Ministerio de Medio Ambiente y AguaViceministerio de Recursos Hídricos y Riego Ministerio de Medio Ambiente y Agua Estado Plurinacional de Bolivia Guía para Ministerio de Medio Ambiente y Agua Viceministerio de Recursos Hídricos y Riego la evaluación Con el apoyo de: genotóxica de cuerpos de agua utilizando células de raíces de cebollines www.cuencasbolivia.org Calle: Héroes del Acre esquina Conchitas Nº 1778 Telf. (591-2) 2124484 – 2117391 Guía para la Evaluación Genotóxica en Cuerpos de Agua Utilizando Células de Raíces de Cebollines Autor Ministerio de Medio Ambiente y Agua (MMAyA) Edición y diseño Viceministerio de Recursos Hidricos y Riego (VRHR) Texto: Gloria Rodrigo Lira El presente documento fue elaborado en el marco del Programa Plurianual de Gestión Integrada de Recursos Hídricos y Manejo Integral de Cuencas 2013 – 2017 y su impresión fue posible gracias al apoyo de la Cooperación Suiza en Bolivia a través de HELVETAS Swiss Intercooperation, programa CONCERTAR miembro de GESTOR. Está permitida la reproducción del presente documento, siempre que se cite la fuente.. La Paz –Bolivia 2014 Contenido 1 Recordando la división celular 1 2 ¿Qué es genotoxicidad ? 5 3 ¿Cómo se evalúa genotoxicidad en cuerpos de agua? 11 4 Protocolo de evaluación 15 4.1 Reactivos y material 18 4.2 Procedimiento de muestreo 19 4.3 Medición de micronúcleos 22 4.4 Datos y cálculos 26 4.5 Interpretación de resultados 28 5 Glosario 30 6 Bibliografía consultada 31 . sugerencia y comentario que se pueda hacer llegar al VRHR para su incorporación en sus próximas ediciones con los reconocimientos que correspondan. control y monitoreo de la calidad de los cuerpos de agua. de la ley del Medio Ambiente (Ley 1333). por lo que será de mucho valor toda observación. monitores comunales. elaboró la presente cartilla que se espera pueda ser difundida y aplicada de manera efectiva y concreta por técnicos de medio ambiente de los gobiernos municipales y departamentales. en cumplimiento con los artículos 9. Carlos Ortuño Yáñez VICEMINISTRO DE RECURSOS HÍDRICOS Y RIEGO . el Ministerio de Medio Ambiente y Agua (MMAyA). Presentación Con el objetivo de facilitar la labor de vigilancia. Como resultado de su aplicación. a través del Viceministerio de Recursos Hídricos y Riego (VRHR). se espera que se pueda mejorar y ampliar el presente documento. Ing. empresas y cooperativas prestadoras de servicios de agua potable y saneamiento básico e instituciones u organizaciones involucradas y comprometidas con este tema. 10 y 11 del Reglamento en Materia de Contaminación Hídrica. . En especies unicelulares. cada división Protozoo de la célula única produce un nuevo organismo. Si la división celular se y órganos que cumplen diferentes funciones específicas detiene el individuo moriría en pocos días. algas. protozoos y las levaduras (Figura 1). la división celular es también necesa- Bacterias ria para reemplazar las células perdidas por su desgaste. como las bacterias. En cuerpos adultos. Organismos unicelulares 1 . hongos. y que se reproducen duplicando tanto su contenido nu- clear como el citoplasmático para luego dividirse en dos nuevas células. Alga En especies pluricelulares se requieren muchas secuen- cias de divisiones celulares para crear un nuevo individuo.1 Recordando la división celular Las plantas y los animales están formados por miles de millones de células individuales organizadas en tejidos nes de nuevas células cada segundo simplemente para mantener su estado de equilibrio. Figura 1. Un humano adulto debe producir muchos millo. Hongos deterioro o por muerte celular programada o envejeci- miento. que Las células germinales son las responsables de la forma- 1 La molécula de ADN (ácido desoxirribonucleico) tiene la estructura de una escalera formada por azúcares. Por lo tanto. el ADN1 y separar o dividir los cromosomas replicados Se componen de 23 pares de cromosomas2. entonces. Las células somáticas La gran mayoría de las células también doblan su masa que mutan pueden. Cada célula germinal es células somáticas. y cada gen tiene 2 Dentro del núcleo. La mitosis es la división celular asociada a las ciales denominadas gametos. formados por el una secuencia única de pares de bases. Los científicos utilizan estas secuencias para localizar la ADN y las proteínas presentes en el núcleo. unidos posición de los genes en los cromosomas y elaborar el