECTO  El examen microscópico de la muestra patológica; escamas de piel, pelos, fragmentos de uñas, exudado purulento, LCR o biopsias, permite observar las características hifas, esporas, levaduras, etc.  Se hace una preparación en lámina portaobjetos con una gota de KOH al 10%. Para la cápsula de Cryptococcus neoformans (LCR), se adiciona una gota de tinta china para visualizar la cápsula. En los exudados purulentos se recomienda realizar una tinción con Gram, Giemsa y también Wright. Si se trata de cortes histológicos hacer una preparación con hematoxilina y eosina. CULTIVOS  El medio más utilizado en micología médica es el descrito por Sabouraud. A éste medio base se le añade una cantidad superior de glucosas (40 x 100), denominándose así agar glucosado de Sabouraud (SGA), al cual posteriormente se le han adicionado antibióticos con el fin de evitar la contaminación bacteriana y ciclo eximida (actidiona) para inhibir los hongos saprofitos. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores  La incubación en micología médica es siempre en aerobiosis, oscilando el tiempo desde 2-3 días para levaduras y especies saprofitas. La temperatura de incubación es 32º C; los dermatofitos y otros causantes de micosis cutáneas a 25 a 30 grados centígrados (temperatura ambiental).  El producto patológico y la técnica de toma de muestra se elegirá de acuerdo con el tipo de micosis por investigar. MATERIALES  Tubos de prueba conteniendo agar glucosado de Sabouraud (SGA)  Cultivos de especies ambientales: Penicillium, Alternaria, Aspergillus, Hormondendrum  Frasco con KOH al 10%, Mango de Kolle  Microscopio METODOLOGÍA  Observar macroscópicamente y realizar preparaciones con azul de lactofenol para su observación microscópica. RESULTADOS  Observar al microscopio (10X y 40X) las muestras directas. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya aya, Martha Flórez Flores DISCUSION: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… CONCLUSIONES: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya aya, Martha Flórez Flores OBSERVACION MICROSCOPICA DE HONGOS AMBIENTALES Hongo ambiental y oportunista Aspergillus spp. Hongo ambiental Penicillium sp Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya aya, Martha Flórez Flores Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya aya, Martha Flórez Flores PRACTICA N° 11 DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTÁNEAS OBJETIVOS  Describir las características de las colonias de hongos causantes de las micosis superficiales y cutáneas en cultivos con agar glucosado de Sabouraud y microscópicamente. INTRODUCCIÓN  La colonización e invasión en mayor o menor grado de una especie fúngica se denomina “micosis”. Dentro de las micosis superficiales se incluyen las causadas por hongos que colonizan la superficie queratinizada de la piel o pelo. Varios son los agentes etiológicos que pueden colonizar la piel.  Las infecciones cutáneas incluyen una variedad de procesos en los que se encuentran afectados piel y anexos (pelo y uñas). La infección puede estar limitado a la capa cornea o llegar a los estratos más profundos, sin invasión linfática. Producidos por los hongos denominados dermatofitos y las enfermedades por ellos producidas dermatofitosis. La dermatomicosis incluye a cualquier proceso micótico de la piel y el de dermatofitosis se reserva para los producidos por los hongos dermatofitos. MICOSIS SUPERFICIALES Piedra negra  Se caracteriza por la presencia de módulos en la porción extrafolicular del pelo, pétreos y de color negro. El agente causal es Piedra hortae. Piedra blanca  Muestra módulos blanco-grisáceos, que son masas agrupadas de hifas y pueden encontrarse en la parte distal o central de pelo axilar, pubiano y crural. Agente causal Trichosporum cutaneum o T.beigelii. Tiña negra  Es una infección superficial del estrato corneo de la piel debido a la colonización Hortaea werneckii. Se caracteriza por la presencia de manchas negro-marronáceas, no descamativas e indoloras; frecuente en palmas, dedos y plantas que en otro lugar de la piel. Pitiriasis versicolor  Caracteriza lesiones furfuráceas a veces papulomatosas o eritematosas confluentes con pigmento variable (hipo o hiperpigmentadas). Tiene como agente causal a Malassezia furfur, se localiza preferente en el tronco, sobre todo hombres y espalda. Al examen microscópico detectan los grupos de levaduras con las hifas. MICOSIS CUTÁNEAS Dermatomicosis  Micosis producida por Candida albicans, hongo oportunista. Agente causal de los intertrigos (submamario o inguinal), eczema de pañales, onicomicosis con paroniquia y granuloma candidiásico. Además de s C.albicantambién pueden producir onicomicosis Candida stellatoidea, C.tropicalis, C.guillermondii y C.parapsilosis.  Las preparaciones teñidas con Gram, muestran levaduras Gram positivas redondas u ovales, con brotes de blastosporas de 3 a 4 m acompañadas de pseudohifas de 3 a 10 micras de longitud.  La mayoría de los medios de cultivo bacterianos son satisfactorios para el aislamiento de Candida; de todas formas se recomienda efectuar la siembra en medio de Sabouraud con antibióticos (cloranfenicol). Los medios que contienen actidiona (cicloheximida) inhiben el crecimiento de algunas especies.  La incubación se realiza a temperatura ambiente (25–30º C) cuando se trata de medios con inhibidores y a 37º C. en el caso de medios enriquecidos exentos de sustancias inhibidoras. Al cabo de 24 a 48 horas se pueden observar las colonias características de color blanco o crema, opacas, elevadas, lisas, brillantes o mates de 1 a 3 mm de diámetro. La prueba de filamentación y producción de clamidosporas características son muy sencillas y útiles para la identificación de C.albicans. Dermatofitosis Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya aya, Martha Flórez Flores  Es una infección fúngica de los tejidos queratinizados (piel, pelo y uñas) que ocurre en los seres humanos y animales producida por un grupo de hongos estrechamente relacionados denominados “dermatofitos”.  