CATEDRA DE BIOQUIMICA LABORATORIO DE BIOQUIMICA GENERALTecnología Médica Elaborada por: Prof. Barbara Butendieck A. 2012 Introducción Normas generales de protección, prevención y comportamiento: Por todos los riesgos indicados, es necesario (y obligatorio) llevar delantal para protegerse de los productos químicos. Como protección personal se puede utilizar, cuando sea necesario, guantes y máscara. Todas las damas y caballeros que tienen el pelo largo, deben recogerlo en forma completa en un moño con un collet, pinche o traba. En el laboratorio no se debe fumar, comer ni beber, para evitar el peligro de un envenenamiento o contagio por contacto accidental con algún producto tóxico o agente patógeno. El material de vidrio debe ser manipulado con precaución para evitar roturas. Se recomienda fijarse en el nombre de las disoluciones y productos antes de utilizarlos. Si se utilizan pipetas de vidrio o plástico, hay que pipetear con el dedo índice, nunca con el pulgar. No se debe pipetear directamente del frasco de agua destilada o de las disoluciones que se comparten con otros grupos: debe pipetearse de la disolución transvasada previamente a un vaso precipitado. Hay que manejar con precaución las sustancias peligrosas: ácidos, álcalis, disolventes orgánicos y productos tóxicos. Estos productos no deben pipetearse nunca con la boca, sino con ayuda de una propipeta. Seguridad en el laboratorio Deben tener presente las reglas generales de seguridad. Se debe estar consciente que los reactivos utilizados en el laboratorio son potencialmente tóxicos, irritantes o inflamables. Sin embargo estas sustancias son peligrosas solo cuando no se manipulan correctamente. La guía y el cuaderno de laboratorio Es muy importante hacer un diagrama de flujo antes de iniciar la sesión. Los procedimientos, detalles, observaciones y resultados se deben registrar en la guía o cuaderno de laboratorio mientras el experimento se está llevando a cabo. Breve pauta para preparar el Informe de Laboratorio. Portada Logo institucional, facultad, escuela; nombre del laboratorio, integrantes del grupo, asignatura, docentes, fecha de entrega. Introducción Breve resumen de conceptos y/o importancia del tema. La información debe tener relevancia para el práctico y no debe ser una copia de un libro, de la guía o de internet. Procurar que no exceda de una plana. Objetivo Aquí se debe incluir cual es el objetivo del práctico, porque, para qué? Parte experimental Materiales y métodos Se describen los reactivos, materiales y equipo que se utilizan, así como la metodología empleada Se debe redactar en tercera persona. Resultados y discusión Se describen los resultados obtenidos, se indican los cálculos, tablas, gráficas o figuras, así como una explicación con fundamentos científicos del porqué se obtuvieron esos resultados. Los resultados experimentales se resumen en forma de tabla o de gráfica. Las tablas y gráficas deben nombrarse ordenadamente en el texto (Tabla 1, Tabla 2, etc.) y deben tener un título. En algunos casos, además, puede ser interesante dar detalles adicionales en forma de una leyenda colocada debajo del título. Las unidades en que se expresan los resultados deben indicarse en la parte superior de cada columna (y nunca en cada línea de cifras). Estas unidades deben elegirse de manera que presenten un número limitado de cifras (por ejemplo, una concentración de 0.0072 mol/L se escribe más fácilmente 7.2 mmol/L o 72 x 10-4 mol/L). En general, los valores obtenidos se presentan en forma de gráfica y no de tabla. Para trazar una gráfica se representan los valores de la variable independiente (parámetro conocido) en el eje de abscisas (eje x) y los de la variable dependiente (parámetro desconocido) en el eje de ordenadas (eje y). Cuestionario En caso de existir cuestionario, incluirlo en el informe. Bibliografía Reportar las fuentes utilizadas con el formato estándar: Para libros: Autor(s), año de publicación, título, editorial y páginas consultadas, en el caso de internet señalar la dirección completa. Para el caso de revistas científicas: Autor(es), año, nombre del artículo, nombre de la