OAA Organismo Argentino de AcreditaciónGUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Página 1 de 17 Código: DC-LE-08 Versión: 1 Fecha de entrada en vigencia: 08-julio-2011 TÍTULO: GUÍA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS RESUMEN: Este documento describe las actividades para la validación de Métodos de Ensayo Microbiológicos que soliciten su acreditación ante el Organismo Argentino de Acreditación. Este documento se distribuye como copia no controlada. Debe confirmarse su vigencia antes de hacer uso de esta versión, por si ha sido modificada. ...... 3 3. 17 ......... OBJETIVO ..... 16 7..1..... 4 5............. Expresión de la Incertidumbre de medición en los informes de ensayo ............................. Anexo I ...................................2...................... ALCANCE ............. Estimación de la incertidumbre de medición ................. Validación de los métodos.......... 16 8.................................. 14 6............................................................................................... 8 6............... 8 6............................. Requisitos generales para las actividades de validación y para la estimación de la incertidumbre de medición.....3.......Parámetros de validación y expresiones para su cálculo .....4... DOCUMENTACIÓN DE REFERENCIA ... 10 6...... ABREVIA TURAS Y DEFINICIONES ........................................................................................................................................... RESPONSABILIDADES ............................................................................................................................................................................................................. DESCRIPCIÓN ................................ DOCUMENTACIÓN RELACIONADA ........................................................... 8 6.OAA Organismo Argentino de Acreditación GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Página 2 de 17 Código: DC-LE-08 Versión: 1 Fecha de entrada en vigencia: 08-julio-2011 1...................................... 3 2..... 3 4... General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture. Norma ISO 16140: 2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs -Guidelines on preparation and production of culture media -. Norma ISO 17994 vigente. Water quality -. 3. 3. OBJETIVO Establecer una guía para la validación de métodos de ensayo no normalizados. Establecer los principios y los requisitos para la evaluación de la incertidumbre de medida en los ensayos y para la expresión de dicha incertidumbre. DOCUMENTACIÓN DE REFERENCIA 3. y los evaluadores y expertos técnicos que actúan en los procesos de acreditación.8. Measurement uncertainty for low counts. 3. 2. Norma ISO 5725-3 vigente. Norma ISO 8199 vigente. 3. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results -.6.10. a muestras ambientales en el ámbito de la producción y manipulación de alimentos y.3. 3.9. ALCANCE Esta guía la deben aplicar los laboratorios de ensayo acreditados ante el OAA. Esta guía está dirigida a Laboratorios que realizan ensayos microbiológicos utilizados en el análisis de agua y de alimentos destinados al consumo humano y la alimentación animal. Norma IRAM 301 vigente (ISO/IEC 17025: vigente). ampliaciones y modificaciones de los métodos normalizados y para las verificaciones necesarias para confirmar que puede aplicar correctamente los métodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos.Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media . ISO/TS 19036:2006/Amd 1:2009. en productos farmacéuticos o cosméticos. 3. Sistemas de Gestión de la Calidad . 3. Water quality -. Norma ISO 11133-2 vigente.Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method.Part 3: Intermediate measures of the precision of a standard measurement method 3. Water quality .Guidance on validation of microbiological methods. Norma ISO 5725-2 vigente. 3. 3. Norma ISO 9000 vigente. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol for the validation of alternative methods. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations.Fundamentos y vocabulario. métodos normalizados empleados fuera del alcance previsto.Criteria for establishing equivalence between microbiological methods.4. Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo / calibración. Norma ISO/TR 13843 vigente.1. los laboratorios que solicitan su acreditación. Norma ISO/TS 19036:2006.2.OAA Organismo Argentino de Acreditación GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Página 3 de 17 Código: DC-LE-08 Versión: 1 Fecha de entrada en vigencia: 08-julio-2011 1. desarrollados o diseñados por el Laboratorio.5.7. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results -. EA Guide EA-04/10: 2002. En el caso de métodos microbiológicos esto es el microorganismo sus componentes o productos asociados (enzimas o toxinas) (3. ABREVIATURAS .11) Especificidad: (para un tipo de matriz y un nivel de inoculación dado): Fracción del número total de cultivos o colonias negativos que son asignados correctamente con el método utilizado (3.2. Nota: Es la combinación de la precisión y la veracidad. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA) vigente. NMKL/NordVal. 3. Editor: H. The Microbiology of Drinking Water (2002) .4). AOAC INTERNATIONAL Methods Committee Guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis. .ISO: International Standardization Organization .14. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. Standing Committee of Analysts.18. JCGM 200:2008 Corrigendum. . 