Los agente etiológicos de las dermatofitosis se clasifican en tres géneros: Epidermophyton, Microsporum y Trichophyton. El diagnóstico se puede hacer mediante: Examen Directo  Para el estudio micológico se procede a tomar la muestra, que en este caso serán pelos, escamas de piel o muestras ungueales, que se toman con pinzas o bisturí estéril del centro o borde de la lesión y se colocan en un portaobjetos. Se transportan entre dos portaobjetos limpios, y se observa directamente al microscopio, con una gota de hidróxido de potasio (KOH) al 10%, cubierto con un cubreobjeto.  Al microscopio se pueden observar las artroconidias dentro del pelo (endotrix) o en forma de vaina alrededor del tallo (ectotrix). Cultivo  Las muestras se siembran en SGA, adicionado de cicloheximida, que inhibe los hongos saprofitos. La identificación se hace sobre la base del aspecto macroscópico de las colonias entre ellos la producción de pigmento. Luego las características microscópicas, observación de macroconidias y microconidias y elementos accesorios sirven para definir cada género y especie.  Observar el desarrollo de los hongos en estudio y anotar las características de sus colonias desarrolladas en SGA. MATERIALES  Tubos sellados de SGA con cultivos de: - Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans - Microsporum gypsum, Microsporum canis  Preparaciones en lámina coloreadas con azul de lactofenol  Microscopio METODOLOGIA:  Examinar al microscopio las láminas preparadas y esquematizar sus observaciones. RESULTADOS: MUESTRA OBSERVACION NOMBRE DEL HONGO: CARACTERISTICAS MACROSCOPÍCA: MICROSCOPICA: Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya aya, Martha Flórez Flores NOMBRE DEL HONGO: CARACTERISTICAS MACROSCOPÍCA: MICROSCOPICA: NOMBRE DEL HONGO: CARACTERISTICAS MACROSCOPÍCA: MICROSCOPICA: NOMBRE DEL HONGO: CARACTERISTICAS MACROSCOPÍCA: MICROSCOPICA: Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya aya, Martha Flórez Flores DISCUSION: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… CONCLUSIONES: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya aya, Martha Flórez Flores Microsporum canis Col. Azul de Lactofenol Epidermophyton flocosum Col. Azul de Lactofenol Trichophyton rubrum Col. Azul de Lactofenol Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya aya, Martha Flórez Flores Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya aya, Martha Flórez Flores PRACTICA N° 12 DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SUBCUTÁNEAS, MICOSIS SISTÉMICAS Y OPORTUNISTAS OBJETIVOS  Identificar microscópicamente los agentes etiológicos de las micosis subcutáneas, y subcutáneas.  Describir las características morfológicas de las colonias de hongos causantes de las micosis cutáneas y subcutáneas.  Identificar microscópicamente los agentes etiológicos de las micosis sistémicas.  Describir las características morfológicas de las colonias de hongos causantes de las micosis sistémicas. INTRODUCCIÓN MICOSIS SUBCUTANEA:  Se consideran en éste grupo las infecciones fúngicas que afectan tejido subcutáneo, dermis y epidermis, causadas por hongos exógenos, saprofitos, cuyo hábitat es el suelo y las plantas. Las infecciones más frecuentes son:  La esporotricosis, debida a Sporothrix schenckii, que se produce habitualmente por la penetración en la piel de astillas, espinas o tierra contaminada; una vez establecida la infección tiende a permanecer localizada en el tejido subcutáneo y a ser muy persistente. Se caracteriza por una lesión ulcerada en el punto de inoculación, que va seguida de la formación de nódulos y abscesos múltiples que siguen las vías de drenaje de los linfáticos superficiales.  La cromomicosis (cromoblastomicosis), es causada por Fonsecaea pedrosoi, Cladosporium carrionii y Phialophora verrucosum, que se caracteriza por el desarrollo de una pápula en el sitio de inoculación, que más tarde se extiende formando lesiones verrugosas o tumorales, semejantes a una coliflor; puede haber infección secundaria y ulceración. Las lesiones, por lo general, están limitadas a los pies y las piernas, pero puede afectar la cabeza, la cara, el cuello y otras superficies del cuerpo; también pueden haber abscesos cerebrales.  El micetoma (maduromicosis), es causado por Nocardia y Streptomyces. MICOSIS SISTEMICAS Y OPORTUNISTAS: Las micosis sistémicas, son infecciones fúngicas que afecta varios órganos y tejidos. Encontramos aquí dos grupos: (a) Las producidas por especies consideradas patógenas, con carácter endémico, este tipo de micosis se transmite por inhalación, ingesta, o traumatismos: blastomicosis y paracoccidiodomicosis; y (b) Las producidas por especies oportunistas, Estas patologías se dan en huéspedes inmunodeprimidos (con trastornos endocrinos, inmunodeficiencias, enfermedades oncohematológicas, alteraciones metabólicas y anatómicas, drogadictos endovenosos, pacientes bajo tratamiento prolongado con corticoides o citostáticos, sometidos a cirugía, dializados, quemados, trasplantados y cateterizados) y son causadas por hongos saprofitos del ambiente o comensales de cuerpo humano. Por ejemplo Candida y Cryptococcus. La infección se adquiere por la inhalación de conidios en la fase micelial, desarrollándose en el huésped un foco pulmonar primario. En caso que el paciente presente inmunodeficiencia puede haber una diseminación sistémica. El diagnóstico de laboratorio se realiza mediante la observación de la fase levaduriforme en los siguientes productos: expectoración, secreción de lesiones mucocutáneas y material de biopsia. La fase levaduriforme se puede obtener en cultivos enriquecidos, incubados a 37º C. Estas pueden ser: Blastomicosis (Blatomyces dermatitis)  La infección comienza habitualmente en los pulmones y se difunde por vía hematógena, causando lesiones destructivas focales en los huesos, piel, próstata y otras vísceras; en general no se afecta el tubo digestivo. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya aya, Martha Flórez Flores  Las lesiones cutáneas son particularmente manifiestas, parecen originarse como metástasis a partir de las lesiones pulmonares primarias, que se abren a la superficie cutánea causando lesiones ulceradas y encostradas. Las lesiones se caracterizan por inflamación granulomatosa, microabscesos y progresiva destrucción de los tejidos; la calcificación es rara. Paracoccidioidomicosis o blastomicosis sudamericana (Paracoccidioides brasilensis)  Las primeras lesiones aparecen en las mucosas de la boca o de la nariz y se difunden por expansión directa, es decir, a través de los límites cutáneo-mucosos afectan la cara; en ocasiones, la diseminación se produce a través de los tejidos linfáticos incluyendo el bazo.  En el tubo digestivo las lesiones comienzan en el tejido linfoide submucoso y pueden originar formación de úlceras e incluso perforaciones; pueden formarse abscesos subcutáneos que, por extensión a la superficie cutánea, pueden producir lesiones deformantes de gran tamaño, encostradas o ulceradas. Las lesiones cutáneas constituyen abscesos piógenos y lesiones inflamatorias granulomatosas. Histoplasmosis (Histoplasma capsulatum)  Causada por la inhalación de esporas lo que conduce a la infección pulmonar; aparecen lesiones miliares distribuidas por todo el parénquima pulmonar y aumento de tamaño de los ganglios linfáticos. La infección inicial es benigna, puede pasar completamente inadvertida o manifestarse como una infección respiratoria autolimitada.  En un pequeño número de individuos la enfermedad progresa, se disemina y causa lesiones prácticamente en todos los tejidos y órganos; aparece fiebre y postración, así como el aumento del tamaño del hígado, bazo y ganglios linfáticos, simulando tuberculosis miliar; en ocasiones, puede evolucionar como una enfermedad pulmonar crónica con cavitación, simulando la tuberculosis pulmonar crónica. Las lesiones de los tejidos se caracterizan por la existencia de una inflamación granulomatosa. Coccidiomicosis (Coccidioides immitis)  La infección se establece por inhalación de esporas transmitidas por el aire; aproximadamente en el 60% se pone de manifiesto únicamente por la adquisición de una hipersensibilidad de tipo retardado frente a los antígenos del hongo; en un 40% se presenta neumonitis aguda acompañada con frecuencia de pleuresía y varias erupciones cutáneas; alrededor del 5% desarrollan una enfermedad pulmonar crónica con cavitación que se asemeja a la tuberculosis pulmonar y conduce ocasionalmente a la calcificación; en menos del 1% aparece una diseminación con lesiones granulomatosas sépticas en muchos órganos y tejidos, entre ellos la piel, huesos, articulaciones y meninges.  Las lesiones de la neumonitis aguda son histológicamente semejantes a las causadas por bacterias piógenas, pero en la enfermedad pulmonar crónica y en las formas diseminadas, la inflamación es granulomatosa. Criptococosis  Esta ocurre en particular en sujetos con inmunodeficiencia de células T y se debe a Cryptococcus neoformans, este hongo se caracteriza por ser una levadura encapsulada. Su hábitat es el suelo contaminado con material fecal de aves.  La Criptococosis es una de las enfermedades que sirve para definir el SIDA. Dentro de las formas clónicas existe: criptococosis pulmonar, del SNC, diseminada, cutánea y mucocutánea.  El producto más frecuente a analizar es sedimento de LCR, en el se observan las típicas levadura capsulazas que se destacan por contraste negativo mediante emulsión con tinta china. Candidiasis (Candida spp)  Las infecciones causadas por Candida es muy variada, este hongo de tipo levaduriforme puede llegar a ser patógeno en humanos y animales en los cuales viven en estado saprofítico. La cavidad bucal y el resto del tracto gastrointestinal son los territorios preferentes, en donde C.albicans se encuentra en el 20% de las personas y en menor proporción otras especies de Candida.  Por lo menos cinco condiciones favorecen el surgimiento de Candidiasis: 1. Cambios fisiológicos como diabetes y embarazo 2. Uso prolongado de antibióticos o fármacos antitumorales e inmunosupresores. 3. Maniobras diagnosticas y terapéuticas agresivas (cateterismos, sondajes) 4. Debilidad general y/o desnutrición. 5. Infección por el virus de inmunodeficiencia humana y la drogodependencia. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya aya, Martha Flórez Flores  El diagnostico de la Candidiasis en el laboratorio incluye la demostración directa de Candida (mediante coloraciones Giemsa, Gram) en muestra clínicas y en cultivos. MATERIALES  Tubos sellados de SGA con cultivos de las diferentes micosis  Láminas, laminillas, colorante azul de lactofenol  Microscopio METODOLOGÍA  Observación de las muestras macroscópicamente  Realizar preparaciones en láminas con azul de lactofenol y observar a 10x y 40x. RESULTADOS  Graficar lo observado. MUESTRA OBSERVACION NOMBRE DEL HONGO: CARACTERISTICAS MACROSCOPÍCA: MICROSCOPICA: NOMBRE DEL HONGO: CARACTERISTICAS MACROSCOPÍCA: MICROSCOPICA: Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya aya, Martha Flórez Flores MUESTRA OBSERVACION NOMBRE DEL HONGO: CARACTERISTICAS MACROSCOPÍCA: MICROSCOPICA: NOMBRE DEL HONGO: CARACTERISTICAS MACROSCOPÍCA: MICROSCOPICA: Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya aya, Martha Flórez Flores DISCUSION: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… CONCLUSIONES: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores Phialophora verrucosum Col. Azul de lactofenol Sporothrix schenckii Col. Azul de Lactofenol Cladosporium carrionii Examen directo con KOH Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores Histoplasma capsulatum Cryptococcus neoformans Coccidioides immitis Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores Candida albicans Coloración Gram Candida albicans Examen directo con KOH Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores GLOSARIO Absceso, acumulo local de pus que representa los restos licuados de leucocitos (neutrófilos) y tejido destruido. Algodoncillo, una micosis de la mucosa de la boca y vías respiratorias