revista, volumen, número, páginas. Los Informes se escribirán a mano en un cuadernillo de matemáticas cuadro chico y se entregarán en la escuela el día lunes siguiente al práctico hasta las 12:00 hrs. La entrega del informe fuera de plazo devengará automáticamente en un 1 en la calificación. Considere en el informe la redacción y la ortografía. Se descontarán decimas de nota por estos errores. SOLUCIONES Y TAMPONES I. SOLUCIONES Una solución es una mezcla homogénea de dos o más componentes. El componente que está en mayor proporción se llama solvente y el o los componentes que están en menor proporción se llaman solutos. En soluciones líquidas, el solvente es líquido en tanto que los solutos pueden ser sólidos, líquidos o gases. La mayoría de las soluciones usadas en bioquímica son soluciones acuosas (solvente agua). Para caracterizar una solución no basta indicar sus componentes, sino que también la proporción en que estos están presentes en la solución, es decir, la concentración de cada uno de los solutos en la solución. UNIDADES DE CONCENTRACIÓN Las más usadas en la práctica son de dos tipos: -. Unidades de concentración referidas a volumen: Indican cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen de solución. Ej.: la molaridad, la normalidad, porcentaje p/v, g/l, etc. -.Unidades de concentración referidas a peso: indican cantidad de soluto disuelto por unidad de peso de solución o de solvente. Ej.: % p/p, molalidad. 1.-Molaridad (M): número de moles de soluto por litro de solución. Para preparar una solución de molaridad dada es necesario conocer el peso molecular (PM) del soluto. Se usan las relaciones: Peso soluto (g) = número de moles de soluto PM (g/mol) N moles de soluto = M Volumen solución (l) Ej.: Una solución 1 M (1 molar) de NaCl contiene 1 mol (58,8g) de NaCl por litro. Un mol de NaCl corresponde a un valor igual al número de Avogadro de moléculas, que es 6,023 x 1023. La concentración de iones en solución también se indica en unidades molares, en este caso el ión es la molécula. Ejemplos: Consideremos la solución 1 M de NaCl. Los enlaces iónicos de la red cristalina de cloruro de sodio se rompen al disolverse la sal. NaCl ------------- Na + Cl + - Por cada mol de NaCl sólido se forma 1 mol de Na+ y un mol de Cl-. Luego: Concentración de Na = 1M Concentración de cloruro = 1 M Para las moléculas más complejas como MgCl 2 MgCl2 ------------- Mg+2 + 2 ClUna solución de cloruro de magnesio 1M contiene: + Ejemplo: Calcular la molaridad de HCl comercial del 28%. 3. luego 1nM = 10-9 M 2.82 moles 36. 4. Para poder transformar %p/p a concentración molar o normal es necesario conocer la densidad (d) de la solución. Porcentaje peso/ peso (%p/p): Peso en gramos de soluto por 100 gramos de solución. Normalidad (N): Número de pesos equivalentes (PE) de soluto por litro de solución.28 = 322g Finalmente.82 M.15 kg = 1150 g Ahora calculamos el peso de HCL puro contenido en este litro: 100 g de solución contienen 28 g. En general : PE = PM N Ácidos y bases: n = N de protones que puede ceder (el ácido) o captar (la base) por molécula. Ej. es la forma más usual. luego 1mM = 10-3 M -6 -6 Micromolaridad (M) 1mol = 10 moles. mg/l: Esta es la forma más sencilla de indicar la concentración de una solución. Primero calculamos cuánto pesa 1 litro de la solución. Aquí la proporción de soluto puede ser mayor que la proporción del solvente. Porcentaje peso/volumen (% p/v): Peso de soluto en gramos por 100 ml de solución (g%). 5.15 (kg/l). por lo tanto 1150 g de solución contienen 1150g x 0.: H2SO4 96%. aparte de la molaridad.5 +2 . para soluciones muy diluidas se usa el submúltiplo mg% = peso del soluto en mg por 100 ml de solución.5 (g/mol) Hemos calculado que 1 litro del ácido comercial contiene 8.Concentración de Mg =1M Concentración de cloruro = 2 M Las concentraciones de soluciones diluidas se suele expresar en unidades que son submúltiplos de M: Milimolaridad (mM): número de milimoles de soluto por litro de solución. Peso de soluto/volumen de solución en g/l. Compuestos que sufren reacciones redox: n= N de electrones captados (agente oxidante) o cedidos (agente reductor) por molécula. su concentración es 8. 