Guia de Seminarios IBMC 2011

INTRODUCCIÓN A LA BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR(en su 28º año consecutivo) http://www.fbmc.fcen.uba.ar/materias/ibmc 2011 GUÍA DE SEMINARIOS INCLUYE: - Listado de docentes - Programa teórico - Bibliografía - Cine - Calendario de seminarios y parciales - Régimen de promoción IBMC 2011 Listado de docentes: Profesores a cargo de teóricas: Dr. Alberto Kornblihtt (Profesor titular) Dr. Eduardo Arzt (Profesor titular) Dr. Omar Coso (Profesor adjunto) Profesor colaborador: Dr. Norberto Iusem (Profesor asociado) Profesores invitados: Dr. Osvaldo Uchitel y Dr. Jorge Muschietti Jefes de Trabajos Prácticos: Dr. Guillermo Alonso Dra. Paula Barrionuevo Dra. Alejandra Cherñavsky Dra. Paula Cramer Dra. Liliana Dain Dr. Diego Ferreiro Dra. Alejandra Guberman Dr. Manuel Muñoz (coordinador de TP) Dra. Guadalupe Nogués (coordinadora administrativa) Dr. Federico Pelisch (coordinador de TP) Dra. Carolina Pérez Castro Dra. Natalia Rubinstein Dra. Patricia Saragüeta Dr. Ignacio Schor Dra. Susana Silberstein Cuña Ayudantes primeros Lic. José Bonfiglio Lic. Natalia Boynak Dr. Flavio de Souza Dr. Juan Gerez Dra. Luciana Giono Lic. Mariana Haedo Dr. Mauro Morgenfeld Dr. Diego Presman Dra. Luciana Rocha Viegas Dra. Laura Zarebski Ayudantes segundos Renzo Adilardi Ana Fiszbein Micaela Godoy Herz Carolina Inda Fernando Merwaiss Nicolás Nieto Moreno María Sol Ruiz Lic. Ayelén Toro Gustavo Vasen 2 IBMC 2011 ASIGNATURA: Introducción a la Biología Molecular y Celular CARRERA: Lic. en Ciencias Biológicas: Ciclo Introductorio CARÁCTER: Obligatorio DURACIÓN DE LA MATERIA: Un cuatrimestre HORAS DE CLASE: a) Teóricas: 9; b) Problemas y Seminarios: 4; c) Laboratorio: 4. TOTALES: 17 ASIGNATURAS CORRELATIVAS: Ninguna PROGRAMA TEÓRICO: 1) Panorama general de la estructura y función celulares. Moléculas y células. Niveles de organización. Células procariotas y eucariotas. Conceptos de evolución y mutación, valor adaptativo. Selección natural. Cómo se estudia la célula. Microscopía óptica. Microscopía electrónica de transmisión y de barrido. Fraccionamiento subcelular. Ultracentrifugación. Histoquímica. Inmunofluorescencia. Inmunohistoquímica. 2) Ácidos nucleicos. Estructura del DNA. Métodos para determinación de secuencia. Estructura del tRNA. RNA mensajero. RNAs ribosómicos. Actividad catalítica del RNA. Hibridación. Genes estructurales y reguladores. Estructura de los genes de eucariotas. Intrones y exones. Procesamiento (splicing) del RNA mensajero. Procesamiento diferencial. Acoplamiento entre transcripción y procesamiento de RNA. Degradación de RNA mensajero (NMD: nonsense mediated decay). 3) Replicación del DNA. Concepto de replicón. DNA polimerasas. Actividades de proofreading y nick translation. Helicasa, primasa, ligasa, topoisomerasa. Ciclo celular. Acortamiento de telómeros y telomerasa. Transcripción. Transcripción inversa. Monitoreo de errores de replicación y transcripción. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 4) Proteínas. Estructura primaria, secundaria y terciaria. Métodos de purificación y determinación de secuencia. Cristalografía de rayos X. Estructura cuaternaria: subunidades, dominios, interacciones (cooperatividad y alosterismo). Proteínas globulares y fibrosas. Proteínas enzimáticas y proteínas estructurales. Modificaciones regulatorias. Receptores, anticuerpos, hormonas. 5) Biosíntesis de proteínas. Ribosomas. Código genético. Supresores. Modificaciones posttraduccionales. Antibióticos y síntesis de proteínas. 6) La tecnología del DNA recombinante (ingeniería genética). Enzimas de restricción. Secuencias palindrómicas. Vectores. Clonado genómico y de cDNA. Concepto de sonda de DNA. Bancos de genes y de cDNA. Rastreo de bancos. Animales transgénicos. Anulación programada de genes por recombinación homóloga (“knock out”). Biotecnología. 7) Regulación de la actividad genética. Modelo procariótico: el operón lactosa. Elementos génicos de control: genes reguladores activos en cis y en trans. Interacciones DNAproteínas. El operón triptofano. Regulación de la traducción por RNAs anti-sentido. Interferencia por RNA (RNAi). Micro RNAs. Elementos reguladores en células eucariotas: regiones pre-promotores, “enhancers” y “silencers”. Factores de transcripción. 8) La membrana plasmática. La bicapa lipídica. Proteínas de membrana. Interacciones hidrofóbicas e hidrofílicas. Métodos físicos para el estudio de la membrana. Criofractura y criograbado. El modelo de mosaico fluido. El uso de la electroforesis en geles de poliacrilamida para estudiar las proteínas de membrana. Transporte de macromoléculas. 3 IBMC 2011 Exocitosis y endocitosis. Hoyos revestidos (“coated pits”). Fagocitosis. El tránsito vesicular de la célula. 9) La compartimentalización de las células eucariotas. El citosol. El retículo endoplasmático. Translocación de proteínas co- y post-traduccional. El aparato de Golgi. Lisosomas y peroxisomas. Organelos con doble membrana: el núcleo, la mitocondria y el cloroplasto. Metabolismo celular: glucólisis, fermentaciones, ciclo de Krebs. Respiración aerobia. El problema y la solución de la conversión de energía: mitocondrias y cloroplastos como maquinarias productoras de ATP. La cadena respiratoria. El cloroplasto y el proceso de fotosíntesis. El proceso quimiosmótico. Ácidos nucleicos en mitocondrias y cloroplastos. Hipótesis sobre el origen endosimbiótico de las organelos celulares. 10) El citoesqueleto. Movimiento ciliar. Aspectos generales de los microtúbulos y los microfilamentos como estructuras cuaternarias dinámicas. Proteínas con afinidad por la actina en células no musculares. Filamentos intermedios. Organización del citoesqueleto. Uniones celulares: estrechas, desmosomas, hemidesmosomas. La matriz extracelular: colágeno, fibronectina, laminina. 11) El núcleo celular. La organización del DNA en cromosomas. Histonas y proteínas nohistónicas. El nucléolo. La membrana nuclear. Organización de las secuencias del DNA: repetitivas y únicas. El ciclo celular. Mitosis. Control de la división celular. Meiosis. Reseña de la genética mendeliana: genotipo, fenotipo, homocigosis, heterocigosis, dominancia, codominancia, alelos múltiples. Leyes de Mendel y sus bases citológicas. Transferencia de material genético. 12) La célula vegetal. La importancia clave de la pared celular. Pared primaria y secundaria. Composición y estructura. Interacción y comunicación entre células vegetales: plasmodesmos. Organización interna: plástidos, vacuola, tonoplasto. Crecimiento, división y diferenciación de células vegetales. 13) El sistema inmunitario. Bases celulares de la inmunología. Funciones de los anticuerpos. Biología molecular de la respuesta inmune: estructura de las inmunoglobulinas. Clasificación de inmunoglobulinas. La generación de la diversidad de los anticuerpos. La selección clonal. Linfocitos T y B. Receptores de membrana. Linfocitos T y la inmunidad celular. El sistema de complemento. 14) Neuronas. Los canales activados por voltaje y el potencial de acción. Transmisión sináptica. Neurotransmisores. Desarrollo y conservación de la estructura neuronal. El desarrollo de las conexiones neuromusculares. Concepto de barrera hematoencefálica. Proteínas de transporte. Las bombas protónicas. Transporte de moléculas pequeñas. Transporte activo. Gradientes iónicos. ATPasas. Bombas aspirantes e impelentes. Canales iónicos. Ionóforos. 15) Cómo se comunican las células entre sí: las señales claves. Mediadores químicos locales, hormonas y neurotransmisores. Receptores: de membrana e intracelulares. Concepto de unión (binding) de ligando a receptor. Segundos mensajeros: el AMP cíclico y el calcio. Modo de acción de los segundos mensajeros. Genes cuyos productos regulan la respuesta celular a señales externas: oncogenes. 4 IBMC 2011 BIBLIOGRAFÍA 1) Alberts et al. Molecular Biology of the Cell (5 a edición, incluye CD interactivo). Garland Publishing, New York & London (2007). http://www.taylorandfrancis.com/books/details/9780815341116/ La 4 a edición (2002) puede consultarse gratuitamente (por búsqueda) en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21054/ 2) Alberts et al. Biología Molecular de la Célula, traducción al español de la 4a edición en inglés. Editorial Omega, Barcelona (2004). En Bs. As. distribuye Cúspide. 3) Alberts, B., Bray, D., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. y Walter, P. Essentials in Cell Biology. An Introduction to the Molecular Biology of the Cell. Garland Publishing, New York & London (2003). 4) Alberts, B., Bray, D., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. y Walter, P. Introducción a la Biología Celular. Traducción al español de la cita 3. Omega, Barcelona. 5) Stryer, L. Bioquímica. Editorial Reverte, Barcelona (traducción de la 4 a edición en inglés). 6) Lodish, H., Berk, A., Lawrence Zipurski, S., Matsudaira, P., Baltimore, D. y Darnell, J. E. Biología Celular y Molecular. Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, 2005 (traducción de la 5a edición en inglés) 7) Lewin, B. Genes VIII. John Wiley & Sons (2002). Relacionado con este importante texto y con experimentos claves en la biología molecular consultar el sitio www.ergito.com 8) Publicaciones periódicas: Scientific American o su edición en español, Investigación y Ciencia; La Recherche o su edición es español, Mundo Científico; Ciencia Hoy (la revista de divulgación científica más seria de la Argentina); Exactamente (la revista de nuestra facultad). 9) Freeland Judson, H. The Eighth Day of Creation. Makers of the Revolution in Biology. Penguin Books, London (1995). 10) Purroy, J. La era del genoma. Salvat ciencia. Barcelona (2001). Se consigue en librerías Distal, Corrientes 913, Cap. Fed. 11) Jacob, François. La estatua interior. Tusquets Editores (1989). 12) Watson, J.D. La doble hélice. Editorial Alianza (2000). 13) Sulston, J, Ferry, G. El hilo común de la humanidad. Siglo XXI de España (2003). BÚSQUEDAS BIBLIOGRÁFICAS Para buscar citas de trabajos originales publicados en revistas científicas en inglés mediante el uso de palabras presentes en sus títulos o resúmenes (abstracts) o el apellido de sus autores, se puede consultar la base de publicaciones más importante en ciencias biomédicas y biotecnología, llamada PubMed, a la siguiente dirección de internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/ 5 IBMC 2011 RÉGIMEN DE PROMOCIÓN (2011) IBMC BIÓLOGOS TEÓRICAS: No son obligatorias. TRABAJOS PRÁCTICOS: Asistencia obligatoria. El alumno queda libre si tiene más del 20% de inasistencias. SEMINARIOS: Asistencia obligatoria. El alumno queda libre si tiene más del 20% de inasistencias. PARCIALES TEÓRICOS: Se tomarán dos exámenes parciales teóricos en el cuatrimestre, los cuales se aprueban con 50 puntos (sobre 100). A quien obtenga 47, 48 ó 49 puntos en uno de ellos, se lo dará por aprobado sí y sólo sí obtiene, respectivamente, 53, 52 ó 51 puntos en el otro. Las notas de los recuperatorios no se tendrán en cuenta para la compensación mencionada. PARCIAL PRACTICO: Se tomará un parcial práctico en el cuatrimestre, el cual se aprueba con 60 puntos (sobre 100). RECUPERATORIOS DE PARCIALES TEÓRICOS: Se podrán recuperar los dos parciales teóricos. Cada recuperatorio se aprueba con 50 puntos (sobre 100). Se tendrá en cuenta solamente la nota obtenida en el recuperatorio, la cual reemplazará a la del parcial reprobado. RECUPERATORIO DEL PARCIAL PRÁCTICO: Se podrá recuperar el parcial práctico. Se tendrá en cuenta solamente la nota obtenida en el recuperatorio, la cual reemplazará a la del parcial reprobado. FIRMA DE LOS TRABAJOS PRÁCTICOS: Aprobarán los Trabajos Prácticos aquellos alumnos que hayan: 1) Aprobado los dos parciales teóricos o sus respectivos recuperatorios. 2) Aprobado el parcial práctico o su recuperatorio. 3) Asistido al 80% de los TTPP. 4) Asistido al 80% de los Seminarios. 5) Presentado TODOS los informes requeridos por el JTP. PROMOCIÓN SIN EXAMEN FINAL: Aprobarán la materia sin rendir examen final los alumnos que: 1) Estén en condiciones de firmar los TTPP, incluso aquellos que hayan rendido y aprobado el recuperatorio del parcial práctico. 2) No hayan recuperado ninguno de los 2 parciales teóricos. 3) Sumen al menos 135 puntos entre los dos parciales teóricos. 4) Hayan llenado la encuesta obligatoria a través de la web. La nota final de promoción se calcula como 0,8 x nota promedio parciales teóricos + 0,2 x nota parcial práctico, y eso se redondea sin decimales: por ej., un 84,5 es un 85 y por lo tanto es un 9, pero un 84,4 es un 8. EXAMEN FINAL: Todos aquéllos que hayan firmado los TTPP y que no reúnan las condiciones para promocionar sin examen final, podrán rendir examen final en las fechas estipuladas por la Facultad siempre que hayan llenado la encuesta obligatoria a través de la web. 6 IBMC 2011 RÉGIMEN DE PROMOCIÓN (2011) IBMC PALEONTÓLOGOS TEÓRICAS: No son obligatorias. TRABAJOS PRÁCTICOS (TODOS MENOS MACRÓFAGOS Y CLOROPLASTOS): Asistencia obligatoria. El alumno queda libre si tiene más del 20% de inasistencias. SEMINARIOS (TODOS MENOS CÉLULA I, CÉLULA II E INMUNOLOGÍA): Asistencia obligatoria. El alumno queda libre si tiene más del 20% de inasistencias. PARCIALES TEÓRICOS: Se tomará UN examen parcial teórico en el cuatrimestre, el cual se aprueba con 50 puntos (sobre 100). PARCIAL PRACTICO: Se tomará un parcial práctico en el cuatrimestre, el cual se aprueba con 60 puntos (sobre 100). RECUPERATORIO DEL PARCIAL TEÓRICO: Se podrá recuperar el parcial teórico. Este recuperatorio se aprueba con 50 puntos (sobre 100). Se tendrá en cuenta solamente la nota obtenida en el recuperatorio, la cual reemplazará a la del parcial reprobado. RECUPERATORIO DEL PARCIAL PRÁCTICO: Se podrá recuperar el parcial práctico. Se tendrá en cuenta solamente la nota obtenida en el recuperatorio, la cual reemplazará a la del parcial reprobado. FIRMA DE LOS TRABAJOS PRÁCTICOS: Aprobarán los Trabajos Prácticos aquellos alumnos que hayan: 1) Aprobado el parcial teórico o su recuperatorio. 2) Aprobado el parcial práctico o su recuperatorio. 3) Asistido al 80% de los TTPP. 4) Asistido al 80% de los Seminarios. 5) Presentado TODOS los informes requeridos por el JTP. PROMOCIÓN SIN EXAMEN FINAL: Aprobarán la materia sin rendir examen final los alumnos que: 1) Estén en condiciones de firmar los TTPP, incluso aquellos que hayan rendido y aprobado el recuperatorio del parcial práctico. 2) No hayan recuperado el parcial teórico. 3) Hayan obtenido al menos 68 puntos en el parcial teórico. 4) Hayan llenado la encuesta obligatoria a través de la web. La nota final de promoción se calcula como 0,8 x nota parcial teórico + 0,2 x nota parcial práctico, y eso se redondea sin decimales: por ej. , un 84,5 es un 85 y por lo tanto es un 9, pero un 84,4 es un 8. EXAMEN FINAL: Todos aquéllos que hayan firmado los TTPP y que no reúnan las condiciones para promocionar sin examen final, podrán rendir examen final en las fechas estipuladas por la Facultad siempre que hayan llenado la encuesta obligatoria a través de la web. 7 IBMC 2011 CRONOGRAMA DE SEMINARIOS Y EXÁMENES* SEMANA O FECHA 5 abril – 8 abril 12 abril – 15 abril 19 abril – 22 abril 26 abril – 29 abril 3 mayo – 6 mayo 10 mayo – 13 mayo 17 mayo – 20 mayo 24 mayo - 27 mayo 28 mayo 31 mayo – 3 junio 7 junio – 10 junio 14 junio – 17 junio 21 junio – 24 junio 25 junio 28 junio – 1 julio 5 julio – 8 julio 11 julio TEMA DE SEMINARIOS ÁCIDOS NUCLEICOS I PROTEÍNAS I Sin Seminarios PROTEÍNAS II SÍNTESIS DE PROTEÍNAS ÁCIDOS NUCLEICOS II ÁCIDOS NUCLEICOS II REPASO PRIMER PARCIAL PAPER - REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN CÉLULA I CÉLULA I INMUNOLOGÍA I PARCIAL PRÁCTICO INMUNOLOGÍA II CÉLULA II Recuperatorio Primer Parcial 16 julio 19 julio 22 julio SEGUNDO PARCIAL Recuperatorio Parcial Práctico Recuperatorio Segundo Parcial *Este cronograma puede ser modificado por motivos de fuerza mayor. 8 IBMC 2011 CINE E INTRODUCCIÓN A LA BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR Películas cuyo contenido está relacionado con temas que se discuten en la materia: 1) Heredarás el Viento (Inherit the Wind) (EEUU, 1960) 127 min. Dirigida por Stanley Kramer, con Spencer Tracy, Fredric March y Gene Kelly. Basada en un caso real. 2) Heredarás el Viento (Inherit the Wind) (EEUU, 1988) Telefilm "remake" del anterior con Jason Robards y Kirk Douglas. 3) Los Niños del Brasil (The Boys from Brazil) (EEUU, 1978) 123 min. Dirigida por Franklin J. Shaffner, con Gregory Peck, Laurence Olivier, James Mason y Lilli Palmer. Basada en la novela de Ira Levin. 4) Parque Jurásico (Jurassic Park) (EEUU, 1993) 126 min. Dirigida por Steven Spielberg, con Sam Neill, Laura Dern, Jeff Goldblum y Richard Attenborough. Basada en la novela de Michael Crichton. 5) Un milagro para Lorenzo (Lorenzo's Oil) (EEUU, 1992) 135 min. Dirigida por George Miller, con Nick Nolte, Susan Sarandon y Peter Ustinov. Basada en un caso real. 6) La bala mágica del Dr. Erlich (Dr. Erlich's Magic Bullet) (EEUU, 1940) 103 min. Dirigida por William Dieterle, con Edward G. Robinson. Guión de John Huston. Basada en la vida del científico alemán Paul Erlich. 7) La Vida de Luis Pasteur (The Story of Louis Pasteur) (EEUU, 1936) 85 min. Dirigida por William Dieterle, con Paul Muni. 8) Y la Banda Siguió Tocando (And the Band Played on) (EEUU, 1993) 155 min. Dirigida por Roger Spottiswoode, con Mathew Modine, Alan Alda, Richard Gere, Lily Tomlin, Steve Martin, Anjelica Huston, Phil Collins. 9) Gattaca (EEUU, 1997) 112 min. Dirigida por Andrew Niccol, con Ethan Hawke, Uma Thurman, Alan Arkin, Ernest Borgnine. 10) Avatar (EEUU, GB, 2009) 162 min. Dirigida por James Cameron, con Sam Worthington, Zoe Saldana, Sigourney Weaver. 9 IBMC 2011 ÁCIDOS NUCLEICOS I ESTRUCTURA Y FUNCIÓN A) GUÍA DE ESTUDIO 1) ¿Cuál es el "dogma central" de la biología molecular? ¿En qué medida el dogma se ha modificado a comienzos de la década del 70? ¿Qué relación tiene la irreversibilidad del flujo de la información genética con el Lamarckismo? 2) ¿Qué hicieron Miescher, Chargaff y Watson y Crick con respecto al DNA? 3) ¿Cuáles fueron las conclusiones de los experimentos de Griffith; Avery, MacLeod y McCarthy; Hershey y Chase? 4) Dibuje la estructura química y el respectivo nombre de las bases nitrogenadas, desoxinucleósidos, ribonucleósidos, desoxinucleótidos y ribonucleótidos que constituyen los ácidos nucleicos. 5) ¿Qué grupos químicos se encuentran en los extremos de una molécula de DNA de cadena simple? ¿Y en los extremos de una de cadena doble? 6) Sugiera un método para diferenciar DNA de cadena simple de RNA. 7) Explique por qué a mayor concentración salina en el medio, la hibridación entre dos hebras de DNA es menos rigurosa, y viceversa. 8) ¿En la molécula de DNA, qué uniones relacionan: a) dos desoxirribosas entre sí; b) dos bases enfrentadas; c) dos bases apiladas? 9) ¿Qué secuencias del DNA son propicias para la formación de estructura Z? ¿Existe dicho Z DNA in vivo? 10) Describa en detalle el proceso de replicación del DNA. a) Explique por qué al producirse la estructura en Y (horquilla de replicación) una de las cadenas hijas se sintetiza en fragmentos. b) Describa la acción de todas las enzimas involucradas en el proceso de replicación del DNA. 11) Describa en detalle el experimento de Meselson y Stahl. a) ¿Qué resultados experimentales (dibuje la posición de las bandas en los gradientes de cloruro de cesio) habrían obtenido Meselson y Stahl si la replicación del DNA fuera conservativa? ¿Y si fuera dispersiva? b) ¿Qué resultados habrían obtenido si hubieran alimentado a las bacterias primero con 14N (liviano), pasándolas luego a 15N (pesado), y analizando entonces el DNA al cabo de la primera, segunda y tercera generaciones? 10 IBMC 2011 B) PROBLEMAS PROBLEMA 1 a) En la figura señale, englobando con un trazo continuo, lo siguiente: 1- un nucleótido 2- un nucleósido 3- una base púrica 4- una base pirimídica 5- un puente de hidrógeno 6- una unión fosfodiéster 7- un extremo 3’ 8- un extremo 5’ 9- una desoxirribosa b) ¿Qué peso molecular promedio tiene un DNA de cadena doble de 150 pares de bases de longitud? Dato: PM de un par de nucleótidos apareados = 650 Da PROBLEMA 2 A diferencia de los bacteriófagos de la familia T (T2 o T4), el fago M13 no infecta a E. coli mediante la inyección de su DNA al citoplasma, sino que penetra entero con su cápside proteica de la cual es desnudado dentro de la bacteria. ¿Le parece a Ud. que Hershey y Chase (experimento del fago T2 marcando proteínas con 35S y DNA con 32P, licuadora, etc.) habrían llegado a las mismas conclusiones que llegaron si hubieran usado el fago M13 en lugar del T2? ¿Por qué? PROBLEMA 3 Un segmento de DNA de cadena simple tiene la siguiente composición de bases: A 31,5% C 23,7% T 17,1% G 27,7%. ¿Cuál sería la composición de bases de la cadena complementaria? ¿Cuál sería la composición de bases de la forma de doble cadena de dicho segmento? 11 IBMC 2011 PROBLEMA 4 Dadas las siguientes moléculas de ácidos nucleicos de cadena doble: i) AAGTTCTCTGAA TTCAAGAGACTT ii) GTCGTCAATGCA CAGCAGTTACGT iii) GGACCTCTCAGG CCTGGAGAGTCC Señale verdadero o falso y justifique: a) Ninguna de las tres moléculas puede ser degradada por una RNasa. b) Las tres moléculas tienen igual temperatura de fusión (Tm) porque tienen la misma longitud. c) Las 3 tienen igual Tm porque [T]/[A] = 1 y [G]/[C] = 1 (Reglas de Chargaff) d) Las dos hebras de cada una de ellas son antiparalelas. e) Tm a > Tm b > Tm c f) Tm b > Tm a > Tm c g) Tm c > Tm b > Tm a h) Tm a > Tm c > Tm b PROBLEMA 5 Explique el siguiente gráfico, obtenido midiendo la absorbancia (A) de luz UV de dos muestras de DNA sometidas cada una a calentamiento gradual: a) ¿A qué corresponden T° I y T° II? b) ¿A qué corresponden Aa y Ab? c) ¿Qué diferencia existe entre el DNA de la curva I y el de la curva II? d) ¿Cómo haría el experimento para determinar la T° I y la T° II? e) Grafique la curva correspondiente a una muestra de DNA II al doble de la concentración original manteniendo proporcionalmente la concentración de sales. PROBLEMA 6 ¿Qué consecuencias tendría para una bacteria la pérdida, por mutación, de la actividad nucleasa de 3' a 5' de la DNA polimerasa III? Justifique. 12 IBMC 2011 PROBLEMA 7 En un tubo de ensayo se agregan los siguientes componentes para la síntesis de DNA in vitro: - DNA molde: DNA circular de cadena simple (7,3 kb) (ver figura) - cebador o "primer" (ver figura) - dATP (desoxiadenosina trifosfato) - dGTP (desoxiguanosina trifosfato) - dCTP (desoxicitidina trifosfato) - dTTP (desoxitimidina trifosfato) - buffer conteniendo Mg2+ - DNA polimerasa I purificada a) ¿Qué producto de reacción se obtiene? b) ¿Qué productos se obtendrán si al final de la reacción de la DNA polimerasa I se agrega la enzima de restricción* EcoRI? c) ¿Y si se agregan EcoRI y BamHI juntas? d) ¿Por qué no es necesario añadir primasa, helicasa o DNA girasa para que se produzca la síntesis de DNA in vitro como la descripta arriba? * Las enzimas de restricción cortan secuencias específicas de DNA de cadena doble. Prácticamente todas, incluyendo EcoRI y BamHI, son incapaces de cortar DNA de cadena simple. PROBLEMA 8 En un experimento, se usaron bacterias E. coli a las cuales se les introdujo el gen de una proteína de medusas que emite fluorescencia verde, llamada “green fluorescent protein” (GFP). Este gen había sido previamente modificado in vitro de la siguiente manera: su DNA estaba formado por una hebra con secuencia normal (wild-type) acompañada de su hebra complementaria que tenía una mutación, de modo de crear un apareamiento erróneo o mismatch en uno de sus pares de bases, es decir que no cumple las reglas de Watson-Crick. (Tal mismatch en la doble hélice resultó estable en estas bacterias porque éstas tenían mutaciones en algunos de sus genes, que les impedían hacer la habitual reparación de mismatches). Luego de la modificación genética mencionada, las bacterias fueron sembradas inmediatamente en una placa de Petri que tenía medio de cultivo sólido, y dejadas en estufa a 37ºC. Teniendo presente los resultados del experimento de Meselson-Stahl, y que la mutación descripta anula la fluorescencia de la GFP, ¿Qué tipo de colonias esperaría Ud. ver al día siguiente?: - colonias blancas, - colonias verdes, - colonias de color mixto (es decir, colonias con una mitad blanca y la otra mitad verde), - algunas blancas y algunas verdes. 13 IBMC 2011 PROBLEMA 9 Se quiere determinar la presencia de secuencias correspondientes al genoma del virus del SIDA insertado en el DNA de linfocitos T de un paciente. Los linfocitos son un tipo de células de la sangre pertenecientes al conjunto de los glóbulos blancos. En un tubo de ensayo se agregaron los siguientes componentes para una reacción de amplificación de DNA por PCR (reacción en cadena de la polimerasa): - DNA molde: DNA total obtenido de linfocitos de un paciente que tiene anticuerpos antiretrovirus HIV circulantes en sangre. - "primer" a, de 20 nucleótidos, cuya secuencia es complementaria a la hebra de abajo del molde en la región a. - "primer" b, de 22 nucleótidos, cuya secuencia es complementaria a la hebra de arriba del molde en la región b. - dNTPs (los cuatro desoxinucleósidos trifosfato). - Buffer conteniendo magnesio. - Taq polimerasa (DNA polimerasa de Thermus aquaticus). Se realizan 30 ciclos de amplificación en un termociclador automático computarizado. Cada ciclo consiste en: 1) Desnaturalización: 30 seg a 94°C 2) Apareamiento: 60 seg a 42°C 3) Extensión: 30 seg a 72°C Preguntas: a) ¿Cuál es la longitud (en pares de bases) del producto de la PCR? b) ¿Cuál es el peso molecular del producto de la PCR? c) ¿Cuál es la masa aproximada de producto obtenida al cabo de 30 ciclos, si se partió de un material conteniendo 10 moléculas de molde (genoma viral)? Considere que el nº de moléculas de producto puede calcularse aproximadamente como x.2n, donde x = nº de moléculas de molde y n = nº de ciclos. d) ¿Cuál sería el producto de PCR si se omitiera… i) uno de los "primers"? ii) los dos "primers"? iii) el DNA molde? e) ¿Cuál sería el producto de PCR si se reemplazara… i) el DNA molde por DNA obtenido a partir de células de raíz capilar del mismo individuo? ii) el DNA molde por ácido nucleico del virus HIV purificado? iii) el "primer" a por otro de 20 nucleótidos, pero de secuencia complementaria a la hebra de arriba de la región a? iv) la Taq polimerasa por la DNA polimerasa I de E. coli ? f) Dado que la PCR es extremadamente sensible, que controles realizaría para descartar una eventual contaminación. Dato: PM de un par de nucleótidos apareados = 650 Da 14 IBMC 2011 PROBLEMA 10 Se desea amplificar por PCR un determinado segmento de DNA genómico como el señalado en la parte de arriba de la Figura 1. La mezcla de reacción contiene la muestra de DNA genómico, desoxirribonucleósidos trifosfato, buffer de pH 7 conteniendo magnesio, los dos oligodesoxirribonucleótidos “primers” (I y II) y la Taq polimerasa. Al cabo de 30 ciclos de PCR, se obtiene una gran cantidad de producto de PCR. Preguntas: a) ¿Cuál de los esquemas de la Figura 1 (A, B, C o D) corresponde al producto de PCR? Justifique. b) ¿Qué paso de la PCR evita la necesidad de agregar helicasa a la mezcla de reacción? Justifique. c) La Taq polimerasa no tiene actividad 3’-5’ exonucleasa. ¿Qué consecuencias tiene este hecho para el producto de PCR? d) Si los “primers” fueran parcialmente complementarios a las secuencias del DNA molde, ¿en cuáles de las siguientes condiciones experimentales sería conveniente trabajar para que se apareen a las mismas y la reacción de PCR pueda ocurrir? i) ¿alta o baja concentración salina? ii) ¿alta o baja temperatura en la etapa del apareamiento? iii) ¿alta o baja concentración de un agente desnaturalizante (por ej., dimetilsulfóxido) en la mezcla de reacción? Elija una opción en cada caso y justifique. e) La secuencia a amplificar tiene un 50% de T y A. Con el objeto de obtener un producto de PCR radiactivo, un investigador agregó a la mezcla de reacción, al comienzo del primer ciclo, exceso de desoxiATP marcado con fósforo 32 (radiactivo) en su fosfato gamma (γ) (ver Figura 2). Para su sorpresa, el producto de PCR no resultó radiactivo. ¿Por qué? ¿Qué error cometió el investigador? Justifique. 15 IBMC 2011 PROTEÍNAS A) GUÍA DE ESTUDIO DE PROTEÍNAS I Y II 1) ¿Cuáles son los aminoácidos que forman parte de las proteínas? ¿Cuáles son polares y cuáles no polares? ¿Qué aminoácidos están cargados positivamente y cuáles negativamente a pH neutro? 2) Nombre 3 aminoácidos básicos, 2 ácidos, 2 que contengan azufre, y 2 con restos aromáticos. 3) Describa las características de las siguientes uniones que participan en proteínas: a) peptídica, b) puente de hidrógeno, c) fuerzas de Van der Waals, d) puente disulfuro, e) unión hidrofóbica, f) unión iónica o electrostática. ¿Cuáles de éstas son necesarias para formar una alfa hélice o una hoja plegada β? 4) Defina estructura primaria, secundaria y terciaria de una proteína. 5) ¿Puede una proteína sintetizarse como un único polipéptido y después de alguna modificación post-traduccional convertirse en una proteína formada por dos polipéptidos? Averigüe en la bibliografía qué pasa con la insulina. 6) ¿Qué se entiende por modificaciones post-traduccionales de las proteínas? Mencione algunas de ellas. 7) ¿Cuáles son las diferencias entre una proteína globular y una fibrosa? Dé ejemplos de ambas. 8) ¿Qué es la cromatografía de afinidad? Diseñe un experimento en el que utilizándola Ud. pueda purificar a la proteína que se une específicamente a la insulina (receptor de insulina). 9) ¿Cuál es el efecto de los siguientes tratamientos sobre una proteína nativa en solución acuosa: urea, mercaptoetanol, SDS (dodecilsulfato de sodio), hidrólisis ácida fuerte, calentamiento a 90ºC. 10) Mencione las características de las enzimas. Defina: sustrato, producto, energía de activación, sitio activo, cofactor. 11) ¿Qué diferencia existe entre una coenzima y un grupo prostético? 12) ¿Qué es una enzima alostérica? ¿El fenómeno de alosterismo está solamente restringido a las enzimas? ¿Qué es el efecto cooperativo? 13) Señale cuáles de las siguientes sustancias son proteínas y cuáles no: anticuerpos hemoglobina miosina (músculo) enzimas actina (músculo, citoesqueleto) clorofila interleuquinas aspirina celulosa (vegetales) bilirrubina caseína (leche) quitina (hongos, insectos) receptores hormonales queratina (piel, pelo) insulina albúmina (plasma sanguíneo) plastoquinona caroteno adrenalina represor del operón lac sacarosa genes 16 IBMC 2011 acetilcolina colágeno antígenos factores de transcripción transcriptasa reversa del virus del SIDA factores de crecimiento de células animales penicilina (antibiótico) fibroína (seda) colesterol telomerasa toxina del cólera 14) Se suele estimar la concentración de proteínas por absorción de luz ultravioleta (UV). ¿Cuáles son los aminoácidos responsables de dicha absorción? 