altas. Células eucarióticas, célula con membrana nuclear. Conidios, esporas asexuales de hongos nacidos en estructuras ramificadas a modo de tallo llamado conidióforos. Descamación, esfacelo excesivo de las capas superficiales de un tegumento, como la epidermis de la piel. Dermatofitos, grupo de hongos queratinófilos que invaden las zonas queratinizadas superficiales del cuerpo (pelo, piel, uñas). Dermatomicosis, proceso micótico de la piel causada por cualquier tipo de hongos, frecuentemente Candida. Dermatitis, inflamación de la piel. Hematógena, originado en o transportado por la sangre. Hifa, estructura tubular de hongos vegetativos que posee paredes cruzados (tabiques). Hongos dimórficos, hongos que pueden sufrir conversión morfológica y crecer en forma de levadura o de moho según las condiciones ambientales; muchos hongos patógenos son dimórficos. Inmunodeficiente, relativo a un trastorno del sistema inmunitario en el que la inmunidad humoral o celular es infrecuente, y esta disminuida la resistencia a la infección. Inmunoincompetente, incapacidad para desarrollar una respuesta inmunitaria al estimulo de los antígenos. Macroconidios, el mayor de dos tipos de conidios producidos por hongos que tienen de ambos tipos pequeños y grandes. Micelio, la masa de hifas, frecuentemente de aspecto algodonoso, formada por una colonia de mohos. Micetoma, infección crónica causada por diversos hongos y actinomicetos. Microconidios, el tipo más pequeño de conidios en hongos. Miliares, relativo al trastorno caracterizado por la aparición de lesiones muy pequeñas, como la tuberculosis miliar, que se caracteriza por la aparición de tubérculos diminutos distribuidos por todo el organismo. Mohos, grupo heterogéneo de hongos que crece en forma filamentosa; unos pocos son dimórficos. Saprofito, microorganismo que normalmente existe en material orgánico muerto. Tiña, lesión circular causada por hongos queratinófilos (dermatofitos); la lesión es escamosa, pruriginosa y se difunde periféricamente. Tubo germinativo, yemas alargadas que se desarrollan cuando hongos dimórficos se convierten de la forma levadura a la forma moho de crecimiento, y maduran para producir hifas verdaderas. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores PRACTICA N° 13 MÉTODOS DE DIAGNOSTICO VIROLÓGICO OBJETIVOS  Familiarizar al estudiante con las diferentes técnicas de aislamiento de virus aprovechando las propiedades que presentan.  Observar y caracterizar morfológicamente células cultivadas.  Explicar la importancia de las técnicas de cultivo de tejidos en virología y en otras disciplinas científicas. INTRODUCCIÓN  Los virus son microorganismos intracelulares obligados por carecer de sistemas energéticos. Estas características son explotadas para su aislamiento y diagnóstico además de muchos otros tales como su acción patógena que depende de muchos factores inherente al microorganismo y al hospedador, receptores específicos existentes, pH.  Un factor determinante y definitivo para el aislamiento viral es la obtención temprana de una muestra adecuada, esto debido a que la excreción del virus tiende a ser por pocos días y la concentración de partículas virales disminuye progresivamente con el tiempo. Toda muestra para estudio virológico debe obtenerse con mucha asepsia, usando siempre soluciones tamponadas, con antibióticos, sobre todo su transporte debe ser con hielo inmediatamente para ser procesadas o colocadas en congeladores a -20° C, estas no deben dejarse a temperatura ambiente o en incubadora, tampoco es recomendable congelar y descongelar las muestras, pues así se podría alterar la estructura del agente viral.  Es importante que las muestras incluyan una ficha de datos epidemiológicos como: Nombre, edad, sexo, antecedentes, fecha de inicio de la enfermedad, síntomas, procedencia, etc. TIPOS DE MUESTRAS Hisopado faríngeo  Lavado de garganta, hisopado nasofaríngeo del fondo de la garganta. El lavado de garganta dentro las 18 horas de iniciado la enfermedad. Para adenovirus, influenza, sarampión, citomegalovirus y parotiditis. Heces  Recolectar en frasco estéril (aproximadamente 2 g) y guardar a –20° C, hasta el envío al laboratorio, la muestra se obtiene dentro de los 10 días de iniciada la enfermedad, si es hisopado rectal humedecer la torunda con suero fisiológico; obtenida la muestra colocarla en caldo tioglicolato hasta su envío siempre en refrigeración. Para aislar rotavirus, adenovirus, coxsackie A y B, reovirus y poliovirus. Piel  Raspado de la pápula o mácula, fluido de vesícula o pústula con ayuda de un hisopo colocar en un caldo buffer a –20°C. También puede colocarse la muestra directamente sobre un cubreobjetos para anticuerpos fluorescentes. Para herpesvirus, varicela. Secreciones oculares  Con ayuda de un hisopado humedecido obtenerse secreciones de la conjuntiva, lavado de ojos, colocar las muestras en tubos con caldo buffer y con otro hisopo para improntas sobre portaobjetos para conjugados fluorescente. Para aislar virus como adenovirus, herpesvirus, sarampión. Tejidos  Se obtiene por biopsias, se limita a algunos órganos como hígado, bazo, verrugas, ganglios inflamados; mantener a –20° C hasta su procesamiento. Sangre  Sangre venosa en cantidad de 5–10 mL sin anticoagulante para la obtención del suero; generalmente es usada para pruebas serológicas en caso de hepatitis, HIV, etc.  El éxito en el aislamiento del virus depende de la correcta recolección, transporte y almacenamiento de las muestras. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores TÉCNICAS DIRECTAS PARA LA DEMOSTRACIÓN VIRAL  Dentro de las técnicas directas se encuentran: - Las que visualizan la partícula viral o su efecto especifico (efecto citopático) como las tinciones para microscopia de luz, microscopia electrónica y el cultivo de aislamiento viral. - Las pruebas para demostración de antígenos virales: los inmunoensayos (ELISA, IFA, RIA) y las pruebas de látex. - Las que evidencian la presencia de material genético viral como: ensayos de amplificación genética (reacción en cadena de la polimerasa o PCR) e hibridación (sondas, ADN ramificado, etc.). - Visualización de la partícula viral. AISLAMIENTO VIRAL EN CULTIVO  Los virus son microorganismos intracelulares y para evidenciarlos, se deben utilizar sistemas basados en líneas celulares. La invasión viral se evidencia a través de un cambio celular o efecto citopático (EC) y mediante pruebas complementarias. Por la especificidad de los virus estos no desarrollan en cualquier célula pues requieren de receptores específicos es por ello que existen variabilidad de células las que las clasificamos por su origen en: Cultivos primarios  Son aquellos que se obtienen por disgregación enzimática y mecánica de embriones, órganos o tejidos (normales o tumorales) de humanos o animales, para producir una suspensión celular. Se mantienen intactas por 3 a 5 pasajes. Línea celular  Cuando un cultivo primario es subcultivado por primera vez. Existen varios tipos de líneas celulares. Una línea celular diploide presenta el 75% de sus células con el cariotipo original de donde fueron obtenidas. Una línea celular establecida es aquella que ha demostrado potencialidad de ser subcultivada indefinidamente in vitro. Ej. Vero, MCR5, HELA, Hep2, W138, Flow 2002. TÉCNICAS INDIRECTAS PARA EL DESCUBRIMIENTO VIRAL  Estas son las técnicas serológicas tradicionales para descubrir anticuerpos contra determinado agente viral, teniendo en cuenta que la exposición al agente produce una respuesta por parte del sistema inmune que genera la producción de anticuerpos específicos. Estos ensayos se pueden clasificar en tres grupos con base en la cuantificación de la reacción antígeno-anticuerpo: a) Los que dependen de la capacidad del anticuerpo que se une al antígeno para ejercer alguna función no relacionada con el virus. Ej. Fijación del complemento (FC), hemoaglutinación indirecta (HAI), aglutinación por látex (AL). b) Los que miden la capacidad de los anticuerpos para bloquear la función viral específica como la neutralización, la inhibición de la hemoaglutinación (IHAI), la inhibición de la neuraminidasa (que mide la capacidad de los anticuerpos para bloquear la infectividad viral), la hemoaglutinación viral y la actividad de la neuraminidasa. c) Los que miden directamente la interacción antígeno-anticuerpo como por ejemplo: la inmunofluorescencia (IFA) indirecta, el radioinmunoanálisis (RIA), ELISA y el Western Blot (WB). INMUNODIAGNÓSTICO ■ ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO La prueba de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) o inmunoensayos ligados a enzimas (EIAs) en la cual el antígeno o anticuerpo está adsorbido a una fase sólida , constituye uno de los primeros inmunoensayos enzimáticos primeramente descritos por Engvall y Perlmann en 1971 y luego aplicados al diagnóstico microbiológico por Voller y colaboradores. ELISA tiene la ventaja sobre las técnicas de inmunofluorescencia (IF) de su mayor sensibilidad ya que, la enzima actúa catalíticamente y de forma objetivable, por lo que es posible medir la densidad óptica de la coloración final. Las enzimas son seguras, de bajo costo y estables, si se comparan con los radio-isótopos utilizados en radioinmunoensayo (RIA) En la actualidad estas pruebas están tomando un rol importante en los laboratorios médicos y de investigación, porque brindan una alternativa viable, mediante la cual es posible realizar la identificación de muchos virus a nivel de género. Están reemplazando a los RIA en muchos Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores laboratorios, por su comparable sensibilidad sin los problemas de manejo, eliminación y corto tiempo de vida de los materiales radioactivos. Debido a su objetividad, facilidad de automatización y posibilidad de trabajar con un gran número de muestras, estos ensayos inmunoenzimáticos están reemplazando parcialmente a técnicas en el laboratorio como : inmunofluorescencia y aglutinación. Estos ensayos presentan tres piezas constantes que originan distintos tipos de EIA en función de como se combinen : el analito (antígeno {Ag} o anticuerpo {Ac} ), el conjugado (de antígeno o de anticuerpo) y el sustrato. Utilizan enzimas como marcadores inmunoquímicos que permiten valorar las uniones antígeno-anticuerpo que se producen tras un periodo de incubación, con la adición posterior de un sustrato. ● Fundamento La prueba de ELISA se basa en la reacción antígeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser de reactividad conocida. El color se genera por la interacción de un sustrato cromogénico y una enzima que ha sido acoplada al anticuerpo detector. Si debe medirse el anticuerpo, se coloca el antígeno en la fase sólida, como una capa de captura. Después de la reacción del antígeno con el suero del paciente, la capa de detección puede ser un reactivo antiinmunoglobulina clase específica (IgM o IgG) para detectar respuesta de anticuerpos clase específicos Dentro de los parámetros fisicoquímicos que intervienen en la unión del antígeno con el anticuerpo tenemos: ▪ Fuerzas de Van der Walls producidas por el movimiento de átomos en la superficie de las moléculas generado por un cambio eléctrico. Son fuerzas débiles presentes cuando la proximidad del Ag y el Ac es grande. ▪ Fuerzas electrostáticas originadas por la fuerza de atracción entre moléculas de carga iónica opuesta, como sucede con los grupos NH3 + (amoníaco)que reaccionan ávidamente con el grupo COOH - (grupo carboxilo). ▪ Uniones por puentes de hidrógeno son de carga energética baja entre átomos electropositivos de hidrógeno y átomos electronegativos de oxígeno o nitrógeno. ● Metodología Los métodos de ELISA se dividen en: ■ ELISA directo: ensayo ELISA simple de dos capas Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados e indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Se debe incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado y controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido). ■ ELISA indirecto Las placas ELISA se preparan de igual forma que en