1 l x 1. Solamente para algunos compuestos se define un PE. luego 1M = 10 M -9 Nanomolaridad (nM) 1 nmol = 10 moles. La milimolaridad y los otros submúltiplos se definen en forma análoga: Milimolaridad (mM): 1 mmol = 10-3 moles. PM del HCl = 36.15 (kg/l) = 1.82 moles de HCl. densidad 1. La concentración de la mayoría de los ácidos comerciales viene dada en %p/p. y este siempre tiene relación con la reactividad del compuesto. es decir. Se habla de porcentaje ya que 100 ml de una solución acuosa relativamente diluida pesan aproximadamente 100g. calculamos a cuántos moles corresponde este peso de HCl: (g/mol) 322 (g) = 8. 2 M. a) ¿Cuántos ml de NaCl 0.. Al contrario. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Para preparar una solución de un soluto dado se puede usar el soluto puro ( generalmente sólido) o una solución concentrada de él en el mismo solvente ( solución stock).5 M se necesitan para preparar 2 litros de NaCl 2 mM? b) ¿Cuántos ml de KCl 0. Expresar la concentración en estas unidades presenta la ventaja de que se hace independiente de la temperatura. Calcule la normalidad de la solución.6.16 kg/l)... El cálculo según la relación dada sería: C2 = V1 x C1 = 10 ml x 2M = 0.Describa la preparación de 3 litros de HCl 0. Ejemplo: En un matraz aforado de 100 ml se colocaron 10 ml de una solución 2M de cloruro de sodio y se aforó con agua. 4. ¿Cuál será la concentración de la solución resultante? Nuestro sentido común nos dice que la respuesta será 0. Este último caso constituye una dilución. Para soluciones acuosas diluidas m es prácticamente igual a M. ya que la solución se diluyó 10 veces.25 M.¿Cuántos mililitros (ml) de H2SO4 3M se requieren para preparar 500 ml de una solución de H2SO4 de concentración? a) 0.05 M b) 0. 2. como la molaridad. (% p/v).. Molalidad (m): Número de moles de soluto por 1000 gramos de solvente. una concentración expresada en unidades referidas a volumen.a) ¿Cuántos g de NaOH sólido se requieren para preparar 500 ml de una solución 0. utilizando una solución comercial concentrada de HCl ( 32% p/p.3 M se necesitan para preparar 2 litros de solución 50 mM? . Esta unidad de concentración se usa solamente para ciertos cálculos físico-químicos.50 ml de H3PO4 85% p/p.71 g/ml se diluyeron a 200 ml con agua.04 M? b) Exprese la concentración de la solución preparada en a) en términos de N. ya que ésta afecta el volumen. d= 1. g/l. Para diluciones rige la relación: V1 x C1 = V2 x C2 V1 = volumen de la solución concentrada C1 = concentración de la solución concentrada V2 = volumen de la solución diluida C2 =concentración de la solución diluida C1 y C2 pueden ser unidades de concentración de cualquier sistema referido a volumen.2 M V2 100 ml PROBLEMAS SOLUCIONES 1.002 N 3. 5. varía con la temperatura. d= 1. BASE: es un compuesto que tiende a captar protones del medio. que deben su basicidad al grupo funcional amino. FUERZA DE ACIDOS Y BASES Un ácido o una base fuerte es el que está completamente disociado en solución. calcule la concentración para el anión Cl y para el catión Na+.+ H+ (3) + (2) .Ud.+ H+ - BH+ BH es el ácido conjugado B.5 mM.COOH Este ácido débil posee un solo protón ácido. Ácidos y bases débiles: prácticamente todos los ácidos y bases orgánicos pertenecen a este grupo.03mM y Na2SO4 0. KCl 35 M. En medio acuoso.6.es la base conjugada de HA. - pH Y TAMPONES ACIDOS Y BASES Según la definición de Bronstedt: ÁCIDO: es un compuesto que tiende a ceder protones al medio. 7. H2SO4 (ambos protones). Ácidos y bases débiles Consideremos a modo de ejemplo el ácido acético.. Ka: HOAC ---- OAc.puede captar protones. MgCl 2 100 mM y CaCl2 1.3 M. HOAc. HNO3. En cambio.Respecto de la solución preparada en 6. Ejemplos de bases según Bronstedt son los compuestos orgánicos básicos. dispone de varias soluciones concentradas: NaCl 2M. KOH. La relación entre la concentración de las especies nombradas a una temperatura determinada está dada por la constante de equilibrio de la reacción de disociación. la especie a. Bases fuertes son: NaOH.. Ácidos fuertes son: HCl. describa la preparación de 2 l de una solución