4.11. AOAC INTERNATIONAL Presidential Task Force on Best Microbiological Methodology. Exactitud de medida: proximidad entre un valor medido y un valor verdadero de un mensurando (3.12.17. BPMM Task Force Final Report 8-7-06. . Environment Agency.16. 3. 85. Holcombe. May 2010. Journal of AOAC Int. LGC.NMKL: Nordic Committee on Food Analysis 4.EA: European co-operation for Accreditation. Accreditation for Laboratories Performing Microbiological Testing.1. Vocabulario Internacional de Metrología . si este no está presente. y términos asociados (VIM). Practices for 3.2009 3. 3.AOAC: Association of Analytical Communities. Protocol for the validation of alternative microbiological methods.IRAM: Instituto Argentino de Normalización. . Teddington: 1998. Nota: También puede definirse como la capacidad de un método de no detectar el microorganismo diana. DEFINICIONES Analito: componente medido por el método de análisis. Oficina Internacional de Pesos y Medidas (BIPM). La exactitud en los ensayos microbiológicos. pueden determinarse mediante los resultados obtenidos en los interlaboratorios (que dan una idea de precisión) y mediante el análisis de un material de referencia certificado (que da una indicación de la veracidad). Vol. The Fitness for Purpose of Analytical Methods.15). JCGM 200:2008.Conceptos fundamentales y generales. ABREVIA TURAS Y DEFINICIONES 4.13. Methods for the Examination of Waters and Associated Materials. 2002 3. No 5.OAA Organismo Argentino de Acreditación GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Página 4 de 17 Código: DC-LE-08 Versión: 1 Fecha de entrada en vigencia: 08-julio-2011 3. EURACHEM Guide.Part 3 Practices and procedures for laboratories 3.15. Incertidumbre estándar.13). Sin embargo. Incertidumbre expandida (U): cantidad que define a un intervalo en torno al resultado de una medición que puede esperarse que incluya una fracción grande de la distribución de los valores que pueden atribuirse razonablemente al mensurando (3. Límite de detección: aplicado a ensayos microbiológicos cualitativos.3). de una medición cuando ese resultado es obtenido a partir de valores de otras cantidades. es el número mínimo de microorganismos dentro de una variabilidad definida que puede determinarse en las condiciones experimentales del método evaluado (3. por ejemplo. en un método alternativo.OAA Organismo Argentino de Acreditación GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Página 5 de 17 Código: DC-LE-08 Versión: 1 Fecha de entrada en vigencia: 08-julio-2011 Exactitud relativa: Grado de concordancia entre los resultados del método evaluado y los obtenidos utilizando un método de referencia reconocido (3. o la mitad de un intervalo de un nivel de confianza determinado. las varianzas o covarianzas de esas cantidades divididas por los resultados de esas mediciones (3.5). La inclusividad es el rango de cepas que refleja la diversidad genética y / o serológica del microorganismo diana que el método puede detectar. Inclusividad/ Exclusividad: inclusividad es la capacidad de un método alternativo de detectar el microorganismo diana a partir de un amplio rango de cepas. se hace necesario la duplicación de las muestras.5). es decir aquellos que pueden presentar reacciones cruzadas con el microorganismo diana. pero en cantidades que no pueden estimarse con precisión (3. La inclusividad y la exclusividad se determinan sobre un amplio rango de cultivos puros de cepas diana y no . Nota: La exclusividad expresa la capacidad del método de no detectar a los microorganismos no . que es igual a la raíz cuadrada positiva de la suma de los términos.5). uc (y): incertidumbre estándar de un resultado. siendo estos términos. Factor de cobertura (k): factor numérico utilizado como multiplicador de la incertidumbre de medida para obtener una incertidumbre expandida de medición.diana. La inclusividad/exclusividad da una medida de la selectividad del método. mientras que la sensibilidad/especificidad se determinan en matrices contaminadas.5).13). (3.5). Este requisito no es aplicable al recuento total de microorganismos viables. es el número mínimo de microorganismos que pueden ser detectados. que caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente atribuidos al mensurando (3. y. Límite de cuantificación: aplicado a ensayos microbiológicos cuantitativos. recuento de hongos y levaduras o métodos de enumeración que no están dirigidos contra microorganismos específicos. Nota: El parámetro puede ser. Nota: Típicamente su valor se encuentra entre 2 y 3 Incertidumbre de medida: Parámetro. . asociado al resultado de una medición. cuando se utilizan diferentes pre-enriquecimientos.3). u (xi): incertidumbre del resultado xi de una medición expresada como una desviación estándar (3. a partir de un rango amplio de cepas nodiana (3. una desviación estándar (o un múltiplo de ella).diana. Nota: En lo posible deben utilizarse muestras idénticas. Incertidumbre combinada. Exclusividad es la falta de interferencia. en las legislaciones nacionales y ciertas normas nacionales de calidad equivalente). Repetibilidad: precisión de medida bajo un conjunto de condiciones de repetibilidad. como ufc por la unidad de cantidad de muestra (ufc/ml ó ufc/g). conviene que toda especificación relativa a las condiciones incluya las condiciones que involucren variaciones y las que no. Método de referencia: método internacionalmente reconocido y ampliamente aceptado (3. o de objetos similares. Método alternativo: método de análisis que demuestra o estima. En la práctica. impedancia. Rango de validación: rango de número medio de partículas por porción analítica para el cual las expectativas de las especificaciones de validación (en particular linealidad)han sido aceptablemente demostradas. métodos que se indican en la Unión Europea. (3. Las “condiciones especificadas” pueden ser condiciones de repetibilidad. el mensurando puede ser el resultado obtenido a partir del recuento de colonias. etc. luego que se han seguido todos los pasos especificados en el método de ensayo. absorbancia. (3. Las variaciones pueden comprender nuevas calibraciones. Método cualitativo: método de análisis cuya respuesta es la presencia o ausencia del analito. la varianza o el coeficiente de variación bajo las condiciones especificadas.3).15).3). Nota: por lo general se expresa como el rango de recuento de colonias “confiable” (3. Nota: (por ejemplo. métodos de AOAC Internacional. Mensurando: magnitud que se desea medir (3. Precisión de medida: proximidad entre las indicaciones o los valores medidos obtenidos en mediciones repetidas de un mismo objeto. Puede expresarse. el mismo analito que se mide utilizando el correspondiente método de referencia (3.4). Nota: Este conjunto de condiciones incluye el mismo procedimiento de medición. operadores y sistemas de medida. o condiciones de reproducibilidad Precisión intermedia: precisión de medida bajo un conjunto de condiciones de precisión intermedia. pero que puede incluir otras condiciones que involucren variaciones. condiciones de precisión intermedia. patrones. CEN. detectado de forma directa o indirecta en una cierta cantidad de muestra. por ejemplo. el mismo lugar y mediciones repetidas del mismo objeto u objetos similares durante un periodo amplio de tiempo. o indirecta (color. Ejemplo: en la determinación cuantitativa de Listeria en leche.15).3). (3. Método cuantitativo: método de análisis cuya respuesta es la cantidad del analito medido de forma directa (enumeración en masa o volumen). Nota: Es habitual que la precisión de una medida se exprese numéricamente mediante medidas de dispersión tales como la desviación típica.15). Nota: En microbiología el mensurando es definido en términos del método empleado.) en una cierta cantidad de muestra (3. NMKL. Representa el nivel más bajo validado con una precisión satisfactoria. ISO.3). para una dada categoría de productos. bajo condiciones especificadas. (3.OAA Organismo Argentino de Acreditación GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Página 6 de 17 Código: DC-LE-08 Versión: 1 Fecha de entrada en vigencia: 08-julio-2011 Nota: También se lo denomina límite de determinación.15). . Validación: Confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos para una utilización o aplicación específica prevista (3. pH. sistemas de medida y mediciones repetidas de los mismos objetos u objetos similares. La veracidad se expresa habitualmente en términos de sesgo o bias. Veracidad: proximidad entre la media de un número infinito de valores medidos repetidos y un valor de referencia (3. Reproducibilidad: precisión reproducibilidad (3. Los diferentes sistemas de medición pueden utilizar diferentes procedimientos de medida. Robustez: capacidad de un método para mantenerse sin cambios ante pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método. Nota: El verdadero valor de una cantidad es un concepto teórico y. conviene que toda especificación relativa a las condiciones incluya las condiciones que varían y las que no. La incidencia de falsos negativos es igual a 1 menos la sensibilidad (3. calidad y vida útil de medios de cultivo y reactivos. así como mediciones repetidas del mismo objeto o de un objeto similar en un periodo corto de tiempo. cuando este está presente.2). no puede ser conocido exactamente. También puede definirse como la capacidad de un método de detectar el microorganismo diana. que provee una indicación de su confiabilidad durante el uso normal (3. Nota. En la práctica. En la práctica el valor de referencia aceptado puede sustituir al valor verdadero. el mismo sistema de medida. etc. La información de la prueba de robustez puede utilizarse para especificar las condiciones en que debe ser aplicado el método Sensibilidad (para un tipo de matriz y un nivel de inoculación dado): Fracción del número total de cultivos o colonias positivos que son correctamente asignados con el método utilizado (3.18). los mismos operadores. cambios en las condiciones ambientales. Es aceptado. en general.11). en la estimación de la incertidumbre de medición debido a la naturaleza empírica de . en las condiciones de incubación (tiempo/temperatura). en los ensayos microbiológicos cuantitativos. Tasa de Falsos Positivos (para un tipo de matriz y un nivel de inoculación dado): es la probabilidad o frecuencia con que la muestra sea asignada como positiva cuando en realidad es negativa. que no se tenga en cuenta al sesgo. las mismas condiciones de operación y el mismo lugar.2). (3.15). Falsos Positivos son aquellos que han sido asignados como tales conociendo que en realidad son negativos. las variaciones a las que hace referencia la definición son por ejemplo.11).4).OAA Organismo Argentino de Acreditación GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Página 7 de 17 Código: DC-LE-08 Versión: 1 Fecha de entrada en vigencia: 08-julio-2011 Nota: Este conjunto de condiciones incluye el mismo procedimiento de medida.15). La incidencia de falsos positivos es igual a: 1 menos la especificidad (3. de medida bajo un conjunto de condiciones de Nota: Este conjunto de condiciones incluye diferentes lugares. sea asignada como negativa por el método. Verificación: Confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos especificados. operadores. Tasa de Falsos Negativos (para un tipo de matriz y un nivel de inoculación dado): es la probabilidad o frecuencia con que una muestra conocida como positiva. no es posible en la práctica determinar el valor verdadero que se requiere para determinar el sesgo. competentes y. autorizados. de acuerdo a un estándar aceptado (ej. equipos con distintas tolerancias a las especificadas. EN. etc. el número de unidades formadoras de colonias por unidad de muestra. debe ser realizada por miembros del personal experimentados. diferentes tiempos/temperaturas de incubación. 