el método directo, los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos : uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpo secundarios por cada primario. ■ ELISA sándwich: ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti- antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores Fijación del Antígeno a la fase sólida: La reacción inmunológica tiene lugar en la fase sólida, ésta puede ser de plástico, vidrio o nitrocelulosa. Los más usados son los de plástico, dentro de éstos los de poliestireno gammairradiados y los de cloruro de polivinilo ya que tienen mayor capacidad para formar enlaces estables que los de poliestireno no tratados. El antígeno diluido en buffer es adherido a la fase sólida por enlaces electrostáticos entre los sitios activos del plástico y regiones de la proteína responsables de esta interacción. El buffer puede ser carbonato a pH 9,6 o buffer fosfato salino ( PBS 1X ) a pH 7,4. La estabilidad de los enlaces electrostáticos, el tiempo de incubación y la temperatura son factores importantes a tener en cuenta para evitar pérdidas de las proteínas y que pueden afectar la sensibilidad del ensayo. ▪ Reacción con anticuerpo: La reacción del antígeno con el anticuerpo se debe realizar en condiciones similares a las fisiológicas: pH 7,4, temperatura de 37ºC y concentración salina equivalente a 0.15M de cloruro de sodio (NaCl). El tiempo puede variar entre 1 a 3 horas. Moléculas no específicas en solución pueden adherirse a la fase sólida afectando el resultado final del ensayo, para disminuir este riesgo se suele agregar al medio de reacción un exceso (0,1% a 1%) de una proteína inerte para que compita eficientemente por los sitios de unión inespecíficos en la fase sólida. Esta proteína puede ser seroalbúmina bovina, caseína, suero entero, gelatina u otros. También es necesario añadir al medio Tween 20 (Monolaurato de polioxietileno sorbitán { surfactante } )para evitar uniones inespecíficas de macromolécula. Por este motivo es agregado en los tampones de dilución y de lavado. ▪ Adición del conjugado enzimático : El conjugado enzimático se prepara por unión covalente de una enzima con el anticuerpo; esta enzima puede ser peroxidasa de rábano (Horseradish peroxidase { HRP } ), fosfatasa alcalina (Alcaline Phosphatase { AP } ) o beta-galactosidasa. Los criterios a tomar en cuenta en la selección de la enzima apropiada son su toxicidad, estabilidad, disponibilidad, viabilidad de conjugarla eficazmente con el anticuerpo elegido, sensibilidad y costo. Las condiciones de reacción entre el conjugado y el complejo formado por la unión antígeno- anticuerpo son similares a las descritas en la etapa anterior. ▪Adición del sustrato: La elección del sustrato va de acuerdo con el tipo de enzima presente en el conjugado. El sistema AP hidroliza al p-nitrofenil fosfato o p-nitrofenol generando un producto soluble de color amarillo. El sistema HRP reduce al sustrato peróxido de hidrógeno produciendo oxígeno que oxida a otros compuestos cromógenos tales como: ♦ Tetrametilbenzidina (TMB) : la oxidación genera un producto de color azul oscuro. ♦ o-phenylene diamine (OPD): es oxidado a un producto coloreado que puede variar de color naranja a pardo oscuro. ♦ Ácido azino-(3-etil)-benzo-sulfónico (ABTS) : la oxidación genera un producto que puede variar del color al azul. La intensidad del color desarrollado es de acuerdo con la cantidad de enzima presente en la reacción. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores La lectura se realiza en un espectrofotómetro a 405 nanómetros PRUEBA RÁPIDA PARA VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA Uno de los pilares básicos de la lucha contra el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) es la detección precoz de las personas infectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). El diagnóstico precoz ofrece la posibilidad de beneficiarse de la terapia antirretroviral en las etapas precoces de la infección, así como intentar modificar las conductas que favorecen la transmisión del virus a otras personas. ♦ Descripción de las pruebas de detección rápida del VIH Son ensayos de lectura visual que pueden realizarse con equipamiento mínimo y generan un resultado en menos de 15 minutos en comparación con la prueba estándar de cribado con técnicas de EIA, de las cuales no se dispone del resultado hasta al cabo de unas horas o días. Tanto la prueba de detección rápida como el EIA detectan anticuerpos específicos del VIH. Se han establecido los diferentes criterios que debería cumplir una prueba de detección rápida del VIH: ▪ Presentar alta sensibilidad y especificidad (>99%) ▪ Ser reproducible ▪ Ser fácil de aprender, realizar e interpretar ▪ Ser precisa ▪ Ser de fácil almacenamiento ▪ No requerir equipamiento adicional ▪ No tener carácter invasivo Durante la realización de las pruebas de detección rápida, se recomienda que los pacientes reciban información y asesoramiento sobre la enfermedad y la infección. Si la prueba es negativa, se considera un negativo definitivo a no ser que haya posibilidades de que se encuentre en el período ventana de exposición (primeros 3 a 6 meses de post exposición). Si el resultado es positivo, se considera un resultado preliminar que debe confirmarse con técnicas de EIA y con la prueba Western blot. Los resultados indeterminados se deberían repetir en un mes. La mayoría de las pruebas de detección rápida del VIH se comercializan con un equipo o kit que incluye todo lo necesario para realizar la prueba y no requiere un equipamiento especializado. En general, disponen de un control de procedimiento incorporado en el equipo o kit. Para la muestra, se puede utilizar sangre entera (más fácil de realizar), plasma o suero, y los resultados se interpretan visualmente. ♦ Capacidad diagnóstica de las pruebas de detección rápida del VIH Es difícil realizar una comparación de la capacidad diagnóstica de las numerosas pruebas de detección rápida comercializadas ya que son, muy distintas entre ellas. Los principios