que contenga NaCl 120 mM. A partir de esto. HClO4. etc. Fórmula estructural: CH3. H3PO4 (solamente el primer protón que se disocia). KCl 0. un ácido débil está solamente parcialmente disociado y la base parcialmente protonada. En solución acuosa coexisten en equilibrio moléculas de la especie protonada con moléculas del anión acetato (OAc) y protones. llamada constante de acidez. la reacción correspondiente de un ácido HA será: HA + H2O -- H3O+ + A – u obviando la participación del agua: HA -- H + A + - (1) Considerando esta reacción en el sentido inverso. A.06 M. MgCl2 0. Similarmente para una base B: B. log Ka pKa de HOAC (25 C)=4. El pH de la solución es igual a pH = .log (1.1 –x El valor numérico de Ka indica que HOAC estará poco disociado. luego podemos aproximar: HOAc = 0.1 reemplazando en la expresión de Ka Ka = x2 = 1. lo usual es caracterizar las bases débiles a través de la constante de acidez de su + ácido conjugado BH (invirtiendo la reacción 2).75 Se cumple: que a mayor Ka ======== menor pKa ===== mayor acidez Con el fin de comprender mejor el significado de la constante de acidez. Según la ecuación 3 H+ = OAc = x HOAc = 0.33 mM Comprobamos que la aproximación hecha fue correcta. en nuestra solución: HOAc = 0.78 x 10-5 0.88 Para una base débil B se puede definir la constante de basicidad Kb Kb = BH+ B H+ Sin embargo.33 x 10 M Es decir.78 x 10-5 Se suele expresar la acidez a través del pKa en vez de usar Ka: pKa = .1 x = 1.1 M OAc = H+ = 1. para un ácido débil HA: Ka = A H HA + -3 Despejando H+ y aplicando log se obtiene . Para un par ácido/base conjugada se cumple: Ka x Kb = Kw y Kw = H+ x OH- = 10-14 (25 C) Kw = constante de disociación del agua ECUACIÓN DE HENDERSON-HASSELBACH En forma análoga a lo visto para HOAC.1 M de HOAc.33 x 10-3) = 2. calcularemos la concentración de las especies presentes en una solución 0.Ka = OAc H + HOAc Ka de HOAc (25 C): 1. la tercera reacción simultáneamente repone parte de los protones neutralizados. (Definiremos este concepto más adelante). El equilibrio de disociación de HOAc se desplaza hacia la formación de acetato. Para: pH = pKa ocurre que [HOAc] = [OAc-] (Verifique esta aseveración) . Sin embargo. OH. HOAc Na+ + OHH2O + OAc + H La suma de las dos primeras reacciones hace disminuir la concentración de protones en la solución. SOLUCIONES TAMPON Cuando se titula una solución de HOAc con una solución de una base fuerte (NaOH). midiendo el pH después de cada adición se obtiene el siguiente gráfico. llamado curva de titulación: pH zona tamponante punto de equivalencia ml NaOH Se aprecia que en un rango de pH alrededor de 4. mezclas tampón. Las reacciones involucradas son: 1.+ H+ 3. Se usa para calcular el pH de la mezcla de un ácido débil con un ácido fuerte o una base fuerte de un ácido débil con su sal. se trata de la zona tamponante del par HOAc/OAc-. NaOH 2. etc.75 (pKa) el pH varía muy poco durante la adición de base.pH = pKa + log A - Ecuación de Henderson-Hasselbach HA Esta ecuación establece la relación entre pH y la proporción entre la especie protonada y desprotonada.. También se usan mezclas de dos diferentes sistemas tampón.40 6.08 12. Estaríamos recorriendo nuestra curva de derecha a izquierda.45 3.30 c) Solubilidad de los compuestos Ejemplo: Una desventaja de los buffer de fosfato es la baja solubilidad de sus sales. Zona tamponante de un sistema tampón: Es el intervalo de pH en el cual el sistema posee propiedades de tampón.concentración: a mayor concentración. Solución tampón (solución amortiguadora o buffer): Es una solución cuyo pH se mantiene prácticamente constante cuando se le agregan pequeñas cantidades de ácido o base.75 4.55 7. Concentración de una solución tampón: Es la suma de las concentraciones de la especie protonada y de la especie deprotonada. . el pH comienza a aumentar más fuertemente. trietanolamina/dietanolamina. mayor capacidad tamponante.15 7. depende del valor del pKa de la especie protonada.A medida que la concentración de la especie protonada HOAc en la solución se hace pequeña.96 2.10 3. Al titular una solución básica que contiene el anión acetato con un ácido fuerte se