5. métodos internos: son aquellos elaborados por el propio laboratorio y que no se encuentran en normas o u otras colecciones de métodos. el laboratorio puede demostrar que se encuentra bajo control. El laboratorio debe operar bajo un sistema de aseguramiento de la calidad de sus ensayos. NMKL. ISO/TR 13843. mediante ensayos colaborativos. etc. los cuales se basan en la capacidad natural de los microorganismos de desarrollarse en un determinado medio de cultivo. 6. métodos no normalizados: pueden considerarse aquellos métodos normalizados modificados o utilizados fuera de su alcance. o por organizaciones técnicas reconocidas (Ej. Por lo tanto. Los equipos e instrumentos deben ser calibrados y/ o validados .OAA Organismo Argentino de Acreditación GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Página 8 de 17 Código: DC-LE-08 Versión: 1 Fecha de entrada en vigencia: 08-julio-2011 los métodos microbiológicos. APHA. Por ejemplo: otra matriz. AOAC. DESCRIPCIÓN Un Laboratorio que realiza ensayos microbiológicos puede utilizar métodos cualitativos y/o cuantitativos. o los valores derivados de los Ensayos de Aptitud. por ejemplo. Incluso cuando se utilicen materiales de referencia certificados. por ejemplo. Standard Methods for Water and Wastewater. RESPONSABILIDADES Se encuentran descriptas en el documento DC-SG-07. a fin de detectarlos y/o poder cuantificarlos. ISO 17994) y son reconocidos formalmente como equivalentes al método de referencia por un organismo competente de acuerdo a unos datos experimentales obtenidos por ej. por lo tanto. El laboratorio debe utilizar métodos de ensayo. Es el procedimiento analítico el que determina directamente el resultado de la medición. combinación de partes del método normalizado con partes de una referencia bibliográfica. USP. aún cuando no se evalúe el componente de la incertidumbre debida al sesgo. sólo puede evaluarse una parte del sesgo. otros medios de cultivo. FDA. ISO 16140.1. Para ello puede utilizar: métodos normalizados: son aquellos métodos publicados como normas internacionales o nacionales. Requisitos generales para las actividades de validación y para la estimación de la incertidumbre de medición a) La validación de los métodos de ensayo y la estimación de la incertidumbre de medición. es decir ajustados a su propósito. EP. mediante su participación en ensayos de aptitud o mediante el ensayo de materiales de referencia certificados. UNE. EPA. 6.) métodos alternativos: se trata de métodos que han sido validados por comparación con el método de referencia que corresponda. Responsabilidades y en el punto 6 de este documento.: ISO. En cualquier caso. que satisfagan las necesidades del cliente y que sean apropiados para los ensayos que realiza. 3. por ejemplo la norma ISO/TS 19036. coliformes) y el método empleado. es decir. en los analistas. Para ello se pueden utilizar matrices estériles inoculadas. El Anexo C de la norma ISO 16140 sirve como referencia para alimentos. etc. Ver lo dispuesto en el documento CE-LE-06 Criterios específicos para la evaluación y acreditación de laboratorio que llevan a cabo ensayos microbiológicos. etc. Si se necesita estimar la incertidumbre para un cliente o para la interpretación de un resultado en contra de una especificación. se hace necesario considerar la presencia de la flora acompañante a fin de evaluar posibles interferencias. en los medios de cultivo. o en su defecto muestras inoculadas o materiales de referencia. por ejemplo el anexo B de la norma ISO 16140 o el anexo B del documento Final Report and Executive Summaries from the AOAC International Presidential Task Force on Best Practices in Microbiological Methodology. Éste . el número y categoría de matrices a analizar debe justificarse de acuerdo al alcance de la acreditación y debe basarse en referencias bibliográficas o estándares reconocidos. los medios de cultivo evaluados y controlados. es recomendable que se lo revise. También pueden utilizarse muestras no esterilizadas inoculadas. f) Para los modelos descriptos en 6. También debe tenerse en cuenta el estado fisiológico del/los microorganismo (s) de acuerdo a las matrices analizadas. g) Se debe designar a un Responsable que tenga las calificaciones y la competencia necesarias.3. debe tenerse en cuenta: el tipo de matriz (o grupo consistente de matrices). e) Tanto en la validación como en el cálculo de la incertidumbre de medición se debe tener en cuenta el rango de trabajo que emplee el Laboratorio en sus análisis de rutina. El número y categoría de matrices a analizar debe justificarse de acuerdo al alcance de la acreditación y debe basarse en referencias bibliográficas o estándares reconocidos. cambio en los equipos. se encuentra en la referencia 3. con el microorganismo diana y con cepas distintas a la diana en concentraciones superiores.2. Cuando se utilice la inoculación. El nivel del