mapa del genoma humano. se encuentran una célula debe realizar para replicar de manera exacta en los huesos. durante el ciclo celular un conjunto complejo de procesos citoplasmáti. ser la causa de dife- y duplican todos sus orgánulos citoplasmáticos en cada rentes tipos de cáncer. los tejidos. Los cromosomas son semejantes a dos brazos. ducción nuclear de cualquier célula que no sea germinal. la piel. fosfatos y cuatro bases nucleotídicas llamadas adenina (A). Las células en dos nuevas células distintas. La mitosis. es el proceso de división o repro- cos y nucleares tienen que coordinarse unos con otros. citosina (C) y ción de las células reproductoras o gametos. existen dos variantes Meiosis. Las células somáticas representan la diferente genéticamente por la recombinación genética totalidad de las células del organismo excepto las célu- que se da durante la meiosis. los órganos y la sangre. una de las estructuras más importantes son los cromosomas. ciclo o división celular. donde se ordena el ADN. De este modo.El ciclo celular comprende el conjunto de procesos que son el origen de los gametos. Dependiendo del tipo de célula. 2 . Se debe recordar que los organismos superio- en la división celular: la mitosis y la meiosis. En casi todos por el centrómero. las germinales o sexuales y las células embrionarias. situados en el núcleo de la célula. los esper- guanina (G). timina (T). sin embargo. los organismos celulares el ADN está organizado en forma de cromosomas. El código genético queda determinado por el orden de estas bases. res que se reproducen de forma sexual se forman a partir de la unión de dos células germinales o sexuales espe- Mitosis. somáticas pueden mutar sin transmitir sus modificacio- nes a los futuros descendientes. sólo se trans- ratos reproductores femenino y masculino. cada dividuo. divisiones sucesivas de una célula diploide acompañadas permite la obtención de cuatro células haploides (n) con por una sola división de sus cromosomas (Figura 2). de las parejas de la célula original. La meiosis consta de Las células germinales contienen toda la información dos divisiones sucesivas de la célula con una única réplica genética de un individuo y la transmiten al embrión. Estas células necesitan unirse que tienen el resto de las células del cuerpo. a partir de una célula diploide (2n).matozoides en los hombres y los óvulos en las mujeres. doble de cromosomas. es decir 23 cromosomas. la célu- lugar a un individuo humano completo. proceso ex. 46 cromosomas. La meiosis es un mecanismo de otra mitad del otro. Estas células están situadas en las gónadas de los apa. mosomas. El producto final son cuatro células con n cro- cluyendo eventuales mutaciones genéticas. para completar así la información para dar Cuando en la fecundación se unen dos gametos. in. entonces. fecundación. a diferencia de la mitosis. la resultante. Es decir. contiene toda la dotación Los gametos se originan mediante meiosis. llamada cigoto. que ocurre en el proceso de cromosomas. consiste en dos división celular que. Los gametos mite a cada célula nueva un cromosoma de cada una contienen la mitad de la información genética de un in. por lo que se dicen gameto contiene la mitad del número de cromosomas que son células haploides. La mi- clusivo de división de las células germinales o también lla. tad de estos cromosomas proceden de un progenitor y la madas células sexuales. 23 al gameto complementario. Por esta razón. La meiosis. En la meiosis. diferentes combinaciones de genes. 3 . del ADN. es decir. Produce una reducción del jue- Meiosis II terior se forman células genéti. 4 . 2n 2n 1n 1n 1n 1n A nivel orgánico Se da este tipo de división en Sirve para la formación de las Figura 2. en pluricelulares para su desa- rrollo. go de cromosomas a la mitad camente iguales. somáticas (mitosis) y células germinales o sexuales para su reproducción asexual y (meiosis). Meiosis I Mitosis A nivel celular 1n 1n Como consecuencia de lo an. Procesos de división del núcleo en células los organismos unicelulares células reproductoras sexuales. Tabla 1. exacta de los cromosomas ho- mólogos. crecimiento y la repara- ción y regeneración de tejidos y órganos. 