15) ¿En qué consiste la técnica de Western blot? 17 IBMC 2011 B) PROBLEMAS DE PROTEÍNAS I PROBLEMA 1 ¿Provoca la sustitución de un aminoácido por otro necesariamente una disminución en la actividad biológica de una proteína? Discuta en qué casos sí. PROBLEMA 2 Dibuje los siguientes tipos de proteínas: a) Con una subunidad y 3 dominios estructurales. b) Con 3 subunidades y 3 dominios estructurales. c) Con 2 subunidades y un dominio estructural. PROBLEMA 3 Aproximadamente, ¿cuántos aminoácidos están contenidos en una proteína de PM = 32.000 Da, sabiendo que el peso molecular promedio de un aminoácido en la cadena polipeptídica es de 110 Da? ¿De dónde proviene este valor de 110 Da? PROBLEMA 4 Un péptido de 12 aminoácidos es sometido a 3 tratamientos por separado: i) corte con tripsina, produciéndose los péptidos Val-Ala-Phe-Leu-Lys, Pro-Trp-Pro-Arg y Val-Met-Gly (la tripsina corta el enlace peptídico hacia el C-terminal de lisinas o argininas). ii) corte con carboxipeptidasa, observándose liberación inicial de Gly (la enzima carboxipeptidasa remueve el aminoácido C-terminal de cualquier proteína, cortando el enlace peptídico formado entre el aminoácido terminal y el anteúltimo). iii) corte con una proteasa capaz de cortar sólo hacia el N-terminal de las alaninas, generando en este caso un pentapéptido y un heptapéptido. ¿Cuál es la secuencia aminoacídica del péptido original? PROBLEMA 5 Ud. está buscando afanosamente una sustancia presente en el espárrago violeta de la Antártida, que cura (según dicen) el resfrío de los guanacos. En sus estudios termina purificando 2 proteínas que no le curan el resfrío a nadie, pero que dan cristales violetas muy bonitos. Ambas proteínas son muy distintas pero tienen el mismo peso molecular en condiciones nativas (40.000 Daltons). Tanto la proteína A como la B tienen 2 cisteínas. El análisis de la proteína A pura indica que tiene un solo tipo de aminoácido N-terminal (treonina), pero el análisis de la proteína B reveló la existencia de 2 tipos de extremos Nterminales (alanina y serina). a) ¿Qué le sugiere que las proteínas corridas en un gel PAGE-SDS, no teñido con azul de Coomassie, den bandas de color violeta? b) ¿Qué le indica la presencia de un solo tipo N-terminal en la proteína A y de dos tipos Nterminales en la proteína B? Ya sea en presencia o en ausencia de mercaptoetanol, la proteína A da una única banda de 40.000 Daltons en un gel de poliacrilamida con SDS. La proteína B, en cambio, da 2 bandas (una de 30.000 y otra de 10.000 Daltons) sólo cuando se la trata con mercaptoetanol. c) ¿Qué infiere de estos resultados respecto de la estructura cuaternaria de las proteínas A y B? d) ¿Por qué es tan diferente la respuesta al mercaptoetanol pese a que ambas proteínas tienen 2 residuos de cisteína? 18 IBMC 2011 PROBLEMA 6 La toxina diftérica es una proteína tóxica para células animales, debido a que posee una actividad enzimática capaz de inhibir la biosíntesis de proteínas. Consta de una sola cadena polipeptídica de 58.000 Daltons. La tripsina, en pequeñas cantidades, fragmenta esta cadena en dos partes, una de 37.000 Daltons y otra de 21.000 Daltons, pero sólo en ciertas condiciones, como se muestra en la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS de la figura. Explique por qué. Nota: En los tratamientos secuenciales, al final de su acción, se eliminó o inactivó el primer agente, antes de agregar el segundo. PROBLEMA 7 a) En base a las fórmulas mostradas, ¿por qué el represor del operón lac, proteína que normalmente se une a la lactosa, puede también unirse al IPTG? b) ¿Qué significa que el IPTG tiene mayor afinidad por el represor que la lactosa? Walter Gilbert, premio Nobel de Química 1980, en 1966 hizo el siguiente experimento que lo hizo famoso: Incubó bacterias E. coli, wild-type o mutantes, junto con IPTG marcado radiactivamente (14C). Luego rompió las células y puso los extractos resultantes en bolsitas de diálisis (cuyos poros dejan pasar moléculas pequeñas como el IPTG pero no proteínas) sumergidas en buffer salino. Luego de 5 horas, midió la radiactividad adentro y afuera de las bolsitas. Los resultados que obtuvo fueron (en unidades arbitrarias de concentración): 19 IBMC 2011 Cepa wild-type 125 100 2 Cepa mutante 841 475 78 Adentro Afuera Adentro, después de seguir dializando poniendo afuera gran volumen de buffer nuevo c) Se sabe que la mutante fabrica cantidades normales de proteína represora. Entonces, ¿qué características genéticas tiene la bacteria mutante? d) ¿Es reversible la unión del represor al IPTG? e) Walter Gilbert se propuso purificar la proteína represora. ¿Cree Ud. que estos experimentos lo ayudaron en su propósito? PROBLEMA 8 Ud. tiene que eliminar de la muestra de DNA de un paciente una gran cantidad de RNA que la contamina. Para ello, debe tratar a la solución que contiene a ambos con una enzima RNasa (ribonucleasa). Como las RNasas altamente purificadas son muy caras y Ud. no dispone de muchos fondos, decide comprar una RNasa que viene contaminada con trazas de DNasa (desoxirribonucleasa). Basándose en el conocimiento de que las RNasas son consideradas “termorresistentes” mientras que las DNasas no, decide pre-tratar la solución de RNasa comprada, calentándola por 10 minutos a 90ºC y transfiriéndola inmediatamente a un balde con hielo. Desafortunadamente cuando prueba su preparación así pre-tratada sobre su muestra, Ud. comprueba que ni el DNA, ni el RNA fueron degradados. ¿Qué error cometió Ud.? PROBLEMA 9 El 15% del peso de una célula de E. coli corresponde a proteínas. Si una célula de E. coli contiene 3.000 tipos diferentes de proteínas, y suponiendo un peso molecular promedio de 50 kDa para cada proteína, a) Estime el número total de moléculas de proteína en una sola célula. b) ¿Es posible calcular la cantidad de moléculas proteicas de cada clase? Datos: Suponga que la densidad del protoplasma es igual a la del agua. Suponga que la célula de E. coli es cilíndrica con una longitud de 2 micrones y un diámetro de la base de 1 micrón. Número de Avogadro = 6,02 x 1023 moléculas/mol Vol. cilindro: π.r2.h 20 IBMC 2011 C) PROBLEMAS DE PROTEÍNAS II PROBLEMA 1 La parte proteica de una glicoproteína tiene, en su estado nativo, un peso molecular de 105.000 Daltons (105 kDa). a) Deduzca su estructura cuaternaria (número de subunidades, PM de cada una de ellas, uniones que las estabilizan y glicosilación de subunidades) a partir de los resultados de los siguientes geles de poliacrilamida en los que se sembró la proteína pura, la cual fue previamente sometida a tres tratamientos (por separado) que se indican abajo. Al final de la corrida electroforética, los geles fueron teñidos con Coomassie Blue, que es un colorante azul que tiene afinidad por las estructuras peptídicas. b) ¿Qué tratamiento previo sugiere Ud. para determinar sin ambigüedad a qué polipéptido están unidas las moléculas de azúcar? c) La sensibilidad del Coomassie Blue es tal que es capaz de detectar a partir de aprox. 0,2 µg de proteína/banda. ¿Cree Ud. que es correcto afirmar que una proteína está pura si se observa una sola banda en un gel teñido con ese colorante? d) En el tratamiento 3, ¿cree Ud. que la enzima Endo-H se agregó antes o después de tratar con SDS y β-mercaptoetanol? PROBLEMA 2 La aldolasa es una proteína homo-oligomérica, soluble, de localización citoplasmática, con función bioquímica de enzima, presente en casi todos los organismos. Cumple un papel biológico muy importante en la glucólisis porque convierte la fructosa-bis-fosfato (molécula de azúcar de seis carbonos) en dos moléculas de tres carbonos cada una. Mutaciones en el gen que la codifica existen en muchas personas que sufren de intolerancia a la ingestión de dulces. La mutación puntual más frecuente en la población mundial es un cambio en el codón 149 que hace cambiar Alanina por Prolina. Un grupo de investigadores (Malay et al., J. Molecular Biology, marzo 2005) purificó la aldolasa nativa, de 160 kDa, y la mutada, de 40 kDa. La aldolasa salvaje fue cristalizada y examinada por difracción de rayos-X. De este análisis, se elaboró el modelo de estructura espacial para el monómero que se muestra en la Figura 1, del cual surgieron las siguientes observaciones: i) la Ala 149 interacciona con la Val 24 (por interacciones hidrófobicas) ii) la Arg 148 interacciona con el Glu 189 (por interacciones iónicas) y juntos se unen al sustrato iii) de las nueve Cys que tiene la proteína, la Cys 361 es la única bien expuesta como para situarse próxima a otra Cys en la misma posición de una subunidad vecina. iv) muchos aminoácidos hidrofóbicos están ocluidos en el interior de la molécula, interaccionando entre sí. 21 IBMC 2011 Además, con ambas proteínas se realizaron los siguientes experimentos por separado (Figura 2): A) fueron tratadas con urea y luego analizadas por métodos físico-químicos para evaluar el grado de plegamiento. B) fueron sometidas a electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) con SDS y urea, con o sin β-mercaptoetanol (MSH) C) fueron incubadas a distintas temperaturas y luego en presencia de fructosa-bis-fosfato para medir su actividad enzimática. Preguntas: a) ¿Cuántas subunidades tienen las moléculas de proteína salvaje nativa? ¿Y las de mutada nativa? b) ¿Por qué la urea provocó los resultados obtenidos en la figura 2A? c) Proponga un modelo de estructura tridimensional posible, al estilo del de la Figura 1 pero para la proteína mutada, que muestre las posiciones aminoácidicas resaltadas en la Figura 1 y que sea compatible con los resultados de los experimentos. Datos: Aminoácidos hidrofílicos: - polares: Ser, Thr, Asn, Gln 22 IBMC 2011 - básicos: Lys, Arg, His - ácidos: Asp, Glu Aminoácidos hidrofóbicos: Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp Otros aminácidos: Cys, Gly, Pro PM promedio de 1 aminoácido en el contexto de una proteína = 110 Da PROBLEMA 3 Un investigador letón tiene serios problemas para caracterizar una enzima que ha purificado y la acción que tiene sobre ella el compuesto X, un aparente activador. En la Figura 1 se ve una migración en un gel nativo de poliacrilamida, teñido con azul de Coomassie. En la calle 1, la proteína se incubó previamente con el compuesto X mientras que en la 2, no. Con el material proteico eluido a partir de cada una de las tres bandas del gel nativo (A, B y C), él hizo un ensayo de actividad, en presencia o ausencia del compuesto X (ver Tabla). fuente de enzima utilizada banda C banda A banda B actividad enzimática medida con X 100 100 2 actividad enzimática medida sin X 2 100 2 Ya bastante confundido, el científico letón decidió correr esos polipéptidos anteriormente extraídos a partir de cada una de las bandas (A, B y C) en un gel de poliacrilamida, pero esta vez con SDS (Figura 2). Luego de ver el resultado, respiró aliviado: 23 IBMC 2011 Preguntas: a) ¿Cómo es la estructura de la proteína y cómo la afecta el compuesto X? b) ¿Por qué en el gel nativo la muestra se siembra en el medio del gel? c) ¿Cómo explica que la banda A haya migrado más rápido que la B en el gel nativo? d) ¿Cómo haría para determinar si la enzima se une al compuesto X, y si lo hace, a qué subunidad? PROBLEMA 4 En los ’90, nuestro país fue sacudido por la noticia de la aparición de casos de cólera que fueron en aumento debido a malas condiciones sanitarias. Vibrio cholerae es la bacteria responsable de la diarrea aguda observada en esta enfermedad. El aislamiento y caracterización de la misma data del siglo antepasado. Sin embargo, su biología molecular y celular comenzó a conocerse recién en los años 80 del siglo pasado, debido principalmente a las investigaciones de John Mekalanos, de la Harvard Medical School. El proceso infeccioso implica la supervivencia de V. cholerae al pH ácido del estómago, su motilidad a través del intestino y la secreción por parte del vibrión de una toxina proteica de 87 kDa compuesta por los productos de 2 genes, llamados ctx A y ctx B. El producto de ctx A es un polipéptido de 27 kDa y el de ctx B, uno de 12 kDa. El polipéptido A sufre una modificación post-traduccional. Se realizaron los siguientes geles de poliacrilamida con la toxina purificada: Preguntas: a) Haga un dibujo de la molécula de toxina que muestre el n° de subunidades de cada clase, el tipo de unión entre las mismas y la característica saliente del producto del gen ctx A. b) ¿Cuántos aminoácidos tiene la toxina aproximadamente? Dato: PM de cada aminoácido = 110 Da. c) ¿De qué signo es la carga eléctrica neta de la toxina a pH = 7? ¿Cómo se modificaría su carga neta y actividad biológica a pH = 12? d) ¿Qué modificación post-traduccional sufre "in vivo" el producto de ctx A para explicar el resultado del gel con SDS y β-mercaptoetanol? PROBLEMA 5 Una proteína imaginaria, llamada heterodimerina, está formada por 2 subunidades unidas por puentes disulfuro según se indica en la figura. Se muestra también parte de la secuencia aminoacídica de la subunidad B, correspondiente a su porción carboxi-terminal, y un esquema del mRNA que la codifica con una porción de su secuencia nucleotídica. 24 IBMC 2011 a) ¿Cuántas bandas y de qué tamaño observaría en dos electroforesis (una con y otra sin tratamiento previo de la muestra con β-mercaptoetanol) en un gel de poliacrilamida con SDS de la heterodimerina pura? Justifique. La enfermedad hereditaria imaginaria, llamada heterodimerosis, es causada por una mutación en el gen B que produce una terminación prematura de la traducción del RNA mensajero de la subunidad B en el punto donde indica la flecha. b) ¿Cuántas bandas y de qué tamaño observaría en dos electroforesis (una con y otra sin tratamiento previo de la muestra con mercaptoetanol) en un gel de poliacrilamida con SDS de la heterodimerina pura de un paciente: i) homocigota para la mutación arriba mencionada? Justifique. ii) heterocigota para la mutación arriba mencionada? Justifique. PROBLEMA 6 En las neuronas de algunos mamíferos que presentan síntomas neurológicos severos, se ha encontrado una proteína de 30 kDa llamada PrS, que tiende a formar agregados insolubles. A esta proteína se le atribuyen: - la causa de la enfermedad. - propiedades infecciosas, ya que una pequeña cantidad (teóricamente una sola molécula) en una neurona puede desencadenar un daño importante como resultado de una propagación de la entidad molecular infectiva, y además, porque la enfermedad puede ser contagiosa. Curiosamente, en neuronas no infectadas existe una proteína de función desconocida y con idéntica secuencia de aminoácidos y las mismas modificaciones covalentes co- y posttraduccionales, llamada PrC, pero que ni se insolubiliza ni es infectiva. Un dato interesante es que la ausencia total de la proteína normal PrC (por ausencia del gen) no provoca enfermedad y hasta protege contra el riesgo de contraerla vía infección por PrS. Por otra parte, personas con ciertas mutaciones puntuales en el gen PrC (como por ejemplo las que causan el cambio de Glu en la posición 200 por Lys, o el cambio de Pro en la posición 102 por Leu) tienen tendencia a desarrollar espontáneamente los síntomas neurológicos sin estar infectados. Estudios in vitro con las proteínas purificadas demostraron que, además de la insolubilidad e infectividad, PrS y PrC difieren en su comportamiento frente a proteasas. Además, si se mezclan 1 µg de PrS (infectiva y resistente a proteasas) con 5 µg de PrC, la mezcla se vuelve tan infectiva y resistente a proteasas como 6 µg de PrS!! A partir de las evidencias mencionadas, deduzca: a) ¿A qué características estructurales de estas proteínas se deben las diferentes propiedades observadas entre PrC y PrS en cuanto a su solubilidad y resistencia a proteasas? b) ¿Qué características deben tener en común las PrC mutadas y PrS para explicar la existencia de la enfermedad neurológica de origen genético? c) ¿Qué propiedad adicional debe tener PrS para explicar la propagación del daño que causa in vivo y la transformación de PrC en los experimentos in vitro? ¿Cree Ud. que PrS y PrC son capaces de interaccionar entre sí in vitro e in vivo? d) ¿Por qué las neuronas sin PrC son resistentes a la infección? 25 IBMC 2011 PROBLEMA 7 Los climas extremos imponen límites a las diversas formas de vida. Sin embargo, a lo largo de la evolución se han seleccionado organismos que han logrado adaptarse a regiones inhóspitas. Un modelo eucariota de estudio de tal adaptación es el pez bacalao del Atlántico Norte (Gadus morhua), de gran tamaño (Fig. 1), que vive en las frías aguas costeras de Islandia y Noruega y que sirve de sabroso y codiciado alimento a sus habitantes. Las enzimas proteicas de estos organismos exhiben cierta flexibilidad, incluso en su sitio activo, de manera que son capaces de catalizar las reacciones con gran rapidez aun a bajas temperaturas, a diferencia de lo que sucede con los organismos que viven en regiones de climas más cálidos, llamados “mesófilos”. Una enzima muy estudiada de este pez es la fosfatasa, que está codificada por 1 solo gen. Este gen codifica un polipéptido de 477 aminoácidos de los cuales 8 son cisteína. Esta enzima contiene 1 solo sitio activo, no sufre proteólisis post-traduccional, y ninguna de sus 8 cisteínas se encuentra formando puentes disulfuro. Las Figuras 2 y 3 muestran las curvas de actividad enzimática en función de la temperatura y de concentraciones crecientes de urea (medida a 15ºC) respectivamente. Dado que la actividad enzimática se pierde completamente a la concentración de urea 4 M, se decidió investigar la variación de peso molecular (PM) estimado mediante columna de tamiz molecular (Sephadex) (Tabla 1) y del grado de plegamiento medido a 15ºC (Figura 4) de la fosfatasa de bacalao en función de las mismas concentraciones crecientes de urea usadas en la figura 3. Cada muestra de la Tabla 1 fue corrida en la columna de tamiz molecular a la concentración de urea indicada. 26 IBMC 2011 Preguntas: a) ¿Cuál es la estructura cuaternaria de la fosfatasa de bacalao? ¿Qué tipos de unión la estabilizan? Justifique. b) En base a los resultados de la Tabla 1 y de la Figura 4, ¿cuál es la causa molecular de que la fosfatasa de bacalao pierda su actividad a 4 M de urea? ¿En qué parte de la molécula de fosfatasa se encontrará el sitio activo de la enzima? c) ¿Qué eventos moleculares son responsables respectivamente de las partes ascendente y descendente de la curva de la Figura 2? Dibuje la curva esperable para la fosfatasa de salmón, un pez mesófilo. d) Una mutación puntual en el gen de fosfatasa de bacalao provoca el cambio de uno de sus codones AGC por TGC. La enzima mutada muestra el mismo comportamiento que la salvaje en el experimento de la Tabla 1. Sin embargo, el grado de desplegamiento en función de la concentración de urea es diferente para la fostafasa mutada comparando con la salvaje (Figura 5). Notablemente, si el grado de plegamiento se mide en presencia de mercaptoetanol, la curva de la fosfatasa mutada da igual que la de la normal. ¿Provocó la mutación la aparición de una nueva unión inter-o intrasubunidad? ¿Cuál es la causa molecular del diferente comportamiento de la enzima mutada frente a la urea? Justifique. e) En base a su respuesta a la pregunta d), ¿cuántas bandas y correspondientes a qué peso molecular observaría en electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS de fosfatasa salvaje y la mutada, corridas con y sin mercaptoetanol? Dato: PM promedio de 1 aminoácido = 110 Da. 27 IBMC 2011 BIOSÍNTESIS DE PROTEÍNAS y CÓDIGO GENÉTICO A) GUÍA DE ESTUDIO 1) ¿Con qué polaridad son sintetizadas las proteínas en los ribosomas? ¿Con qué polaridad es leído el mRNA? 2) Describa los procesos que tienen lugar luego de la llegada de un aminoacil-tRNA al ribosoma, hasta la llegada del siguiente aminoacil-tRNA. 3) ¿Qué quiere decir que el código genético es universal y degenerado? ¿Es estrictamente universal? 4) ¿Qué entiende por hipótesis del “wobbling”? ¿Qué son los tRNAs isoaceptores? 5) ¿Cuál es el codón de iniciación y cuáles los codones de terminación de la traducción? 6) ¿Qué función cumplen las aminoacil-tRNA sintetasas? 7) ¿Qué función cumple la peptidil-transferasa? ¿Se trata de una proteína? 8) ¿Cuál es la forma de las moléculas de tRNA? Señale los lugares donde se encuentra el anticodón y el sitio de unión a los aminoácidos. 9) ¿Qué entiende por tRNA supresor, y cómo se origina ese tipo de molécula? 10) Compare la estructura en subunidades y la composición de los ribosomas procarióticos y eucarióticos. 11) ¿Cuál es el efecto del cloranfenicol, actinomicina D, estreptomicina, puromicina y cicloheximida sobre la síntesis de proteínas: a) en procariotas y b) en eucariotas? 12) ¿Cuál es la diferencia entre un mensajero policistrónico y un mensajero que codifica para una poliproteína? Dé ejemplos. 13) Asigne verdadero o falso. a) El fMet-tRNAMet se une inicialmente a la subunidad 30S del ribosoma. b) El aminoácido se une covalentemente al ribosoma por medio de una peptidiltransferasa. c) El ribosoma 70S se disocia para formar partículas 30S Y 50S. d) Las cadenas laterales de los aminoácidos reconocen a los codones del mRNA. e) El tRNA reconoce a una molécula de DNA. f) El tRNA reconoce a un codón. g) El tRNA reconoce a un anticodón. h) La aminoacil-tRNA sintetasa reconoce al codón. i) Las moléculas de tRNA son sintetizadas a través de un mRNA intermediario. j) Las moléculas de tRNA se unen a los aminoácidos sin la necesidad de enzimas. k) El codón AUG no codifica para aminoácido alguno; es simplemente un codón de iniciación. l) El cloranfenicol y la cicloheximida inhiben a la peptidil transferasa. m) El PM de un polipéptido es siempre mayor que el del mRNA que lo codifica. 28 IBMC 2011 EL CÓDIGO GENÉTICO Y LA DESIGNACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS MEDIANTE LETRAS ÚNICAS 29 IBMC 2011 B) PROBLEMAS PROBLEMA 1 De arriba hacia abajo, la figura muestra 3 etapas consecutivas de la elongación de la traducción en los ribosomas. a) Identifique en los dibujos lo siguiente: extremos 5' y 3' del mRNA, extremo NH2-terminal del polipéptido naciente, extremos 5' y 3' de cada anticodón, sitios "A", "P" y "E" del ribosoma, uniones peptídicas, uniones covalentes no peptídicas, puentes de hidrógeno. b) Sabiendo que los círculos representan a los aminoácidos metionina (M), triptofano (W), fenilalanina (F) y ácido aspártico (D), asigne las bases que pueda al mRNA y a los anticodones. c) ¿En qué etapa actúa la peptidil transferasa? PROBLEMA 2 Una mutación puntual (C que cambia a G) en un gen bacteriano produce la aparición de un codón stop UAG en la mitad de su mensajero, lo cual provoca la pérdida de la capacidad de usar ácidos grasos como fuente de alimento. a) ¿Cuál es el aa codificado por el codón alterado? (utilice el código genético) Una segunda mutación (independiente de la primera) en un gen que codifica para un RNA de transferencia provoca la alteración de su anticodón de manera tal que se aparea con el codón stop UAG, incorporando el aminoácido tirosina en esa posición. Tal mutación suprime los efectos de la primera, restaurando a las bacterias su capacidad de alimentarse de ácidos grasos. 30 IBMC 2011 b) ¿Qué cambio de base es el que determina la segunda mutación? c) ¿Qué mecanismos garantizan: i) que se incorpore tirosina en las posiciones correctas de esa y otras proteínas? ii) la terminación de la traducción de aquellos mensajeros cuyo codón stop natural es UAG? d) Discuta las consecuencias fisiológicas que puede ocasionar a la bacteria la adquisición de esta nueva mutación supresora. PROBLEMA 3 La región codificante del gen de la Taq polimerasa (DNA polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus) comienza con la siguiente secuencia de nucleótidos como se muestra en el esquema: Preguntas: a) La Taq polimerasa tiene en total .............. aminoácidos, de los cuales los 300 primeros del extremo NH2 son responsables de la actividad exonucleasa de 5’a 3’; mientras que en el extremo COOH reside la actividad de polimerasa. Se sabe que además de la proteína completa de .............. kDa, T. aquaticus sintetiza a partir del mismo mRNA una proteína de 65,5 kDa, con plena actividad de DNA polimerasa y sin actividad 5’ a 3’ exonucleasa, como consecuencia de la iniciación en un codón interno para metionina. Dato: PM promedio para un aminoácido = 110 Da. b) ¿Cuál sería el efecto (sobre la síntesis de la proteína completa y sobre la corta) de la inserción de una A a la derecha de la T indicada en la figura? En su respuesta debe indicar cuáles actividades (exonucleasa, polimerasa o ambas) esperaría encontrar. c) Comparando las secuencias aminoacídicas de las DNA polimerasas de T. aquaticus y E. coli, se observa que hay un 38% de identidad de secuencia. Sin embargo, las secuencias nucleotídicas de los genes correspondientes no guardan identidad entre sí. Dé una explicación para este hecho en base al código genético. d) Thermus aquaticus tiene en sus ácidos nucleicos un contenido de G+C más elevado que E. coli. ¿Cuál puede ser la ventaja de este hecho para T. aquaticus? e) El gen de la Taq polimerasa tiene 76 codones para arginina distribuidos así: CGT 0 CGA 0 CGC 24 AGG 25 CGG 27 AGA 0 ¿Por qué piensa Ud. que estos organismos evolucionaron de manera de poseer esta particular distribución de codones sinónimos? PROBLEMA 4 Se aisló un antibiótico llamado edeína a partir de un cultivo bacteriano. La edeína inhibe la síntesis de proteínas, pero no tiene efecto sobre la síntesis de DNA (duplicación), ni sobre la de RNA (transcripción). Cuando se agrega a un sistema de síntesis de proteínas in vitro (lisado de reticulocitos), la edeína detiene la síntesis luego de un corto período de retardo (lag) (ver figura), a diferencia de la cicloheximida, que detiene la síntesis proteica inmediatamente. Un análisis de la mezcla de traducción in vitro muestra que luego de 5 minutos de tratamiento con edeína no quedan prácticamente polirribosomas y todo el mRNA aparece unido a subunidades ribosomales pequeñas (40S). 31 IBMC 2011 a) ¿Qué etapa de la síntesis proteica es inhibida por la edeína? b) ¿Por qué hay un retardo (lag) en el efecto inhibitorio de la edeína? c) ¿Esperaría Ud. que los polirribosomas desaparecieran al agregar cicloheximida? PROBLEMA 5 La ciclosporina A, producida por un hongo, es un polipéptido de poderosa acción inmunosupresora. De hecho, es utilizado para prevenir el rechazo de injertos de riñón o hígado. La incubación de linfocitos T con ciclosporina A marcada radiactivamente resulta en la inmediata acumulación de la droga en el citosol (citoplasma). Nunca se detecta la droga marcada asociada a la membrana plasmática. La ciclosporina A marcada del citosol se encuentra unida a un receptor de 17.000 Daltons de peso molecular. Una vez unida a su receptor, la ciclosporina A inhibe la aparición de la proteína interleuquina 2 (IL-2) en cultivos de linfocitos T. Este efecto podría deberse a uno o más de los siguientes fenómenos in vivo: 1) Inhibición de la transcripción del gen de la IL-2. 2) Estimulación de la degradación del mRNA de la IL-2. 3) Inhibición de la traducción del mRNA de la IL-2. 4) Destrucción de la IL-2 secretada. 5) Aumento de la rapidez de utilización de IL-2 secretada. Para determinar cuáles de estas hipótesis podrían ser correctas, se hizo una preparación de todos los RNAs poliadenilados de dos cultivos de linfocitos T, uno tratado y otro no tratado previamente con ciclosporina A. Cada una de las dos preparaciones de RNA poliadenilado fue ensayada en un sistema de traducción in vitro y se midió (por medio de anticuerpos específicos y electroforesis en geles) la cantidad de IL-2 fabricada (ver tabla). Preparación de RNA poliadenilado proveniente de: Linfocitos T no tratados con ciclosporina Linfocitos T tratados con ciclosporina Cantidad de IL-2 sintetizada in vitro (unidades arbitrarias) 100 1 Cantidad de actina sintetizada in vitro (unidades arbitrarias) 500 500 Nota: La actina es una proteína presente en todas las células eucariotas que es imprescindible para su estructura, forma y función. Preguntas: a) ¿A cuáles de los cinco niveles mencionados más arriba podría actuar la ciclosporina? b) ¿Qué objeto tiene medir en paralelo la cantidad de actina sintetizada? c) Vuelva a este problema luego de resolver Nucleicos II y proponga otros experimentos para confirmar la respuesta a la pregunta a). 