inóculo debe ser acorde a lo analizado por el laboratorio en la práctica diaria y lo especificado por el método de ensayo. debe tenerse en cuenta que según la naturaleza del método y de la matriz. por ejemplo el análisis de muestras de alimentos con alta carga y baja carga en la determinación de Salmonella.OAA Organismo Argentino de Acreditación GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Página 9 de 17 Código: DC-LE-08 Versión: 1 Fecha de entrada en vigencia: 08-julio-2011 antes de su uso. contaminadas por mezcla. tanto en la validación de los métodos como en la estimación de la incertidumbre de medición.1 y 6. el microorganismo (o grupo consistente de microorganismos. deben tener en cuenta las condiciones encontradas en la práctica diaria. d) Las actividades de validación y las de estimación de incertidumbre de medición deben reflejar las condiciones reales de la aplicación de los métodos de ensayo. que hayan demostrado previamente la ausencia del microorganismo diana. Para la selección de los microorganismos a utilizar puede servir como referencia lo indicado en el Anexo G de la norma ISO 16140 o en la norma ISO 11133-2.2. por ejemplo. c) Para la estimación de la incertidumbre. Una guía para la preparación de muestras de agua. b) Para la validación/verificación de los métodos. y el cálculo no se ha actualizado en los últimos 6 meses. la incertidumbre debe recalcularse cuando se produzcan cambios significativos en las condiciones: por ejemplo. Por ello pueden utilizarse: de preferencia muestras naturalmente contaminadas.2. para evaluar el diseño experimental y los resultados obtenidos.14 de este documento. Esto implica especificar los requisitos y condiciones a cumplir. no puede ser utilizada como único método para la validación ni para la estimación de la incertidumbre de medición. h) La participación en Ensayos de Aptitud (EA). para lo cual deben determinarse sus características de desempeño a fin de comprobar que cumple con los requisitos especificados para ese uso particular.OAA Organismo Argentino de Acreditación GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Página 10 de 17 Código: DC-LE-08 Versión: 1 Fecha de entrada en vigencia: 08-julio-2011 decidirá además las acciones a seguir en caso que no se obtengan los resultados esperados. puede utilizarse como actividades complementarias a la validación y pueden dar una indicación de la precisión obtenida para un método en particular. en el contexto de este documento. las muestras distribuidas durante la ronda. Los procedimientos y el alcance de la validación no son siempre los mismos. han sido especialmente homogeneizadas y estabilizadas. los niveles de microorganismos en las muestras del EA. Etapas en el proceso de validación El proceso de validación de un método debe estar cuidadosamente planificado. b) Planificar las acciones a seguir.2. utilizan una variedad de métodos empíricos para obtener su resultado. es decir para detectar o cuantificar un microorganismo o grupo de microorganismos específicos. Validación de los métodos El término “validación” se utiliza para indicar el proceso que provee evidencia objetiva que el método es capaz de servir a su uso esperado. En adelante se mencionará el término validación pero lo expuesto aplica igualmente a la verificación de los métodos de ensayo. las matrices. para indicar el proceso que lleva a cabo el laboratorio con el fin de demostrar su capacidad para ejecutar correctamente un método normalizado cuando lo realiza exactamente como está descripto en la norma. determinar los parámetros de desempeño del método. pueden no ser aquellos que el laboratorio analiza rutinariamente y pueden no cubrir el rango encontrado en el trabajo diario.2. 6. La participación en EA puede utilizarse en la estimación de la incertidumbre de medición bajo las condiciones estipuladas en la norma ISO/TS 19036 vigente. en muchos casos. debido a las siguientes limitaciones: en las rondas de EA. por ello deben contemplarse los siguientes pasos: a) Conocer el problema analítico a resolver. por lo cual para evaluar el resultado de la ronda se utilizan valores de consenso. establecer el diseño . El término “verificación” se utiliza. los laboratorios participantes. Deben ser establecidos de acuerdo a las características del método de ensayo utilizado por el Laboratorio y tener en cuenta las necesidades del cliente. Sin embargo la participación en EA.1. 6. son diferentes a las que analiza el Laboratorio en su rutina diaria y no tienen en cuenta la presencia de flora acompañante. . lo cual deberá estar fundamentado de manera confiable y científica.3.2. En el caso de los métodos microbiológicos se consideran modificaciones relevantes.2.OAA Organismo Argentino de Acreditación GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Página 11 de 17 Código: DC-LE-08 Versión: 1 Fecha de entrada en vigencia: 08-julio-2011 experimental y el método de análisis de resultados.2.1).2. establecer condiciones tales como temperatura y tiempo de incubación. En este caso el laboratorio debe confirmar que puede aplicarlo correctamente previo a su uso en ensayos. En todos los casos se requiere un Protocolo de validación (ver 6.2. si se han satisfecho los requisitos. En esta etapa es fundamental definir el alcance de la validación de acuerdo al método a emplear.2. mediante la comprobación del cumplimiento de los parámetros estadísticos que figuran en el método normalizado (siempre y cuando se indiquen en la norma). 