2n 2n genético mosomas homólogos y entre- cruzamiento como fuente de variabilidad genética. Diferencias entre la mitosis y la meiosis Mitosis Meiosis 2n 2n A nivel genético Reparto exacto del material Segregación al azar de los cro. teratógenos5 .). como son las pro. es la molécula que dirige la síntesis de proteínas a partir de la información la vía hepática. físico o biológico qué actúa sobre los tejidos vivos. carcinogénesis y teratogénesis respectivamente. esta fracción contiene citosol y micro- 3 Agente químico. contenida en el ADN. originando efectos biológicos como una de las ramas de las ciencias biológicas encar- adversos en los seres vivos. extractos acuosos. gada de evaluar el daño causado en el ADN (Figura 3) por distintos tipos de exposición a potenciales agentes De acuerdo a su modo de acción o efectos que puede genotóxicos y que se evalúa a partir del monitoreo am- ocasionar se clasifican en mutágenos3. dando lugar a los procesos de mutagéne- sis. debido a que permite predecir el posible comportamiento del compuesto a evaluar en su paso por 6 Ácido ribonucleico. en bacterias que presentaban mutaciones en genes espe- El daño en el material genético se da en el ADN y en to- cíficos y el desarrollo de la fracción S98 para activación dos aquellos componentes celulares que se encuentran relacionados con la funcionalidad y comportamiento de 7 La prueba de Ames se utiliza en la evaluación de mutagenicidad de muestras problema (agua. químico o biológico de ocasionar un daño A objeto de sistematizar e interpretar estos fenómenos. aire. se desarrolló la Genética Toxicológica. teínas y el ARN6. conjunción con la prueba de Ames para evaluar el potencial mutagénico de compuestos químicos 5 Agente o sustancia que actúa sobre el embrión en desarrollo causando alteraciones morfo-fisiológicas. Las ratas utilizadas son de las líneas Sprague-Dawley y Wistar. 5 . Es considerada parte esencial de las los cromosomas dentro de la célula.2 ¿Qué es genotoxicidad? Genotoxicidad es la capacidad relativa que tiene un agente físico. pruebas toxicológicas para la detección y localización de fuentes que generen un daño potencial por la presencia de compuestos genotóxicos. Los primeros estudios llevados a cabo por Ames7. causando cáncer. físico o biológico capaz de causar daño al ADN somas. carcinógenos4 y biental y humano. etc. lixiviados de residuos sólidos. 8 Fracción sobrenadante obtenido del hígado de rata a partir de un homogeneizado por centrifu- gación a 9000 g durante 20 minutos en un medio adecuado. que se constituye en el material genético. La fracción S9 se utiliza en 4 Agente químico. animales de laboratorio.fosfato Figura 3. nadas carcinógenos genotóxicos. en experimentos con to de los oncogenes por activación de protooncogenes. taciones en el desarrollo del cáncer con el descubrimien- Copia mutada Adenina Timina Citosina Guanina Cadena azúcar . existen también otros carcinógenos no genotóxicos o epigenéticos que actúan En la década de los 80’s se confirma la función de las mu- por otros mecanismos.metabólica. Esquema del proceso de mutación en la cadena del ADN. permitió demostrar. que entre el 60 y el 90% de las Ahora se sabe que además de las sustancias denomi- sustancias carcinogénicas fueron mutagénicas. 6 . te cierto tiempo en un ecosistema mediante respuestas puestos tienen la capacidad de alterar el material ge. los organismos biológicos tienen genicidad. individuales o de conjunto. la capacidad de detectar cambios en la calidad del agua Por tanto.. los ensayos nético en los organismos y producir: malformaciones en o test biológicos se están transformando en herramien- el embrión o feto. influir en los procesos de envejecimiento y desarrollo de tumores permitió establecer la necesidad provocar mutaciones que pueden generar cáncer (Majer de evaluar el riesgo de carcinogenicidad por exposición et al. mutaciones en las células germinales tas valiosas para la evaluación del impacto ambiental ge- reduciendo la fertilidad. En este sentido. las pruebas para la detección de mutágenos y expresar las alteraciones más sutiles que operan duran- adquirieron su importancia debido a que estos com. arte. a sustancias químicas mediante la evaluación de muta- Según Fiskesjo (1985). 7 . nerado por los compuestos mutágenos. 