32 IBMC 2011 PROBLEMA 6 En eucariotas, la subunidad pequeña (40S) se une al extremo 5'CAP de los mRNAs. Luego se desliza en dirección 3' y sólo se detiene al encontrar un AUG que se encuentre situado dentro de la secuencia adecuada, necesaria para que sea reconocido como iniciador. Se realizó un ensayo de traducción in vitro en un lisado de reticulocitos (libre de mRNA endógenos), al que se le agregaron distintas variantes (artificiales) de mensajero de una dada proteína, los cuales sólo diferían en las bases que aparecen en la figura. Se midió luego la cantidad de proteína correctamente sintetizada: Secuencia del mRNA alrededor del primer AUG 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9) 10) 11) 12) 13) 14) 15) 16) 17) 18) 19) 20) 21) 22) 23) 24) Cantidad de proteína sintetizada a partir del AUG resaltado en negrita (% respecto del máximo) 100 100 100 100 100 100 100 2 2 2 100 2 2 100 100 100 100 100 1 2 100 100 100 100 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' NN....NNNGGAUUAUGGNN....NN NN....NNNGGACUAUGGNN....NN NN....NNNGGAUCAUGGNN....NN NN....NNNGGAAUAUGGNN....NN NN....NNNGGAUAAUGGNN....NN NN....NNNGGAGUAUGGNN....NN NN....NNNGGAUGAUGGNN....NN NN....NNNGGAUUAUGUNN....NN NN....NNNGGAUUAUGCNN....NN NN....NNNGGAUUAUGANN....NN NN....NNNGGGUUAUGGNN....NN NN....NNNGGCUUAUGGNN....NN NN....NNNGGUUUAUGGNN....NN NN....NNNGCAUUAUGGNN....NN NN....NNNGAAUUAUGGNN....NN NN....NNNGUAUUAUGGNN....NN NN....NNNGGGCUAUGGNN....NN NN....NNNGCGAAAUGGNN....NN NN....NNNGGUUUAUGUNN....NN NN....NNNGGAUAAUGUNN....NN NN....NNNCGAUUAUGGNN....NN NN....NNNAGAUUAUGGNN....NN NN....NNNUGAUUAUGGNN....NN NN....NNNCCAUCAUGGNN....NN 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' El 1) es el mRNA original. Del 2) al 24) son variantes artificiales. a) Determine cuáles de los cambios impiden el reconocimiento del iniciador y cuáles no. b) Escriba una secuencia consenso para el contexto del AUG iniciador. c) ¿Habrá genes eucariotas que no posean esta secuencia consenso? d) La figura de abajo muestra dos mRNAs que tienen dos AUG cerca del 5'CAP. Determine, en cada caso, en cuál se iniciará la traducción y cuál será la secuencia de los primeros aminoácidos: i) ii) 5' NN....NNNUGUUUAUGUCACCAUGGUAGUNN....NN 3' 5' NN....NNNUGAUUAUGGCACCAUGGUAGUNN....NN 3' PROBLEMA 7 En el año 1961, un investigador llamado Dintzis (Proc. Natl. Acad. Sci. 47, 247,1961) hizo un experimento usando reticulocitos (células precursoras de los glóbulos rojos) enteros incubados a 15ºC en presencia de aminoácidos y otros nutrientes esenciales. Luego de 1 hora de incubación, agregó aminoácidos marcados todos radiactivamente y sacó 33 IBMC 2011 alícuotas a diferentes tiempos para analizar los productos marcados obtenidos. A los 4 minutos, observó que las únicas cadenas completas de hemoglobina α que estaban marcadas, lo estaban en el extremo -COOH, y que recién a los 60 minutos aparecían cadenas completas marcadas en su totalidad, incluyendo su extremo -NH2. a) ¿Con qué polaridad (direccionalidad) son sintetizadas las cadenas de hemoglobina α? b) ¿Por qué cree Ud. que Dintzis incubó a 15ºC y no a 37ºC? c) ¿Ud. cree que se puede generalizar en forma universal la respuesta a), es decir, que los resultados pueden ser extrapolables a todas las proteínas? PROBLEMA 8 Streptococcus pneumoniae, o neumococo, es una bacteria que infecta las vías respiratorias de los humanos y es difícil de atacar con los antibióticos tradicionales porque suelen aparecer cepas bacterianas resistentes a ellos. Por eso se están usando nuevos antibióticos más efectivos, como la evernimicina. El neumococo es normalmente sensible a este antibiótico, aunque también, pero muy esporádicamente, aparecen cepas resistentes. Para aislar el gen de la resistencia se hicieron los siguientes experimentos: Se sembraron ordenadamente y por duplicado bacterias provenientes de pacientes no tratados con evernimicina en dos placas de Petri, una conteniendo evernimicina y la otra no. Ambas placas se incubaron a 37ºC para que crezcan las colonias. La figura muestra lo observado al día siguiente: Se tomó la única colonia hallada en la placa 2. Se extrajo el DNA cromosómico y, al secuenciarlo, se comprobó que el único cambio de secuencia en todo el genoma respecto del genoma de las bacterias de las colonias que crecieron en la placa 1 y no en la placa 2 (bacterias sensibles) correspondía al gen del RNA 23S, el cual mostraba una mutación: en lugar de una C (presente en el gen de las sensibles), las resistentes mostraban una T. Se diseñaron dos pares de oligonucleótidos primers para PCR: Par I: capaz de amplificar al gen que tiene la T pero no la C. Par II: capaz de amplificar al gen que tiene la C pero no la T. Preguntas: a) ¿Cuál pudo ser la causa de la aparición de las bacterias resistentes de la figura? ¿Qué maquinaria enzimática “se equivocó”? b) El cambio C a T en el gen de RNA de 23S de la única colonia de la placa 2, ¿surgió como consecuencia de la presencia de la evernimicina o era pre-existente? ¿Con qué mecanismo evolutivo es consistente este resultado? ¿Con qué par de primers (I o II) se obtendría producto de PCR a partir de DNA de las siguientes colonias?: Placa 1: posiciones B3 y A5 Placa 2: única colonia (posición A5) c) ¿A qué macromolécula se uniría la evernimicina y qué actividad enzimática inhibiría en las bacterias sensibles? 34 IBMC 2011 ÁCIDOS NUCLEICOS II A) GUÍA DE ESTUDIO 1) Haga un esquema de un gen eucariótico típico. Señale qué porciones del gen se verán representadas en el mRNA maduro y qué porciones se verán representadas en la proteína que codifica. 2) ¿Qué significa que la TATA box (TATA) es una secuencia consenso? Escriba todas las secuencias posibles que caigan dentro del consenso de la TATA box. ¿Qué función cumpliría la TATA box? 3) Describa las diferencias entre los RNA mensajeros de procariotas y de eucariotas. 4) ¿Qué es un RNA mensajero policistrónico y en qué organismos se observa este tipo de mRNA? 5) Defina: a) gen, b) replicón, c) plásmido, d) intrón, e) exón, f) splicing, g) pseudogén 6) ¿A partir de qué sustratos se sintetiza RNA mensajero? ¿Sobre qué molde? ¿Se requiere cebador o “primer”? Describa las enzimas que realizan la transcripción en procariotas y eucariotas. 7) ¿La sustitución de una base por otra en una zona del DNA que codifica para proteínas (mutación puntual) da lugar necesariamente a un cambio de aminoácido? 8) Describa el mecanismo propuesto para el procesamiento (splicing) del RNA mensajero. ¿Qué entiende por splicing alternativo o diferencial? 9) ¿Cómo influye la temperatura y la concentración de sales en el grado de hibridación entre dos cadenas complementarias? ¿Cómo se puede lograr la hibridación entre dos cadenas con complementariedad parcial? 10) Además del splicing del RNA, ¿existe el "splicing" de proteínas? ¿Qué son las inteínas y las exteínas? ¿Para qué codifican las inteínas? 11) ¿Qué es una enzima de restricción? ¿De dónde se obtienen? ¿Para qué se usan? ¿Qué tipos de extremos pueden dejar en el DNA de cadena doble? 12) Complete las siguientes secuencias para que correspondan a posibles palíndromos reconocibles por una enzima de restricción: a) AGT b) CAA c) CCC d) ATC 35 IBMC 2011 B) PROBLEMAS PROBLEMA 1 ¿Cuáles de las siguientes preparaciones llevan secuencias de intrones? a) DNA cromosómico humano. b) DNA cromosómico de ombú. c) DNA cromosómico del protozoo Trypanosoma cruzi. d) DNA cromosómico de Escherichia coli. e) RNAs mensajeros citoplasmáticos humanos. f) RNAs nucleares precursores del mRNA (transcriptos primarios) de ratón. g) Un banco de cDNA (cDNA “library”) de trigo. h) Un banco de genes (genoteca o “gene library”) de trigo. i) RNA ribosómico maduro de cucaracha. j) RNA de transferencia (maduro) de chimpancé. k) DNA de mitocondrias de mamíferos. l) DNA de mitocondrias de levaduras. m) DNA de cloroplastos de girasol. PROBLEMA 2 Existe un solo gen para la fibronectina (FN) en cada célula de mamífero (en realidad dos copias, dos alelos, cuyas secuencias son idénticas). El gen tiene 70 kb de longitud. Sin embargo, se han encontrado en el citoplasma de fibroblastos dos RNA mensajeros de 7,7 y 8,0 kb de longitud, respectivamente. El de 7,7 kb es idéntico en secuencia al de 8,0 kb, excepto por el hecho de que carece de un segmento interno de 0,3 kb. a) ¿Cómo explica la gran diferencia de tamaño entre el gen (70 kb) y sus mensajeros (aproximadamente 8,0 kb)? b) ¿Cómo explica la existencia de dos tipos de RNA mensajeros de FN diferentes? Discuta los posibles mecanismos que pudieron originar los dos mRNAs. ¿Qué implicancias biológicas podría tener la presencia de los dos mRNAs? Ud. supone que algunos tejidos expresan el mensajero de 7,7 kb, mientras que otros sólo expresan el de 8,0 kb, y decide investigarlo usando hibridación de sondas de cDNA radiactivo a preparaciones de mensajero total de distintos tejidos. c) ¿Cuál de las dos especies de mensajero detecta en un Northern con cada una de las siguientes tres sondas? Justifique. i) un cDNA del mRNA de FN de 7,7 kb. ii) un cDNA del mRNA de FN de 8,0 kb. iii) un cDNA del mRNA del segmento diferencial de 0,3 kb. PROBLEMA 3 El splicing es una reacción enzimática por la cual se eliminan los intrones del RNA transcripto primario y los exones son unidos entre sí para formar el RNA maduro. Se ha descripto splicing en transcriptos primarios tanto de RNAs mensajeros (el más común) como de RNAs ribosomales y de transferencia (menos frecuentes). Las reacciones de splicing pueden ser reproducidas "in vitro", es decir, en un tubo de ensayo si se colocan en el mismo los sustratos adecuados y las enzimas o complejos enzimáticos correspondientes. Se estudiaron "in vitro" dos tipos distintos de reacciones de splicing: I) Splicing de un transcripto primario de RNA mensajero. II) Splicing de un transcripto primario de RNA ribosomal. Cada uno de los transcriptos primarios marcados radiactivamente fue incubado en presencia o en ausencia de una preparación nuclear enriquecida en spliceosomas. A distintos tiempos (de 0 a 2 hs de incubación) se tomaron muestras y se las sembró en calles 36 IBMC 2011 de un gel de poliacrilamida donde, luego de la electroforesis, se observan bandas radiactivas correspondientes a los sustratos, moléculas intermediarias y productos de las reacciones. La posición de cada uno de éstos está representada por diagramas, donde los rectángulos son exones y las líneas, intrones. I) Splicing de un transcripto primario de RNA mensajero Preguntas: a) Identifique sustrato, producto/s y molécula/s intermediaria/s de la reacción e interprete la variación con el paso del tiempo de las intensidades de cada banda en el panel de la izquierda. b) ¿Por qué el patrón de bandas del panel de la derecha es diferente? c) ¿Qué patrón de bandas habría obtenido en los siguientes experimentos en los que la preparación de spliceosomas hubiera sido pretratada de las siguientes maneras: i) Calentamiento a 100ºC por 10 minutos y enfriamiento rápido en hielo. ii) Digestión con una lipasa (enzima que degrada lípidos, es decir, grasas). iii) Digestión con una proteasa (enzima que degrada proteínas). iv) Digestión con una DNasa (enzima que degrada DNA). v) Digestión con una RNasa (enzima que degrada RNA). Nota: Las enzimas mencionadas fueron eliminadas antes de agregar la preparación de spliceosomas pre-tratada al tubo donde se ensaya la reacción de splicing in vitro. II) Splicing de un transcripto primario de RNA ribosomal 37 IBMC 2011 d) Identifique sustrato, producto/s e intermediario/s de la reacción e interprete la variación con el paso del tiempo de las intensidades de cada banda en el panel de la izquierda. e) Dado que los patrones de bandas son idénticos en ambos paneles, es decir en presencia o en ausencia de preparación de spliceosomas, ¿qué puede Ud. concluir sobre el mecanismo del splicing de este RNA ribosomal comparativamente con el del RNA mensajero? f) ¿En cuál de los dos splicings estudiados (I o II) será crítica la estructura secundaria del transcripto primario para que la reacción ocurra? g) ¿Cuál podría ser la causa de que la cantidad de la forma varíe con el tiempo de incubación de manera diferente de la cantidad de la forma ? PROBLEMA 4 Un cultivo de células de embrión de pollo (cultivo normal) produce grandes cantidades de la proteína X. Cuando estas células en cultivo son infectadas con el virus de sarcoma (cultivo infectado) las células no mueren, pero en ellas ya no se detecta actividad biológica de la proteína X. Por otra parte, existe un tipo de células de embrión de pollo que no presenta actividad biológica de la proteína X en ninguna condición (cultivo mutante). Se dispone de un clon de cDNA de la proteína X y de anticuerpos anti-proteína X (que reconocen a la proteína X tanto nativa como desnaturalizada). Estos reactivos son utilizados como “sondas” en los siguientes experimentos de Southern, Northern y Western: Complete los lugares donde haya puntos suspensivos y responda cada pregunta: a) Sabiendo que el clon de cDNA usado como sonda no posee sitios para la enzima PvuII y que existe un solo gen para la proteína (2 alelos) por genoma, ¿qué indica la presencia de 3 bandas de hibridación en los carriles a y b del experimento de Southern? b) ¿A qué nivel está afectada la actividad de la proteína X en el cultivo infectado? c) ¿Y en el cultivo mutante? d) ¿Qué conclusiones le sugiere la existencia de 2 bandas de hibridación en los carriles A y B del experimento de Northern? e) El mRNA más largo de la proteína X es de 6 kb. Este mRNA daría una proteína de a lo sumo .............. aminoácidos. El peso promedio de cada residuo aminoacídico es 110 Daltons, por lo tanto el polipéptido más grande de la proteína X debería pesar ............. Daltons. ¿Cómo se explica que la banda más grande en el Western presente un PM aparente mayor (300.000 Daltons)? 38 IBMC 2011 PROBLEMA 5 El gen Bdf codifica para la proteína BDF, un factor de transcripción que controla la transcripción de diversos genes involucrados en la diferenciación del tejido óseo en los vertebrados. La Figura 1 muestra que la transcripción del gen Bdf es "despertada" por la unión de otro factor de transcripción, la proteína BAF, a un enhancer que está presente en la región promotora del gen Bdf. El transcripto primario del gen Bdf puede ser procesado por "splicing" alternativo generando 2 mRNAs distintos, uno con y otro sin el exón 3. Nunca los dos tipos de mRNAs se dan simultáneamente en el mismo tipo celular o tejido. Uno de los dos mRNAs da polipéptidos de BDF activos y el otro no. La inclusión del exón 3 en el mRNA es provocada por la unión específica de la proteína SF2 (factor de splicing alternativo) a una secuencia de 9 bases presente en el exón 3 del transcripto primario. Preguntas: a) Ubique la señal y el sitio de corte y poliadenilación, y la TATA box en las regiones que corresponda en los esquemas del gen, del transcripto primario y de los mRNAs de la Figura 1. b) Defina secuencia palindrómica. ¿Cuáles de los elementos nombrados en el gen Bdf en la Figura 1 generalmente corresponden a secuencias palindrómicas? c) ¿Cuántas bandas de hibridación y de qué tamaño en pares de bases (pb) se observaría en un Southern de DNA genómico humano digerido simultáneamente con las enzimas de restricción BamHI y HindIII, en dos experimentos distintos: uno hibridado con una sonda correspondiente al exón 2 y otro hibridado con una sonda correspondiente al exón 4? Si lo considera necesario ayúdese con esquemas. 39 IBMC 2011 Se analizó la expresión del gen Bdf en 3 tejidos humanos (sangre, hueso e hígado) mediante las técnicas de Northern y Western (Figura 2). En el Northern, se corrieron RNAs de los 3 tejidos mencionados en 3 calles separadas en geles de agarosa, transferidos e hibridados con una sonda correspondiente al exón 2. En el Western, se corrieron proteínas de los 3 tejidos mencionados en geles de poliacrilamida con SDS, sin y con pre-tratamiento con β-mercaptoetanol (β-MSH), transferidas y reveladas por un anticuerpo contra la porción de la proteína BDF codificada por el exón 2. d) Asigne los tamaños en bases a las bandas de mRNAs α y β del Northern. e) Calcule y asigne los pesos moleculares en Daltons a las bandas b y c del Western. El PM de la banda a es de aproximadamente 42 kDa. PM de un aminoácido = 110 Da. f) ¿Para cuál de los 3 dominios característicos de los factores de transcripción (unión al DNA, dimerización y transactivación) codifica el exón 3? ¿Cuál es la estructura cuaternaria de BDF? g) ¿En cuál/es de los 3 tejidos analizados será activo el factor de transcripción BDF? h) Teniendo en cuenta que la velocidad de degradación de los mRNAs de BDF es igual en todos los tejidos, ¿en cuál/es de los 3 tejidos analizados esperaría Ud. que se exprese la proteína BAF? i) ¿En cuál/es de los 3 tejidos analizados se expresa la proteína SF2? j) Las proteínas BAF, BDF y SF2 participan en el mecanismo de diferenciación del tejido óseo. Sin embargo la tabla muestra que los correspondientes knock outs tienen fenotipos muy diferentes. ¿Cómo explica cada uno de ellos? GEN KNOCKEADO Baf (codifica para proteína BAF) Bdf (codifica para proteína BDF) Sf2 (codifica para proteína SF2) FENOTIPO DEL RATÓN Normal (indistinguible del salvaje) Nace y crece con deficiencias en el desarrollo óseo Letal embrionario k) Dos mutaciones distintas en el medio del exón 3 provocan el mismo fenotipo: la ausencia de actividad de la proteína BDF. ¿Por qué mecanismo actúa cada una de ellas? Aminoácidos Hebra codificante Glu Arg Asp 5'…GAA AGA GAC…3' SALVAJE 5'…GAA TGA GAC…3' MUTANTE 1 5'…GAA CGA GAC…3' MUTANTE 2 40 IBMC 2011 PROBLEMA 6 Se utilizó la construcción de la Figura 1 para obtener ratones transgénicos. En dicha construcción se clonaron el gen de la alternatina (proteína de nombre imaginario) de ratón, bajo las órdenes del promotor y región regulatoria del gen de la antitripsina y el cDNA de la proteína SF2 de ratón, bajo las órdenes del promotor y región regulatoria del gen de la metalotioneína. Ambas unidades transcripcionales fueron separadas por un segmento de DNA "nexo" que no codifica para nada ni tiene actividad regulatoria de la transcripción. Preguntas: a) ¿Qué longitud (en nucleótidos) tienen el transcripto primario y los 2 mRNAs maduros de "alternatina" que se producen por "splicing" alternativo del exón 2? b) ¿Qué peso molecular tienen los 2 polipéptidos de "alternatina", sabiendo que las regiones 5' y 3' no codificantes de su gen son de 100 y 70 pb respectivamente? PM 1 aa = 110 Da. c) ¿Qué peso molecular tiene la proteína SF2 sabiendo que las regiones 5' y 3' no codificantes de su gen son de 50 y 110 pb respectivamente? d) Para identificar cuáles de las crías eran transgénicas se preparó DNA genómico de las colas de los ratoncitos, se lo digirió con la enzima de restricción Eco RI, y se lo sometió a la técnica de Southern, usando como sondas de hibridación o bien al intrón 1, o bien al intrón 2 del gen de "alternatina". i) ¿Qué resultados habría esperado (número de bandas y tamaño) sabiendo que río abajo del gen endógeno de "alternatina" las secuencias del cromosoma de ratón no tienen nada que ver con lo que se encuentra río abajo de dicho gen en la construcción de la figura? ii) ¿Cuál de las 2 sondas es informativa para saber qué ratones son transgénicos y cuáles no? Justifique. 41 IBMC 2011 e) En aquellas condiciones y tejidos del transgénico en que ambos promotores están encendidos, la construcción de la Figura 1 produce 3 tipos de mRNAs: los 2 de "alternatina" y el de SF2. ¿Cuantos tipos de mRNAs maduros se producirán en las mismas condiciones y tejidos de una construcción idéntica a la de la Figura 1, pero que llevara una mutación que altere la secuencia AATAAA del exón 3 del gen de "alternatina", anulando su función? Justifique. Mediante la técnica de Northern se estudió la expresión de los mRNAs de "alternatina", SF2 y actina en preparaciones de RNA de cerebro e hígado de ratones normales (no transgénicos), transgénicos para la construcción de la Figura 1, y transgénicos para la misma construcción a los que se suministró agua de beber con exceso del ión Zn2+ desde el nacimiento. Los resultados se encuentran en la Figura 2. f) Interprete los resultados. Su interpretación debe justificar la ausencia, presencia e intensidad de bandas detectadas por cada sonda en los 2 tejidos de cada tipo de ratón. g) La proteína SF2 se localiza normalmente en el núcleo y es capaz de reconocer y unirse específicamente a ciertas secuencias de los RNAs transcriptos primarios. En base a esta información y a los resultados anteriores, ¿que función le parece a Ud. que tiene esta proteína? h) ¿Qué resultados de Northern se obtendrán si se genera un ratón transgénico con una construcción idéntica a la de la Fig. 1 pero con una mutación en el cDNA de SF2 que introduce un codón stop de la traducción prematuro, localizado a 5 codones río abajo del ATG iniciador, y se le da de beber agua con exceso de Zn2+? Justifique. i) ¿Por qué dicha mutación no provoca la degradación del mRNA de SF2 por NMD (nonsense mediated mRNA decay)? j) ¿A qué se debe la transcripción tejido-específica del transgén de "alternatina"? ¿Y la transcripción activable por Zn2+ del transgén de SF2? PROBLEMA 7 En un filtro de nitrocelulosa como el de la Figura 1 se depositaron 24 clones genómicos distintos conocidos (es decir, se sabe exactamente a qué gen corresponde cada uno) en forma de manchas circulares ordenadas en una matriz A1, A2,...; B1, B2,....; etc. Todos los clones habían sido obtenidos con el mismo vector plasmídico y los 24 insertos corresponden a 24 genes humanos diferentes. 42 IBMC 2011 El DNA depositado en las manchas fue inmovilizado y desnaturalizado por tratamiento del filtro con NaOH 0,5 N. Luego el filtro fue hibridado en condiciones rigurosas con una sonda radiactiva correspondiente al DNA del vector plasmídico solo, lavado en condiciones rigurosas y expuesto a una película radiográfica, obteniéndose el resultado de la Figura 2. Esta técnica se llama "dot blot". Una vez obtenido el resultado, el filtro fue tratado con agua destilada a 100ºC durante 10 minutos, tratamiento (llamado "strip off") que despega y lava la sonda radiactiva hibridada pero no despega a los DNAs de los clones que habían sido inmovilizados en el filtro. Luego el filtro fue hibridado en condiciones rigurosas con una preparación de RNA mensajeros de hígado humano marcados radiactivamente, y luego del lavado y autorradiografía se obtuvo el resultado de la Figura 3. Por último, se realizó un nuevo "strip off" y el filtro fue hibridado en condiciones rigurosas con una preparación de RNA mensajeros de páncreas humano marcados radiactivamente y, luego del lavado y autorradiografía, se obtuvo el resultado de la Figura 4. Preguntas: a) ¿Cuál es la causa de que en la Figura 2 todas las manchas den hibridación positiva? b) ¿Cuáles de los 24 genes: i) se expresan solamente en hígado? ii) se expresan solamente en páncreas? iii) se expresan en ambos órganos? iv) no se expresan en ninguno de los dos órganos? c) Si unos de los clones llevara por inserto al gen de la insulina humana, ¿qué señal esperaría obtener en la coordenada correspondiente a ese clon en las Figuras 3 y 4? ¿Y para otro clon que llevara por inserto el gen de actina humana? d) ¿Por qué se usa agua destilada para el "strip off" y no agua de la canilla (grifo)? e) Los experimentos mostrados en este problema reflejan los principios de la moderna tecnología de los "chips" de DNA. La diferencia es que en lugar de un filtro de nitrocelulosa 43 IBMC 2011 se usa un soporte sólido del tamaño de un cubreobjetos; y en lugar de depositar un arreglo ordenado de sólo 24 genes, se hace un arreglo de todos los genes de un organismo (6.000 en la levadura, por ejemplo; ¿cuántos en el humano?). Dicho arreglo o chip puede ser hibridado, por ejemplo, con cualquiera de las preparaciones que se listan al final de este párrafo. Los patrones de hibridación del "chip" son analizados tanto cualitativamente como cuantitativamente por medio de computadoras. Discuta la utilidad de cada experimento. i) mRNAs marcados provenientes de distintos tejidos ii) mRNAs marcados provenientes de un mismo tipo celular en dos condiciones distintas, una antes y otra después del tratamiento con un medicamento. iii) mRNAs marcados provenientes de un tipo celular de fenotipo normal y otro de fenotipo canceroso. Busque información periodística, de divulgación científica o en la web sobre los "DNA chips", también llamados "DNA microarrays" y discuta su importancia. PROBLEMA 8 La pérdida de extremidades ha ocurrido en diversas líneas evolutivas de los animales. En los reptiles, por ejemplo, se sabe que las serpientes evolucionaron a partir de ancestros con cuatro patas. Lo mismo ocurrió en los mamíferos, donde los cetáceos (ballenas, delfines y orcas) provienen de ancestros cuadrúpedos. En este contexto resulta importante saber si la pérdida o reducción de extremidades fue un proceso gradual o abrupto y cuáles fueron los genes responsables de la misma. Un modelo muy valioso para estudiar este problema lo constituyen los "espinosos", que son peces de la especie Gasterosteus aculeatus. En los peces en general, los dos pares de aletas (anteriores y posteriores) son los equivalentes de las patas de los otros vertebrados. En los espinosos marinos, el par de aletas posteriores (llamadas también aletas pélvicas) se presenta como dos espinas punzantes (Figura 1, arriba). Sin embargo, los espinosos de agua dulce carecen de las dos espinas pélvicas o las tienen muy reducidas (Figura 1, abajo). Un grupo de investigadores de EEUU, Canadá e Islandia publicó el 15 de abril de 2004 un trabajo en Nature (Vol. 428, pág. 717-723) donde identificaron al gen responsable de la diferencia anatómica entre los espinosos marinos y de agua dulce. Se trata del gen Pitx1 (Figura 2), que codifica una proteína de 283 aminoácidos, que tiene un dominio homeótico en el medio. Una vez comprobado que el transcripto de Pitx1 no sufre ningún tipo de splicing alternativo, aislaron clones de cDNA a partir de mRNA de espinosos marinos y de agua dulce y, para su sorpresa, comprobaron que las secuencias de ambos tipos de clones eran idénticas. 44 IBMC 2011 Inmediatamente realizaron experimentos de Northern (Figura 3) con mRNAs extraídos de distintas partes de larvas de espinosos marinos y de agua dulce, usando como sonda radiactiva al cDNA. Las larvas todavía no han desarrollado aletas. Preguntas: a) ¿Cuál es la longitud en nucleótidos del mRNA maduro del gen Pitx1? Justifique. b) ¿Qué fenómenos ocurren en cada una de las dos posiciones numeradas como +1 y +3362? Justifique. c) ¿Entre el +1 y qué posición como máximo podría estar situado el ATG iniciador de la traducción del gen Pitx1? Justifique. d) Indique si se obtiene producto de PCR y en caso afirmativo de qué tamaño (longitud en pares de bases en los siguientes experimentos: i) Primers 1 y 2 usando como molde DNA genómico de espinoso ii) Primers 1 y 3 usando como molde DNA genómico de espinoso iii) Primers 2 y 3 usando como molde DNA genómico de espinoso iv) Primers 1 y 2 usando como molde cDNA de espinoso marino v) Primers 1 y 3 usando como molde cDNA de espinoso marino vi) Primers 2 y 3 usando como molde cDNA de espinoso marino e) ¿Qué función cumplirá la proteína codificada por el gen Pitx1. Justifique. f) En ratones existe un homólogo del gen Pitx1 de peces. El gen se expresa en diversas partes del cuerpo incluyendo la pelvis. El knockout homocigota de este gen produce severas alteraciones en diversas partes del cuerpo de las crías que les provocan una muerte prematura. Entre las alteraciones mencionadas figura una reducción del tamaño de sus extremidades posteriores. Teniendo en cuenta lo que pasa en ratones, el hecho de que las secuencias de los cDNAs de Pitx1 de espinosos marinos y de agua dulce son idénticas y los resultados de la Figura 3, ¿qué mutación del gen Pitx1 podría haber causado la pérdida de espinas en los espinosos de agua dulce y cómo alteraría su expresión? Justifique. 45 IBMC 2011 g) Si se comprobara que ninguna región del gen Pitx1 se encontrara mutada en los espinosos de agua dulce, ¿qué otro gen podría estar mutado y así causar la pérdida de espinas? Justifique. h) ¿Por qué la diferencia genética en los espinosos de agua dulce no causa otras alteraciones corporales y su muerte prematura, a diferencia de lo que ocurre con el knockout de Pitx1 en ratones? Justifique. i) Los lagos post-glaciales en los que se generaron los espinosos sin espinas son muy recientes en términos geológicos. ¿Es este hecho consistente o contradictorio con los datos del paper de Nature? Justifique. j) La presencia de espinas pélvicas en los espinosos marinos parece ser una adaptación defensiva contra peces predadores de estructuras bucales blandas. La ausencia de espinas pélvicas en espinosos de agua dulce parece ser una adaptación defensiva contra invertebrados predadores que atrapan más eficientemente a los espinosos con espinas pélvicas agarrándose de las mismas. Asigne verdadero o falso, justificando solamente las verdaderas: a) La presencia de invertebrados predadores en agua dulce provocó la aparición de mutaciones que causan la desaparición de las espinas pélvicas en los espinosos. b) La presencia de invertebrados predadores en agua dulce aceleró la aparición de mutaciones que causan la desaparición de las espinas pélvicas en los espinosos. c) El origen de la mutación que causa la desaparición de las espinas pélvicas es un hecho independiente de la presencia de invertebrados predadores en agua dulce. d) La mutación que causa la desaparición de las espinas pélvicas tiene valor adaptativo neutro en ambientes marinos. e) La mutación que causa la desaparición de las espinas pélvicas tiene valor adaptativo positivo en ambientes de agua dulce. PROBLEMA 9 En las plantas la luz controla la expresión de muchos genes involucrados en procesos importantes como el crecimiento, y la formación de flores y frutos. La molécula encargada de transferir la señal luminosa a estos efectos biológicos es una holoproteína llamada fitocromo. El fitocromo está constituido por una porción proteica (apofitocromo, de 240.000 Daltons de peso molecular nativo) unido a un grupo prostético no proteico (tetrapirrol) de bajo peso molecular. Existen dos formas del fitocromo, una llamada Pfr y otra llamada Pr. La conformación del apofitocromo es idéntica en las dos formas. Lo que las distingue es una distinta conformación del grupo prostético. La secuencia aminoacídica del apofitocromo no presenta motivos tipo cierre de leucinas, dedos de zinc o hélice-vuelta-hélice. En la oscuridad, las moléculas de fitocromo se encuentran como Pr. Si se iluminan las plantas con luz roja, ésta es absorbida por el grupo prostético, el cual cambia de conformación y el fitocromo se vuelve Pfr. Preguntas: a) Conociendo el PM nativo del apofitocromo (ver enunciado) y sabiendo que el mRNA del apofitocromo es de 4000 bases, que su región 5’ no codificante es de 50 bases y que su región 3’ no codificante es de 350 bases (incluyendo al codón “stop”), ¿cuál es la estructura cuaternaria del apofitocromo? Para facilitar los cálculos considere el PM de 1 aminoácido = 100 Daltons. Con el fin de averiguar cuál es el mecanismo por el cual el fitocromo controla la expresión de los genes vegetales se realizaron los siguientes experimentos: Cuando se detecta mediante anticuerpos fluorescentes específicos contra apofitocromo la localización del fitocromo en células vegetales mantenidas en oscuridad se observa la imagen de la izquierda. Si las células son previamente irradiadas con luz roja, se observa la imagen de la derecha. Resultados similares a los de la figura se obtienen si en ambos casos 46 IBMC 2011 se tratan además las células con cicloheximida, un inhibidor de la peptidiltransferasa eucariota. b) i) ¿Qué le indica el experimento 1 respecto de la localización del fitocromo y la influencia de la luz? ii) ¿Para qué se hizo el experimento control con cicloheximida? iii) Dibuje los resultados que habría obtenido en oscuridad y en luz roja si en lugar de usar anticuerpos contra al apofitocromo hubiera usado anticuerpos que reconocen al grupo prostético sólo en la conformación en que se encuentra como Pfr. Al someter a un extracto de proteínas nucleares vegetales a una cromatografía de afinidad en columna de fitocromo puro unido covalentemente a agarosa, ninguna proteína del extracto queda retenida en la columna si esta se hace en oscuridad. En cambio, si la columna es pre-irradiada con luz roja, una proteína llamada PIF queda específicamente retenida y así se la puede purificar. c) ¿Qué conclusiones saca de este experimento? Se comprobó que la proteína PIF es capaz de unirse al enhancer (DNA doble cadena) 5’CACGTG3’. Buscando genes que tuvieran este enhancer en su región promotora se encontró al gen que codifica para una proteína llamada MYB. MYB es una proteína dimérica cuyos polipéptidos tienen un motivo estructural tipo hélice-vuelta-hélice. La figura muestra un esquema del gen que codifica para MYB. d) ¿Qué función tendrá la proteína MYB? e) ¿Cómo afectarían a la expresión del gen MYB, a nivel del mRNA y su proteína, las siguientes mutaciones: i) Inserción de una base en el exón 2? ii) Inserción de una base en la posición inmediatamente río abajo del ATG? iii) Inserción de una base entre el TGA y la señal de poliadenilación? f) Dado que la secuencia CACGTG del promotor del gen MYB es un palíndromo de 6 bases, ¿por qué este promotor no es destruido por una enzima de restricción en la planta in vivo? g) ¿Por qué la estructura del gen MYB revela que es incorrecta la definición de exón como la porción del gen que se expresa en proteína? ¿Cuál es la definición más adecuada de exón? 47 IBMC 2011 Se realizaron Northerns de RNA de una planta normal (I) y 3 plantas mutantes (II, III y IV), previamente sometidas a oscuridad o a luz roja. En la hibridación se usó una mezcla de sondas para los mRNAs de MYB y de la proteína de expresión constitutiva actina. La mutante II es homocigota para un codón “stop” prematuro en el gen de PIF. La información para las mutantes III y IV se traspapeló, pero se sabe que una es una mutante homocigota que sólo fabrica la conformación Pfr del fitocromo (no puede cambiar a Pr), mientras la otra es una mutante homocigota para una deleción de la TATA box del gen MYB. h) i) Interprete los Northerns I y II del experimento 4 ¿Por qué dan distinto? ii) ¿Qué le indica la banda de hibridación de actina? iii) Identifique a cuál mutante corresponde cada uno de los Northerns III y IV. Justifique. iv) Dibuje los Northerns que obtendría con la planta normal y las 3 mutantes si usara una sonda que reconociera al mRNA de la proteína PIF, sabiendo que PIF se expresa en todos los tejidos de la planta y siempre de manera no regulada por la luz. i) ¿Cuál de los dos modelos de abajo (A o B) es compatible con los resultados de los experimentos de arriba? No lo justifique. Respecto del OTRO modelo (el que Ud. consideró incorrecto) justifique y describa TODOS los aspectos que son incompatibles con los resultados descriptos. 