6. Alcance de la Validación/verificación de los métodos El alcance dependerá del tipo de método utilizado. Se pueden presentar los siguientes casos. Confirmar la validez del procedimiento utilizado de acuerdo al propósito establecido y. c) Llevar a cabo la validación y evaluar los resultados obtenidos.2. Debe tenerse en cuenta que cualquier variación en el método normalizado implica la repetición de dicha confirmación. cambios en las condiciones de incubación (tiempo-temperatura). El diseño experimental y el análisis de resultado tienen que ser estadísticamente válidos. 6. el laboratorio debe decidir cuáles deben ser caracterizados con el fin de validar el método. la utilización de medios de cultivos diferentes a los descritos en el método de referencia.3.1 Métodos normalizados: el Laboratorio utiliza un método normalizado que se aplica exactamente como está descripto en la norma.2.2 Métodos modificados: el Laboratorio realiza modificaciones al método de ensayo normalizado que pueden tener una repercusión sobre la calidad de los resultados. especificar la matriz o matrices a estudiar. límites de operación. realizar una clara descripción del/los microorganismos de interés. Si los parámetros de desempeño no están ya especificados. d) Realizar el Informe de validación (ver 6. entre otras: incluir en el alcance del método otra matriz que la especificada en el método normalizado. y establecer otras limitaciones y especificaciones. por comparación con los parámetros de desempeño establecidos. Los parámetros a determinar son: Ensayos cualitativos Ensayos cuantitativos Límite de detección Precisión (Repetibilidad + Precisión Verificación de la sensibilidad y la intermedia) especificidad Límite de cuantificación (a) Verificación de la veracidad (a) El límite de cuantificación debe ser determinado en los casos que afecte o esté cercano al límite especificado en la norma correspondiente. 6.2). siguiendo los lineamientos establecidos en la Norma ISO 16140 o los protocolos de AOAC. o estos no son plenamente aplicables. según las matrices. etc. En estos casos se debe tener en cuenta que los parámetros a determinar dependerán de las modificaciones introducidas y la naturaleza del método. antes de utilizar el método en el laboratorio. utilización de una sola placa de Petri para el recuento cuando el método normalizado indica dos. baños termostáticos utilizados para la incubación de caldos de pre .2. utilización de una porción de ensayo o suspensión inicial diferente. la validación es mucho más exigente y deben ser adecuada y totalmente validados antes de su uso.1. AFNOR.enriquecimiento o de enriquecimiento.OAA Organismo Argentino de Acreditación GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Página 12 de 17 Código: DC-LE-08 Versión: 1 Fecha de entrada en vigencia: 08-julio-2011 el uso de equipos críticos con distinta tolerancia a la especificada en el método normalizado.2.. por ejemplo estufas de incubación. Cuando no se disponga de esta información (datos de validación). El diseño experimental y el análisis de los resultados tienen que ser estadísticamente válidos.2.2. Los datos de validación pueden obtenerse de ensayos colaborativos o de datos provistos por el fabricante y sometidos a la evaluación de una tercera parte (por ejemplo. En estos casos. ya que al no disponerse de información previa sobre el desempeño del método. todos los parámetros de desempeño posibles. prestando particular atención a aquellas características de desempeño que puedan haber sido afectadas por el cambio introducido. AOAC. NordVal. 6. siguiendo los lineamientos establecidos en 6. cuando se dispone de los datos de validación.3 Métodos alternativos: el Laboratorio utiliza métodos alternativos o métodos rápidos de confirmación. para satisfacer las necesidades del tipo de aplicación. Los parámetros a determinar son: Ensayos cualitativos Ensayos cuantitativos Recuento de microorganismos Recuento de microorganismos Límite de totales (a) en medio selectivo/diferencial detección Además de los especificados Precisión (Repetibilidad + Sensibilidad en (a): Precisión intermedia) Especificidad (b) Sensibilidad Límite de cuantificación Inclusividad/ Especificidad Rango validado Exclusividad Incertidumbre de medición Inclusividad Robustez Exclusividad Robustez (b) El límite de cuantificación debe ser determinado en los casos que afecte o esté cercano al límite especificado en la norma correspondiente.2. la Norma ISO/TR 13843. . el Laboratorio debe realizar una verificación de su aplicabilidad. o los protocolos de AOAC. combinación de partes del método normalizado con partes de una referencia bibliográfica. se deberán evaluar. utilización de un método de recuento de colonias o un método de cálculo y expresión de los resultados diferente al especificado en el método normalizado. Se pueden utilizar como guías. según sus características. el Laboratorio debe realizar la validación. NordVal. utilización de un rango de recuento diferente al especificado en el método normalizado. por ejemplo: la Norma ISO 16140.2. NMKL). 