2005).El descubrimiento de la relación entre mutagénesis y el rioesclerosis. enfermedades cardíacas. Mitocondria Citoesqueleto Núcleo Retículo Ribosomas endoplasmático Centriolo Membrana plasmática Citoplasma Peroxisoma Aparato de Golgi Nucleólo Figura 4. Célula eucariota animal 8 . Célula eucariota vegetal 9 . Citoesqueleto Aparato de Golgi Reticulo Endoplasmático Cloroplasto Núcleo Nucleolo Mitocondria Ribosomas Vacuola Citoplasma Membrana Plasmática Pared celular Figura 5. Telofase Anafase Metafase Interfase Profase Células de raiz de cebollin en diferentes estadios de división . es decir. se dispone de pruebas con las que se es cada día más evidente. de los 175 carcinógenos conocidos también son mutá- puestos genotóxicos. La correlación entre mutagenicidad y carcinogenicidad Actualmente. daños microscópicos o moleculares. Mediante estos ensayos se pueden determinar nuestro organismo o sobre otros seres vivos. se considera que este daño produce efectos he. redables y provocan la formación de tumores. y su eva- un compuesto químico se une a una molécula biológica. Se ha demostrado que 157 puede determinar un daño genético y así detectar com. con micro o macro orga. luación está limitada por la sensibilidad y especificidad como el ADN o a ciertas proteínas. General. complejos que se forman cuando requiere conocer el agente químico a verificar. sino que se debe mente. o bien la formación El monitoreo de los contaminantes por análisis directo de aductos. De ahí la conveniencia de saber con precisión bioquímicas.3 ¿Cómo se evalúa genotoxicidad en cuerpos de agua? Los ensayos de genotoxicidad están diseñados para de. el posible daño que un compuesto puede tener sobre nismos. Muchas de estas pruebas son genos. Para detectar con exactitud o predecir confiablemente tectar compuestos que inducen directa o indirectamente los efectos genotóxicos de una sustancia en el ser hu- a daños genéticos por diferentes mecanismos. mano no es suficiente una sola prueba. disponer de por lo menos dos o más alternativas. in vivo o in vitro. del método utilizado 11 . el mismo que ha mos. Ante esto. El procedimien. ser aún más tóxico que el original. peces (Minissi et al. to se describe en una serie de documentos de principios 1999. el test de Ames es utilizado mundialmente como bles debido a que un organismo puede metabolizar un un ensayo inicial para discriminar nuevos químicos y fár- compuesto cualquiera y convertirlo en otro que puede macos por su potencial mutagénico. a nivel mundial. las agencias reguladoras do que pueden inducir daño genético en mamíferos y de medio ambiente exigen una batería o conjunto es. 1999) de 1970. sentido.. to mutagénico de estas aguas y sus sedimentos puede torización para liberar productos de consumo humano. plantas y potabilización requiere de cloro. Majer et al. El efec- tándar de estudios de genotoxicidad antes de dar au. El protocolo mejorado para micronúcleos en raíces de La batería estándar para determinar genotoxicidad inclu. Vicia y Allium (raíces de habas y cebollas) fue establecido ye el llamado test de Ames. los bioensayos ofrecen ventajas considera. (haba) es el más sensible para agentes aneugénicos y tarse y son caras de realizar. gación de la Universidad de California. Berkeley.. En varios estudios. 12 . escritos por Bruce Ames y su grupo de investi- Entre los diferentes ensayos citogenéticos en plantas. En este el test de micronúcleos (MCN) en raíces de Vicia faba 9 Las pruebas estándar para la carcinogenicidad hechas sobre roedores toman años para comple. las aguas contaminadas han mostra- Actualmente. ser evaluado bajo condiciones de laboratorio usando entre ellos el agua potable debido a que el proceso de sistemas biológicos como bacterias. que es un ensayo biológico como un ensayo estándar internacional por el Interna- rápido utilizado para determinar el potencial mutagénico tional Program on Plant Bioassays bajo el auspicio del y cancerígeno de compuestos químicos9. trado ser mutagénico en diferentes ensayos. 1997). organismos acuáticos (Minissi y Lombardi. Programa Ambiental de las Naciones Unidas (Ji et al.. levaduras. 1996). Cebollines (Allium cepa) paludosa) 13 .. En China el test de MCN en Vicia faba (haba) es rina o amor de hombre) y Allium cepa (cebolla) debido un método estándar en monitoreo ambiental (Kong et a que resultaron ser bioindicadores altamente sensibles. además de ser simple. fáciles de aplicar en diferentes situaciones empleando procedimientos y protocolos sencillos y de bajo costo. en este tipo de ensayos con MCN también condiciones mínimas de laboratorio (Minassi y Lombardi. al. Figura 6.clastogénicos. barato y requerir Sin embargo. 