de acción más frecuentes en estas pruebas son la aglutinación, la inmunoconcentración (flow through), la inmunocromatografía (lateral flow) y la fase sólida (solid phase). El método de producción y de combinación específica de los antígenos varía entre las distintas pruebas de detección. La mayoría incluye uno o más antígenos del virus VIH-1 (gp41, gp120, gp160) y VIH-2 (gp36). Otros incorporan el antígeno core (p24). Actualmente, existe controversia en la duración del período ventana entre 3 ó 6 meses. En general, se recomienda el alta médica a los 6 meses después de una actividad de riesgo de infección. ■ PRUEBA DE INMUNOFIJACIÓN DE DOT-BLOT Prueba para la detección del VIH en la cual los antígenos virales se encuentran unidos a una membrana de nitrocelulosa dentro de un contenedor plástico. Los antígenos utilizados son recombinantes o sintéticos. Se utilizan conjugados de anti-inmunoglobulina ligados a una enzima que se fija al anticuerpo del paciente. La adición del sustrato permite la visualización del color en el papel. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores Su ventaja y principal indicación es la posibilidad de identificación entre los dos tipos de virus. Las pruebas son rápidas y fáciles de realizar, pero son costosas. Muchas producen resultados en 5 ó 15 minutos. TÉCNICAS DE INOCULACIÓN EN ANIMALES DE LABORATORIO Este fue el primer método que se utilizó para el aislamiento de virus, demostrándose la reacción positiva por la muerte y los cambios histológicos o clínicos. Existen factores negativos en el uso de animales de laboratorio: el confinamiento de los mismos de tal manera que no se pueda impedir una infección cruzada a otros animales y al personal de laboratorio, la presencia de enfermedades víricas latentes en los animales de experimentación que pueden activarse por el mismo trauma que supone la inoculación con la consiguiente interferencia a la hora de la interpretación de los resultados. Debe elegirse cuidadosamente el tipo y la edad del animal que va a utilizarse , así como la vía de inoculación, ya que cada especie tiene su propia sensibilidad y cada virus sus propios requerimientos respecto a un tipo de células .El animal más utilizado es el ratón de menos de dos días de edad especialmente como animal de rutina con fines diagnóstico siendo el que proporciona el principal método de aislamiento de los virus Coxsakie A. ► el ratón lactante se utiliza en virología para : ♦ Inocular por vía intracerebral (0,06 ml) : Herpes simple ♦ Inocular por vía subcutánea (0,06 ml) : infección por Coxsakie, Arbovirus y Reovirus ♦ Inocular por vía intradérmica (0,02ml) virus Coxsakie ► el ratón adulto se utiliza : ♦ Inocular por vía intracerebral (0,03ml) o intraperitoneal hasta 2 ml de encefalitis ♦ Inocular por vía intracerebral : rabia, coriomeningitis linfocitaria ♦ Inocular por vía intranasal ( 0,05 ml): Influenza A,B y C ♦ Inocular por vía intraperitoneal o intracerebral para obtención de inmunosueros. ► la cobaya se utiliza para : ♦ Inocular por vía intraperitoneal hasta 5 ml de coriomeningitis linfocitaria ♦ Inocular por vía intraperitoneal o intramuscular para obtención de inmunosueros hasta un ml. ► el conejo se utiliza para : ♦ Inocular por vía intradérmica Herpes tipo B ♦ Inocular por vía intradérmica para la obtención de vacunas ♦ Inocular por vía intravenosa hasta 2 ml o intramuscular hasta 2 ml o intraperitoneal hasta 2 ml para la obtención de inmunosueros. Materiales : jeringa con aguja de 1 ml, embudo de cristal, tubos de ensayo, algodón. Reactivos : alcohol etílico de 70º, éter etílico, solución de inoculación Técnica : a) Anestesiar al ratón con un algodón empapado de éter etílico colocado en el interior de un embudo invertido, introducir en él el ratón. b) rasurar la zona a inyectar e inyectar la solución de inoculación en el lugar de inoculación que puede ser: IC intracraneal, IM intramuscular, IN intranasal, SC subcutánea, ID intradérmica, IV intravenosa, IP intraperitoneal. Interpretación de los resultados: Se manifiesta la infección en el ratón, se observará ésta por la sintomatología , la muerte o la elevación del título de anticuerpos. Se observará durante dos o más semanas el animal inoculado Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores TÉCNICAS DE INOCULACIÓN EN EMBRIÓN DE POLLO Existen varios métodos de inoculación de huevos fértiles, dependiendo del virus que desea cultivarse. Una vez inoculados, los huevos se incuban a temperaturas entre 35 y 38ºC dependiendo del virus). Antes de proceder a la inoculación de un huevo debe limpiarse cuidadosamente su superficie con alcohol. ● Inoculación corio-alantoidea ♦ Edad del embrión : 10 a 12 días ♦ Método : Examinar el huevo en ovoscopio provisto de lámpara de 100 vatios. Ésta técnica llamada de iluminación permite apreciar los vasos sanguíneos del embrión, la cámara de aire con claridad a través de la cáscara. Con un lápiz se delimitar la cámara de aire así como también el punto en que el corio-alantoides es bien notorio y desarrollado. Practicar una cámara de aire artificial de la siguiente manera: a) Quitar un pequeño triángulo de cáscara de encima del corio-alantoides sin dañar la fárfara b) Utilizando una aguja de disección incidir cuidadosamente la fárfara sin dañar la membrana corio- alantoidea que está debajo. c) Realizar una pequeña abertura en la cámara de aire y valiéndose de un gotero realizar una succión suave en el agujero hecho anteriormente. La membrana corio-alantoidea se separa de la fárfara efectuándose entonces la inoculación a través de la hendidura de la misma. Sellar la abertura e incubar durante 2 a 4 días examinando diariamente ● Inoculación en saco amniótico ♦ Edad del embrión: 7 a 14 días ♦ Método Proceder como para la inoculación corio-alantoidea. Cuando la membrana corio-alantoidea aparezca se aumenta el tamaño del orificio .A través de la membrana corio-alantoidea y utilizando unas pinzas estériles se extrae una parte de la membrana amniótica. Inocular en la cavidad amniótica, sellar e