6.4 Métodos internos: para estos métodos. Análisis estadístico Metodología para el cálculo de la incertidumbre.2 Informe de validación.2. las condiciones del ensayo.1 Protocolo de validación. Condiciones ambientales. cuando corresponda a un método de ensayo cuantitativo.3. Conclusiones y declaración de conformidad sobre la aptitud del método de ensayo. materiales. El Informe de validación debe ser revisado y aprobado por el Responsable. la estandarización del inóculo. .2. especialmente cuando pueden causar diferencias significativas en la recuperación de los microorganismos y el rango de aplicación en el caso de los ensayos cuantitativos.3. aún cuando se hayan producido desviaciones del protocolo o. medios de cultivo. el acondicionamiento y preparación de las mismas. Criterios de revalidación El Responsable debe justificar y fundamentar apropiadamente si considera al método adecuado. Listado de equipos.3. cuando corresponda. Criterios de aceptación para cada uno de los parámetros. Protocolo e Informe de validación 6. Personal que llevará a cabo la validación Metodología y diseño experimental. Este debe incluir: la definición del analito.OAA Organismo Argentino de Acreditación GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Página 13 de 17 Código: DC-LE-08 Versión: 1 Fecha de entrada en vigencia: 08-julio-2011 6. cuando uno de los puntos del informe no concuerde con el requisito establecido previamente. por ejemplo los criterios de aceptación. Se deben adjuntar al informe de validación los datos originales o hacer referencia en donde estos se encuentren. etc. la naturaleza de las muestras (naturales o inoculadas) utilizadas para la validación. Con el fin de organizar y planificar las actividades de la validación se debe elaborar un protocolo de validación que incluya: Objetivo Alcance: ámbito de aplicación del ensayo a validar.1 Resultados obtenidos. 6. incluyendo la incertidumbre de medición.3. fundamentada en la evaluación de los parámetros de desempeño respecto a los criterios establecidos. Debe reflejar el protocolo de validación e incluir.2. reactivos y cepas de referencia. además de lo especificado en 6. los microorganismos utilizados. instrumentos.2. Aquí tiene suma importancia la especificación de la matriz. Parámetros de desempeño a determinar. cuando corresponda. Registros asociados El Protocolo de validación debe ser revisado y aprobado por el Responsable. además de lo especificado en 6.3 a): a) realizar un cálculo para estimar la incertidumbre asociada a sus ensayos cuantitativos. basado en un pensamiento crítico y en el mejor juicio profesional.1. 6. la homogeneidad de los reactivos. además de lo especificado en 6. la temperatura y tiempo de incubación. Por esta razón. . donde es difícil construir un modelo apropiado que permita cuantificar las contribuciones de cada paso a la incertidumbre del proceso de medida y. el Laboratorio debe: a) identificar las distintas fuentes de incertidumbre. ya sean cualitativos o cuantitativos. los medios de cultivo. etc.3. dado que el mensurando se define en los términos del método.3. sirve como el único método para establecer el valor aceptado del parámetro medido (AOAC). la interpretación de los analistas. cuando corresponda la presencia de la flora acompañante. el consenso actual sobre la estimación de la incertidumbre en los ensayos microbiológicos cuantitativos es 1 Método empírico: es un método que determina un valor al que sólo se puede llegar en términos del método en cuestión y que. Esto puede realizarse de muchas maneras. Métodos de ensayo microbiológicos cualitativos: El concepto de cálculo de incertidumbre de medición no puede aplicarse directamente a los resultados de los ensayos cualitativos como los obtenidos en los análisis de detección o en los de determinación de atributos para fines de identificación.2. teniendo en cuenta. pero no deben ser utilizados para cuantificar el sesgo. como por ejemplo. cuyo valor se obtiene también de métodos empíricos. Métodos de ensayo microbiológicos cuantitativos: el Laboratorio debe. el laboratorio puede utilizar aquel que.OAA Organismo Argentino de Acreditación GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Página 14 de 17 Código: DC-LE-08 Versión: 1 Fecha de entrada en vigencia: 08-julio-2011 6.3 a): a) determinar el límite de detección. tales como. ya que es un importante indicador de la validez del método en el laboratorio. basado en requisitos de especificidad y sensibilidad y realizado en matrices representativas. el Laboratorio debe. en los métodos microbiológicos cuantitativos. Estimación de la incertidumbre de medición Para todos los métodos. tales como diagramas de flujo. No obstante. La estimación de la incertidumbre de medición debe realizarse para resultados válidos. Dado el carácter de los ensayos microbiológicos. la poca disponibilidad de materiales de referencia certificados que representen al microorganismo en su hábitat natural. y demostrar que se encuentran bajo control. es decir aquellos que se encuentran dentro de los límites de recuento especificados en el método. el sesgo o “bias” no contribuye a la incertidumbre del método. b) determinar la incidencia de resultados falsos positivos y falsos negativos asociada a los ensayos cualitativos que se realizan (Tasa de Falsos Positivos y Tasa de Falsos Negativos). en este último caso para los métodos alternativos o de confirmación rápida. ya sea en la literatura (normas o publicaciones relevantes al sector) o por los fabricantes. métodos empíricos1. Existen diferentes modelos para estimar la incertidumbre para ensayos cuantitativos. constituye una herramienta útil para demostrar la competencia del laboratorio. por definición. etc. Esta no debe exceder las recomendaciones publicadas. dado que los resultados dependen de las condiciones definidas en el método. 