1998). Plantines de purpurina (Tradescantia Figura 7. puede utilizarse raíces de Tradescantia paludosa (purpu- 1997). Figura 8. Cebollines en proceso de ensayo . 11 La mitosis es la división de la célula en la que. Sin embargo. Tales núcleos anafase de la mitosis12 donde el fragmento cromosó.6 micras. célula hija recibe una dotación completa de cromosomas. el huso se desmonta porque el compuesto estudiado es un clastógeno. previa duplicación del material genético. los Los micronúcleos son conocidos. gen a los núcleos de las células hijas. al. elementos rezagados. así sustancias químicas. 2010). en la telofase.4 Protocolo de evaluación Los micronúcleos son fragmentos de cromosomas o cro- mosomas completos que. Su formación ocurre en la ma en uno o varios núcleos secundarios. fármacos y otros conta- como los fragmentos que posean centrómeros. plaguicidas. Luego. Después de la división. grandes (Terradaset.4 a 1. Si que recibe el nombre de huso acromático. lo que permite que cada una de las cromátidas lo que se observará será la formación de micronúcleos idénticas que formaban el par se separen (cromosomas hijos) y se dirijan a los dos polos de la célula arrastradas por los microtúbulos del huso mitótico. la mitosis11. espontáneamente o por cau- mico que no posea centrómero o el cromosoma des- orientado no podrá integrarse a un núcleo por carecer sa de agentes que rompen cromosomas o que alteran del elemento indispensable para orientarse en el huso el huso10 de división. en el campo de la he. quedan incluidos en el citoplasma generalmente redonda u ovalada. Entre estos agentes están las radiaciones. son mucho más pequeños que el núcleo principal. se formarán no es necesario. Su forma es mosomas completos. pero si es un aneuploidógeno. los centrómeros se dividen. 12 Durante la anafase. los cromosomas normales. 15 . de 10 Durante la división celular se forma una estructura especial para desplazar a los cromosomas ahí su nombre de micronúcleos (Figura 9. con un diámetro que de las células hijas y una proporción de ellos se transfor- varía desde 0. dan ori- minantes ambientales. quedan fuera del núcleo durante acromático. como cuerpos de Howell-Jolly. que pueden ser fragmentos o cro- matología. cada micronúcleos pequeños. Figura 10). en células vegetales. división celular persisten al menos durante la siguiente interfase. las más utili- zadas son las células meióticas de la purpurina ó amor de hombre y las células meristemáticas de cebolla y haba. pero debe conside. toquímicas que el núcleo principal. Los micronúcleos son núcleos citoplasmáticos redondos - La posibilidad de probar mezclas o y de tamaños variables con las mismas características his- muestras complejas en su composición. cultivos de linfocitos de sangre periférica. células de la mucosa bucal. eritrocitos policromáticos de la médula ósea. pues lo que se observa como micro- núcleos es claramente una pérdida de ADN. Como se indicó antes. la prueba no deja lugar a dudas sobre proyecciones del núcleo normal. el daño producido. pero están envueltos dentro de un pedazo separado de membrana nuclear. eritrocitos en peces y aves. - La abundancia de células analizables en diferentes periodos del ciclo celular y el Para la realización de esta prueba es indispensable utili. hepatocitos de rata. La prueba se realiza en diferentes tipos celulares como: 16 . Formación de núcleos y micronúcleos a partir de una célula madre - La posibilidad de probar un sólo agente o sustancia química sin otros compuestos. rarse que en las células con poco citoplasma los micro- núcleos no son fácilmente distinguibles de los lóbulos o Adicionalmente. que los micronúcleos formados durante la zar un tejido en constante división. Como ventajas de la técnica de micronúcleos están: Figura 9. rezagos anafásicos. Formación de micronúcleos en raíces de habas (Vicia faba) que fueron germinados en aguas con arsénico.Entre las principales desventajas están: - La prueba no detecta agentes que no - Tampoco es útil en poblaciones celulares producen pérdidas de material genético o que no se dividen. y Figura 10. 