Universidad Nacional del SantaE.A.P de Ing. Agroindustrial Manual de Composición Bioquímica de Productos Agroindustriales PRÁCTICA Nº 3: CUANTIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA 1. INTRODUCCIÓN El comportamiento acido-básico de las proteínas determina muchas de sus propiedades en solución. La solubilidad de una proteína varía con el pH, la temperatura, fuerza iónica y la constante dieléctrica del solvente. Uno de los métodos más utilizados consiste en aislar la proteína por tratamiento de la materia a pH alcalino, seguida por una precipitación en su punto isoeléctrico. Las proteínas se pueden contabilizar con el método espectrofotométrico de Biuret. El fundamento de este método es siguiente: El sulfato de cobre reacciona con compuestos que contienen dos o más enlaces peptídico dando un complejo de coloración violeta. La intensidad del color obtenida es una medida del número de enlaces peptídicos presentes en la proteína. 1.1. MÉTODO KJELDAHL El contenido proteínico de los alimentos puede determinarse por medio de diversos métodos. La forma más habitual es su cuantificación de forma indirecta y aproximada, bien a partir del contenido en nitrógeno de la muestra, o bien deduciendo su cantidad a partir del contenido de uno o dos aminoácidos particulares que conforman la proteína, fáciles de identificar y de cuantificar por su reactividad química específica. Este segundo procedimiento conlleva una mayor inexactitud. Desde hace más de 100 años se está utilizando el método Kjeldahl para la determinación del nitrógeno en una amplia gama de muestras (alimentos y bebidas, piensos, forrajes, fertilizantes) para el cálculo del contenido en proteína. También se utiliza el método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno en aguas residuales y suelos. Es un método oficial descrito en múltiples normativas: AOAC, USEPA, ISO, Farmacopeas y distintas Directivas Comunitarias. La convención general, sobreentendida, es que la totalidad del nitrógeno de la muestra está en forma proteica, aún cuando la realidad es que, según la naturaleza del producto, una fracción considerable del nitrógeno procede de otros compuestos nitrogenados (bases púricas y pirimidínicas, creatina y creatinina, urea, amoniaco, etc.), por ello se denomina “proteína bruta” o “proteína total” a la obtenida por este método. Con este análisis, sin embargo, no se determina el nitrógeno nítrico, el cianhídrico, el de la hidracina, el de grupos azo y el nitrógeno de un núcleo cíclico. Ing. Jorge Domínguez Castañeda, Ing. Cesar Moreno Rojo, Ing. Jhonathan Moreno Silva, Ing. Jhon Gonzales Capcha OBJETIVOS Establecer el flujo para la obtención de proteínas a partir de leche fresca y conserva de pescado. Ing. NaOH 0. Ing. caseína para el patrón: disolver 50 mg de proteína en 5 ml. EQUIPOS Equipo Kjeldahl Estufa. Jhon Gonzales Capcha .2. REACTIVOS Reactivo de Biuret: disolver 3 gr de sulfato de cobre CuSO4 x 5 H2O y 9 gr de tártaro sódico potásico en 500 ml. 3.P de Ing. Ácido bórico QP. Placa Petri. Ácido clorhídrico 0. Balanza analítica. Comprender los fundamentos del método Kjeldahl para la determinación del contenido en proteína de un alimento.1. Beakers. Cesar Moreno Rojo. Etanol QP. Verde de bromocresol QP. Agroindustrial Manual de Composición Bioquímica de Productos Agroindustriales 2. 3. Cuantificar las proteínas por el método espectrofotométrico de Biuret.5N NaOH 40 % HCl 1 N Medidor de pH Centrifuga Ácido sulfúrico QP. MUESTRA Leche.3.1 N. de hidróxido de sodio 0. de H2O. MATERIALES Y MÉTODOS 3. Jhonathan Moreno Silva.2 mol/Lt. añada 5 gr de yoduro de potasio y complete hasta 1 lt con hidróxido de sodio 0. Pipetas. 