6. estime conveniente. tablas. Es por ello que la utilización de materiales de referencia certificados. Un método de ensayo diferente (a menudo para el mismo analito) puede dar un resultado diferente.3. listas o diagramas de causa-efecto (espina de pescado). a muestras ambientales en el ámbito de la producción y manipulación de alimentos. Esta norma propone un modelo. donde la enumeración de microorganismos se lleva a cabo mediante técnicas de recuento de colonias. sR interlaboratorio derivado de pruebas de aptitud. que incluye todas las fuentes de variabilidad que pueden encontrarse en la práctica. Para recuentos bajos ver 6. sR interlaboratorio derivado de la validación del método. Este enfoque es aplicable para estimar la incertidumbre en ensayos microbiológicos cuantitativos. No es aplicable a la enumeración de microorganismos utilizando la técnica del Número Más Probable.2. al planificar el diseño experimental para la recolección de datos y operar bajo condiciones de aseguramiento de calidad. dado que se asume que la incertidumbre asociada con los recuentos bajos en placa o en membrana. La incertidumbre de medida se estima mediante un enfoque simplificado tomando en cuenta la distribución de Poisson. Sin embargo.2. cuando se obtienen recuentos bajos o ningún recuento. de modo de demostrar que el método se encuentra bajo control y minimizar variabilidades. Utiliza tres posibilidades para el cálculo de la desviación estándar de la reproducibilidad (sR): sR intralaboratorio. además.2. Para este último caso el Laboratorio debe tener en cuenta las condiciones estipuladas en la norma ISO/TS 19036 vigente. También es aplicable a ensayos cuantitativos llevados a cabo mediante métodos instrumentales.OAA Organismo Argentino de Acreditación GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Página 15 de 17 Código: DC-LE-08 Versión: 1 Fecha de entrada en vigencia: 08-julio-2011 que la precisión es el componente más importante y el único que puede determinarse de una manera práctica. tal como se describe en la norma ISO 5725-3 incorpora la mayoría.3. Por ello el Laboratorio puede utilizar los siguientes modelos: 6. cuando el recuento de los duplicados seleccionados para realizar la estimación se encuentra dentro del rango de recuento especificado en el método que se trate.1 Precisión intermedia. Aplica a cualquier resultado incluyendo recuentos bajos y/o bajo número de microorganismos. Aplica a ensayos cuantitativos de productos destinados al consumo humano y la alimentación animal y.2. El laboratorio debe tener en cuenta lo especificado en la Norma ISO/TS 19036.3. que es un caso particular de "precisión intermedia" según lo definido en la ISO 5725-3. es similar a la que se obtiene para recuentos mayores y. 6. que adopta un enfoque “top-down” o "global". no refleja ni representa la verdadera condición de estas muestras. tanto interno como externo. En estos casos no se considera apropiado inocular las muestras con un adecuado número de microorganismos para poder llevar a cabo el cálculo de la precisión intermedia.2 Norma ISO/TS 19036:2006 y su Amd1: 2009. dado que el coeficiente de variación (CV) aumenta rápida y significativamente cuando disminuye el recuento. y se basa en la desviación estándar de la reproducibilidad (sR) del resultado final del proceso de medición. lo cual para una matriz particular y para un ensayo dado puede ser la regla. ya sea en placa o por filtración por membrana. mediante la utilización de datos experimentales. las fuentes de incertidumbre significativas. De este modo se asegura la . no es apropiado el cálculo de la precisión intermedia.3. sino todas. 7.3 a). lo expresado en el ítem 8. siempre que: a) identifique las combinaciones inusuales e investigue sus causas. 6.4. indicando el nivel de confianza considerado. el Laboratorio puede utilizar los límites de confianza de las tablas. Ensayos que utilizan el Número Más Probable (NMP) para determinar el número de microorganismos en una muestra de ensayo: para estos ensayos y de acuerdo al consenso actual.3. de los diversos métodos utilizados. DOCUMENTACIÓN RELACIONADA CE-LE-06. . algunos.2. b) demuestre que la precisión (determinada por ejemplo. También deberá indicarse o hacer referencia al procedimiento empleado para el cálculo de la incertidumbre.1 de la Norma ISO/TS 19036. cuando éste así lo requiera.3. conducen a una subestimación significativa de la incertidumbre. Por ejemplo. se dan las indicaciones para la expresión del resultado del ensayo y su incertidumbre asociada. 6. mediante el análisis de duplicados) se encuentra dentro de dichos límites. Expresión de la Incertidumbre de medición en los informes de ensayo En el Amd. Para los métodos de recuento que utilizan el Número Más Probable (NMP). ya que. Debe indicarse además el nivel de confianza considerado y el factor de cobertura. la incertidumbre del resultado se expresará como el límite inferior y superior del intervalo de confianza de las tablas (de acuerdo al método utilizado). El Laboratorio puede adoptar la expresión que le resulte más conveniente y que considere clara a fin de informar al cliente. Criterios específicos para la evaluación y acreditación de laboratorios que llevan a cabo ensayos microbiológicos. c) cumpla con lo especificado en 6.OAA Organismo Argentino de Acreditación GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Página 16 de 17 Código: DC-LE-08 Versión: 1 Fecha de entrada en vigencia: 08-julio-2011 validez de la estimación de la incertidumbre de medición para las actividades rutinarias del laboratorio y no solamente en un momento dado.1 del Amd. Este procedimiento debe estar disponible para el cliente.1 de la Norma ISO/TS 19036. Anexo I .Parámetros de validación y expresiones para su cálculo .OAA Organismo Argentino de Acreditación GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Página 17 de 17 Código: DC-LE-08 Versión: 1 Fecha de entrada en vigencia: 08-julio-2011 8.