17 . Reactivos requeridos para uno a diez ensayos Lápiz negro con goma 1u Reactivos Cantidad Marcador indeleble 1 u Ácido acético 99% 100 mL Masking de 1 pulgada 1u Microscopio con objetivos 4x a 120x 1u Solución de ácido clorhídrico 1 N 50 mL Pinza metálica de punta fina 1u Etanol 70% 500 mL Piseta para agua de 500 mL 1u Solución Etanol: ácido acético (3:1) 100 mL Portaobjetos 1 caja 50 u H2O hervida de grifo 1 000 mL Probeta de 100 mL 3u Recipiente plástico de 5 L 1 u* H2O destilada 1 000 mL Servilletas de papel o papel filtro rápido 1u Solución de orceína13 acética 45% 50 mL Tubos de ensayo de boca ancha 40 u Vaso de precipitados de 250 mL 7u Colorante de color rojo violáceo. Gradilla para tubos largos 1u Jarra plástica de 1 L 1u Tabla 2. Contómetro o contador de células 1u *Material requerido por muestra a ensayar 18 . Tabla 3. Sin embargo.1 Reactivos y material Los reactivos y material requeridos para el ensayo de una muestra se presentan en las Tablas 2 y 3.4. Material requerido Material Bisturí o gillete Cantidad 3u éstos pueden ser utilizados hasta para 10 muestras. extraído de líquenes y que tiñe con preferencia núcleos y cro- 13 Viales o frascos de 5 mL con tapa 10 u mosomas. con Copas de coctel de 100 mL 24 u* excepción de los recipientes para la toma de muestras y Cubreobjetos 1 caja 100 u las copas de coctel. f) La parte interna de los frascos no debe c) Se debe tomar un volumen suficiente ser tocada con la mano ni debe quedar de muestra. salvo cuando se trate evitar riesgos de contaminación.4. corriente (Figura 11). estas de muestras de sedimentos. se recomienda entre 2 a 3 expuesta al polvo. se puede usar servilletas de papel.. determinaciones deben realizarse en deben ser filtradas para la realización de los alícuotas de muestras separadas de las que ensayos o determinaciones. desechos. d) Se debe realizar todas las determinaciones a) Las muestras no deben incluir partículas posibles de campo. temperatura y conductividad. Es b) Para minimizar la contaminación de la importante recordar que en gran parte de muestra. 19 . como las mediciones grandes. humo u otras impurezas. Para material accidental. Si no hubiera serán enviadas al laboratorio. 2009. Además. papel filtro.2 siguientes precauciones14: Procedimiento de muestreo Durante el muestreo de agua se recomienda tomar las litros para eventuales necesidades de repeticiones. hojas u otro tipo de de pH. 14 Litter et al. e) Se deben limpiar muy bien los frascos y demás materiales de recolección. conviene recogerla con la boca los casos la contaminación de los frascos del frasco en la misma dirección de la no es visible ni siquiera al microscopio. colecciones. g) Las personas encargadas de la recolección para evaluar el grado de contaminación o de muestras deben mantener las manos asimilación de carga orgánica a lo largo del limpias y usar guantes. con la inclusión opcional de puntos adicionales - Dilución al 50%. j) Se debe mantener un registro de toda la información de campo. no debe añadirse sal al hielo de - Profundidad de los niveles estático y dinámico. Entre luz solar. refrigeración. h) Los frascos deben ser llenados completa. Para esto se deberá - Profundidad del ranurado. de las fuentes de contaminación. traslado al laboratorio (Figura 12). para la preservación en su - Tiempo de bombeo. 20 . l) En el caso de aguas subterráneas. la muestra de agua debe evaluarse considerando las si- k) El muestreo en pequeños cursos de agua guientes proporciones de dilución: debe hacerse aguas arriba y aguas debajo - Sin dilución (100% la muestra). los datos que se deberán registrar están: i) En lo posible. muestras. llenar una ficha de recolección por muestra o conjunto de muestras de las mismas Para determinar si existe una relación de dosis – efecto. las muestras deben ser refrigeradas en cajas - Profundidades de donde se realizaron las re- de poliestireno de manera inmediata. deben mente y de manera rápida con la muestra y considerarse protocolos específicos para luego resguardadas fuera del alcance de la evitar la alteración de las muestras. etc. tramo en estudio. características. - Tipo de bomba. Para evitar posible contaminación de las - Profundidad del pozo. - Dilución al 6. Toma de muestra para ensayos. Las diluciones pueden realizarse con agua hervida de - Dilución al 12. y grifo o agua destilada.25%. - Dilución al 25%. la misma que deberá utilizarse también para el control negativo o blanco. Figura 12. Lectura de micronúcleos en microscopios. 21 . Figura 11.55%. asegurándose hacerse 3 réplicas para facilitar luego la aplicación de que la zona radicular quede en contacto con el agua (Figura 14). guiente secuencia de acciones: 22 . 