48 IBMC 2011 PROBLEMAS INTEGRATORIOS DE EJERCITACIÓN PARA EL PRIMER PARCIAL PROBLEMA 1 En la retina del ojo de los humanos existen dos tipos de células: los bastones y los conos. Los bastones expresan específicamente una proteína llamada rodopsina, la cual posibilita la visión en general. En cuanto a los conos, existen tres tipos celulares diferentes: los conos “azules”, los “rojos” y los “verdes”, expresando específica y exclusivamente cada uno de estos las proteínas conocidas como pigmentos visuales “azul”, “rojo” y “verde” respectivamente. Estos pigmentos son capaces de captar luz de los colores indicados por su nombre y el funcionamiento conjunto de los tres tipos de conos da por resultado la visión policromática. El gen del pigmento azul (gen A) se encuentra localizado en el cromosoma humano N° 7. En cambio, los genes de los pigmentos rojo (gen R) y verde (gen V) se encuentran uno al lado del otro (o sea, en tandem) en el cromosoma sexual X, no habiendo contraparte en el cromosoma Y. Cada uno de estos dos genes tiene su propio promotor y región regulatoria de la transcripción, y se transcriben de manera específica, es decir, el gen R sólo en los conos “rojos” y el gen V sólo en los conos “verdes”. Los genes R y V tienen secuencias nucleotídicas muy similares (98% de similitud), a tal punto que muchos sitios para enzimas de restricción se encuentran conservados en ambos genes. La Figura 2 muestra una estructura más detallada de ellos. Desde 1779 se conoce el carácter hereditario de la alteración en la visión en colores en humanos. Varones que tengan delecionado el gen R no ven el rojo y varones que tengan delecionado el gen V, no ven el verde. 49 IBMC 2011 a) Dibuje las bandas de hibridación que obtendría en un Southern de DNA genómico cortado simultáneamente con las enzimas de restricción Eco RI (E) y BamHI (B), obtenido de sangre de los siguientes individuos: - varón R+V+: tiene los dos genes sanos y enteros. - varón R+V-: tiene delecionado el gen “verde”. - varón R-V+: tiene delecionado el gen “rojo”. - varón R-V-: tiene delecionados ambos genes. Se utilizó como sonda a un clon de cDNA que contiene sólo los exones 1 y 2 del gen “verde”, marcado con 32P por “nick translation”. Esta sonda reconoce a ambos genes, aún en condiciones de alta rigurosidad de hibridación (baja sal). b) ¿Es el experimento anterior útil para determinar los genotipos de las cuatro personas? Justifique. c) Dibuje las bandas de Southern que hubiera obtenido de los mismos pacientes si en lugar de usar la sonda indicada se hubiera usado como sonda sólo al exón 5. ¿Hubiera sido este análisis tan informativo como el de la pregunta a)? Justifique. d) Una manera más rápida de efectuar el análisis de los cuatro individuos es realizando una PCR con “primers” específicos para el gen “verde” que se aparean a zonas de sus exones 4 y 5, según se ve en la Figura 3. Estos primers no se aparean con las secuencias de los exones 4 y 5 del gen “rojo”: Diga si detecta o no productos de PCR y de qué tamaño para cada uno de los cuatro individuos, habiendo usado como molde DNA genómico de sangre. e) ¿Qué productos de PCR y de qué tamaño habría obtenido en cada uno de los individuos si hubiera usado como molde cDNA total obtenido de retina? f) ¿Con cuál de las dos hebras (codificante o no codificante) se aparea el primer izquierdo? ¿Y el derecho? g) La deleción de la región del cromosoma X marcada como LCR en la figura 1 provoca una fuerte disminución de la transcripción de ambos genes R y V. ¿Qué función le atribuiría Ud. a la región LCR? ¿Qué motivos de secuencia aminoacídica esperaría Ud. encontrar en las proteínas que se unan a la región LCR? Justifique. h) ¿Qué fenotipo esperaría Ud. encontrar en un animal (cuyo mecanismo de visión policromática normal fuera similar al de los humanos) en el cual se haya introducido un transgén que llevara la región promotora del gen “rojo” incluyendo el LCR, colocada “río arriba” del gen de la toxina diftérica, una proteína que mata sólo a las células donde se fabrica. i) ¿Qué colores percibirán los humanos R-V- y los humanos que tienen delecionado el LCR? 50 IBMC 2011 PROBLEMA 2 Primera parte El factor de transcripción trimerina, que se fabrica sólo en células de la glándula mamaria, es producto de un gen maestro que determina la diferenciación de la glándula y activa la transcripción de los genes que producen p roteínas de la leche. La Figura 1 muestra la estructura del gen de la trimerina de ratón. El mRNA de este gen presenta splicing alternativo de su exón 3, que codifica para el dominio de transactivación de este factor de transcripción. En condiciones normales, en cada célula de la glándula mamaria se producen cantidades suficientes de los 2 mRNAs: el que incluye al exón 3 y el que lo excluye. La Figura 2 muestra la estructura cuaternaria de la proteína trimerina. Las 3 subunidades son producto del gen de la Figura 1. La subunidad α es producida por el mRNA que incluye al exón 3, mientras que las dos subunidades β, que son idénticas, son codificadas por el mRNA que carece del exón 3. Preguntas: a) ¿El sitio marcado con un signo de interrogación en la Figura 1 es donde termina la transcripción? Justifique brevemente. b) i) Dibuje las bandas y asigne la longitud de los mRNAs en nucleótidos en un experimento de Northern donde RNA total de glándula mamaria de ratón es hibridado con una sonda correspondiente al exón 1 del gen de trimerina, sabiendo que la subunidad α es 10.000 Daltons más pesada que la β. ii) Dibuje las bandas que observaría si hubiera usado como sonda al exón 3. c) ¿Cuál será la longitud del transcripto primario del gen de trimerina? ¿La especie molecular llamada “transcripto primario” existe realmente? Justifique. d) ¿Está bien llamar exón al exón 1 si bien éste no codifica ninguna porción de la proteína trimerina? Justifique. e) Dibuje las bandas y asigne el PM en kilodaltons en un experimento de Western (gel de poliacrilamida con SDS, una calle con y otra sin mercaptoetanol) donde proteínas de 51 IBMC 2011 glándula mamaria de ratón son reveladas con un anticuerpo que reconoce la secuencia aminoacídica codificada por el exón 4 de la trimerina. f) Existe una cepa de ratón mutante en que el gen (maestro) de la trimerina se transcribe muy poco (prácticamente a niveles basales) y su fenotipo es ausencia de glándula mamaria. En lugar de estar mutado el promotor del gen de trimerina, se descubrió que lo que se encuentra fallado por una mutación es el splicing alternativo de su exón 3 de modo que éste no se incluye nunca en el mRNA maduro. Explique cómo la mutación mencionada afecta la expresión de trimerina y la aparición de glándula mamaria. Segunda parte En un intento por disminuir el consumo de bebidas alcohólicas por parte de los jóvenes en los boliches, el gobierno de Vacalandia quiere promover el consumo de leche. Para ello, ha contratado a la empresa biotecnológica “Greenmuuuu” para que genere vacas transgénicas que fabriquen una leche que se vea verde fluorescente cuando es iluminada por luz negra (luz de 400 nm de longitud de onda, cercana al ultravioleta), justamente el tipo de iluminación que se usa para bailar en los boliches, suponiendo que la leche verde fluorescente resultará tan atractiva y divertida para los jóvenes que la preferirán en lugar del alcohol. Para lograr su cometido, la empresa obtuvo vacas transgénicas usando un plásmido en el cual el cDNA del gen GFP fue colocado río abajo del promotor y enhancer del gen de la quesina de vaca, un gen que sólo se expresa en glándula mamaria (Figura 3). Aclaración: El cDNA de GFP proviene de la medusa (aguaviva) Aequorea victoria y codifica la proteína verde fluorescente (GFP), una proteína de una estructura terciaria muy particular tal que genera luz verde (fluoresce) cuando es excitada con luz de 400 nm, sin estar unida a ningún grupo prostético. g) ¿Cuáles de los siguientes pasos experimentales NO corresponden a la obtención del cDNA de GFP que se usó para armar el transgén de la Figura 3? Justifique sólo esos pasos que no corresponden. i) Aislamiento de RNA total de Aequorea victoria. ii) Digestión de DNA genómico de Aequorea victoria con una enzima de restricción. iii) Digestion de RNA total de Aequorea victoria con una enzima de restricción. iv) Incubación del RNA total de Aequorea victoria con oligo dT, transcriptasa reversa y desoxirriboinucleósidos trifosfato. h) Incubación del RNA total de Aequorea victoria con oligo dT, transcriptasa reversa y ribonucleósidos trifosfato. i) Indique en la Figura 3 dónde se ubican la trimerina, los factores de transcripción basales, la RNA polimerasa II, la cola de poliA, el cap, los spliceosomas y la proteína quesina. Justifique los casos en los que no se pueda ubicar algo de lo que se le pide. j) ¿Existirá peligro de que las mujeres que beban leche fluorescente verde conteniendo la proteína GFP produzcan leche fluorescente verde en sus propias mamas? Justifique. 52 IBMC 2011 PROBLEMA 3 Transmitido por el mosquito Aedes aegypti, el virus del dengue es el agente causal de la llamada “fiebre dengue”, enfermedad que ha reaparecido recientemente en forma preocupante en diversas regiones tropicales del mundo y también en nuestro país, sobre todo en la provincia del Chaco. Un síntoma que suele producir en los casos severos es hemorragia debido a una exagerada respuesta de las células del sistema inmune infectadas, lo cual provoca muerte de células de los vasos sanguíneos. El virus, de la misma familia del de la fiebre amarilla, tiene como genoma una única molécula de RNA de cadena simple, de 10,7 kilobases (kb) y no contiene ni codifica transcriptasa reversa. Este genoma codifica para 10 polipéptidos virales, todos de diferente estructura primaria. Tres de estos polipéptidos, llamados estructurales, forman parte, junto al RNA, de la partícula viral o virión. Los 7 polipéptidos restantes (llamados NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b y NS5) no forman parte de los viriones, pero tienen diversas actividades enzimáticas, algunas importantes para la replicación del virus en la célula infectada. NS5 es la polimerasa encargada de replicar al genoma viral y fabricar mRNA a partir del mismo. Preguntas: a) Marque en las siguientes opciones qué tipo de polimerasa será NS5 y justifique su opción: i) DNA polimerasa DNA dependiente ii) RNA polimerasa DNA dependiente iii) RNA polimerasa RNA dependiente iv) DNA polimerasa RNA dependiente b) ¿Necesitará la polimerasa viral NS5 un “primer” para funcionar? Justifique. c) ¿Tendrá esta polimerasa actividad de "proofreading" o lectura de pruebas (3’-5’ exonucleasa)? Analizando la secuencia del mRNA de una de las variedades argentinas se observó que a partir del primer codón AUG en adelante, no hay ningún codón stop de la traducción (UAA, UAG o UGA) hasta el codón número 3.393 (UAA), localizado muy cerca del extremo 3’ del mRNA. Este mRNA da origen a los 10 tipos de proteínas diferentes codificadas por el virus arriba mencionados. d) Sabiendo que el genoma de dengue no tiene intrones y que tiene un solo marco de lectura abierto, ¿qué mecanismo puede explicar la aparición de 10 polipéptidos diferentes? e) Uno solo de los 10 polipéptidos tiene metionina como primer aminoácido, ¿cuál es? f) NS3 tiene actividad de helicasa de RNA de cadena doble y también de proteasa. ¿En qué ayudarán estas dos actividades de NS3 al proceso de replicación del virus? g) No habiendo vacuna disponible por el momento, los investigadores están tratando de desarrollar drogas que inhiban específicamente a la polimerasa viral. Se piensa que este tipo de drogas no afectaría a las células no infectadas del paciente, con lo cual no tendría efectos secundarios perjudiciales. ¿Por qué tales drogas no afectarían: i) la duplicación del DNA? ii) la transcripción de los genes celulares? iii) el alargamiento de los telómeros de los cromosomas celulares? 53 IBMC 2011 LECTURA E INTERPRETACIÓN DE UN “PAPER” CIENTÍFICO. 1) El inglés La literatura científica, y sobre todo en biología molecular, celular y en bioquímica, se encuentra principalmente en el idioma inglés. Las revistas más serias y exigentes en cuanto a la calidad de los trabajos aceptados son publicadas en inglés, aún cuando las casas editoras se encuentran en países no angloparlantes. Por lo demás, el inglés se ha convertido en el idioma más usado para intercambiar conocimientos científicos en congresos, cursos y encuentros de carácter internacional. Este hecho está probablemente relacionado con el fuerte y extenso desarrollo de la ciencia en los países angloparlantes (USA y Gran Bretaña), a su vez relacionado con su grado de desarrollo socio-económico. El uso del inglés por científicos de países no angloparlantes como el nuestro, podría ser considerado como un síntoma de dependencia cultural. Sin embargo, su no uso nos imposibilitaría comunicar nuestros hallazgos y acceder a la información científica rápidamente y de primera mano, hecho que nos llevaría a situaciones de mayor dependencia económica y aislamiento, provocadas por la falta de un desarrollo científico-técnico propio. En este sentido, los estudiantes de Ciencias deben aprender a leer el inglés desde los primeros años de su carrera. Si nuestra actualización dependiera únicamente de los libros de texto que son traducidos al español, estaríamos constitutivamente atrasados por un lapso de 3 a 5 años respecto de la fecha en que se generó una información. Afortunadamente, el inglés usado en ciencia tiene una gran proporción de palabras de origen greco-latino que resultan familiares a nuestro idioma, lo cual facilita su entendimiento. 2) Las publicaciones científicas La publicación de un hallazgo científico o de un conjunto de experimentos relacionados constituye lo que en la jerga se conoce como un paper científico. Los papers se agrupan en revistas que se editan mensualmente, quincenalmente o semanalmente. Hay revistas más y menos especializadas temáticamente. Hay revistas que incluyen papers de todas las ramas de las ciencias experimentales (la más prestigiosa se llama Nature y se edita semanalmente en Londres desde el año 1869), y otras dedicadas a una disciplina en particular. A continuación se nombran algunas de las revistas más leídas que incluyen temas de biología molecular y celular: Multidisciplinarias Biología celular y molecular, Bioquímica, Microbiología, Genética, Inmunología Cell (USA) Genes and Dev. (USA) J. Biol. Chem.(USA) EMBO Journal (Eur) Biochemistry (USA) J. Cell. Biol. (USA) J. Immunol. Biochem. J. (GB) Mol. Cell. Biol. (USA) Mol. Biol. Cell (USA) Mol. Cell (USA) Eur. J. Biochem.(Eur) Nucleic. Acids Res. (GB) FEBS Lett. (Eur) J. Mol. Biol. (GB) Virology Nature Genetics (UK) Nature Biotech. (UK) Mol.Gen. Genetics J. Bacteriol. (USA) J. Virol. (USA) Medicina experimental Nature Med. (UK) The Lancet (GB) New Eng. J. Med. (USA) J. Exp. Med. (USA) J. Clin. Invest. (USA) Nature (GB) Science (USA) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 54 IBMC 2011 3) La estructura del paper científico Generalmente el paper está estructurado en las siguientes secciones: 1) Título, 2) Autores y su dirección postal, 3) Resumen (abstract), 4) Introducción, 5) Materiales y Métodos (o Procedimientos Experimentales), 6) Resultados, 7) Discusión y/o Conclusiones, 8) Bibliografía citada. En algunos casos las secciones 6 y 7 se reúnen en una sola. El estilo general del paper debe ser claro, sintético y preciso. Resumen: debe permitir al lector tener una idea de lo que los autores encontraron sin necesidad de leer todo el trabajo. Introducción: debe incluir los antecedentes publicados del tema en forma breve, sin convertirse en una revisión (review) sobre el tema. Materiales y Métodos: deben presentar toda la información necesaria para que el lector sea capaz de reproducir los experimentos descriptos sin problemas. Si parte de la metodología ha sido publicada previamente, ésta no se describe en detalle sino que se incluye la cita bibliográfica correspondiente. Resultados: esta sección se limita a la descripción, lo más objetiva posible, de los resultados obtenidos. Estos se encuentran volcados en figuras (gráficos, fotos, micrografías, etc.) y tablas numéricas. Cada figura o tabla lleva una leyenda aclaratoria del contenido. Discusión: se comentan los resultados obtenidos a la luz de lo que se conocía previamente en la literatura. Se proponen teorías, nuevas hipótesis y perspectivas. Se lucubra (no demasiado!) y se sugieren nuevos experimentos. Bibliografía: existen dos formas de citar la bibliografía en el texto: 1) Numérica: por orden de aparición en el texto, con números arábigos consecutivos entre paréntesis. Luego, en la sección 8 se ordenan las citas numéricamente. 2) Por apellidos: entre paréntesis se coloca el apellido del autor seguido de una coma y del año de publicación. Ej.: (Brown, 1984) Si los autores son 2, se cita (Brown & Smith, 1983) Si los autores son 3, se cita (Brown, Smith & Jones, 1975) Si los autores son más de 3, se cita (Brown et al., 1986) Luego, en la sección 8 se ordenan las citas por orden alfabético respecto del primer autor. Formas de citas bibliográficas: a) Sin incluir el título del paper: - Autores (año). Nombre de la revista Nº de volumen, paginación. Ejemplo: Maxam, A.M. & Gilbert, W. (1980) Methods Enzymol. 65, 499-580. b) Incluyendo el título del paper: - Autores (año) título del paper. Nombre de la revista Nº de volumen, paginación. Ejemplo: Goldstein, J.L. & Brown, M.S. (1977) The low density lipoprotein pathway and its relation to atherosclerosis. Ann. Rev. Biochem. 46, 897-930. c) Citas de trabajos que forman parte de libros: - Autores (año) El nombre del libro. Editores responsables. (Ciudad de edición: casa editora), paginación. Ejemplo: Pestka, S. (1977) In Molecular Mechanisms of Protein Biosynthesis, eds. Welssbach, H. & Pestka, S. (New York: Academic Press), 467-553. 4) Desarrollo del seminario El objetivo del seminario es leer e interpretar los resultados de un paper científico. Simultáneamente se reconocen aspectos formales del paper, como son estructuración, lenguaje utilizado, claridad, etc. 55 IBMC 2011 RECOMENDACIONES: - No lea una traducción hecha por otro. Se desvirtuaría el objetivo del T.P. - Dé una primera leída al paper. Ubique las palabras o frases que no entiende. Trate de ayudarse con el glosario de esta guía y con el diccionario. - En un principio pase por alto todo aquello que le parezca incomprensible y tome ventaja reafirmando todo aquello que le resulte fácil entender. En lecturas sucesivas se aclararán las porciones originalmente incomprensibles. - No se detenga en los detalles técnicos de la sección de Procedimientos Experimentales. Para nuestros fines es mucho más importante la interpretación de los resultados. 5) Cuestionario. a) ¿Es el título del paper claro y adecuadamente informativo? b) ¿Cómo se llaman y qué utilidad tienen los términos que están entre paréntesis inmediatamente abajo del título? c) ¿Le bastó leer el resumen para saber de qué se trataba el paper? d) Las figuras y tablas con sus correspondientes leyendas, ¿son autoexplicativas o le fue imprescindible recurrir al texto para entenderlas? e) ¿Cuáles son los pasos que van desde el completado de un manuscrito hasta la publicación del mismo en una revista científica? f) ¿Por qué los autores colocaron el gen lac Z' en orientación invertida (rev Z) bajo las órdenes de un promotor del fago l y no del propio promotor del operón lac? g) El gen lac Z' colocado en el plásmido pBD4/lacZ' (rev), (lleva la región o (gen operador) del operón lac? h) ¿Cuál es el mecanismo propuesto por el cual la presencia del plásmido pBD4/lacZ' (rev) previene la inducción de la β-galactosidasa por IPTG? i) ¿Qué experimentos adicionales realizaría Ud. para demostrar que lo que está impedido por la presencia de pBD4/lacZ' (rev) es la traducción del mRNA y no la transcripción del gen de la β-galactosidasa? j) ¿Cuál es la explicación que dan los autores para justificar que la inhibición de la síntesis de la permeasa y de la transacetilasa es menor que la de la β-galactosidasa? k) ¿Existe algún caso natural de regulación de la traducción por RNA anti-sentido? l) ¿Qué importancia para la salud podría tener este mecanismo de regulación por RNA antisentido? 6) Glosario: Phage: fago λ PL promoter: promotor de la transcripción del fago lambda (left). To target: apuntar, dirigir a. Translation: traducción. Template: molde. To anneal: en este caso, re-hibridar. Temperature sensitive represor: Proteína represora (represor) del promotor que funciona (reprime) a 30ºC, pero deja de funcionar (no reprime) a 42ºC. Media: medios de cultivo. Singular: medium. To transfect: transfectar; en este caso, sinónimo de transformar. To sonicate: sonicar, romper las bacterias con ultrasonido. To prevent: prevenir, impedir. To titrate: titular, como en la titulación de una solución. To encompass: abarcar. Feasible: factible. 56 Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 81, pp. 7525-7528, December 1984 Genetics Anti-mRNA: Specific inhibition of translation of single mRNA molecules (fi-galactosidase mRNA/complementary RNA/lactose operon) SIDNEY PESTKA, BRUCE L. DAUGHERTY, VINCENT JUNG, KUNIMOTO HOTTA, Roche Institute of Molecular Biology, Roche Research Center, Nutley, NJ 07110 AND ROBERT K. PESTKA Communicated by Herbert Weissbach, August 9, 1984 ABSTRACT A plasmid was constructed to generate RNA complementary to the /8-galactosidase mRNA under control of the phage X PL promoter. When this anti-mRNA was produced, synthesis of 13-galactosidase was dramatically inhibited (98%). Syntheses of galactoside permease and transacetylase, whose coding sequences are downstream of the .-galactosidase coding region, are inhibited to a lesser degree, 80% and 55%, respectively. The generation of anti-mRNA that can be targeted to inhibit a single species of mRNA molecule within cells provides a potent mechanism by which specific transcripts can be translationally inactivated. This can be used to determine the function of proteins as well as to select cloned genes in a single rapid and convenient step. Inhibition of translation has been efficiently carried out by antibiotics and other inhibitors of protein synthesis (1). In specific instances, physiological mechanisms have been manipulated to turn on or off genes such as the lac operon of Escherichia coli grown in the presence or absence, respectively, of a 0-galactoside (see ref. 2). However, no general method has been described to block the translation of a specific mRNA molecule. It has been known that RNA with substantial structure, such as double-stranded RNA, serves as a poor template for protein synthesis (1, 3). Knowledge of this has been used effectively to block translation in cell-free extracts. In vitro, hybrid-arrested translation has been reported to prevent the synthesis of specific proteins (4, 5) and has been used to detect recombinant DNA molecules containing sequences complementary to a given mRNA. The procedures of hybrid-arrested translation involve DNARNA hybridization, wherein the double-stranded DNA is denatured by heating and annealed with a population of mRNA molecules. Hybridization of DNA to the mRNA effectively blocked translation of these mRNA molecules that formed hybrids. To develop a method to block the translation of specific mRNA molecules in intact cells, we postulated that RNA complementary to mRNA would also effectively block translation if RNA-RNA hybridization would occur readily under physiological conditions within the cell. Because single-stranded complementary RNA molecules can be readily generated within cells by appropriate vectors, the hypothesis could be tested conveniently. The objective was to generate anti-mRNA intracellularly to block translation of specific proteins. The present communication describes the construction and use of complementary RNA generated in vivo to block translation of only a single species of mRNA molecules to which it can specifically hybridize. the mRNA transcribed upon induction of this operon is polycistronic, it would be possible to determine the extent of polarity of the inhibition of translation if RNA complementary only to the lacZ (,3-galactosidase) coding sequence was used as the anti-mRNA. An 831-base-pair DNA fragment of the lactose operon, cloned in phage M13mp7 (6), was the source of a DNA fragment containing the sequence coding for the NH2 terminus of B-galactosidase. This fragment was isolated and placed in reverse orientation under control of the phage X PL promoter. The gene coding for a temperature-sensitive repressor of PL, cIts, is carried on a compatible plasmid pRK248cIts (79). Thus, at 30°C, no anti-mRNA would be made, but at 42°C anti-mRNA would be synthesized extensively. On hybridizing with the mRNA, the anti-mRNA would block translation of the message for ,-galactosidase highly specifically, acting as a precisely directed anti-mRNA "missile." EXPERIMENTAL PROCEDURES Media, Enzymes, and Electrophoresis. M9 medium consisted of 50 mM Na2HPO4, 28 mM KH2PO4, 8.5 mM NaCl, 19 mM NH4Cl, 0.1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 0.4% Casamino acids, 1% glycerol, and thiamin at 2 ,ug/ml. Restriction endonucleases were obtained from Bethesda Research Laboratories. T4 DNA ligase was obtained from Amersham. Agarose gel electrophoresis was performed according to the procedures of Sharp et al. (10). Fragments were isolated from the gels by the method of Schmitt and Cohen (11). Construction of Plasmids. Phage M13mp7 was used to isolate a BamHI/Cla I fragment containing some of the sequence coding for the NH2-terminal region of,-galactosidase, beginning at amino acid 6 (Fig. 1). The plasmid pRC23, which contains the phage X PL promoter, was cut with restriction endonucleases Cla I and BamHI. The large Cla I/BamHI fragment from the plasmid was isolated and ligated to the small BamHI/Cla I fragment containing part of the lacZ as described above (Fig. 1). Ligations were performed in 66 mM Tris HCI, pH 7.5/5 mM MgCl2/5 mM dithiothreitol/1 mM ATP for 16 hr at 15°C. DNA concentration was between 1 and 10 nM and phage T4 DNA ligase was used at 300 units/ml. The result was a plasmid, pBD4/lacZ'(rev), containing a lacZ gene fragment in reverse orientation with respect to the PL promoter. This plasmid was transfected into E. coli 294 harboring the compatible plasmid pRK248cIts containing the temperature-sensitive X repressor clts (7-9). Little or no anti-mRNA would be synthesized at 30°C. At 42°C, anti-lacZ mRNA would be synthesized at high levels. Growth of Bacteria. E. coli 294(pRK248cIts) harboring pRC23 or pBD4/lacZ'(rev) was grown in 10 ml of M9 medium containing 1% glycerol overnight at 30°C. To start the experiment, two flasks containing 150 ml of fresh M9 medium (1% glycerol) were inoculated with the E. coli containing pRC23 and another two flasks containing the same medium Abbreviation: IPTG, isopropyl PRINCIPLE OF THE PROCEDURE Because the lac operon of E. coli is well understood, it was chosen as the focus of these initial studies. In addition, since The publication costs of this article were defrayed in part by page charge payment. This article must therefore be hereby marked "advertisement" in accordance with 18 U.S.C. §1734 solely to indicate this fact. 7525 A-D-thiogalactoside. 