3. Matraz. 4. PROCEDIMIENTO Ing. Catalizadores. Proteína pura por ejemplo.2 mol/Lt.Universidad Nacional del Santa E.A. conserva de pescado. Jorge Domínguez Castañeda. Rojo de metil QP. Ing. A. El contenido en proteína se puede calcular seguidamente. En este artículo docente se explica el primer procedimiento.0 y 1. Este método puede ser dividido. Después se adicionan 12 mL de H2SO4 concentrado Posteriormente se digiere a 400 ºC durante una hora.1. Ing. cuando el nitrógeno se atrapa sobre ácido bórico. 1.4.3. Ello condicionará la forma de realizar la siguiente etapa de valoración. Ing. 4. así como los reactivos empleados. Ing. presuponiendo una proporción entre la proteína y el nitrógeno para el alimento específico que está siendo analizando. Ing.P de Ing. Procedimiento: Se introducen de 1 a 5 g de muestra un tubo de mineralización y se ponen 2 pastillas de catalizador que suele estar constituido por una mezcla de sales de cobre. De forma habitual se utiliza como catalizador una mezcla de K2SO4 : CuSO4 : Se (10:1:0. Agroindustrial Manual de Composición Bioquímica de Productos Agroindustriales 4.1 en peso). Jhon Gonzales Capcha . óxido de titanio o/y óxido de selenio.2. de reactivo de Biuret en todos los tubos y mezclar. 10 y 16 mg de proteína (0. Jorge Domínguez Castañeda.1. leer la densidad óptica en 500 nm corrigiendo con el blanco. Se sabe que la digestión ha terminado porque la disolución adquiere un color verde esmeralda característico.Universidad Nacional del Santa E. Cesar Moreno Rojo. PRUEBA DE KJELDALH 4. PRUEBA DE BIURET Preparar un blanco de agua de 2 ml y tres tubos de patrón que contengan 4. Después de 30 min. ETAPA DE DIGESTIÓN Un tratamiento con ácido sulfúrico concentrado. Jhonathan Moreno Silva. FUNDAMENTO Y ETAPAS DEL MÉTODO KEJLDAHL El método Kjeldahl mide el contenido en nitrógeno de una muestra. tal y como explicaremos más adelante. De las muestras obtenidas se diluyen adecuadamente y se toman un volumen de 2 ml para mediciones espectrofotométricas. básicamente en 3 etapas: digestión o mineralización. 4.3. en presencia de un catalizador y ebullición convierte el nitrógeno orgánico en ion amonio. según la ecuación. El procedimiento a seguir es diferente en función de si en la etapa de destilación el nitrógeno liberado es recogido sobre una disolución de ácido bórico o sobre un exceso conocido de ácido clorhídrico o sulfúrico patrón. destilación y valoración.6 ml de la solución de patrón) y añadir agua hasta completar 2 ml. Añadir 8 ml. OBTENCIÓN DE PROTEÍNAS DE LECHE Para la obtención de la caseína se trabajará con la muestra de la práctica anterior. Cesar Moreno Rojo. Ing. Sistema de digestión foss ETAPA DE DESTILACIÓN Se alcaliniza la muestra digerida y el nitrógeno se desprende en forma de amoniaco. Jorge Domínguez Castañeda. Ing. el nitrógeno proteico es transformado en sulfato de amonio por acción del ácido sulfúrico en caliente. Agroindustrial Manual de Composición Bioquímica de Productos Agroindustriales En esta etapa. En la actualidad. Jhonathan Moreno Silva. El amoniaco destilado se recoge sobre un exceso desconocido de ácido bórico. El destilado obtenido es agregado automáticamente a un matraz que contiene el líquido receptor elaborado por ácido bórico. Ing. El amoniaco liberado es arrastrado por el vapor de agua inyectado en el contenido del tubo durante la destilación.Universidad Nacional del Santa E. para