20 del cebollín y finalmente cortar las hojas para el control positivo (muestra sin dilución) y 20 para dejándolas con unos 5 a 7 cm de longitud (Figura 13). Se debe evitar lastimar la cofia o da bulbos con diámetro de 1 cm. se inhibiría el crecimiento radicular. De usarse cabezas de cebollas más tocando la base o fondo del vaso porque grandes. Luego se rá considerarse un número de 140 bulbos. Se puede insertar y sujetar los 10 tallos con Para proceder con los ensayos se deberá seguir la si- palitos mondadientes. cada una de las diluciones de la muestra (80 bulbos). pero nunca análisis estadístico. 2) En vasos de precipitados o en copas de coctel con agua hervida de grifo o En cada caso deberán realizarse 2 réplicas de 10 bul.3 Medición de micronúcleos Para el ensayo con bulbos de Allium cepa (cebollines). Se recomien. también puede debe colocar 10 bulbos. se debe seleccionar el número necesario o suficiente de 1) Preparación de cebollines: Con un estilete u cuchillo muy fino. destilada (2 réplicas por tratamiento). Los restantes 20 servirán para reemplazar algún imprevisto. Mínimamente debe. se bos cada una. de la zona radicular se bulbos con el mismo tamaño y apariencia. 20 para el debe retirar la cascara externa de la cabeza control negativo o blanco (agua de grifo o destilada).4. Si se ve por conveniente. tres son suficientes por tratamiento. lugar de nacimiento de las raíces. debe quitar o cortar con cuidado todas las raíces. 5%. lavarlos agua hervida de grifo con agua hervida de grifo y colocarlos en 23 . sacar el Figura 14.5 cm. según el crecimiento de las raíces (en invierno estas suelen crecer más lentamente). 12. por 48-72 horas hasta que las raíces alcancen una longitud de 1 – 1. 50% y 100%. la muestra de agua que se está evaluando (control negativo. 25%. Cebollines preparados para ser ensayados 3) Dejar reposar en esta agua. 6.25%. 4) Al segundo o tercer día. Figura 13. si fuera necesario también en control positivo) todo por duplicado o triplicado). a temperatura ambiente. Bulbos de cebollines en manojo de cebollines del agua. tapar y dejar en baño raíces. un papel cebolla con el nombre horas. Se 10 a 15 minutos. pueden las raíces como color. Anotar en el reporte este dato de de la muestra. Se debe de la raíz y eliminar el resto. 8) A las 22 horas se debe cambiar las raíces colectadas a otro vial con etanol al 70% 12) Añadir una gota de orceína acética y dejar y rotular cada muestra con cuidado. en un tubo con solución de ácido terminación. de manera transversal en forma de micro rodajas. fecha. con agua hervida de grifo o destilada y observar inicialmente las características de 9) Colocar unas cuantas raíces. sacar el manojo de preparadas se pueden guardar hasta tres cebollines de las muestras de agua. 24 . Si se seca. cebollines de cada tratamiento en viales con tapa conteniendo la solución de 10) Sacar 1 a 2 raíces sobre un portaobjetos. con lápiz negro. lavar meses en refrigeración. 5) Dejar el ensayo corriendo por 24 o 48 las raíces. escrito tiempo. Se debe contar y medir las clorhídrico (HCl) 1 N. junto con orceína acética. grosor y forma de la ser 5. etanol: ácido acético 3:1. Se puede utilizar cortar aproximadamente los 3 mm finales también botellitas de antibióticos. con baño María. La muestras así 6) A las 24 o 48 horas. lo más finamente posible. guardarlos por un máximo de 22 horas para que se fijen y detengan los procesos 11) Cortar las raíces con el gillete o bisturí. metabólicos. etc. Se debe cuidar que el vial no 7) Cortar y colectar las raíces de los 20 se abra cuando está en el baño María. se puede usar un vaso con agua hervida. añadir más puede colocar dentro del vial. reportar los datos en una tabla para María de 3 a 5 minutos. Si no se cuenta procesarlos. código. Estas raíces están listas para evaluar micronúcleos. 15) Reportar las células que contengan uno o 14) Observar al microscopio. contar Figura 15. Células binucleadas presentando más de 3 micronúcleos 25 . Esta acción debe temente y repiquetear con la goma de un realizarse por duplicado. 1 000 células por placa. presionar fuer. 13) Tapar con un cubreobjetos. lápiz. donde las células estén dispersas. ubicar campos más micronúcleos (Figura 15). Célula con núcleo y micronúcleo núcleo principal. identificado. 6) Debe estar claramente separado del Figura 16.4. 