7526 Genetics: Pestka et aL agqI EoORI c/oI BomHI Proc. NatL. Acad. Sci. USA 81 (1984) PstI 0 pRC23 BomHI BimHI CloI CIaI ,--~ ""-~ BomHI CloI BomHI I I m HI FIG. 1. Construction of pBD4/lacZ'(rev) from pRC23 and M13mp7. Details are given in the text. The portion of the lacZ gene contained in the BamHI/Cla I fragment from M13mp7 represents nucleotides 19-440 of lacZ, with the initiator AUG of the lacZ gene taken as position 1. This fragment is designated lacZ'. Amp, ampicillin, Tet, tetracycline. were inoculated with the E. coli containing pBD4/lacZ'(rev). These were grown at 30'C until the optical density at 600 nm reached about 0.5. At this point, isopropyl ,/-D-thiogalactoside (IPTG) was added to one flask of each of the cultures to a final concentration of 1 mM. Aliquots of each of the four cultures were removed and placed at 00C at the starting time of induction (0 min). The cultures were then placed in a 420C water bath and shaken vigorously. Aliquots from each of the four cultures were taken at 15, 30, 60, 90, and 120 min and placed at 0C until assayed a short time later. Enzyme Assays. Assays for B-galactosidase, lactose permease, transacetylase, and alkaline phosphatase were performed as described (12-15). Enzyme concentrations were determined from the linear portions of the curves in all cases. The specific procedures are given below. Assay of p-galactosidase. 8-Galactosidase was measured as described (12) with minor modifications. Samples of bacterial cultures were diluted with Z buffer (50 mM sodium phosphate, pH 7.0/10 mM KCl/1 mM MgSO4/50 mM 2-mercaptoethanol) into a total volume of 1.1 ml. Two drops of chloroform and one drop of 0.1% sodium dodecyl sulfate were added, after which tubes were swirled on a Vortex mixer for 10 sec. The tubes were then placed in a water bath for 5 min at 30°C. A 1-ml sample was then added to a cuvette. The reaction was started by adding 0.2 ml of o-nitrophenyl ,3D-galactoside (4 mg/ml) and lnixed for a few seconds. The cuvette was then placed in a Beckman DU-8 spectrophotometer which was programmed to determine changes in absorbance at 420 nm per min. Assay of lac carrier protein. Lactose permease was assayed as described (12, 13) with modifications as noted below. Aliquots of bacterial suspensions were centrifuged at 10,000 x g for 5 min. The pellets were washed with 2 ml of 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 7.5, containing 10 mM MgSO4 and resuspended in 0.2 ml of the same buffer. In each of four tubes, 50 ,ul of the bacterial suspension was added, after which they were incubated at 26°C for 5 min. With a Hamilton syringe, 2 ,l of 10 mM [14C]methyl 3-D-thiogalactopyranoside (New England Nuclear; 22.5 mCi/ml; specific activity 25.6 Ci/mmol; 1 Ci = 37 GBq) was added to each of the four tubes for 0, 15, 30, and 60 sec. The reaction was stopped by the addition of 3.5 ml of 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 5.5, containing 100 mM LiCl. The solution was filtered on a 25-mm 0.45-gm Amicon filter (no. 041255) and washed with 3.5 ml of the same solution. The radioactivity on the filter was then measured in 10 ml of Bray's solution in a scintillation spectrometer. Assay of thiogalactoside transacetylase. Aliquots of bacterial suspension were centrifuged at 10,000 x g for 5 min. The pellets, resuspended in 250 ,ul of 50 MM Tris HC1, pH 7.8, were assayed for thiogalactoside transacetylase as reported (14). The suspensiohs were sonicated twice for 15 sec on ice. The extracts were heated at 70°C for 5 min and centrifuged in a Microfuge for 15 min. Each supernatant was transferred to a fresh tube. The reaction was started by mixing 0.5 ml of a solution consisting of 50 mM Tris HCl at pH 7.8, 2 mM EDTA, 1 mM 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), 0.1 mM acetyl-CoA, and 50 mM IPTG with 200 ,l of the bacterial extracts. The solution was transferred to a cuvette, which was placed in a Beckman DU-8 spectrophotometer that was programmed to calculate changes in absorbance at 412 nm as a function of time. Assay of alkaline phosphatase. Aliquots of bacterial suspensions were centrifuged at 10,000 x g for 5 min. The pellets were washed in 2 ml of 0.1 M Tris-HCl, pH 7.4. After centrifugation, the pellets were resuspended in 2 ml of the same buffer. The assay consisted of mixing 0.5 ml of the bacterial suspension with 1 ml of 1 M Tris HCl, pH 8.8, and incubating at 37°C for 5 min. The reaction was started by the Genetics: Pestka et aL Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 7527 pRC23 + C ePTu 0.02 C 0 Z ~~~~~~Rev + I PTG N < < RevZ 0.01 4 pRC23 0 30 60 90 120 MINUTES AT 420C FIG. 2. B-Galactosidase as a function of time after cells were transferred to 420C in the presence or absence of IPTG. 83-Galactosidase levels in cells containing plasmid pRC23 or pBD4/lacZ'(rev) are designated by curves labeled pRC23 and RevZ, respectively. 0 30 60 90 MINUTES AT 420C 120 FIG. 4. Thiogalactoside transacetylase as a function of time after cells were transferred to 42°C in the presence or absence of IPTG. Curves are labeled as in Fig. 2. addition of 0.5 ml of 0.04 M p-nitrophenyl phosphate and the mixture was incubated at 37°C. At 30, 60, and 120 min, 0.7 ml was centrifuged in a Microfuge for 5 min and the supernatant was transferred to a fresh tube. The absorbance at 420 nm was measured in a spectrophotometer and the change per min was determined from the readings at different times. RESULTS When E. coli 294 containing the parental plasmid pRC23 was induced at 42°C with IPTG, there was a rapid rise in synthesis of p-galactosidase (Fig. 2). When E. cOli 294 with the plasmid containing the reverse orientation was induced, the rise inB-galactosidase synthesis on induction with IPTG was essentially prevented. The higher uninduced level of -galaci tosidase in the presence of the plasmid carrying the lacZ fragment was due to titration Qf the lac repressor by the lacZ segment containing the secondary repressor binding site (refs. 16 and 17; also see discussion below). In the absence of IPTG, induction of the PL promoter at 42°C decreased the endogenous level of B-galactosidase in E. coli 294/pBD4/ lacZ'(rev). To determine if the anti-lacZ segment also prevented syn- thesis of lactose permease and thiogalactoside transacetylase encoded by the same polycistronic message, these enzymes were also assayed in the same series of cultures with and without induction with IPTG (Figs. 3 and 4). The permease and transacetylase were induced concomitantly with pB-galactosidase; however, their synthesis was not inhibited as much as that ofl-galactosidase by anti-lacZ mRNA (Figs. 3 and 4; Table 1). Nevertheless, the same pattern of inhibition was seen as with j-galactosidase. The synthesis of an enzyme, alkaline phosphatase, encoded by another mRNA was not affected either by IPTG or by the anti-lacZ mRNA (Fig. 5). Thus, in all cases, the presence of the plasmid containing lacZ in the reverse orientation was sufficient to inhibit the synthesis of 8-galactosidase, permease, and transacetylase. When induction of E. coli 294 containing plasmid pRC23 or pBD4/lacZ'(rev) was performed with IPTG at 30°C, 13galactosidase in both cultures increased to about the same levels (data not shown). Under these conditions, there was no inhibition of,-galactosidase synthesis in E. coli 294 containing the plasmid pBD4/lacZ'(rev), as expected, since no reverse transcript is synthesized at 30°C, where the PL promoter remains repressed. Table 1. Induction of enzymes of lac operon in presence or absence of reverse lacZ Inhibition of Induction by IPTsG, % synthesis by Control lacZ'(rev) lacZ'(rev), % Enzyme 2 98 100 P-Galactosidase 20 80 100 Lactose permease Es 50 R>Z~~~e +I IPTG gii 0 30 60 90 120 MINUTES AT 4200 FIG. 3. Lactose permease as a function of time after cells wvere transferred to 42°C in the presence or absence of IPTG. Curves are labeled as in Fig. 2. TMG, thiomethyl galactoside. Thiogalactosidase 55 45 100 transacetylase The induction of each enzyme at 90 min after the addition of IPTG was taken from the data of Figs. 2-4. Background values at 0 min in the absence of IPTG were subtracted from the enzyme levels at 90 min to determine the level of induction. Control cells contained plasmid pRC23. The cells with the segment of the lacZ gene oriented in the reverse direction with respect to the PL promoter contained plasmid pBD4/lacZ'(rev). With the level of increase (induction by IPTG) in enzyme taken as 100% in the control cells, the increase in the cells containing pBD4/lacZ'(rev) is shown as a percentage of the values in the control cells. 7528 Genetics: Pestka et aL c Proc. NatL. Acad. Sci. USA 81 (1984) I ALKALINE PHOSPHATASE 3 0 o 0002 0 (0 10 pRC23 pRC23+IPTG I oE0.001o <3 RevZ 30 evZ + IPTG 0 60 90 MINUTES AT 420C 120 were transferred to 42°C are labeled as in Fig. 2. FIG. 5. Alkaline phosphatase as a function of time after cells in the presence or absence of IPTG. Curves DISCUSSION The presence of anti-lacZ mRNA can be controlled by the X phage PL promoter. Under conditions in which no anti-lacZ mRNA is made, ,-galactosidase, lactose permease, and transacetylase are induced by IPTG. When anti-lacZ mRNA is present, the syntheses of all three enzymes produced from the same polycistronic mRNA are inhibited, whereas the synthesis of alkaline phosphatase, produced from a different mRNA template, is not affected. It is thus clear that antimRNA can be generated and can function in intact E. coli. Although the syntheses of all the enzymes made on the polycistronic lac mRNA are inhibited by the anti-lacZ mRNA, inhibition of the synthesis of permease and transacetylase, whose coding regions are distal to the coding region of f8galactosidase, occurs to a smaller degree than inhibition of ,3-galactosidase synthesis (Table 1). There is a polarity to the inhibition in that permease synthesis is inhibited 80%, whereas synthesis of transacetylase, whose coding region is most distal to that of p-galactosidase, is inhibited only 55%. Ribosomes initiating within polycistronic mRNAs (18) at the permease and transacetylase initiation codons must account for this lower degree of inhibition, and these observations support direct reinitiation at AUG codons corresponding to these enzymes. The presence of the plasmid containing the lacZ' region in reverse orientation with respect to the PL promoter increases the level of 8-galactosidase. The plasmid appears to be titrating the repressor protein even though there is no lac operator segment present. This is consistent with the results of Reznikoff et al. (16), who reported the existence of a secondary binding site for lac repressor within the operatorproximal third of the lacZ gene. This site was precisely defined by Gilbert et al. (17) to be located at position 357-391 of the lacZ gene, starting from the initiator codon, ATG, of lacZ taken as position 1. The segment of the lacZ gene incorporated in pBD4/lacZ'(rev) represents positions 19-440 and thus encompasses this secondary binding site for lac repressor. When this secondary binding site was deleted from the plasmid pBD4/lacZ'(rev), there was no titration of repressor and thus no increase in 0-galactosidase in the absence of IPTG compared to control cells. Nevertheless, P-galactosidase synthesis induced by IPTG was inhibited 97% upon induction of the anti-lacZ mRNA fragment at 42°C (unpublished data). The use of anti-mnRNA that can be induced within cells provides a potent mechanism by which specific transcripts can be translationally inactivated. This procedure should provide a convenient and rapid method to determine the function of proteins or other RNAs within cells. The techniques should be applicable to eukaryotic cells with appropriate vectors and regulatory elements. During the completion of these initial experiments, Izant and Weintraub (19) reported the use of anti-mRNA in mammalian cells. Indeed, it is possible that anti-mRNA transcripts have physiological roles in cells, as suggested by Simons and Kleckner (20) and by Mizuno et al. (21). We hope to be able to determine the optimal size and region for targeting by anti-mRNA segments in the near future. As hybrid-arrested translation has been used in vitro to screen recombinant DNA clones, antimRNA recombinants may be employed in vivo to screen and select for phenotypically altered cells lacking single functions. The method may be applicable to screen for recombinants that inhibit gene products in diploid cells where simultaneous insertional inactivation of genes is not feasible. 1. Pestka, S. (1977) in Molecular Mechanisms of Protein Biosynthesis, eds. Weissbach, H. & Pestka, S. (Academic, New York), pp. 467-553. 2. Miller, J. H. & Reznikoff, W. S., eds. (1980) The Operon (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). 3. Singer, M. F., Jones, 0. W. & Nirenberg, M. W. (1963) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 49, 392-399. 4. Paterson, B. M., Roberts, B. E. & Kuff, E. L. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 4370-4374. 5. Hastie, N. D. & Held, W. A. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1217-1221. 6. Messing, J. (1982) in Recombinant DNA, ed. Walton, A. G. (Elsevier, Amsterdam), pp. 143-153. 7. Lieb, M. (1966) J. Mol. Biol. 16, 149-163. 8. Bernard, H.-U. & Helinski, D. R. (1979) Methods Enzymol. 68, 482-492. 9. Crowl, R. (1985) Methods Enzymol., in press. 10. Sharp, P. 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(1984) Cell 36, 1007-1015. 20. Simons, R. W. & Kleckner, N. (1983) Cell 34, 683-691. 21. Mizuno, T., Chou, M.-Y. & Inouye, M. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1966-1970. IBMC 2011 REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA EN BACTERIAS A) GUÍA DE ESTUDIO 1) Defina los siguientes términos, identificando si se trata de una proteína, un segmento de DNA (gen), o una molécula pequeña (metabolito) distinta de DNA y proteína: Operador, represor, inductor, promotor, co-represor, alolactosa, β-galactosidasa 2) ¿Qué es un diploide parcial? 3) Explique los siguientes términos: - Reprimido - Inducido - Constitutivo 4) ¿Qué es un inductor gratuito? Dé ejemplos. 5) ¿Qué utilidad tiene para la bacteria que la lactosa sea un inductor de su operón y, en cambio, el triptofano un co-represor del suyo? 6) ¿Qué es la represión catabólica? 7) ¿Qué papel juega el AMP cíclico (cAMP) en la transcripción de los genes del operón lactosa? 8) ¿Qué ocurre con la concentración intracelular de cAMP de E. coli cuando ésta es cultivada en un medio con glucosa? Relacione su respuesta con las de las preguntas 6 y 7. 9) Explique el fenómeno de diauxia. 10) Aceptando el hecho de que todas las células de un organismo pluricelular poseen los mismos genes, ¿qué ocurriría en ese organismo si no existiera el fenómeno de regulación de la expresión genética? 11) ¿Qué elementos del sistema del operón lactosa actúan en cis y cuáles en trans? 12) ¿Qué es un "enhancer"? ¿Cómo funcionan estos elementos en la regulación de la expresión genética en eucariotas? 13) ¿Qué son los factores de transcripción? ¿Cómo funcionan? ¿Qué relaciones tienen con los productos de los oncogenes? 14) ¿Qué son las estructuras "cierre relámpago" de leucinas, "dedos" de zinc y hélice vuelta hélice? 15) ¿Qué es un homeobox? 61 IBMC 2011 B) PROBLEMAS PROBLEMA 1 a) Describa el fenotipo correspondiente a los siguientes genotipos: FENOTIPO NO INDUCIDO GENOTIPO i+p-ocz+ i+p+oczcrm i+p+ocz+ / i+p-oczcrm i-p+o+z+ i+p+oczcrm / i-p+o+z+ i: p: o: oc: z: zcrm: gen que codifica al represor promotor operador operador constitutivo, esto es, que no reconoce al represor gen estructural de la β-galactosidasa mutante del gen z que produce una enzima inactiva, pero la cual es reconocida por anticuerpos anti β-galactosidasa (crm = "cross reacting material": material que reacciona en forma cruzada con anticuerpos contra β-galactosidasa). actividad β-gal reconocimiento por Ac. anti β-gal INDUCIDO actividad β-gal reconocimiento por Ac. anti β-gal b) Vuelva a completar el cuadro suponiendo que se agregó glucosa al medio de cultivo. PROBLEMA 2 Dos horas después de agregar el compuesto X a un cultivo de bacterias, en presencia o ausencia del antibiótico cloranfenicol, se midió la actividad de 3 enzimas: A, B y C. De acuerdo a los resultados de la tabla, defina cuál de las enzimas es constitutiva, cuál activable y cuál inducible por el compuesto X. Agregados al cultivo Ninguno Compuesto X Compuesto X + Cloranfenicol Actividad de enzima A 0 100 0 Actividad de enzima B 100 100 90 Actividad de enzima C 0 100 90 PROBLEMA 3 La termoestabilidad de la DNA polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus (T. aquaticus) ha contribuido a la automatización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), al evitar el agregado de enzima en cada ciclo. Es posible purificar la enzima a partir de T. aquaticus, pero los rendimientos son bajos y es más difícil cultivar esta bacteria termófila (crece a 95ºC) que a E. coli. El clonado del gen de la DNA polimerasa de T. aquaticus y su expresión en E. coli (Lawyer et al. J. Biol. Chem. 264, 6427, 1989) permitió evitar los dos problemas mencionados y producir la enzima en escala industrial. La estrategia utilizada para expresar la Taq polimerasa en E. coli fue transformar esta última con un plásmido que lleva el gen completo de la Taq polimerasa (desprovisto de su propio promotor), colocado río abajo de la zona regulatoria del operón lac, la cual incluye el gen del represor (i), el promotor (p) y el operador (o). 62 IBMC 2011 Indique el/los cultivo/s que Ud. elegiría como material de partida para la purificación de Taq polimerasa, con el objeto de usarla después en reacciones de PCR. Fundamente las respuestas. Frasco 1 2 3 4 5 6 7 8 Temp. 37°C 37°C 37°C 37°C 95°C 95°C 95°C 95°C Agregados al medio lactosa lactosa + glucosa lactosa + glucosa + cAMP lactosa + cloranfenicol lactosa lactosa + glucosa lactosa + glucosa + cAMP lactosa + cloranfenicol ¿Lo elegiría? Fundamente los “no” PROBLEMA 4 Existe una variante mutante del gen que codifica para la proteína represora del operón lac de E. coli que se denomina super represor (lac IS). Este represor mutante se caracteriza por ser incapaz de unirse al inductor del operón (alolactosa, IPTG, etc.). Sin embargo, el super represor conserva intacta la capacidad de unirse al operador del operón lac. Suponga que, en una bacteria que posee en su cromosoma una mutación lac IS y el resto del operón lac normal, se introduce un plásmido que contiene un operón lac normal entero (incluyendo un gen del represor normal lac i+). Si se cultiva la bacteria en un medio que contiene lactosa: a) ¿Es la β-galactosidasa de esta bacteria constitutiva, inducible o ininducible? b) ¿Cuál de los dos genes (lac IS o lac i+) será dominante? ¿En cis o en trans? c) ¿Cuál será el efecto sobre la expresión de las proteínas del operón lac de agregar AMP cíclico (cAMP) al medio de cultivo? ¿Y el de agregar glucosa? d) ¿Podrá crecer esta bacteria en otro medio de cultivo adecuado que contenga lactosa como único alimento? ¿Y si también se agrega IPTG a este medio? PROBLEMA 5 (Basado en los papers de Chopra et al., J. Biol. Chem. (marzo 2003) y Park et al., Science (sept 2002).) Bacillus anthracis (o ántrax) es una bacteria extremadamente patogénica que amenaza a la salud pública, ya que presumiblemente fue usada dentro de sobres de correo como arma mortal en ataques bioterroristas. Su toxina está formada por dos componentes proteicos secretados. Uno de ellos es la proteína PA, cuyo peso molecular nativo es 441 kDa. Cuando el ántrax ingresa a una persona por inhalación, PA es secretada por la bacteria hacia afuera y se inserta en la membrana de las células humanas atacadas, formando un 63 IBMC 2011 canal. A través de este canal, el otro componente proteico, llamado “factor letal” (LF), es capaz de pasar al citosol de las células infectadas, para allí ejercer su acción devastadora. Para comprender los mecanismos de la acción mortífera del ántrax, se realizó el siguiente experimento: Mediante PCR (usando DNA del ántrax como molde y primers apropiados), se amplificó el gen de PA (desprovisto de su propio promotor), el cual fue colocado en un plásmido, río abajo de la región regulatoria completa del operón lac, como se muestra en la figura: El plásmido recombinante de la figura fue usado para transformar células de Escherichia coli. Las bacterias así transformadas fueron cultivadas en un medio completo (sin glucosa ni lactosa, con penicilina) y luego se transfirieron a diferentes tubos con los agregados que figuran a continuación y se continuó cultivando: i) IPTG ii) IPTG + glucosa iii) lactosa + glucosa iv) lactosa + glucosa + tetraciclina* v) lactosa + glucosa + cAMP * La tetraciclina es un inhibidor de la traducción procariota. Preguntas: a) ¿La cepa de E. coli transformada con el plásmido de la figura podrá causar la enfermedad del antrax? ¿Por qué? b) Dibuje la curva de crecimiento bacteriano y el gráfico de cantidad de PA biosintetizada en función del tiempo de cultivo, esperable para cada uno de los cinco casos. Tome en cuenta el fenómeno de diauxia. Justifique sus respuestas muy brevemente. c) ¿Habría podido realizarse este experimento si no se hubiera agregado penicilina en la primera etapa del cultivo? ¿Por qué? PROBLEMA 6 La proteína de shock térmico (heat-shock protein) GroEL de Escherichia coli tiene un PM de 57.000 Daltons y forma multímeros tetradecaméricos (14 subunidades). GroEL es inducible por calor (tratamiento de las bacterias 5 minutos a 43°C). Preguntas: a) ¿Qué significa que GroEL es inducible? b) El hecho de que GroEL sea inducible por calor, ¿le sugiere alguna hipótesis sobre las características de la proteína represora? ¿Cuál es esa hipótesis? c) ¿Qué tipo de mutantes de E. coli en que GroEL no sea inducible por calor deberían poder encontrarse? 64 IBMC 2011 Soneto a las ribozimas Era una enzima en un intrón colada, (quiero decir, compuesta de ARN), anciana evolución, tal que sostiene la facultad de extraerse de la nada y, antes de batirse en retirada, llevar a los exones que retiene a reaccionar de forma que deviene en completar su unión tan deseada. Su importancia biológica radica en resolver de modo terminante problema que de antiguo nos complica y cuya enunciación sigue delante: Sea pues la gallina: proteínas, y huevo el ARN ¿qué fue antes? DIEGO (UN EX-ALUMNO) 65 IBMC 2011 CÉLULA I MEMBRANA, TRÁNSITO VESICULAR, "SORTING" CELULAR A) GUÍA DE ESTUDIO 1) Haga un cuadro comparativo con las características de las células procariotas y eucariotas. 2) Dibuje la estructura molecular de la membrana plasmática según el modelo de mosaico fluido. 3) ¿Qué es una molécula anfipática? 4) ¿Qué tipo de lípidos forman la membrana plasmática? 5) Defina: fluidez de membrana, movilidad lateral de proteínas, proteínas periféricas, proteínas integrales, flip flop, vesículas "inside out", y "right side out". 6) ¿Qué proteínas se extraen de la membrana por tratamiento con: a) soluciones salinas? b) detergentes? c) tripsina sobre la célula intacta? d) tripsina sobre preparaciones de membrana? 7) Describa tres hechos experimentales que confirmen el modelo de mosaico fluido de la membrana celular. 8) ¿Qué significa que la membrana es: a) asimétrica, b) semipermeable? 9) ¿Qué son los hoyos revestidos (coated pits) y las vesículas revestidas (coated vesicles)? ¿De qué están revestidos? 10) Mencione organelos celulares que no estén rodeados de membranas. 11) ¿Cómo prepararía usted fracciones enriquecidas en núcleos, mitocondrias, microsomas y citosol, por centrifugación diferencial a partir de un homogenato celular? 12) ¿Qué es un liposoma? Mencione alguna de las utilidades de los mismos en biología molecular y celular. 13) ¿Qué función cumplen el R.E.L. y el R.E.G.? 14) ¿Qué estructuras conforman el aparato de Golgi? ¿Qué funciones tiene el mismo? ¿Y específicamente en células vegetales? 15) ¿En qué compartimento celular se glicosilan las proteínas? ¿Qué ocurre con las cadenas de oligosacáridos unidas a proteínas en el aparato de Golgi? 16) ¿Qué destino celular tienen las proteínas cuyo mRNA codifica para una secuencia hidrofóbica (péptido señal) en el extremo N-terminal? ¿Qué entiende por descarga vectorial? 17) ¿Cuál es el efecto del antibiótico tunicamicina? 66 IBMC 2011 18) ¿Dónde y de qué manera se originan los lisosomas? ¿Cuál es el contenido de los lisosomas? ¿Qué ocurre si penetra al lisosoma una droga como la cloroquina que es capaz de captar ávidamente H+? 19) Describa los distintos tipos de lisosomas secundarios. 20) ¿Qué función cumple la catalasa en los peroxisomas? 21) Describa cómo participan los canales de Na+ y K+ en la generación de los potenciales de reposo y acción de las células nerviosas. ¿Qué es el "patch clamp"? 23) La hipercolesterolemia familiar (HF) es una enfermedad hereditaria en la cual los pacientes tienden a presentar una alta concentración de colesterol en sangre. La mayoría de los pacientes homocigotas mueren durante la infancia por problemas cardiovasculares. Considerando el mecanismo por el cual el colesterol entra a la célula, a) ¿Qué defecto/s genético/s podría/n ocasionar la aparición de la HF? b) ¿Cómo podría realizarse un diagnóstico precoz de la enfermedad? c) Comente la factibilidad de emplear terapia génica para esta enfermedad. 67 IBMC 2011 B) PROBLEMAS PROBLEMA 1 La adenilato ciclasa (AC) eucariótica es una enzima de membrana plasmática que fabrica cAMP hacia el citoplasma. Para que la producción de cAMP sea estimulada, la AC tiene que encontrarse unida a un receptor celular, el cual a su vez haya unido su ligando específico (hormona adrenalina, por ejemplo). Se dispone de dos tipos celulares mutantes: las células A poseen receptores para adrenalina pero no tienen AC. Las células B poseen AC, pero no tienen receptores para adrenalina. Se realizaron los siguientes experimentos de fusión celular midiéndose en cada caso la actividad de AC en presencia de adrenalina. Células 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A A B B A+B A+B A+B A+B adipocitos Tratamiento con Virus Sendai (*) NO SI NO SI NO NO SI SI Preincubación 30 min a 37°C 30 min a 37°C 30 min a 37°C 30 min a 37°C 30 min a 0°C 30 min a 37°C 30 min a 0°C 30 min a 37°C Actividad AC (**) (unidades arbitrarias) 2 2 100 100 100 100 100 3600 5000 (*) El tratamiento con virus Sendai causa la fusión celular. (**) La actividad enzimática se mide a 37°C en presencia de adrenalina. Preguntas: a) ¿Por qué se observa activación solamente en el caso 8? b) ¿Qué ocurrió en los otros experimentos y para qué fueron realizados? c) ¿Habría cambiado el resultado si las células A y B hubieran sido obtenidas de animales alimentados durante largo tiempo con una dieta rica en ácidos grasos saturados? PROBLEMA 2 La enzima X es una proteína de membrana mitocondrial interna y está formada por dos polipéptidos (a de 40.000 Da y b de 22.000 Da) unidos por fuerzas no covalentes. Se dispone de preparaciones de membranas mitocondriales abiertas y de mitocondrias sometidas a diversos tratamientos, obteniéndose las siguientes fracciones: 68 IBMC 2011 En las distintas fracciones se ensayó la actividad enzimática y la composición polipeptídica de la proteína X. Actividad enzimática (*) 0 100 0 0 100 0 0 0 0 Polipéptido a No Si (40 kDa) Si (40 kDa) No Si (30 kDa) No Si (20 kDa) No Si Polipéptido b No Si (22 kDa) No Si (22 kDa) Si (22 kDa) No No No No I II III IV V P1 S1 P2 S2 P3 S3 P4 S4 F5 (*) Expresada en unidades arbitrarias. Puede concluirse que: a) El polipéptido .............. es una proteína integral de membrana. b) El polipéptido .............. es una proteína periférica. c) La actividad enzimática de la proteína X depende de la presencia de: i) a ii) b iii) a y b d) El polipéptido que es periférico está ubicado en la membrana interna mitocondrial sobre la cara: i) de la matriz mitocondrial ii) del espacio intermembrana e) ¿En qué compartimentos celulares se sintetizan los polipéptidos a y b? 69 IBMC 2011 f) ¿Qué le indica el hecho de que el tratamiento con tripsina de las vesículas de membrana interna right side out (III) no afecte a la actividad de la enzima X? g) Haga un esquema de un trozo de membrana mitocondrial y ubique, con su orientación correcta, los polipéptidos a y b de acuerdo con lo respondido en las preguntas anteriores. PROBLEMA 3 Hace algunos años se ha descubierto que, pese a tener secuencias aminoacídicas muy diversas, todas las proteínas peroxisomales poseen cerca de su extremo carboxi-terminal la secuencia Ser-Lys-Leu (SKL, en el código de una letra). Esta secuencia consenso SKL sirve de "etiqueta" para dirigir a estas proteínas a los peroxisomas. Por métodos de ingeniería genética es posible construir un plásmido de expresión en células de mamíferos con un cDNA para la proteína peroxisomal luciferasa que contiene la secuencia SKL (Figura 1). Cuando se transfectan células de mamíferos en cultivo con este plásmido se observa que la luciferasa codificada por el mismo se almacena correctamente en los peroxisomas, por un mecanismo similar al de la catalasa. Por manipulaciones génicas fue posible delecionar la secuencia SKL o agregar secuencias provenientes de genes de otras proteínas (ver figuras). En todos los casos las modificaciones no alteran el marco de lectura del resto de la luciferasa. Preguntas: a) ¿Por qué mecanismo entra al peroxisoma la luciferasa codificada por el plásmido de la Figura 1? b) ¿En qué compartimento celular se almacenará la luciferasa codificada por el plásmido: i) de la Figura 2? ii) de la Figura 3? Justifique sus respuestas describiendo los pasos por los que la proteína llega al compartimento correspondiente. Describa los mecanismos moleculares y si corresponde la orientación final de la proteína. c) Los tres cDNAs de luciferasa codifican para la secuencia consenso de glicosilación Asparagina-X-Serina (NXS en el código de una letra) ¿Cuáles de las tres luciferasas producidas terminarán glicosiladas? Justifique su respuesta. 