llevar a cabo este proceso se utilizan digestores automáticos que son capaces de digerir un número determinado de muestras al mismo tiempo. Jhon Gonzales Capcha .A. Para alcalinizar fuertemente el medio y así desplazar el amoniaco de las sales amónicas.P de Ing. Procedimiento: Después de enfriar se coloca el tubo de mineralización en el destilador automático al cual está programada para adicionar NaOH al 40 % y agua destilada además de inyectar vapor. Ing. rojo de metil y verde de bronocresol. empleando ácido clorhídrico o sulfúrico y como indicador una disolución alcohólica de una mezcla de rojo de metilo y azul de metileno. Agroindustrial Manual de Composición Bioquímica de Productos Agroindustriales Equipo de destilación FOSS ETAPA DE VALORACIÓN O TITULACIÓN La cuantificación del nitrógeno amoniacal se realiza por medio de una volumetría ácido-base del ión borato formato.Universidad Nacional del Santa E. En la tabla 1 se recogen los factores para algunos alimentos. Para calcular el porcentaje de proteína basta con multiplicar por un factor de conversión el % de nitrógeno calculado. Jhon Gonzales Capcha . Ing. Cesar Moreno Rojo. Jorge Domínguez Castañeda. CÁLCULOS De la valoración se puede calcular el número de equivalentes de nitrógeno recogidos.P de Ing. Este factor de conversión está tabulado para cada grupo de alimentos. Factor de conversión para obtener la tasa de proteína bruta a partir del nitrógeno total. Ing. Los equivalentes de ácido consumidos corresponden a los equivalentes de amoniaco destilados. Jhonathan Moreno Silva. y con éste dato se obtiene el porcentaje de nitrógeno en la muestra. Ing. Tabla 1.A. Ing. 007 x 100 gr muestra Dónde: ml muestra=gastotitulacion de lamuestra N=normalidad ml blanco=gasto de titulacion del blanco gr muestra= peso de la muestra El resultado obtenido debe de ser multiplicado con el factor (k). Z. Ing. Berk.P de Ing. FÓRMULA PARA CALCULAR PORCENTAJE DE PROTEÍNAS de proteinas= ( mlmuestra −mlblanco ) x N x 14. Jhonathan Moreno Silva. Ing. Editorial El Manual Moderno. J. de acuerdo al tipo de muestra analizada. 1980.A. Cesar Moreno Rojo. Agroindustrial Manual de Composición Bioquímica de Productos Agroindustriales Fuente: Elaboración propia en base a información secundaria. 5. Jorge Domínguez Castañeda. 2ª. Introducción a la bioquímica de los alimentos.B.Universidad Nacional del Santa E. México. Ing. 6. Hacer una propuesta para aplicación industrial. Jhon Gonzales Capcha . Ing.S. 358pp. BIBLIOGRAFÍA Braverman. RESULTADOS Presentar los flujos de obtención de las proteínas de soya y leche. Ed. Comparar el método de Biuret con el método de Kjeldahl. Ed. Ing. 671pp. McGraw-Hill.Universidad Nacional del Santa E. Gaithersburg. Watty. 1976. 2003. Dauvillier.. pág. 1989. México. Sawyer. Kirk. A.. R.A. Adrian. Ing. Ing. Alhambra Universidad.: “Análisis nutricional de los alimentos”. USA.S. 2000. Análisis químico de alimentos de Pearson. 41-43. 131. Nielsen. D.: “Química analítica”. J.S. 586pp.P de Ing. Ed. Acribia. 1988.. México.. Acribia. M. D. C. Ed. Jorge Domínguez Castañeda. España 331pp. 1982.A. 2000..E.142. pág. Cesar Moreno Rojo. Jhonathan Moreno Silva. Pearson. West. Ed. Química analítica.A. S. R. H.C.. Jhon Gonzales Capcha . Skoog. Ing. Técnicas de laboratorio para el análisis de alimentos. J. Poiffait. Kluwer Academic/Plenum Publ. Ed. D. Agroindustrial Manual de Composición Bioquímica de Productos Agroindustriales Egan. pág.M. 17ªed. B. 231. P.: “Food Analysis”. AOAC International: “Official Methods of Analysis”. Potus. 4ªed.