5) No debe presentar refringencias (núcleos o partes de núcleos brillosos). 2) Debe tener una forma redonda u ovalada. de micronúcleos de las células debe cumplir con los si. textura y retrac- ción que el núcleo principal.4 Datos y cálculos El recuento de micronúcleos se realiza en microscopio binocular con el objetivo de 40X. 4) Debe tener el mismo color. 3) Su diámetro debe estar entre 1/16 y 1/3 de los núcleos principales. 8) El micronúcleo dudoso será descartado en guientes requisitos (Fenech 2000. 26 . El criterio para análisis 7) No debe estar sobrepuesto a ninguno de los núcleos. 1) Debe tener morfología idéntica a los núcleos principales. Figura 16): el análisis. que se aplica para determinar la diferen- evento al azar. cia significativa entre medias del control y los grupos de La frecuencia de Micronúcleos (MCN %) se calcula como tratamiento (Duan et al. Esto para dis. sigue: MCN%= Número de células con micronucleos Número total de celulas contadas x 100 Interpretación de 27 . 1999). Asimismo. grupo experimental. así como el cálculo de la varianza minuir la probabilidad de que la presencia de todos los tratamientos. se puede utilizar el de los micronúcleos se pudiese deber a un t-test Dunnett. 9) Cuando la frecuencia de micronúcleos sea Para el análisis estadístico se puede hacer uso de Micro- menor de 3/1 000 (0.3%) se deberá evaluar soft Excel y determinar medias y error estándar en cada un máximo de 3 000 células. 4. MCN muestra < 2MCN blanco => No tiene riesgo genotóxico MCN muestra ≥ 2MCN blanco => Tiene riesgo genotóxico La Figura 17 muestra parte de los resultados con células de raíces de haba (Vicia faba) y la Figura 18 resultados Los resultados son considerados negativos cuando no con raíces de cebollines (Allium cepa). igual o mayor al doble de los formadas en el ensayo en blanco. En este entendido. se dirá que el agua tiene riesgos genotóxicos. 28 . si el número de formados en el grupo de control negativo o blanco.5 Resultados Los resultados son considerados positivos cuando se observa un aumento significativo en la frecuencia de hay un aumento significativo en la presencia de micronú- cleos. Es decir. si en el agua evaluada el número de mi- células con micronúcleos respecto al grupo de control cronúcleos formados es menor al doble de micronúcleos negativo o blanco. se micronúcleos (MCN) formados en el agua evaluada es dirá que el agua no tiene riesgos genotóxicos. Micronúcleos desarrollados en ensayos con Figura 18. células de raíces de Allium cepa (cebolla). 29 . Micronúcleos desarrollados en ensayos con células de raíces de Vicia faba (haba).Figura 17. pérdida o reor. pero la mayor parte radiación o por errores durante la replicación y la repa- de los cancerígenos son genotóxicos. se denominan carcinógenos. Mutágenos: Un agente químico. como la vincristina (aneuploidógenos). mutaciones que pueden o no Mutación: Alteración en la secuencia de ADN.5 Glosario Aneugénicos: Agente capaz de producir en la célula que uno o más cromosomas completos de un conjunto Mutagenicidad: Propiedad de agentes físicos o quími- cos de inducir cambios en el material genético que se normal falten o se presenten más de una vez. o actuar indirectamente mediante la afectación de las quedan fuera del núcleo durante la mitosis. mas completos que espontáneamente o por causa de agentes que rompen cromosomas. por son necesariamente cancerígenas. ganancia. Puede desembocar en un cáncer. físico o biológico que somas y/o consecuentemente. Cuando numerosas mutaciones causan Micronúcleos: Fragmentos de cromosomas o cromoso- cáncer. como las radiaciones Genotóxico: Tóxico o dañino para el ADN. transmiten durante la división celular. Entre sus consecuencias están las enfer- medades genéticas y el cáncer. Las sustancias genotóxicas no ser causado por daños producidos por químicos. enzimas involucradas en la replicación del ADN y cau- sando. en consecuencia. . ración del ADN. altera o cambia la información genética de un organis- denamiento de los fragmentos cromosómicos mo y causa un incremento en la frecuencia de mutacio- nes espontanea. Clastogénicos: Agente que causa rotura de los cromo. Las sustan- (agentes que se denominan clastógenos) o que dañan cias genotóxicas pueden unirse directamente al ADN el huso mitótico. Muta. Arreola Duan CQ. Capítulo ción de arsénico en aguas y suelos... 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