70 IBMC 2011 PROBLEMA 4 En las levaduras la degradación de los ácidos grasos ocurre en los peroxisomas. Los ácidos grasos (ácidos carboxílicos de cadena larga que forman parte de los fosfolípidos) se degradan totalmente hasta fragmentarse en moléculas de Acetil-CoA. Este Acetil-CoA sale del peroxisoma gracias a una enzima proteica de localización peroxisomal llamada carnitina acetiltransferasa y entra en la mitocondria ayudado por la misma enzima, de localización mitocondrial. Una vez en la mitocondria, el Acetil-CoA entra al ciclo de Krebs, contribuyendo a la obtención de energía metabólica (ATP) del mismo modo que lo hace el Acetil-CoA proveniente de la glucólisis. Un único gen de localización nuclear codifica para las dos formas (peroxisomal y mitocondrial) de la carnitina acetiltransferasa: Este gen tiene 2 promotores alternativos de la transcripción. El promotor 1 (P1) es constitutivo. El promotor 2 (P2) es inducible por ácidos grasos. El transcripto iniciado por el promotor 1 no incluye nunca al exón 2 en el mRNA maduro, por splicing alternativo. El transcripto iniciado por el promotor 2 incluye a todos los exones que se encuentran río abajo de P2 en el mRNA maduro. Ambos promotores pueden funcionar simultáneamente. La actividad enzimática de la carnitina acetiltransferasa está codificada por los exones 3 y 4. Preguntas: a) ¿En qué compartimento celular se sintetizan las carnitina acetiltransferasas mitocondrial y peroxisomal; y qué tipo de translocación las lleva a sus destinos? b) ¿En qué compartimento/s celular/es se acumulará la actividad de carnitina acetiltransferasa en las siguientes condiciones: i) levaduras cultivadas sin ácidos grasos en el medio de cultivo. ii) levaduras cultivadas con ácidos grasos en el medio de cultivo. c) ¿Cuál será la ventaja (valor adaptativo) de que el promotor 2 (y no sólo el 1 o ambos) sea inducible por ácidos grasos? d) Para cada una de las dos condiciones de cultivo de la pregunta b), indique él o los destinos celulares de la actividad de carnitina acetiltransferasa para las siguientes mutaciones de su gen (suponga en todos los casos que las mutaciones se encuentran en homocigosis): i) Deleción de la secuencia que codifica para la señal de transporte a mitocondria (MTS). ii) Deleción de la secuencia que codifica para AKL. iii) Deleción de ambas secuencias (MTS y AKL). iv) Inserción, en el exón 2, río abajo del ATG y en fase de traducción con éste (se mantiene el marco de lectura), de una secuencia codificante para un péptido señal start transfer, que incluye el sitio de reconocimiento para la peptidasa de la señal. e) ¿Cuál es la causa molecular de que ninguna de las carnitina acetiltransferasas estudiadas (ni la enzima normal ni las mutantes descriptas en la pregunta d) se almacenen en los lisosomas? 71 IBMC 2011 PROBLEMA 5 La calreticulina es una proteína con actividad de chaperona, localizada normalmente en el lumen del retículo endoplasmático rugoso. Su actividad consiste en plegar correctamente proteínas mal plegadas, a las cuales reconoce sólo si están glicosiladas en asparragina con un oligosacárido que aún contenga la glucosa terminal. Se obtuvo una línea celular de ratón donde se anularon (knockearon) los dos alelos del gen de la calreticulina (células calret-). Si bien estas células son viables, pliegan mal algunas de sus proteínas, en particular a una glicoproteína de secreción llamada fibronectina. Se transfectaron células calret- con distintos clones de cDNA de calreticulina (Figura 1) que la dirigen a diferentes compartimentos celulares. La construcción A corresponde a la calreticulina normal (salvaje), en tanto que las construcciones B a D son variantes artificialmente creadas. Al final de la transfección se midió la cantidad de fibronectina presente en el medio condicionado. Los resultados (Figura 2) indican que sólo la transfección con la construcción A revirtió el fenotipo de las células calret-, es decir, permitió detectar niveles de fibronectina en el medio similares a los de las células normales. 72 IBMC 2011 Preguntas: a) ¿Por qué las células calret- sin transfectar tienen niveles mucho más bajos de fibronectina en el medio condicionado que las células normales? Justifique. b) ¿A qué compartimentos celulares se dirigieron y en qué forma se acumularon (soluble o de membrana) las calreticulinas codificadas por las construcciones A, B, C, D y E usadas para transfectar las células calret-? Justifique su respuesta poniendo en evidencia sus conocimientos teóricos sobre los mecanismos de direccionamiento de proteínas en las células eucariotas. En los casos de membrana dibuje la topología de la proteína calreticulina en la misma. c) ¿Por qué las transfecciones con las construcciones B, C, D y E no recuperaron los niveles de fibronectina en el medio? Justifique su respuesta para cada una de las construcciones indicando si en cada destino la chaperona encontró o no a la fibronectina, y, en caso de haberla encontrado por qué no pudo plegarla correctamente. d) ¿Qué resultados habría obtenido si en los experimentos de la Figura 2, en lugar de medir cantidad de fibronectina en el medio, hubiera medido cantidad de fibronectina intracelular? Dibuje el gráfico de barras y justifique. PROBLEMA 6 La proteína 1 es una proteína lisosomal. Se obtuvieron 3 variantes (2 a 4). Todas ellas, al igual que la 1, se translocan co-traduccionalmente en el retículo endoplasmático rugoso. Indique justificando: a) el destino final de cada una de las 3 variantes. b) cuál/cuáles de las 4 podrá/n estar sujeta/s al control de calidad de plegamiento que tiene lugar en el lumen del rugoso. 73 IBMC 2011 PROBLEMA 7 El Dominio de Agregación Condicional (DAC) es una secuencia aminoacídica que, por presentar alta afinidad por sí misma, provoca el agregado y precipitación de las proteínas que la poseen. A su vez el DAC presenta sitios de unión específica para el ligando sintético AP22542 (una molécula orgánica, no tóxica, pequeña e hidrofóbica que no es fabricada en células animales). Cuando se une al DAC, AP22542 promueve la desagregación de la proteína, permitiendo que la misma se pliegue correctamente y no precipite. La agregación de proteínas en el retículo endoplasmático rugoso provoca la retención de las mismas en su lumen, mientras que si se encuentran solubles y bien plegadas, dichas proteínas siguen la vía normal de secreción. La agregación de proteínas en el citoplasma (citosol) provoca la inmediata degradación total de las mismas por proteasas inespecíficas. Teniendo en cuenta estos conceptos, Rivera et al. (Science 287, 826-830, 2000) transfectaron células humanas en cultivo con la construcción I con el fin de desarrollar un sistema de expresión de proteínas recombinantes controlable por la adición o no del ligando AP22542 al medio de cultivo de las mismas. Entre el cDNA para DAC y el cDNA para la proteína X introdujeron una región que codifica para el sitio de reconocimiento de la proteasa FURINA, presente en todos los tipos celulares de mamíferos, pero de localización exclusiva en el lumen del aparato de Golgi. Se realizó un experimento de transfección con la construcción I, en ausencia del ligando AP22542. Al cabo de 48 hs se analizó la expresión de la construcción I en distintos compartimentos celulares por la técnica de Western, usando anticuerpos policlonales antiproteína X. Preguntas: a) ¿En qué destino (núcleo, citosol, lisosomas, peroxisomas, RER, Golgi, mitocondrias, medio extracelular) encontrará Ud. una banda que sea reconocida por el anticuerpo mencionado? ¿Qué peso molecular tendrá la banda observada? (considere 1 aminoácido = 100 Daltons). Justifique su respuesta. b) ¿En qué compartimentos encontrará Ud. una banda que sea reconocida por el anticuerpo mencionado y qué peso molecular tendrá la banda observada en una transfección igual a la de la pregunta a) pero en presencia del ligando AP22542? Justifique. c) ¿Qué resultados de Western habría obtenido en cada caso si se hubieran usado para transfectar las construcciones II y III, en ausencia y en presencia del ligando AP22542? Justifique. 74 IBMC 2011 d) La proteína X no posee señal de glicosilación. ¿Bastaría con introducirle la señal de glicosilación Asn-Ala-Ser en la construcción I para direccionarla a los lisosomas? ¿Por qué? En humanos “normales”, a los pocos minutos de haber ingerido alimentos aumenta la concentración de glucosa en sangre y la misma gatilla la secreción de la hormona insulina por las células del páncreas. La insulina secretada viaja por la sangre y estimula la entrada de glucosa a las células de los tejidos, donde será utilizada como fuente de energía. Al bajar los niveles de glucosa la insulina en sangre disminuye. En cierto tipo de diabetes, los pacientes no fabrican insulina y por lo tanto tienen altos niveles de glucosa en sangre (hiperglucemia). Como la glucosa no puede entrar a las células, éstas quedan “hambreadas” de glucosa y deficitarias en energía. e) Si con fines de terapia génica se utilizara una construcción similar a la I donde la proteína X fuera insulina y el promotor fuera de expresión en todos los tejidos, introduciéndola de manera estable en cualquier tipo celular del paciente, ¿qué debería administrarse a los pacientes y en qué momentos del día, para garantizar una secreción y función de insulina recombinante similares a las fisiológicas? Justifique. PROBLEMA 8 La fusión entre una vesícula de transporte y una membrana "blanco" ("target" en inglés) se lleva a cabo gracias a la existencia de proteínas integrales de membrana específicas llamadas SNAREs. La vesícula presenta en su membrana un v-SNARE, anclado por un dominio de transmembrana hidrofóbico, exponiendo hacia el citoplasma un dominio (DIE) que interacciona específicamente con el DIE del t-SNARE que se encuentra anclado en la membrana "target". Los DIEs son alfa hélices e interaccionan entre sí formando un "coiledcoil" o torzada. La unión de los dos tipos de SNARE por sus DIEs atrae físicamente a las dos membranas a una distancia tan corta (1,4 nm) que sus fosfolípidos se reordenan espontáneamente y se produce la fusión. La Figura 1 muestra el paso previo a la fusión de una vesícula de transporte y la membrana plasmática que dará lugar a una exocitosis. 75 IBMC 2011 La especificidad de la interacción v-SNARE/t-SNARE es tal que nunca dos v-SNAREs interactúan entre sí, ni tampoco dos t-SNAREs entre sí. Como se ve en la Figura 1, los SNAREs son proteínas integrales con topología atípica porque presentan sus extremos N-terminales hacia el citoplasma y sus C-terminales hacia el lumen de la vesícula o, lo que es topológicamente equivalente, hacia el exterior de la célula. Con el fin de usar el mecanismo de los SNAREs para lograr fusión de células entre sí, se fabricó una serie de clones de expresión de cDNAs de v- y t-SNAREs modificados con el agregado de un péptido señal start transfer y sitio para la peptidasa de la señal, para dirigirlos a otro destino celular y/o con otra topología (Fig. 2). Estos clones fueron transfectados individualmente o de a pares en células humanas en cultivo y a las 24 horas se determinó si hubo o no fusión celular. Cuando se transfectan de a pares ambas proteínas recombinantes son expresadas en las mismas células. De todas las combinaciones de transfección posibles (A solo, B solo, C solo, D solo, A+B, A+C, A+D, B+C, B+D y C+D), solamente en la última (C+D) se observó fusión celular. Preguntas: a) Explique para cada una de las 10 transfecciones por qué razón hubo o no fusión celular describiendo el destino celular de las proteínas recombinantes expresadas, su topología y glicosilación. Justifique. b) La tunicamicina es una droga que inhibe la glicosilación de proteínas en asparagina. Sabiendo que los v- y t- SNAREs normales tienen en sus DIE las secuencias Asn-Ala-Ser y AsnGlu-Thr repectivamente, ¿qué efectos tendrá el agregado de tunicamicina sobre: i) la fusión de vesículas con membranas "target" en células normales no transfectadas? ii) la fusión de células entre sí en células transfectadas con C+D? iii) la fusión de células entre sí en células transfectadas con A+B? Justifique PROBLEMA 9 (OPTATIVO) La siguiente es una clave dicotómica que permite identificar proteínas de acuerdo a su localización precisa en los distintos compartimentos de una célula eucariota. Los caracteres (o “etiquetas”) mencionados corresponden a los de los precursores de las proteínas maduras. a) Asigne correctamente el número de una o más proteínas de las listadas más abajo, a cada casillero de la clave. Ayuda para el uso de la clave: Para cada proteína compare los dilemas de igual jerarquía (A y AA, por ejemplo). Si la proteína pertenece a A, entonces continúe comparando los dilemas B y BB. Si la proteína pertenece a AA, entonces continúe comparando los dilemas G y GG. 76 IBMC 2011 Clave: A. Con péptido señal hidrofóbico N-terminal que reconoce al SRP (“signal recognition particle”) y secuencia de reconocimiento para la peptidasa de la señal. B. Con péptido hidrofóbico interno “stop transfer” (de anclaje). C. Con secuencia Asn-X-Ser/Thr en porción N-terminal ............................................. CC. Sin secuencia Asn-X-Ser/Thr en porción N-terminal ................................................ BB. Sin péptido hidrofóbico interno “stop transfer” (de anclaje). D. Con secuencia de retención KDEL............................................................................ DD. Sin secuencia de retención KDEL. E. Con secuencia Asn-X-Ser/Thr en porción N-terminal. F. Con señal conformacional para adición de Man-6P ............... FF. Sin señal conformacional para adición de Man-6P .................. EE. Sin secuencia Asn-X-Ser/Thr en porción N-terminal .................................. AA. Sin péptido señal hidrofóbico N-terminal que reconoce SRP. G. Con péptido “señal” para translocación a mitocondria. H. Con péptido de anclaje a membrana mitocondrial ............................................. HH. Sin péptido de anclaje a membrana mitocondrial ................................................ GG. Sin péptido “señal” para translocación a mitocondria. I. Con secuencia SKL de entrada a peroxisoma ........................................................ II. Sin secuencia SKL de entrada a peroxisoma. J. Con secuencia básica de transporte a núcleo ....................................... JJ. Sin secuencia básica de transporte a núcleo .......................................... Lista de proteínas a asignar: 1- Bip, proteína soluble que pliega proteínas en el lumen del retículo endoplasmático. 2- Insulina, hormona proteica no glicosilada. 3- Tubulina, proteína del citoesqueleto 4- Catalasa, enzima del peroxisoma 5- Factor de transcripción 6- Receptor de LDL (lipoproteína de baja densidad), proteína glicosilada de membrana. 7- Enzima del ciclo de Krebs 8- Subunidad del receptor de acetilcolina, proteína no glicosilada de membrana. 9- Hidrolasa ácida 10- Fosfofructoquinasa, enzima glucolítica. 11- Subunidad de membrana de la ATPasa mitocondrial b) Hay un casillero que queda vacío, ¿a qué tipo de proteínas corresponde? PROBLEMA 10 (OPTATIVO) Las proteínas peroxisomales (PP) entran al peroxisoma por translocación post-traduccional. La etiqueta es la secuecnia SKL (Ser-Lys-Leu) localizada en su extremo C-terminal. Dicha secuencia es reconocida por un receptor proteico citosólico llamado Pex5, el cual a su vez es reconocido por un receptor proteico de la membrana peroxisomal, llamado Pex 13. La función de SKL consiste exclusivamente en reconocer y unirse a Pex5. Si un péptido corto con la secuencia SKL es unido covalentemente a una partícula de oro de 9 nm de diámetro, equivalente al tamaño de la mayor parte de las PP en su estado plegado, dicha partícula se transloca normalmente al interior del peroxisoma. La Figura 1 muestra dos modelos alternativos para el mecanismo de entrada al peroxisoma. En el modelo "A", la PP se transloca sola, dejando a Pex5 en el citosol. En el modelo "B", se translocan conjuntamente la PP y Pex5 unidos, volviendo Pex5 al citosol posteriormente. 77 IBMC 2011 Para distinguir entre los dos modelos se hicieron los siguientes experimentos: Se transfectaron cultivos de células humanas normales o provenientes de un paciente con la enfermedad de Zellweger con la construcción de la Fig. 2. Las células de estos pacientes tienen peroxisomas defectuosos porque está anulada la maquinaria de importación de sus enzimas. La construcción de la Figura 2 expresa una proteína de fusión entre Pex5, la secuencia SKL, un sitio de reconocimiento para la proteasa Plp, la cual se localiza exclusivamente en el lumen del peroxisoma, y la porción codificante del gen de la β-galactosidasa de E. coli. Una vez transfectadas las células y transcurridas 48 hs, se aislaron las proteínas citosólicas y las contenidas en el lumen de los peroxisomas. Ambas preparaciones fueron analizadas por la técnica de Western (gel de poliacrilamida con SDS) con una anticuerpo que reconoce al Pex5 producido por la construcción de la Figura 2 pero no al Pex5 endógeno. En paralelo se midió la actividad de la β-galactosidasa. Los resultados se encuentran en la Figura 3. 78 IBMC 2011 Preguntas: a) ¿Cuál de los dos modelos es correcto? Justifique diciendo qué indican cada una de las bandas de la Figura 3 y la actividad de β-gal. b) Dibuje Westerns como los de la Figura 3, pero usando un anticuerpo anti β-galactosidasa. c) ¿Qué resultados habría obtenido en Westerns, (dibújelos) usando el mismo anticuerpo contra Pex5, si las construcciones transfectadas hubieran tenido las siguientes modificaciones, todas ellas sin alterar el marco de lectura restante?: i) Deleción de la secuencia que codifica para SKL. ii) Inserción de una secuencia que codifica para un péptido señal start tranfer en el extremo N-terminal de Pex5 . iii) Deleción de la secuencia que codifica para el sitio de reconocimiento para la Plp. d) ¿Cómo habrían dado los Westerns si el modelo correcto fuera el otro? e) ¿Por qué se observa actividad de β-galactosidasa en las células transfectadas si no se adicionó al cultivo ni lactosa ni IPTG? Justifique demostrando que sabe el tema "operón lac". f) ¿Alguna de las 3 proteínas (PP, Pex5, Pex13) podría estar glicosilada en asparagina? Justifique. g) ¿En qué aspectos la translocación de proteínas al peroxisoma resulta semejante a i) a translocación al REG de las proteínas de secreción? ii) la importación de proteínas por la mitocondria? iii) el transporte de proteínas al núcleo? Compárelas considerando los siguientes parámetros: - caracter post o co-traduccional - etiqueta - receptor soluble de la etiqueta - receptor de membrana del anterior - canal hidrofílico - estado de plegamiento de la proteína durante el pasaje - necesidad de chaperonas para el pasaje h) La función de los peroxisomas es proveer de enzimas oxidasas y catalasa que oxidan compuestos orgánicos que pudieran resultar tóxicos para la célula, tornándolos inactivos. Estas reacciones de oxidación consumen oxígeno. No obstante, las células provenientes de pacientes de enfermedad de Zellweger consumen oxígeno normalmente. ¿Cómo se explica? ¿Qué función cumpliría ese consumo de oxígeno? 79 IBMC 2011 CÉLULA II CITOESQUELETO, CICLO CELULAR Y NEURONAS. A) GUÍA DE ESTUDIO CITOESQUELETO 1) Describa los tres componentes del citoesqueleto incluyendo: monómeros que los componen, estructura, tamaño, localización, polaridad y orientación (si la tienen). 2) ¿Cuál es el efecto del la colchicina, colcemida, taxol, agua pesada, vinblastina y vincristina? Indique sobre qué componentes del citoesqueleto actúa cada compuesto. 3) Defina “extremo +”, “extremo –“ y “concentración crítica” para un microtúbulo de tubulina o un microfilamento de actina. ¿Cómo se diferencian los extremos en cuanto al estado de hidrólisis de las moléculas de GTP (microtúbulos) o ATP (filamentos de actina)? 4) Describa los fenómenos de “efecto noria” (treadmilling) y “catástrofe”. 5) ¿Cuáles de los componentes del citoesqueleto son estables y cuáles dinámicos? Describa los distintos procesos celulares en los cuales intervienen los dinámicos. 6) Describa la estructura de un flagelo o cilia y cómo se produce el movimiento de los mismos. ¿En qué células de qué organismos se encuentran? ¿Qué es el efecto telescópico? 7) ¿Qué función cumplen las proteínas motor dineína y kinesina? ¿Con qué componentes del citoesqueleto interaccionan? 8) ¿Qué tipo de microtúbulos participan en la división celular y qué papel que cumple cada uno? ¿Cuáles son los distintos modelos postulados sobre el papel de los microtúbulos en la segregación de los cromosomas? 9) Defina centríolo, centrosoma y centrómero. 10) ¿En qué estructuras celulares se encuentran filamentos de actina? Dé ejemplos de proteínas que modifican las propiedades (elasticidad y plasticidad) de los filamentos de actina. 11) ¿Qué tipos de filamentos intermedios conoce? 12) ¿Qué tipo de moléculas forman la lámina nuclear? ¿Qué ocurre con la lámina nuclear durante la mitosis? 13) Describa los distintos tipos de uniones célula-célula y célula-matriz extracelular. ¿Con qué elementos del citoesqueleto interaccionan? CICLO CELULAR 1) Describa los distintos tipos de señalización (autócrina, parácrina, endócrina, neuronal, dependiente de contacto). Dé ejemplos de tipos de moléculas que reciben esas señales. 80 IBMC 2011 2) ¿Qué se entiende por “Transformación Celular”? Señale diferencias con “Transformación Bacteriana”. 3) ¿Qué es un “interruptor molecular”? Dé ejemplos. 4) ¿Qué es un Oncogén? ¿Qué es un Supresor de Tumores? Qué es un Proto-Oncogén? 5)¿Cuáles son los mecanismos que pueden llevar a la activación de un Proto-Oncogén? 6) Teniendo en cuenta dos ejemplos clásicos de interruptores moleculares, ¿cuáles de las mutaciones que pueden sufrir resultan en transformación celular? 7) ¿Qué tipo de experimentos permiten identificar un oncogén? 8) ¿Cuáles son las distintas fases del ciclo celular y qué procesos ocurren en cada una de ellas? 9) ¿Qué son los “puntos de chequeo” (o control) y cuál es su importancia biológica? 10) ¿Qué tipos de moléculas regulan los puntos de control de las transiciones entre una fase y la siguiente y cómo se regula su actividad? 11) ¿Qué significa que el ciclo celular sea unidireccional? ¿Cómo se logra? NEURONAS 1) ¿Que célula es considerada la unidad celular del tejido nervioso? ¿En qué diferencias estructurales se basan la hipótesis reticular y la hipótesis neuronal de la estructura del sistema nervioso? ¿Qué desarrollo tecnológico permitió saldar la disputa entre estas dos hipótesis (Golgi vs Cajal)? 2) ¿Cuáles son los mecanismos de comunicación entre las diferentes partes de una neurona cuyo cuerpo se encuentra a metros de su terminal sináptica? ¿Qué función cumple cada uno? 3) Dibuje los elementos básicos que definen una sinapsis química y una sinapsis eléctrica. 4) El Dr. Eduardo De Robertis (1913-1988) descubrió en nuestro país las vesículas sinápticas. ¿Qué contienen? ¿Cómo y hacia dónde vierten su contenido? ¿Cuál es el receptor de ese contenido? ¿Cuál es el destino de la vesícula sináptica una vez que vertió su contenido? ¿Cuál es el destino del contenido? 5) ¿Qué significa activar un canal? ¿Qué diferencia fundamental existe entre la estructura molecular de un canal voltaje-dependiente y uno ligando-dependiente? ¿Dónde se ubica cada uno de estos tipos en una neurona? 6) Explique la estructura general de un canal de Na voltaje-dependiente. Mencione diferencias y similitudes con el canal de Ca-voltaje dependiente y el canal de K-voltaje dependiente. 81 IBMC 2011 B) PROBLEMAS CITOESQUELETO PROBLEMA 1 La figura muestra una fotografía de microscopía electrónica de un corte transversal de un flagelo eucariota. a) Asigne los siguientes componentes a las posiciones indicadas por números en la figura. Túbulo "A" Vaina interna Túbulo "B" Nexina Brazo externo de dineína Radio Brazo interno de dineína Microtúbulo único b) ¿Cuáles de las estructuras mencionadas están compuestas por tubulina? c) ¿Cuáles de las estructuras son continuas con componentes del cuerpo basal o blefaroplasto? d) Mutaciones en los genes que codifican para las dineínas causan esterilidad masculina porque los flagelos de los espermatozoides no se mueven. ¿Por qué estos pacientes presentan también trastornos en las vías respiratorias tales como congestiones bronquiales? e) ¿Por qué el tratamiento de un hombre con cáncer con taxol, una droga que estabiliza los microtúbulos polimerizados, inhibe la proliferación de las células cancerosas y disminuye la cantidad de espermatozoides producidos por los testículos pero no afecta la motilidad de los mismos? Justifique cada uno de los 3 casos. PROBLEMA 2 El movimiento ondulatorio de un flagelo eucariota se produce porque éste se curva en ciertas regiones y esa curvatura se va corriendo a lo largo del flagelo, según se ilustra en la Figura 1. La fuerza que produce la curvatura es una fuerza de deslizamiento entre 2 dobletes de microtúbulos adyacentes por acción de las cabezas de dineína que funcionan como proteínas "motor" y se desplazan sobre la tubulina. a) En una curvatura como la que se muestra en la Figura 2, ¿cuánto se deslizó (en nanometros) un doblete de microtúbulos respecto del adyacente? 82 IBMC 2011 b) Las moléculas elásticas de nexina que unen dobletes adyacentes deben estirarse para acomodar la curvatura del flagelo hasta un semicírculo. Si el largo de una banda de nexina no estirada situada en la base del flagelo es de 30 nm. ¿cuál es el largo de la banda de nexina estirada situada en la punta del flagelo? c) ¿Qué ocurriría con los dobletes adyacentes de la figura si se destruyeran las bandas de nexina y los radios por un tratamiento suave con proteasas, que no destruye a los microtúbulos de tubulina? Datos: - perímetro del círculo: p = 2.π.r (r: radio) - teorema de Pitágoras: a²+b² = c² (a y b son los catetos y c es la hipotenusa) PROBLEMA 3 Los microtúbulos del cinetocoro, que unen a los centrosomas con los cinetocoros, guían a los cromosomas hacia los polos de la célula durante la mitosis. De cada centrosoma sale también, en forma radial, un conjunto de microtúbulos que no se enganchan a cromosomas, llamados microtúbulos del áster. Se realizó el siguiente experimento in vitro: Centrosomas aislados fueron incubados con tubulina soluble (monomérica) para iniciar el crecimiento de microtúbulos y posteriormente se agregaron cromosomas aislados. Los cromosomas se unieron espontáneamente a los extremos libres de los microtúbulos, como se ilustra en la figura. Los complejos fueron luego diluidos a una concentración muy baja de tubulina soluble y fueron observados nuevamente. Como se ve, sólo los microtúbulos del cinetocoro resultaron resistentes a la dilución. 83 IBMC 2011 a) ¿Por qué piensa Ud. que los microtúbulos del cinetocoro son más estables que los del áster? b) De todos modos, los microtúbulos del cinetocoro no son 100% estables en una célula. ¿Cuál es la evidencia para esta afirmación? c) Explique el mecanismo de la desaparición de los microtúbulos del áster luego de la dilución. ¿Se despegan del centrosoma; se despolimerizan de un extremo o se desintegran al azar en varios puntos a lo largo de su longitud? PROBLEMA 4 En la figura se grafica la velocidad de crecimiento para los dos extremos (+ y -) de microfilamentos de actina en función de la concentración de actina globular soluble. a) Señale en la figura los rangos de concentraciones en que: i) ambos extremos despolimerizan ii) ambos extremos polimerizan iii) un extremo polimeriza y el otro despolimeriza b) Identifique las curvas del extremo (+) y del (-). c) Defina y señale la concentración crítica del extremo (+) y la del extremo (-). d) ¿Qué es el efecto noria o "treadmilling"? Indique en qué punto de las abcisas se produce efecto noria. e) De acuerdo a lo anterior, ¿cómo define extremos (+) y (-)? PROBLEMA 5 La doble membrana nuclear está sostenida, desde el lado nuclear, por una malla fibrosa de laminas llamada lámina nuclear. Las laminas son 3 tipos de proteínas (lamina A, lamina B y lamina C) que forman filamentos intermedios. Cuando las células entran en mitosis, la lámina nuclear se desarma y la membrana nuclear se desintegra. El armado y desarmado de la lámina nuclear está controlado por la fosforilación reversible y regulada de las laminas. Para investigar el rol de la fosforilación Ud. marca células con un aminoácido radiactivo y luego purifica las laminas tanto de células que están en mitosis como de células en interfase. Después somete las laminas purificadas a electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida. 84 IBMC 2011 En este tipo de electroforesis, las proteínas se separan de acuerdo a su peso molecular en una dirección y de acuerdo a su carga neta en otra dirección, perpendicular a la primera. Como control también se corrieron laminas de mitosis tratadas con fosfatasa alcalina, una enzima que las defosforila completamente. a) Ordene las 3 laminas por peso molecular decreciente. b) Ordene las 3 laminas por carga neta negativa creciente. c) En la mitosis, ¿las laminas se fosforilan o se defosforilan? d) ¿Por qué la lamina C de la mitosis presenta dos manchas en la electroforesis bidimensional? e) ¿Por qué piensa Ud. que los cambios de fosforilación en la mitosis no producen cambios sensibles en el peso molecular de las laminas? f) ¿De qué manera piensa Ud. que los cambios en la fosforilación provocarán el desarmado de la lámina nuclear? Nota: Ojo!, no confundir los términos lamina (proteína) con lámina (estructura nuclear formada por laminas) y mucho menos con laminina (otra proteína no emparentada con las laminas que forma parte de la matriz extracelular de muchas células). 