incubar. ● Inoculación de saco alantoideo ♦ Edad del embrión : 10 días ♦ Método Se procede como en la inoculación corio alantoidea pero sin extraer la membrana. Inocular directamente en la cavidad alantoidea. Con el agujero realizado en la cámara de aire se evita el reflujo del inóculo motivado por la presión. Sellar e incubar. ● Inoculación en saco vitelino ♦ Edad del embrión: 3 a 8 días ♦ Método Tomado de Microbiología Granados 1 a edición Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores Se efectuará la inoculación directa a través de la cámara de aire, puesto que a la edad señalada el saco vitelino rellena casi por completo el huevo. Sellar e incubar. ♦ Examen Colocar el huevo en una placa de Petri, sobre algodón empapado en desinfectante. Utilizando tijeras y pinzas estériles eliminar la cáscara de encima de la cámara de aire. Extraer la membrana interna (fárfara) y colocarla en agua destilada estéril. Examinarla para apreciar lesiones. La identificación de virus aislados en huevos puede hacerse por técnicas de neutralización o de fijación del complemento con sueros específicos. Es posible neutralizar tanto el efecto particular producido por el virus como la formación de placas o muerte del embrión, como en el caso de los myxovirus, neutralizar o inhibir la propiedad de estos virus de aglutinar los hematíes. Las pruebas de fijación de complemento tienden a dar reacciones de grupo más que específicas de tipo. MATERIALES  Frascos para cultivos celulares con medio de cultivo de crecimiento EAGLE (20% de suero bovino fetal).  Láminas fijadas con efectos citopáticos de virus de la rabia  Microplacas para ELISA para VHA.  Prueba de ELISA rápida para VIH METODOLOGÍA  Observar los medios de cultivos usados para cultivo celular  Observar las laminas fijadas al microscopio y las pruebas de ELISA. Tomado de Manual de Técnicas de Microbiología Médica Baker Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores RESULTADOS: Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores DISCUSION: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… CONCLUSIONES: …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………… Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores Corpúsculo de Negri en Neuronas Virus de la Rabia Efecto citopático Sincitio (Células multinucleadas) Virus Sincitial Respiratorio Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores GLOSARIO Acido nucleico viral, puede ser ADN o ARN, consta de una sola cadena abierta o circular, monocatenario o bicatenario; se conoce como prófago. Bacteriófago, virus que infectan a las bacterias; se reproducen en cultivos de bacterias susceptibles. Cápside, constituida por la unión de proteínas globulares o capsómeros, protege al ácido nucleico; puede ser icosaédrica, helicoidal o compleja. Ciclo lítico, célula receptora + virus  fijación  penetración  replicación del ácido nucleico  síntesis de capsómeros  ensamblaje de los nuevos virus  lisis o liberación. Ciclo lisogénico, célula receptora + virus  fijación  penetración  prófago + ADN celular  síntesis de capsómeros  ensamblaje  célula lisógena: ADN viral + cromosoma bacteriano. Cuerpos de inclusión, estructuras intracelulares pueden ser agregados de virus en el interior de una célula afectada o acumulo anormales de material celular que se producen como consecuencia del trastorno metabólico inducido por el virus. Efecto citopático (ECP), cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de sincitios y existencia de cuerpos de inclusión. ELISA, abreviatura de análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas. Hemaglutinación, propiedad que permite detectar virus en cultivos celulares por aglutinación de eritrocitos. Inmunodeficiente, relativo a un trastorno del sistema inmunológico, en el que la inmunidad humoral o celular es infrecuente, y esta disminuida la resistencia. Inmunodiagnóstico, relativo o perteneciente a un diagnóstico basado en reacciones antigeno- anticuerpo. Inmunofluorescencia, técnica utilizada para identificar rápidamente un antígeno, exponiéndolo a los anticuerpos conocidos, marcados con fluoresceina y observando la característica reacción de precipitación antígeno-anticuerpo. Inmunoincopetencia, incapacidad para desarrollar una reacción inmunitaria al estimulo de los antígenos. Inmunocomprometido, relativo a una situación o sujeto caracterizado por que las respuestas inmunitarias esta debilitado por una infección o por un fármaco inmunosupresor. Respuesta inmunitaria, función defensiva del organismo con producción de anticuerpos para destruir antígenos y tumores invasores. Sincitio, acumulo de células que contienen mas de un núcleo. Transducción viral, es la transferencia de ADN de un huésped a otro, por un virus; ocasiona la resistencia a los antibióticos. Virus, son elementos genéticos extracromosómicos constituidos por un ácido nucleico y una cápsula proteica o cápside; en ocasiones puede presentar una envoltura membranosa; son específicos en cuanto a que huéspedes pueden infectar. A las partículas víricas se les denomina viriones. Viroides, filamentos sencillos de ARN, sin cápside; se replican dentro de células vivas, sus huéspedes son plantas. Manual de Prácticas de Microbiología FMH-USMP FILIAL NORTE José Huapaya Yaya, Martha Flórez Flores FUENTES DE INFORMACIÓN ■ Arenas R. Micología Médica Ilustrada.2ª edición.2005. Editorial Mc Graw Hill ■ Bailey & Scott. 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Prueba de detección rápida de la infección por VIH. AATRM Núm. 2007/3 ■ Cristhopher Donat’s Cruz Malpica. Estandarización de la prueba de Ensayo Inmunoenzimático para la detección de anticuerpos IgG en sueros humanos para el virus Phlebotomus fever. Tesis para optar el título de químico farmacéutico. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Facultad de farmacia y Bioquímica 2001 http://sisbib.unmsm.edu.pe/Bibvirtual/tesis/Salud/Cruz_M_C/generalidades.h tm ■ Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. 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