85 IBMC 2011 CICLO CELULAR PROBLEMA 6 Critique las siguientes afirmaciones y justifique. a) El ciclo celular se divide en varias fases, las cuales están marcadas en el diagrama. De todas ellas, la más rica en eventos regulatorios conocidos es “G1”. b) Durante G1 sucede el proceso de división en sí. c) La replicación del ADN nuclear ocurre durante un periodo muy corto de la interfase llamado periodo “S”. d) Los tiempos de cada fase son variables pero la que sufre mayores variaciones en su duración entre diferentes generaciones es la fase “M”. e) Un tipo de proteínas clave en el control del desarrollo del ciclo celular es la ciclina. Su aparición (o aumento) dispara procesos posteriores que dependen de la fosforilación de proteínas en algunos de sus residuos serinas y/o treoninas. f) La ciclina se une a otra proteína (Cdk o “quinasa dependiente de ciclinas”) inhibiendo su actividad enzimática (proteína quinasa). Cuando las condiciones en que se encuentra la célula así lo indican, la ciclina es rápidamente degradada liberando a la Cdk. Esta Cdk ahora puede mostrar su actividad y permite que se supere el siguiente punto de control o “checkpoint”. PROBLEMA 7 Una gran parte del conocimiento actual sobre el funcionamiento del ciclo celular ha sido conseguida gracias a estudios realizados con levaduras que tienen mutados genes esenciales para que el ciclo prosiga. Cuando uno de esos genes está mutado las levaduras son incapaces de dividirse y eso se considera evidencia de que esos genes codifican para proteínas de importancia para la progresión del ciclo. Este concepto, si bien ha resultado sumamente útil plantea una paradoja: Si esas cepas mutantes no pueden dividirse, las colonias de levaduras no pueden crecer. ¿Cómo es que existen entonces estas levaduras? ¿Cómo se hace para poder propagarlas? PROBLEMA 8 Las proteínas quinasas agregan un grupo fosfato a sus proteínas blanco, acción que se denomina “fosforilar” en la jerga de los laboratorios de biología molecular. Estas se dividen en serín/treonín quinasas y tirosín quinasas dependiendo del tipo de aminoácido al cual fosforilen. El Factor Promotor de la Mitosis (MPF) es una proteína dimérica compuesta por una ciclina (ciclina B) y una Cdk o “quinasa dependiente de ciclinas” que se llama Cdc2, y es del tipo serín/treonín quinasa. Además del control de la actividad quinasa de las Cdks dado por la aparición y desaparición periódica de las ciclinas, existe un nivel adicional de control dado por un 86 IBMC 2011 mecanismo alternativo que consiste en la fosforilación en tirosinas de la subunidad Cdc2 de MPF, tal cual se esquematiza en la parte central de la figura. Un aminoácido crítico de Cdc2 es el #15, tirosina, abreviado como Y15, el cual es fosforilado por la quinasa de tirosinas Wee1 y defosforilado por la fosfatasa de tirosinas Cdc25. El balance entre las actividades de estas dos proteínas determina el estado de fosforilación de Y15 en Cdc2. Cuando Wee1 está más activa que Cdc25, Y15 queda fosforilada y por lo tanto MPF resulta inactivo. En el caso inverso, Y15 queda desfosforilada y MPF se muestra activo. Las actividades regulatorias varias de MPF y sus proteínas asociadas se estudian en extractos de ovocitos de rana. En esos extractos, la quinasa Wee1 está activa y la fosfatasa Cdc25 está inactiva. a) ¿Cómo será la actividad de MPF en esos extractos de ovocitos, alta o baja? Como dato adicional de la complejidad del sistema sabemos que, así como la actividad de MPF es regulada por fosforilación, también lo es a su vez la actividad de Cdc25. El ácido okadaico (OA) es un potente inhibidor de las fosfatasas del tipo serina/treonina. El agregado de OA es usado comúnmente como método para lograr una rápida activación de MPF. Usando anticuerpos específicos para cada componente se puede analizar el estado de fosforilación de cada molécula en los extractos siguiendo la movilidad electroforética de los mismos en geles PAGE-SDS y desafío con los anticuerpos respectivos (Western-Blot). Nota: las proteínas fosforiladas normalmente corren más despacio que sus versiones no fosforiladas. Los efectos del agregado de OA se muestran en la figura. 87 IBMC 2011 En base a los resultados del gel: b) ¿Podría decir si la proteína Cdc25 está fosforilada o no? ¿En qué tipo de aminoácidos? c) Indique cuál de las dos formas (activa o inactiva) corresponde a la proteína Cdc25 fosforilada y márquela en el esquema de modo tal de ubicar la actividad quinasa y la actividad fosfatasa que actúa sobre ella. d) ¿Cómo puede ser que el OA cause un aumento de la fosforilación de Cdc25 pero una disminución en la fosforilación de Cdc2? PROBLEMA 9 La duración del ciclo celular puede variar mucho de acuerdo al entorno en el que se encuentra un tipo celular determinado a expensas de la duración de cada una de las distintas fases, excepto de la M, que es bastante constante y de aproximadamente 1 hora. Para medir la duración del ciclo celular de los hepatocitos que forman parte del hígado de un ratón adulto, se prepararon cortes de hígado y se los tiñó con un colorante para que las células en mitosis resulten fácilmente reconocibles al microscopio. Habiendo observado 25.000 células en total, se encontraron solamente 3 células en mitosis. a) Calcule la duración del ciclo celular de los hepatocitos en el hígado de un ratón adulto. En otro experimento, los hepatocitos fueron disgregados y puestos en condiciones de cultivo (asincrónico) sobre una placa de plástico. En un momento se agregó timidina radiactiva que se incorpora al DNA a través del proceso de replicación. A distintos tiempos (posteriores al agregado de timidina radiactiva), se separaron alícuotas para: 1) contar las células totales (Figura 1) 2) contar las células que presentaban mitosis con cromosomas marcados con la radiactividad (Figura 2). b) En base a las Figuras 1 y 2 calcule la duración total del ciclo celular y de la fase G2 de los hepatocitos en cultivo. c) Con los datos anteriores y del enunciado, y sabiendo que el período S dura 6 horas, ¿cuánto dura G1? d) Si la velocidad de avance de la DNA polimerasa en la fase S es siempre 2 kpb/minuto y el tamaño del genoma de ratón es 3x109 pb, ¿en cuánto tiempo se terminaría de replicar todo el genoma? ¿Es consistente el resultado de este cálculo con las respuestas anteriores? 88 IBMC 2011 NEURONAS PROBLEMA 10 El Prof. John Z. Young (Premio Nobel de Medicina) descubrió que ciertas especies de calamares (Loligo) poseen un axón gigante (del diámetro de un spaghetti y de varios centímetros de longitud. El Prof. Rodolfo Llinás utilizó esta preparación para estudiar la importancia del axoplasma y sus elementos (iones, proteínas, etc.) en la generación del impulso nervioso. Con un rodillo extrajo todo el axoplasma e insertando una cánula en el mismo permitió rellenarlo con distintas soluciones. a)¿Cuál de las siguientes soluciones cree Ud. que reemplazará más fielmente al axoplasma? - Solución A: NaCl 440 mM, KCl 5 mM, CaCl2 0,001 mM - Solución B: albumina 1g/litro, NaCl 440 mM, KCl 5 mM, CaCl2 0,001 mM - Solución C: KCl 440 mM, NaCl 5 mM, CaCl2 0,1 mM b) ¿Permitirá la solución que Ud. eligió generar un potencial de acción? c) Si agregamos a la solución exterior saxitoxina (toxina que producen los dinoflagelados durante los episodios de marea roja y que bloquea el canal de Na+ especificamente), ¿se podrá generar un potencial de acción? ¿Se producirán cambios muy significativos en el potencial de membrana? PROBLEMA 11 (con conceptos de citoesqueleto) En las neuronas, muchas proteínas que terminan alojadas en el espacio sináptico viajan dentro de vesículas de secreción desde el cuerpo celular a lo largo del axón hasta su porción terminal. Los ribosomas libres y asociados al retículo endoplasmático se encuentran exclusivamente en el citoplasma del cuerpo celular. Preguntas: a) ¿Qué efectos tendrá la colchicina, un alcaloide que afecta el equilibrio dinámico tubulina/microtúbulos, sobre la secreción de proteínas en el botón axonal? Justifique. b) La secreción requiere ATP in situ (en el lugar), lo cual es coherente con el hecho de que las mitocondrias también viajen por la misma vía hasta el terminal axonal (a una velocidad aproximada de 1 metro por día!). No obstante, el ATP también es requerido a lo largo de todo el axón. ¿Para qué? c) La enfermedad hereditaria de “Charcot*-Marie-Tooth” es una neuropatía causada por la mutación del gen de la kinesina KIF1B que impide a esta proteína unir ATP. El síntoma más notorio de esta enfermedad es debilidad muscular. ¿Cuál es el mecanismo molecular de la enfermedad? * Nota histórica: Jean-Martin Charcot (1825-1893) fue un famoso neurólogo francés que fue maestro de Sigmund Freud durante su visita al hospital “La Salpetrière” de París. 89 IBMC 2011 PROBLEMA 12: Problema integrador de citoesqueleto, tránsito de proteínas y metabolismo (OPTATIVO) Los animales alternamos períodos de vigilia (estar despiertos) con períodos de sueño (estar dormidos). Poco se sabía de los eventos moleculares que determinan el pasaje de la vigilia al sueño y viceversa, hasta que se descubrió una proteína, llamada orexina (hipocretina), que es fabricada por algunas neuronas (llamadas aquí neuronas de tipo I) de una región del cerebro llamada hipotálamo. La orexina es sintetizada en el retículo endoplasmático rugoso y empaquetada en vesículas de transporte que viajan, mediante una proteína motor, por los microtúbulos maduros (o estables) de los axones de las neuronas de tipo I hacia sus terminales nerviosas donde es secretada por exocitosis. La orexina secretada difunde por la sinapsis hasta encontrarse con la membrana de neuronas de tipo II, donde interactúa con un receptor específico constituido por una proteína integral de siete pasos de membrana. La unión de la orexina a su receptor produce una serie de efectos biológicos que incluyen promover la vigilia y el apetito. Existe una enfermedad en los humanos llamada narcolepsia en la cual los pacientes tienen somnolencia diurna y sufren ataques repentinos de sueño, desplomándose de golpe por falta de tono muscular. Esta enfermedad ha sido muy estudiada en perros. Existen dobermans y “salchichas” alterados genéticamente que sufren narcolepsia. Se los puede observar jugueteando activamente hasta que de repente caen dormidos por unos 30 a 60 segundos, sin tono muscular alguno, luego de lo cual despiertan de golpe y siguen jugando por unos minutos antes de repetir el ciclo. En 1999 se descubrió que los perros narcolépticos tienen mutado el gen del receptor de orexina. Al poco tiempo se encontró que algunos humanos narcolépticos tienen destruidas las neuronas de tipo I, mientras que otros tienen mutado el gen de la orexina. Como prueba experimental de estas observaciones, se hicieron ratones knock out para el gen de la orexina, los cuales nacieron y crecieron normalmente pero presentaron narcolepsia y además comían menos que los normales. Si quiere ver filmaciones reales de dobermans, humanos y ratones narcolépticos, baje archivos de la siguiente dirección de web: http://med.stanford.edu/school/Psychiatry/narcolepsy/moviedog.html 90 IBMC 2011 Preguntas: a) ¿Cuáles de las siguientes mutaciones en el gen de orexina causarán narcolepsia? Justifique indicando los destinos celulares de las proteínas mutadas. i) Deleción del péptido señal “start transfer”, sin alterar el resto del marco de lectura. ii) Introducción de una secuencia de aminoácidos básicos (localización nuclear,) sin alterar el marco de lectura ni el plegamiento del resto de la proteína. iii) Cambio de un aminoácido por otro que provoca un mal plegamiento irreversible de la proteína. iv) Introducción de una secuencia SKL (de entrada a peroxisoma) en el extremo Cterminal, sin alterar el marco de lectura ni el plegamiento del resto de la proteína. v) Deleción de la secuencia de reconocimiento para la peptidasa de la señal, sin alterar el resto del marco de lectura. b) El taxol es una droga usada frecuentemente en quimioterapia del cáncer, cuyo mecanismo de acción consiste en inhibir el equilibrio polimerización/despolimerización de los microtúbulos de tubulina. Sabiendo que ni las neuronas de tipo I ni las de tipo II se dividen en el adulto, pero que los microtúbulos son imprescindibles para la llegada de las vesículas con orexina a los terminales nerviosos, ¿producirá el tratamiento con taxol trastornos en el sueño en los pacientes? Justifique. c) ¿Cómo se definen el extremo (+) y el extremo (–) del microtúbulo de tubulina? d) El receptor de orexina (7 pasos de membrana) es una glicoproteína. i) ¿Con qué tratamientos se lo podrá solubilizar? Justifique. ii) ¿Por qué a pesar de ser una glicoproteína no se dirige a los lisosomas? iii) Su secuencia aminoacídica presenta 3 sitios de N-glicosilación (Asn-X-Ser): uno de ellos se encuentra en uno de los segmentos transmembrana, otro en uno de los dominios extracelulares y el tercero, en uno de los dominios intracelulares. Sólo uno de los 3 está glicosilado, ¿cuál y por qué? e) (Pregunta extra con conceptos de metabolismo) La termogenina es una proteína que se integra a la membrana interna mitocondrial y actúa como desacoplante. Tanto la sobreexpresión de termogenina como la falta de oxígeno (anoxia) producidas en neuronas de tipo I de ratones normales reducen los niveles de ATP sin matar a las células. Explique las diferencias entre los mecanismos de acción de la termogenina y la anoxia; y por qué ambos eventos causan narcolepsia a pesar de no matar a las neuronas de tipo I. Justifique. 91 IBMC 2011 INMUNOLOGÍA A) GUÍA DE ESTUDIO 1) ¿Qué es un antígeno? ¿Qué tipo de sustancias son los antígenos? 2) ¿Qué es un anticuerpo? ¿Qué tipo de sustancias son los anticuerpos? 3) ¿Dónde se producen las células precursoras de las células blancas? ¿Dónde maduran los linfocitos? ¿En qué órganos se pueden encontrar linfocitos? 4) Explicar las diferencias entre una respuesta inmune humoral y una respuesta inmune celular: ¿Qué se produce, contra qué reaccionan estos productos y como se destruye el antígeno en cada respuesta? 5) ¿Cómo se explica que un organismo sea capaz de producir anticuerpos contra una sustancia sintética que no existe en la naturaleza? 6) ¿Qué hecho determina que un determinado clon de linfocitos sea seleccionado para multiplicarse y madurar? 7) ¿Por qué la segunda exposición a un antígeno suele provocar una respuesta inmune más rápida e intensa que la primera? 8) ¿Por qué un mismo animal no fabrica anticuerpos contra sus propias macromoléculas? 9) ¿Cuántas cadenas polipeptídicas y de qué tipo forman un anticuerpo? ¿Cómo se disponen? ¿Dónde está el sitio de unión al antígeno? ¿Cuántos hay por molécula de anticuerpo? 10) ¿Cuántos tipos de cadenas livianas y pesadas existen y cómo se llaman? ¿Qué clases de anticuerpos: a) activan complemento? b) atraviesan la placenta? c) se unen a fagocitos? d) se unen a mastocitos? e) predominan en la respuesta primaria? f) se encuentran en las secreciones? 11) ¿Pueden los anticuerpos matar por sí mismos a microorganismos invasores? 12) ¿Qué son las regiones constantes, la región variable y la región hipervariable de una inmunoglobulina? 13) ¿Cómo se explica que un ser humano sea capaz de producir más moléculas diferentes de anticuerpos que las que podrían ser codificadas por todo el ADN de su genoma? 14) ¿Por qué son variables las zonas variables de cada cadena? ¿Qué otros factores aumentan la diversidad de los anticuerpos? ¿Cuántos anticuerpos diferentes son producidos por un único linfocito B? 15) ¿Qué determina que se produzca el cambio de clase del anticuerpo secretado por la misma célula plasmática? 16) ¿Qué clases de linfocitos T existen y qué hace cada una? 92 IBMC 2011 17) ¿Qué es un epitope? ¿Qué es un anticuerpo monoclonal? ¿Cómo se produce un anticuerpo monoclonal en el laboratorio? ¿Qué es un anticuerpo policlonal? 18) Explique por qué una célula infectada con un virus se convierte en un blanco del sistema inmune. 19) ¿En qué células se encuentran los antígenos de MHC de tipo I? ¿Qué tipos de células reconocen? 20) ¿En qué células se encuentran los antígenos de MHC de tipo II? ¿Qué tipos de células reconocen? 21) ¿Cómo presentan las células B y los macrófagos los antígenos provenientes del exterior a las células T? 22) ¿Cómo se presentan los antígenos provenientes del interior de la célula? 23) ¿Qué es el proteasoma? 24) ¿Existe un motivo de estructura primaria (una secuencia aminoacídica consenso) característico de los polipéptidos de presentación? 25) ¿Dónde se ensamblan (se arman) las moléculas MHC? 93 IBMC 2011 B) PROBLEMAS PROBLEMA 1 La iguana voladora de la isla de Krakatoa poseía en su saliva una exótica proteína, la krakatoína, que inyectada en una persona, tenía como único efecto matar a aquellos linfocitos B que se unieran por sus receptores a la krakatoína. En 1987, el profesor Vulkan descubrió que si la saliva de las iguanas voladoras era hervida antes de ser inyectada, la persona podía producir anticuerpos contra la Krakatoína y quedaba vacunada por un tiempo contra la mordedura de la iguana voladora. Los estudios del Prof. Vulkan fueron interrumpidos por la famosa erupción volcánica que destruyó la isla y extinguió completamente a las iguanas y al Prof. Vulkan, por lo que quedaron pendientes las siguientes cuestiones: a) ¿Era letal la mordedura de la iguana? b) ¿Quedaban vacunadas contra la krakatoína aquellas personas mordidas por iguanas vivas que, se entiende, no habían sido hervidas previamente? c) ¿Podían ser vacunadas con krakatoína hervida aquellas personas que previamente habían sido mordidas por iguanas voladoras? d) ¿Habían perdido muchos linfocitos B por acción de la krakatoína las personas mordidas? PROBLEMA 2 Se sabe que existe un solo par de alelos para la inmunoglobulina M (IgM) por célula. Hay dos formas de IgM, la de membrana y la secretada, las cuales difieren en las regiones Cterminales de sus cadenas pesadas. La IgM de membrana tiene una secuencia hidrofóbica de transmembrana (o anclaje) que no está presente en la forma secretada. Ud. dispone de un oligonucleótido sintético correspondiente a la secuencia de anclaje, como así también de un anticuerpo monoclonal que sólo reconoce dicha secuencia aminoacídica. Con estas dos herramientas moleculares, Ud. analiza DNA, RNA y proteínas de dos tipos celulares: linfocitos B inmaduros (LB) y plasmocitos (PL). a) Interprete los resultados. b) ¿Por qué mecanismo se generan las dos formas de IgM? c) ¿Qué resultados se habrían obtenido si con los mismos filtros se hubieran usado como sondas un oligonucleótido sintético y un anticuerpo monoclonal correspondientes a las regiones constantes de la cadena pesada de la IgM? d) Dibuje una molécula de IgM unida a membrana y una soluble. 94 IBMC 2011 PROBLEMA 3 Ud. entra a trabajar a un laboratorio de inmunología como becario y su director le pide que realice 3 experimentos de "Western". La idea es confirmar, para cada uno de 8 cultivos celulares (del A al H), de qué tipo celular se trata: linfocitos B (inmaduros, maduros o de memoria), precursores de linfocitos B o plasmocitos. Cada "Western" fue revelado con un anticuerpo específico diferente según muestra la figura: a) Complete la siguiente tabla con los resultados de los experimentos de “Western” indicando a qué tipo celular corresponde cada cultivo y qué función o tipo de respuesta realiza. señal positiva para: sec. de Cµ Cδ anclaje Cultivo A B C D E F G H Tipo celular Función / Tipo de respuesta Se realizó un cuarto “Western” que fue revelado con un anticuerpo anti Vh del clon X. Los resultados se muestran en la siguiente figura: b) Dibuje detalladamente para los cultivos A y H el RNA mensajero maduro de la cadena pesada de Ig. 95 IBMC 2011 PROBLEMA 4 Hace algunos años (Nature 415: 1035, 2002), Hochenlinger y Jaenisch generaron un ratón clonado por transferencia de un núcleo de un linfocito B ya exitosamente rearreglado (de aquí en más llamado donante) a un cigoto al cual se le había destruido su propio núcleo. Preguntas: a) ¿Qué quiere decir que una respuesta B humoral a una infección es policlonal? Responda brevemente. La respuesta a esta pregunta le ayudará a seguir adelante con el problema. b) Todos los linfocitos B del ratón clonado resultaron monoclonales. ¿Qué significa esta afirmación? c) Para comprobar la afirmación anterior, los investigadores hicieron 100 Northern blots de RNAs obtenidos de 100 linfocitos B maduros individualmente obtenidos de ganglios del animal. ¿Cuál de las siguientes sondas fue la que se usó en la hibridación del Northern que permitió concluir que todos los linfocitos B del ratón clonado eran monoclonales? Justifique. Segmentos de DNA correspondientes a: i) un rearreglo VDJ (de cadena pesada), distinto del arreglo del linfocito B donante. ii) el rearreglo VDJ (de cadena pesada) del linfocito B donante. iii) la porción constante mu (Cµ) de cadena pesada del linfocito B donante. iv) la porción constante delta (Cδ) de cadena pesada del linfocito B donante. A posteriori, los investigadores analizaron DNA genómico de hepatocitos y neuronas del ratón clonado adulto y encontraron que estos contienen el mismo rearreglo en los genes que codifican para las inmunoglobulinas. d) ¿Es también así en el DNA genómico de hepatocitos y neuronas de los animales normales (no clonados)? Justifique. Los investigadores encontraron que la cantidad de linfocitos en sangre del animal clonado es normal y que entre los anticuerpos secretados había de diferentes clases incluyendo del tipo IgM, de lo cual concluyeron que la célula B donante original no había sufrido aún “switch de clase”. e) ¿Es correcta esta afirmación? Justifique. f) ¿Qué habría concluido respecto a la célula B donante si sólo hubieran encontrado IgA? ¿Es posible obtener sólo IgA? g) ¿Cómo serán en cuanto a su variabilidad los receptores de células T (TCR) de los linfocitos T de este ratón, monoclonales o policlonales? Finalmente hicieron también otro ratón clonado por transferencia nuclear a partir de un linfocito T ya exitosamente rearreglado, con resultados similares en cuanto a la monoclonalidad de las células maduras del ratón en los linajes celulares correspondientes. h) ¿Cuál/es de los dos animales (clonado a partir de célula B o clonado a partir de célula T) será capaz de: i) Generar una respuesta inmunológica a un transplante de órgano o tejido heterólogo. Justifique. ii) Generar una respuesta humoral a la inyección de un antígeno. PROBLEMA 5 Tomando en cuenta el esquema del DNA que codifica para las cadenas pesadas (H) de los anticuerpos que se muestra en la Figura 1 y la curva de respuesta de un animal de experimentación a la inyección de un antígeno "X" que se ilustra en la Figura 2: a) Dibuje: i) Un esquema de los mRNAs más abundantes de las cadenas H de los linfocitos B (B1, B2, B3 y B4) que respondan al antígeno "X", indicados en la Figura 2. ii) Un esquema donde muestre las proteínas correspondientes a los mRNAs B2 y B3, dibujándolas con la célula que las produce. 96 IBMC 2011 b) Diga qué otras células y proteínas participan en el paso de B1 a B2. Use esquemas y justifique. c) En el tiempo que se indica en la Figura 2, se inyecta otro antígeno diferente, "Y", que es la primera vez que se inyecta en el organismo en estudio. Dibuje: i) La curva de respuesta al antígeno "Y" en el mismo gráfico de la Figura 2. ii) Un esquema del mRNA de cadena H de las células que responderán al antígeno "Y", pre- y post respuesta al mismo. PROBLEMA 6 Para estudiar la colaboración entre distintos tipos de linfocitos en la generación de la respuesta inmune, se obtuvieron linfocitos B, T, y macrófagos de un hombre inmunizado con la toxina del tétano inactivada (TOXT). Los linfocitos fueron cultivados in vitro durante varios días en presencia de TOXT e interleuquina 2 para producir clones B y T específicos para TOXT. 97 IBMC 2011 Se hizo el siguiente experimento con un clon B, un clon T y los macrófagos: las células del clon B o los macrófagos fueron incubadas con diferentes sustancias, luego lavadas para eliminar su exceso y finalmente enfrentadas con células de un clon T. Al cabo de 2 días se observó si había o no proliferación de las células T. Agregado de clon B o macrófagos Mφ Mφ Mφ Mφ Mφ B B B B Incubaciones 1 hora Anti-hIg cloroquina Anti-hIg DNP 4 horas TOXT TOXT TOXT TOXT desnat. TOXT TOXT TOXT desnat. TOXT TOXT Lavado de células Agregado de clon T Si Si Si Si Si Si Si Si Si Dos días a 37°C Si Resultado: Proliferación de clon T No +++++ +++++ +++++ No No +++++ No ++ No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Aclaraciones: Anti-hIg: anticuerpo anti-inmunoglobulinas humanas TOXT desnat.: TOXT desnaturalizada por calor DNP: dinitrofenol (desacoplante) Preguntas: a) Analice detalladamente los resultados de cada uno de los diez tratamientos. En su análisis debe responder a las siguientes preguntas: i) ¿Cuál es el antígeno en este sistema? ii) ¿Qué tienen en su membrana los linfocitos B? iii) ¿Por qué en algunos casos hay proliferación de los linfocitos T y en otros no? iv) ¿Cuál es el efecto y cómo actúan el Anti-hIg, la cloroquina y el DNP? b) Haga un dibujo sencillo que muestre la cooperación entre un linfocito B y un linfocito T específicos para TOXT. c) ¿Son los macrófagos capaces de presentar antígeno a las células T? d) ¿Por qué el Anti-hIg y la TOXT desnaturalizada se comportan distinto cuando se usan macrófagos que cuando se usan linfocitos B? e) Se sabe que la inmunidad que los humanos desarrollan contra el tétano es de tipo humoral, y que la TOXT desnaturalizada puede usarse como vacuna contra el tétano. In vivo, ¿participan clones B iguales al utilizado en el experimento in vitro, en la respuesta inmune generada por dicha vacuna? PROBLEMA 7 Un polipéptido "N" es clivado in vitro en cuatro péptidos/epitopes (X,W,Y,Z) que presentan capacidad antigénica. La mezcla resultante es pasada por una columna de afinidad que tiene anticuerpos anti-X unidos covalentemente a sefarosa. Lo que NO queda retenido en la columna (llamado aquí el "eluido") es utilizado en los siguientes experimentos: a) Se utiliza el "eluido" para estimular un cultivo de linfocitos totales sin macrófagos. i) ¿Se producirán anticuerpos anti-W en estos cultivos? Tanto en caso de respuesta afirmativa como negativa, justifique con un esquema de las células participantes que ilustre su respuesta por el sí o por el no. ii) ¿Se producirán anticuerpos anti-X en estos cultivos? b) Se utiliza el "eluido" para estimular un cultivo de linfocitos totales con macrófagos donde a los macrófagos se les han eliminado todos los receptores de membrana excepto las moléculas MHCII y los receptores Toll. ¿Se producirá IL-1 e IL-2 en estos cultivos? 98 IBMC 2011 c) Se utiliza el "eluido" para estimular un cultivo de linfocitos totales sin macrófagos donde a los linfocitos B se les han "afeitado" los receptores de membrana. ¿Se producirá IL-2 en estos cultivos? d) Se utiliza el "eluido" para estimular un cultivo de linfocitos totales con macrófagos normales donde a los linfocitos B se les han "afeitado" los receptores de membrana. ¿Se producirán anticuerpos en estos cultivos? e) Se inyecta el "eluido" en ratones que habían sido previamente vacunados con el péptido "N". ¿Habrá producción de anticuerpos predominantemente del tipo IgG contra el péptido "N"? PROBLEMA 8 Los ratones de la cepa CH3, que son resistentes a la infección con el parásito protozoario Leishmania, desarrollan una respuesta mediada por linfocitos T helper 1 (TH1) después de la infección, mientras que los ratones de la cepa BALB/c hacen una respuesta mediada por linfocitos T helper 2 (TH2) y son más susceptibles a la infección (es decir que están menos protegidos). Si se hace una segunda exposición al antígeno (parásito), las curvas de la respuesta de memoria son las siguientes: Preguntas: a) ¿En cuál de los dos casos estarán involucrados linfocitos CD4 +? b) ¿Cuál es el tipo de anticuerpo predominante en I? ¿Cómo lo demostraría por Western blot? c) ¿En cuál de los dos casos se encontrará abundante cantidad de linfocitos CD8+? d) Si después de la activación por el antígeno se realiza un Northern blot de RNA extraído de linfocitos TH1 y TH2, ¿qué sondas utilizaría para diferenciarlos, detectando mRNAs que estén presentes selectivamente en cada uno de ellos? e) Los pocos anticuerpos obtenidos en II y la gran cantidad de anticuerpos obtenidos en I ¿son mono o policlonales? f) ¿Se verán afectadas ambas cepas por la extracción del timo en su capacidad de responder contra Leishmania? ¿En igual medida? g) Después de la activación por el antígeno, los linfocitos CD8+ expresan en membrana un receptor para una de las interleuquinas, el cual no está presente, por ejemplo, en los macrófagos. ¿Cuál es la interleuquina que actúa como ligando de este receptor? 99 IBMC 2011 PROBLEMA 9 Darrah et al. publicaron en Nature Medicine (13: 843, 2007) un estudio acerca del tipo de respuesta y del tipo de células del sistema inmune que están involucrados en la inmunidad generada por la vacunación contra Leishmania major, un parásito cuya infección afecta a 12 millones de personas en la actualidad. La vacunación consiste en la inyección en los pacientes de un virus recombinante no inmunogénico que no enferma pero al entrar en las células del vacunado expresa una proteína del parásito que funciona como antígeno. Para ensayar la efectividad de la vacunación hicieron el siguiente experimento. A ratones vacunados o no, les hicieron distintos tratamientos detallados en la figura y al cabo de dos semanas los desafiaron mediante la inoculación de parásitos para medir la cantidad de los mismos en los ratones después de otra semana. Obtuvieron los resultados que se muestran en la figura. Preguntas: a) ¿Cómo interpreta los resultados de los puntos 1 y 2 de la figura en términos de la eficacia de la vacunación? b) ¿Cómo afectó a la efectividad de la vacuna el tratamiento del punto 4 en la figura? ¿Para qué hicieron el tratamiento indicado en el punto 3? c) De acuerdo a los resultados del tratamiento del punto 4 del experimento de la figura, i) ¿Qué célula colaboradora está actuando? ii) ¿Qué CD estará expresando la misma? iii) ¿Qué otra citoquina produce? iv) ¿Es una célula de memoria? d) i) ¿Serán las células descriptas en la pregunta c) las únicas que participan? Si considera que hay otras, indique cuáles y con qué CD las identificaría. ¿Qué tipo de respuesta inmune se está generando? Justifique. ii) ¿Qué otra célula del sistema inmune innato estaría también involucrada? e) Los investigadores aislaron de un ratón vacunado, como en el punto 1 de la figura, las células descriptas en las preguntas c) y d) y las transfirieron a un ratón gemelo del original, naïve (que nunca había sido expuesto a los antígenos de este parásito), y previamente irradiado. i) ¿Por qué los investigadores usaron para este experimento ratones gemelos, naïve e irradiados? ii) ¿Qué resultado obtuvieron cuando a estos ratones los desafiaron con el parásito, como 1 ó 2 de la figura? Justifique. 100 IBMC 2011 iii) ¿Qué resultado habrían obtenido si hubieran desafiado con parásitos a ratones gemelos, naïves e irradiados pero a los que previamente no se les hubiera inyectado las células descriptas en las preguntas c) y d)? Justifique. PROBLEMAS OPTATIVOS PROBLEMA 1 Se desea probar la existencia de linfocitos CD8 citotóxicos en una preparación de linfocitos totales de un individuo A. Para ello se realiza un ensayo de citotoxicidad "in vitro" utilizando como blanco ("target") células de un individuo Z, las cuales habían sido previamente cargadas con 51Cr e irradiadas para inmunosuprimirlas. Se obtiene una gran respuesta citotóxica, es decir, una gran liberación de 51Cr desde el interior de las células del individuo Z, cuando se las incuba con los linfocitos del individuo A. a) ¿Qué resultado esperaría si el ensayo de citotoxicidad se hubiera hecho con linfocitos del individuo A qué pasan de largo por una columna de afinidad de anticuerpo monoclonal anti-CD4-agarosa? ¿Por qué? b)¿Qué resultado esperaría si al ensayo hecho en a. se le agrega IL-2 exógena? ¿Por qué? c) ¿Qué le ocurriría al individuo Z si se lo inmunosuprime y luego se lo inyecta con: i) la preparación de linfocitos original del individuo A? ii) la preparación de linfocitos del individuo A que pasó de largo por la columna de afinidad? PROBLEMA 2 Se estudió la proliferación de linfocitos T en las siguientes condiciones in vitro: Tubo 1: macrófagos de ratón normal + células CD4 autólogas + Ag proteico. Tubo 2: macrófagos de ratón normal + cloroquina + ídem resto del tubo 1. Tubo 3: macrófagos de ratón k.o. + ídem resto del tubo 1. Tubo 4: células de pulmón de ratón cepa A + células CD8 de ratón cepa B + IL2. Tubo 5: Ídem tubo 4 + cloroquina Tubo 6: células de pulmón de ratón cepa A k.o. + resto del tubo 4. Aclaraciones: k.o.= knock out del gen que codifica para una proteína del retículo endoplasmático con actividad de bomba de los péptidos producidos en el proteasoma. ¿Qué resultados esperaría en cada caso? Justifique su respuesta. PROBLEMA 3 El brillante inmunólogo Dr. Leukin diseñó un experimento para evidenciar activación y proliferación de linfocitos T. Para ello disponía de dos anticuerpos, cada uno de ellos covalentemente unido a un marcador fluorescente de distinto color (anticuerpos fluorescentes). Uno de los anticuerpos unido a un marcador fluorescente rojo reconocía exclusivamente células CD4. El otro, unido a un marcador fluorescente verde, reconocía células CD8. Se realizó el siguiente experimento de activación y expansión clonal: Tubo 1: Pool de linfocitos T + antígeno proteico + células presentadoras de antígeno. Tubo 2: Pool de linfocitos T + antígeno viral + células autólogas infectadas por virus + células presentadoras de antígeno. Luego de realizar estas incubaciones, hizo reaccionar cada tubo con los anticuerpos fluorescentes para detectar qué subpoblación de linfocitos T había proliferado en cada caso. Complete el siguiente cuadro indicando el tipo de fluorescencia que Ud. hubiera 101 IBMC 2011 esperado encontrar en cada caso. Justifique su respuesta, utilice esquemas. Indique las principales interleuquinas que intervienen en cada caso. Tubo 1 2 Rojo Verde PROBLEMA 4 Las células foliculares de la tiroides son las que secretan la tiroxina, una pequeña molécula yodada que regula el metabolismo energético de los mamíferos. La captación del iodo plasmático, la síntesis y secreción de la tiroxina están bajo el control de la hormona tirotrópica (TSH), una glicoproteína sintetizada y secretada por la hipófisis anterior. Existe una enfermedad en que los pacientes (son casi siempre mujeres): - Tienen una tiroides muy grande y evidencias clínicas de hiperfunción tiroidea. El perfil bioquímico de estas pacientes es el siguiente: "La tiroxina plasmática es altísima". - La TSH plasmática es baja (cuando se mide la concentración de moléculas de TSH por radioinmunoensayos que utilizan tanto anticuerpos monoclonales como policlonales). - El suero de estas pacientes tiene una molécula de las siguientes características: - No es reconocida por los anticuerpos anti-TSH (tanto monoclonales como policlonales) - Es capaz de estimular la captación de iodo, la síntesis de tiroxina y la secreción de la hormona tanto cuando se la incuba in vitro con células tiroideas como cuando se la inyecta en animales de experimentación. - Actúa sobre el receptor de TSH: Si se incuban membranas de células foliculares tiroideas (donde se encuentra el receptor de la TSH) con TSH marcada radiactivamente, se puede seguir perfectamente la cinética de la interacción hormona receptor. Pero si se preincuban las membranas tiroideas con suero de estas pacientes, y luego se agrega TSH marcada, no se detecta adsorción de la hormona a los receptores. Explique los resultados. PROBLEMA 5 Ud. dispone de los siguientes anticuerpos monoclonales: 1- anti-receptor IL-2 2- anti-proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC clase I). 3- anti-receptor de BCGF (IL-4) 4- anti-proteínas del MHC clase II Indique cuáles de estos anticuerpos bloquean: a) la proliferación clonal de linfocitos B b) la proliferación clonal de linfocitos CD8+ Justifique brevemente. Ayúdese con un diagrama de cooperación celular. 102 IBMC 2011 CÉLULA III METABOLISMO (Esta guía no se resolverá en clase) A) GUÍA DE ESTUDIO 1) Defina: a) energía; b) metabolismo; c) catabolismo; d) anabolismo; e) reacción endergónica; f) reacción exergónica; g) oxidación; h) reducción. 2) ¿En qué compartimentos celulares ocurren: a) glucólisis; b) ciclo de Krebs; c) cadena respiratoria; d) oxidación de los ácidos grasos; e) fotosíntesis? 3) A) Dibuje un corte de una mitocondria típica vista al microscopio electrónico (haga un dibujo GRANDE). Señale y dé nombre a todas sus partes y compartimentos y ubique en su dibujo lo siguiente: a) protones (H+) acumulados por el bombeo de la cadena respiratoria; b) ATPasa (ATP sintetasa); c) isocitrato deshidrogenasa; d) oxidación de ácidos grasos; e) citocromo b; f) FADH2; g) síntesis de ATP; h) cardiolipina; i) conversión de piruvato en Acetil CoA; j) NADH+H+; k) ARN ribosomal. B) Dibuje un corte de un cloroplasto típico visto al microscopio electrónico; ubique en el dibujo las siguientes estructuras y dónde ocurren los siguientes procesos: a) membranas externa e interna; b) sacos tilacoides; c) grana; d) estromas; e) ribosomas; f) ADN cromosómico; g) ferredoxina; h) todas las enzimas del ciclo Benson-Calvin; i) ATPasa; j) fotosistemas y cadena de transporte electrónico; k) clorofila; l) sitios de bombeo de H+ al lumen tilacoidal; m) consumo de agua por la cadena de transporte de electrones, n) consumo de CO2, ATP y NADPH; ñ) conversión de NADP a NADPH, o) conversión de ADP a ATP. 4) Detalle los pasos de la glucólisis. ¿Cuál es la enzima clave en la regulación de la glucólisis? ¿Qué ventajas (valor adaptativo) presenta para la célula que esta enzima sea inhibida por ATP y citrato; y estimulada por AMP? 5) ¿Cuántos ATP y NADH+H+ se producen por cada molécula de glucosa en la glucólisis, en la fermentación láctica, en la fermentación alcohólica, y en la respiración aerobia? 6) ¿Cuál es la importancia de la aparición de la respiración aerobia en la evolución de la vida sobre la Tierra? Explique por qué la fotosíntesis tiene que haber sido una adquisición cronológicamente anterior a la respiración aerobia. 7) ¿Qué ocurre con el ciclo de Krebs, la cadena respiratoria y la síntesis de ATP mitocondrial en presencia de cianuro? ¿Y en presencia de un desacoplante como el dinitrofenol? 8) Haga un esquema comparativo de la síntesis de ATP en la fosforilación oxidativa mitocondrial y de la fotofosforilación del cloroplasto de acuerdo con la hipótesis quimiosmótica. 9) Describa el experimento de Racker-Stockenius, que permitió confirmar la hipótesis quimiosmótica. 10) ¿Qué papel cumplen el O2 en la respiración aerobia y el H2O en la fotosíntesis? 11) ¿Cuáles son los productos primarios de la fotosíntesis, cómo se originan y para qué son utilizados? 103 IBMC 2011 12) Señale verdadero o falso: a) En las mitocondrias sólo se produce energía en la fosforilación oxidativa acoplada a la cadena respiratoria. b) La fermentación no aporta más energía a la célula que la glucólisis. c) La conversión de piruvato a Acetil-CoA libera CO2 en el citoplasma. d) Los H+ se acumulan en el espacio entre las dos membranas mitocondriales. e) El NADH+H+ no es un producto primario de la fotosíntesis. f) Los productos primarios de la fotosíntesis son utilizados en el citoplasma de la célula vegetal para reducir CO2 en azúcares. g) El NADH+H+ producido en la glucólisis se acumula hasta que se agota el NAD + (oxidado) y la glucólisis se frena. h) Todo desacoplante de la cadena respiratoria disipa el gradiente de protones frenando el ciclo de Krebs. i) En las células vegetales se produce ATP en el citoplasma, en las mitocondrias y en los cloroplastos. j) Los peroxisomas y las mitocondrias consumen O2, en tanto que los cloroplastos producen O2. k) La glicosilación de proteínas se produce en el RER por adición de monosacáridos de a uno sobre la proteína naciente. l) El emparejamiento (trimming) de los oligosacáridos unidos a proteínas comienza en el RER y culmina en el Golgi, donde se agregan nuevos azúcares. m) Los lisosomas, las mitocondrias y los cloroplastos presentan bombas de H+. n) Los lisosomas se forman en el Golgi como vesículas recubiertas de clatrina. ñ) Los peroxisomas son las únicas organelas celulares que realizan detoxificación. o) La similitud entre un citocromo y una clorofila radica en que ambos son grupos prostéticos de un mismo tipo de apoproteínas. p) El O2 liberado en la fotosíntesis proviene del H2O. 104 IBMC 2011 B) PROBLEMAS PROBLEMA 1 ¿Qué produce mayor cantidad de ATP en la respiración aerobia, una molécula de glucosa o una de un ácido graso de 16 carbonos, sabiendo que hasta la formación de Acetil-CoA la degradación de ácidos grasos no produce energía? Enumere (no los describa) los procesos involucrados en la producción de ATP a partir de Acetil-CoA y los compartimentos mitocondriales en donde ocurren. PROBLEMA 2 La entrada de la carnitina acetiltransferasa a los peroxisomas y a las mitocondrias, tal cual fue comentada en el problema 4 de la guía "Célula I", es inhibida por agentes desacoplantes (dinitrofenol). El agregado de ATP revierte la inhibición de la entrada a peroxisomas, pero no a mitocondrias. ¿Qué le indica esto sobre la naturaleza de la energía necesaria para la translocación a cada uno de los dos destinos? PROBLEMA 3 El factor de crecimiento epidermal (EGF) es una proteína que para cumplir su rol biológico, es decir, estimular el crecimiento de las células animales, se une desde afuera a un receptor específico situado en la membrana plasmática de las células blanco. Luego, el complejo EGF-receptor es internalizado por un proceso de endocitosis mediada por receptor y ambos, el EGF y su receptor, son degradados en el interior celular. Para estudiar este mecanismo se realizaron distintos pretratamientos a cultivos de células hepáticas humanas, luego se agregó EGF marcado radiactivamente y se determinó la cantidad del mismo unido a membrana y degradado en el interior celular al cabo de 45 minutos de incubación a 37°C. En la siguiente tabla se esquematizan los resultados. Pretratamiento 1 2 3 4 5 6 ninguno cianuro tunicamicina (inhibe glicosilación) tripsina cloroquina (inhibe lisosomas) transfección de un clon conteniendo el cDNA de clatrina en posición invertida respecto de un promotor eucariótico EGF unido a membrana* 1000 1000 1000 0 1000 1000 EGF internalizado** 1000 0 1000 0 1000 0 EGF degradado sí -no -no -- * Una vez pretratadas las células, los correspondientes reactivos fueron eliminados por lavado antes de ensayar la unión del EGF. ** En unidades arbitrarias. Explique el mecanismo de acción de cada pretratamiento, de qué manera y a qué nivel influye sobre la unión y la degradación del EGF. PROBLEMA 4 La figura muestra el aumento de la turbidez -que es directamente proporcional al número de bacterias presentes- de un cultivo de E. coli a 37°C en diversas condiciones. a) Explique la diferencia de comportamiento presentada. b) ¿De qué otro modo puede Ud. medir el crecimiento de la población bacteriana? 105 IBMC 2011 PROBLEMA 5 El tubo A contiene una preparación de tilacoides intactos a la cual se le agrega ferredoxina (purificada por separado). El tubo B contiene una preparación de mitocondrias intactas mientras que el tubo C contiene una preparación de liposomas que incluyen bacteriorrodopsina y ATPasa de mitocondrias de corazón bovino (igual que en el experimento de Racker y Stockenius). Todas las preparaciones membranosas se encuentran en una solución acuosa conteniendo Mg2+, el buffer apropiado, ADP y fosfato inorgánico. 106 IBMC 2011 a) Explique los resultados en cada sistema. Para A, además grafique las curvas de O2 liberado versus tiempo para cada uno de los tratamientos indicados en la figura. b) ¿Qué resultados hubiera Ud. esperado en cada uno de los casos si: i) las preparaciones membranosas hubieran sido tratadas previamente con tripsina? ii) las preparaciones membranosas hubieran sido tratadas previamente con detergentes? Nota: El dinitrofenol (DNP) es un desacoplante. PROBLEMA 6 El proceso de crecimiento y maduración del ovocito ocurre casi totalmente dentro del folículo ovárico. El ovocito se encuentra dentro de la cavidad interna del folículo (atrio) recubierto de una capa de células especializadas, el "cumulus". La maduración nuclear se detiene en la profase I de la meiosis hasta que las gonadotrofinas liberadas en el período preovulatorio provocan la reanudación de la meiosis. El ovocito puede experimentar espontáneamente este fenómeno en condiciones "in vitro". La respuesta meiótica en cultivo puede ser evaluada morfológicamente mediante la observación microscópica de la ruptura de la membrana nuclear, proceso conocido como ruptura de la vesícula germinal (GVB, germinal vesicle breakdown). La evolución de este fenómeno depende de las fuentes de energía disponibles. Con motivo de evaluar la fuente de energía utilizada por los ovocitos durante la maduración, se incubaron ovocitos desnudados (es decir, separados de las células del cumulus mediante una digestión con hialuronidasa). La Figura 1 muestra las curvas obtenidas al graficar las respuestas observadas (% de GVB) a dosis crecientes de diferentes sustratos. 107 IBMC 2011 Dato: El oxalacetato puede generar piruvato por una reacción enzimática independiente de su participación en el ciclo de Krebs. Por este motivo, en presencia de oxalacetato siempre hay piruvato suficiente como para generar la Acetil-CoA necesaria para el ciclo de Krebs. Preguntas: a) ¿Qué infiere de la falta de respuesta en presencia de glucosa o lactato? b) ¿Qué indican los resultados obtenidos en presencia de piruvato y oxalacetato? Ud. cuenta con dos inhibidores del ciclo de los ácidos tricarboxílicos: malonato y fluoroacetato. El malonato bloquea la acción de la succinato deshidrogenasa, mientras que el fluoroacetato inhibe la conversión de citrato en isocitrato. c) ¿Qué experimento realizaría para comprobar la hipótesis deducida de la Figura 1? Grafique y explique los resultados que espera obtener. Con el objeto de averiguar el origen del piruvato utilizado como sustrato por los ovocitos desnudados, Dows y col. cultivaron ovocitos desnudados; complejos cumulus-ovocitos (tal cual son extraídos del ovario) y un co-cultivo de células del cumulus y ovocitos desnudados. Los cultivos fueron realizados en medio con glucosa en presencia y ausencia de un inhibidor de la glucólisis, el iodoacetato. La Figura 2 muestra los % GVB obtenidos en cada caso. 108 IBMC 2011 d) Postule un modelo sencillo de acuerdo a los resultados obtenidos. e) ¿Cómo comprobaría experimentalmente la conexión entre los tipos celulares involucrados? PROBLEMA 7 La levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae) es un hongo unicelular que puede crecer tanto en presencia como en ausencia de oxígeno (es aerobio facultativo). En ausencia del mismo produce CO2 y etanol. Se tienen dos cultivos de levaduras: A) En medio mínimo con glucosa en presencia de O2. B) En medio mínimo con glucosa en ausencia de O2. Para cada uno de estos cultivos explique: a) ¿En qué compartimento de la célula y en qué pasos metabólicos: i) se sintetiza ATP? ii) se sintetiza GTP? iii) se reduce NAD + a NADH+H+? iv) se oxida NADH+H+ a NAD +? Nota: No es necesario que explique el detalle de la reacción química que ocurre. b) Explique y justifique qué sucedería en los cultivos A y B para los ítems I a IV al agregar: i) un agente desacoplante como el dinitrofenol (DNP). ii) un inhibidor del transporte de electrones como el cianuro. 109 IBMC 2011 EJEMPLOS DE PROBLEMAS SOBRE CÉLULA I, II Y III DE SEGUNDO PARCIAL PROBLEMA 1 El citocromo b2 es una proteína soluble de 481 aminoácidos, de la cadena respiratoria de las mitocondrias de levaduras, localizada en el espacio intermembrana. Está codificada por un gen nuclear y llega a su destino final por translocación post-traduccional. En su región amino-terminal, el precursor del citocromo b2 (561 aa) posee dos secuencias que le marcan el camino a seguir: la secuencia de importación (S.I.), de 31 aminoácidos, con carga neta positiva, seguida de la secuencia de exportación (S.E.), de 49 aminoácidos, de naturaleza hidrofóbica. El camino tiene dos etapas: - IMPORTACIÓN: La S.I. dirige al precursor hacia la mitocondria y hace que la proteína se transloque del citoplasma a la matriz mitocondrial directamente, a través de puntos en que las dos membranas están en contacto. Una vez en la matriz, la S.I. es clivada por una peptidasa específica de la matriz. - EXPORTACIÓN: La S.E. dirige al precursor sin S.I. a través de la membrana interna desde la matriz hacia el espacio intermembrana. Allí, otra peptidasa elimina a la S.E., alcanzando el citocromo completamente procesado su destino final. Durante la importación, el precursor se desenrolla para atravesar los puntos de contacto. Para que se produzca la exportación, el precursor, parcialmente procesado, DEBE PERMANECER EN ESTADO DESPLEGADO en la matriz. Si se pliega, no se transloca al espacio intermembrana, acumulándose en la matriz. Lo que impide que se pliegue es una proteína de matriz, llamada hsp60, que reconoce y se une específicamente a la S.E., retardando el plegamiento y permitiendo en consecuencia la exportación. Preguntas: a) ¿En qué ribosomas se sintetiza el precursor del citocromo b2? b) ¿A qué grupo de proteínas pertenece hsp60? c) Describa el camino y el destino preciso (compartimento, unión o no a membrana, etc.) que tendría el citocromo b2 (o sus precursores) en cada una de las siguientes alteraciones: i) Se ha mutado el sitio de reconocimiento de la peptidasa del espacio intermembrana. ii) Con S.I. / sin S.E. iii) Sin S.I. / sin S.E. iv) S.I y S.E. han sido reemplazados por un "péptido señal" de inserción clásico. v) Igual a iv), pero además se le ha agregado en su extremo C-terminal la secuencia de entrada a peroxisomas Ser-Lys-Leu. vi) Igual a iii), pero además se le ha agregado en su extremo C-terminal la secuencia de entrada a peroxisomas Ser-Lys-Leu. d) Si se agrega el desacoplante valinomicina, la fase de exportación de esta translocación se interrumpe aún si la mitocondria tiene exceso de ATP. ¿Cómo actúa la valinomicina y qué le indica este experimento sobre la fuerza que propulsa la translocación de proteínas a la mitocondria? 110 IBMC 2011 e) ¿Qué conclusiones sacaría Ud. si la inhibición de la exportación por valinomicina sólo ocurriera cuando la mitocondria agotase su contenido de ATP? Existe una cepa mutante de levaduras, llamada mif4, donde el gen que codifica para la proteína hsp60 no se expresa. f) ¿Qué ocurre con la cadena respiratoria? ¿Qué pasa con la producción de ATP en esta cepa, a nivel citoplásmico y mitocondrial? g) De hecho, la mutante sobrevive y crece. ¿Cómo lo logra? ¿Cómo se reoxida su NADH+H+? h) Las bacterias tienen una proteína llamada GroEL, la cual tiene una secuencia aminoacídica muy parecida a la de hsp60. In vitro, GroEL, al igual que hsp60, es capaz de mantener desplegado al precursor del citocromo b2 de levaduras. ¿Qué le indica este experimento sobre el origen evolutivo de las mitocondrias? ¿Cuál sería la función de GroEL en bacterias? PROBLEMA 2 La bacteria Escherichia coli, los espermatozoides humanos y el alga verde unicelular Chalmydomonas se mueven en medio líquido gracias a que tienen flagelos. La estructura y el mecanismo de movimiento de los flagelos son totalmente diferentes en procariotas respecto de eucariotas. La tabla muestra la producción de ATP a partir de glucosa y si se detecta o no movimiento flagelar en los tres tipos celulares en distintas condiciones Agregados Bacteria Escherichia coli Espermatozoide humano Alga verde Chlamydomonas COLUMNA Moles de ATP producidos por mol de glucosa con O2 sin O2 sin luz sin luz 38 36 36 1 2 2 2 2 Movimiento flagelar en presencia de glucosa con O2 sí sí sí 3 sin O2 no no sí 4 sin O2 sin luz no no no 5 DNP no no no 6 DNP + ATP no sí sí 7 colchicina sí sí sí 8 Aclaraciones: Las columnas 1, 2 y 5 son en oscuridad; las demás, en presencia de luz. DNP: Dinitrofenol. Es un desacoplante. Colchicina: droga que inhibe la polimerización de microtúbulos. Preguntas: a) Explique las causas de las diferencias en la cantidad de ATP producido por mol de 111 IBMC 2011 glucosa en cada tipo celular y en las distintas condiciones (columnas 1 y 2). b) Explique sintéticamente para cada condición (cada columna) por qué hay o no movimiento del flagelo en cada tipo celular (columnas 3 a 8). PROBLEMA 3 En las bacterias, la glucólisis y el ciclo de Krebs ocurren en el protoplasma (no hay citoplasma y núcleo), mientras que la cadena respiratoria tiene lugar en la membrana plasmática. Se transformó Escherichia coli con un plásmido que expresa el cDNA de la proteína “desacoplina” bajo las órdenes del promotor/operador del operón lactosa (Figura 1). La desacoplina funciona como un desacoplante de la cadena respiratoria. Para cumplir esta función debe insertarse en la membrana. En el cromosoma bacteriano se encuentran todos los elementos génicos involucrados en el sistema del operón lactosa, incluyendo los genes para las proteínas crp (cap) y adenilato ciclasa. Escherichia coli tiene un flagelo macizo constituido por la proteína flagelina, que se mueve por rotación gracias a un cuerpo basal proteico que actúa como motor impulsado por fuerza protón motriz. 112 IBMC 2011 Preguntas: a) Dibuje en la Figura 1 la enzima responsable de la síntesis de ATP en la fosforilación oxidativa, respetando su forma y orientación y señale el sitio activo. b) ¿Cuál es el equivalente topológico del espacio periplásmico en las células eucariotas? c) En base al enunciado, tache lo que no corresponda en la siguiente tabla y justifique todas sus respuestas para cada una de las condiciones de cultivo, todas con aereación por agitación. Condiciones del cultivo glucosa lactosa lactosa + glucosa lactosa + glucosa + AMPcíclico Síntesis de ATP por fosforilación oxidativa Sí/No Sí/No Sí/No Sí/No pH del espacio periplásmico Ácido/Neutro Ácido/Neutro Ácido/Neutro Ácido/Neutro Consumo de O2 Sí/No Sí/No Sí/No Sí/No Movimiento del flagelo Sí/No Sí/No Sí/No Sí/No d) ¿Qué habría pasado con el movimiento del flagelo si las bacterias se hubieran cultivado en presencia de lactosa y exceso de ATP? Justifique. e) En otros experimentos se probaron separadamente 3 construcciones mutadas de cDNA de “desacoplina” (Figura 2). Ninguna de ellas fue capaz de desacoplar. Explique por qué. f) Escherichia coli habita normalmente el colon (intestino grueso) de los vertebrados. El colon es un segmento del aparato digestivo principalmente anaerobio. En esas condiciones E. coli realiza distintos tipos de fermentaciones, entre ellas la láctica. ¿Cuál es el valor adaptativo de la misma? g) ¿Por qué el balance de la respiración aerobia en bacterias es de 38 ATP producidos por molécula de glucosa, mientras que en los eucariotas es de 36 ATP? No explique todo el balance, simplemente diga a qué se debe la diferencia. PROBLEMA 4 Si se incuba un cultivo de la bacteria Escherichia coli en presencia del disacárido lactosa marcado con el isótopo radiactivo 14C en todos sus carbonos, al cabo de un tiempo, las bacterias sintetizan grandes cantidades de ATP (lo cual les permite dividirse y crecer) y liberan CO2 radiactivo al medio. a) ¿Qué procesos de control genético y metabólico están ocurriendo en la bacteria para que se produzcan las dos moléculas mencionadas? b) Si al mismo cultivo, que aún posee un exceso de lactosa marcada radiactivamente, se le agrega un exceso de glucosa no marcada, al cabo de un tiempo las bacterias siguen produciendo ATP y CO2, pero éste último no es más radiactivo. ¿Por qué? ¿Qué ocurrió? c) ¿Qué ocurrirá con la producción de ATP y de CO2 en los experimentos planteados en las preguntas a) y b), si en cada caso se agrega un exceso del desacoplante dinitrofenol? 113 IBMC 2011 NÚCLEO, CROMATINA, DIVISIÓN CELULAR y GENÉTICA (Esta guía no se resuelve en clase. Es un repaso de herencia mendeliana, mitosis, y meiosis) A) GUÍA DE ESTUDIO 1) ¿Qué característica de las histonas hace que éstas se peguen fuertemente al ADN? 2) ¿Cuáles son las histonas presentes en el nucleosoma? ¿Cuántas moléculas de cada una de ellas hay por nucleosoma? 3) ¿Cada cuántos pares de bases del ADN se forma un nucleosoma? 4) ¿Qué ocurre con la estructura de la cromatina cuando ésta es tratada con nucleasa (DNasa) micrococal? 5) ¿En cuántos nucleosomas aproximadamente está organizada la cromatina de una célula humana? Recuerde que el tamaño del genoma (haploide) humano es aproximadamente 3x109 pares de bases. 6) ¿Qué papel cumple la histona H1 en el empaquetamiento de la cromatina? 7) Esquematice los distintos órdenes de empaquetamiento que presenta la cromatina para formar un cromosoma metafásico. 8) Defina: cariotipo, centrómero, constricción primaria, satélite, cromátida, brazo del cromosoma, telómero, cromosomas acrocéntricos, metacéntricos y telocéntricos. 9) ¿Para qué sirven las técnicas de bandeo de cromosomas con colorantes? 10) ¿Qué es un cromosoma politénico, qué organismos los poseen y cómo se originan? 11) Dibuje las distintas fases de la mitosis y describa los principales eventos de cada una de ellas. 12) ¿Qué son las fibras polares y las del cinetocoro? ¿Cuáles son las evidencias de que los centríolos no son los centros organizadores del huso mitótico? 13) Defina: fenotipo, genotipo, gen dominante, gen recesivo, heterocigota, homocigota, alelos, ligamiento genético. 14) Ud. concursa para obtener un cargo de Profesor de Biología en un colegio secundario. En la prueba de oposición le piden que enuncie (y resuelva) tres problemas que ilustren: a) la primera ley de Mendel b) la segunda ley de Mendel c) co-dominancia en grupos sanguíneos humanos A, B y O y que defina el concepto de alelos múltiples. 15) ¿Qué son los poros nucleares? ¿Qué sustancias pueden pasar a través de los mismos? ¿Cuál es la ultraestructura de los poros? 16) Esquematice los distintos pasos que involucra el armado de los ribosomas en el nucléolo y en el citoplasma. 17) ¿Cómo está constituida la lámina nuclear? ¿Qué factores regulan su armado y desarmado? 114 IBMC 2011 B) PROBLEMAS PROBLEMA 1 Las histonas son proteínas cuya secuencia está muy conservada a lo largo de la evolución (por ejemplo, la histona H4 de vaca difiere en sólo 2 de sus 102 aminoácidos con la de arveja) ¿Qué le sugiere esta observación con respecto a un posible rol regulatorio de la expresión genética por parte de las histonas? PROBLEMA 2 Señale verdadero o falso. Justifique SOLO las falsas. a) La cromatina inactiva está más empaquetada que la cromatina activa. b) Las histonas fosforiladas se unen más fuertemente al ADN. c) Sólo el ADN procariota se encuentra superenrollado en condiciones fisiológicas. d) Los nucleosomas estabilizan el superenrollamiento del ADN en la cromatina. e) Los sitios hipersensibles a la digestión con DNasa I se encuentran preferentemente en las regiones codificantes del ADN. f) El núcleo celular está recubierto por una envoltura nuclear doble formada por una bicapa lipídica interna y una lámina proteica externa. g) El movimiento de los cromosomas hacia los polos es causado por polimerización y despolimerización de microfilamentos de actina. h) El nucléolo es la región asociada a los genes ribosomales donde se acumula y procesa el ARN ribosomal. i) La lámina nuclear se desarma en el período S de la interfase. j) Los cuerpos basales o blefaroplastos son los que realizan el trabajo mecánico que posibilita el movimiento de cilias y flagelos. PROBLEMA 3 ¿Cuántas moléculas de ADN contiene un cromosoma de una célula eucariótica en: a) el período G1 del ciclo celular? b) el período G2 del ciclo celular? c) en la profase mitótica? d) en la metafase mitótica? e) en la anafase mitótica? Señale en cuál de las etapas mencionadas dicho cromosoma podría ser visto con morfología de bastón al microscopio óptico. PROBLEMA 4 Señale V o F y justifique: a) En la mitosis se separan los cromosomas homólogos. b) Los cromosomas homólogos se separan en la segunda división meiótica. c) Los cromosomas homólogos se separan en la primera división meiótica. d) Las cromátidas hermanas se separan en la segunda división meiótica. e) Las cromátidas hermanas se separan en la mitosis. f) En el crossing over intercambian material genético las cromátidas hermanas. g) En un individuo con 2n=36, las dos células resultantes de la primera división meiótica tienen 18 cromosomas cada una. h) Si dos genes se encuentran ligados pero sus loci están tan alejados que la frecuencia de recombinación entre ambos es del 50%, los cruzamientos en que se tenga en cuenta a ambos genes seguirán la segunda ley de Mendel. 115 IBMC 2011 PROBLEMA 5 Los grupos sanguíneos A, B y O están determinados por tres alelos en la población humana: IA, IB e IO, siendo IA e IB codominantes entre sí y dominantes sobre IO. El grupo sanguíneo Rh está determinado por un par de alelos (Rh+ dominante sobre Rh-) ubicados en otro par de cromosomas. Una mujer de grupo B Rh+ da a luz a un bebé de grupo A Rh-. a) Dé todos los genotipos posibles de la madre y del niño. b) ¿Qué tipos sanguíneos (fenotipos y genotipos) debería tener su marido para asegurar que su esposa le ha sido fiel? c) Si Ud. fuera un abogado representando a un esposo engañado en un juicio sobre paternidad, involucrando los mismos hechos básicos que los descriptos más arriba, ¿qué grupo o grupos sanguíneos debería tener su cliente para demostrar fehacientemente que su esposa lo engañó y así ganar el juicio? PROBLEMA 6 Un pterodáctilo (reptil volador) puede tener ojos rojos (RR o Rr) o azules (rr). En un locus ubicado en otro par de cromosomas existe un gen que si es tt hace que los ojos sean incoloros, mientras que si es Tt o TT hay expresión de color en los ojos (ya sea rojo o azul). Un pterodáctilo RrTt se aparea con un pterodáctilo RRtt... a) Dé los fenotipos de los padres. b) ¿Cuál es la probabilidad de que tengan un pichón de ojos azules? c) ¿Cuál es la probabilidad de que tengan un pichón de ojos rojos? d) En un cruzamiento RrTt x RrTt, ¿cuál es la probabilidad de que nazcan pichones con ojos incoloros? PROBLEMA 7 En el pollo, las plumas sedosas están determinadas por un gen recesivo respecto al que rige plumas normales. a) Si de un cruzamiento entre individuos heterocigotas para dicho gen se criasen 98 aves, ¿cuántos cabría esperar que fuesen sedosos y cuántos normales? b) Si tuviese un pollo de plumas normales, ¿cuál sería el camino más rápido para determinar si es homocigótico o heterocigótico? PROBLEMA 8 Groff y Odland encontraron una variedad de pepinos cuyas flores no podían abrirse al madurar. Sin embargo dichas flores podían ser polinizadas abriéndolas artificialmente. Los resultados de dichos experimentos fueron: Fenotipos de la progenie Flores abiertas Flores cerradas todas ninguna 145 59 81 77 Progenitores cerrado x abierto F1 x F1 cerrado x F1 Designe los símbolos para los genes involucrados e indique el genotipo de: a) los progenitores cerrados; b) los progenitores abiertos; c) la F1. 116