observa el mismo fenómeno. Los valores de pKa para algunos tampones de uso común en bioquímica están contenidos en la tabla 1. Capacidad de una solución tampón: La capacidad de una solución tampón indica la cantidad de ácido o de base que es capaz de absorber sin cambiar fuertemente su pH y depende de: .75 4.pH : es máxima para pH = pKa .75 5.21 7.00 7. d) Variación del pH con la temperatura: Ejemplo: Una desventaja de los tampones de Tris es que su pH varía notoriamente con la temperatura. Las soluciones tampón son sistemas formados por un ácido débil y su base conjugada o por una base débil con su ácido conjugado. Compuesto Acido fosfórico (pka1) Glicina Acido cítrico (pKa1) Acido fórmico Acido acético Acido cítrico (pKa2) Acido cítrico (pKa3) MES (ácido conjugado) Imidazol (ácido conjugado) Acido fosfórico (pKa2) HEPES (ácido conjugado) Trietanolamina (ácido conjugado) TRIS (ácido conjugado) Acido fosfórico (pKa3) Selección de un tampón: Las variables a considerar son en primer lugar: a) El pH al cual deseamos trabajar b) La capacidad que necesitamos Otros aspectos importantes pueden ser: pKa (20ºC) 1.77 8. ejemplos: Tampón tris/fosfato. Un tampón es "bueno" aproximadamente 1 unidad de pH alrededor del pKa. hasta que la solución pierde su característica de tampón. 0415 moles de acetato de sodio.V.0415 M 1. g) Interacciones entre el sistema tampón y las sustancias en estudio.0708 . .15 [HOAc] [OAc-] = 0.708 [HOAc] Por otra parte: [HOAc] + [OAc-] = 0.60 = 4.1 .708 [HOAc] = 0.0585 M Se desea preparar un volumen igual a un litro.708 [OAc-] [OAc-] = 0.3 ml de HOAc 2 M y se afora con agua. luego se necesitan 0.0415 moles = 3.0. Cálculos relacionados con la preparación de tampones: Ejemplo: Se desea preparar un litro de buffer acetato 0.708 0.0.necesaria para que el pH de la solución sea igual a 4. Ejemplo: influencia de un sistema tampón sobre la actividad de determinada enzima. Ejemplo: Acetato de amonio.0293(l) 2M Preparación de la solución: en un matraz aforado de 1 litro se colocan 3.75 + log [OAc-] [HOAc] log [OAc-] = -0.4 g de acetato de sodio más 29.4 g HOAc: se aplica la relación de las diluciones V1 = 1 (l) x 0. reemplazando el pKa de HOAc y el pH: [HOAc] 4. es necesario usar un buffer que sea suficientemente transparente a la longitud de onda de la determinación.1 .e) Volatilidad: Algunos sistemas tampón presentan la ventaja de ser volátiles.1 (todas las concentraciones en M) [HOAc] = 0.0415 = 0.1 M de pH = 4.60: pH = pKa + log [OAc-] . NaOAc : PM = 82 0. La ecuación de Henderson-Hasselbach permite calcular la razón de las concentraciones de HOAc y OAc.: Cuando se desea detectar un compuesto por absorciometría. bicarbonato de amonio.[OAc-] [OAc-] = 0.1 . f) Transparencia a la luz U.0708 = 0.0585 M = 0.60 a partir de ácido acético 2 M y acetato de sodio.[OAc-] Reemplazando: [OAc-] = 0. : a) 1. El Ka de un ácido HA es 1.7 b) 4 x 10-8 M 3.1 M y NH3 0.4 ¿Cuál es la concentración de iones hidrógeno? Resp.: pH 9. de una solución de un ácido fuerte HX de concentración 5 mM? Resp.30 b) 2 x 10-12 M 2.05 11.02 M de ácido débil HA es 4.) 9.: 94.15 M? (pKa ácido acético = 4. Tris = Tris (hidroximetil)aminometano Fórmula estructural: (CH3OH)3 CNH2 PM: 121.1 M c) una solución que contiene 0. El Ka del ácido fórmico es 1.: a) 6.8 x 10-4.1 Acido + conjugado: Tris H . a) La concentración de iones H de una muestra de orina es 2 x 10 M.6 x 10-6 a) ¿Cuáles son pH y grado de ionización del ácido en una solución 10-3 M? b) Calcular el pKa Resp. 5. ¿Cuántos g de NaOH sólido se necesitan para preparar?: a) 250 ml de una solución 0.: a) 4.05 M NaOAc.3 mM ( [OAc-] y [HOAc] respectiv. ¿Cuál es el pH de una solución que contiene NH4Cl 0.08 M y b) 500 ml de una solución de NaOH a pH 9.: a) 3. Calcular el pH de una solución formada cuando a 200 ml de ácido acético 0. Calcule el pH de las soluciones obtenidas al mezclar 10 ml de NaOH 0.2 M. Se preparó un "buffer" disolviendo en agua 5 x 10-3 moles de ácido fórmico y 7 x 10-3 moles de formiato de sodio en un volúmen final de 1 l. ¿Cuál es su pH? b) El pH de una muestra de suero es 7.0? El Ka para el ácido acético es 1.7 mM.: 10000 ml = 10 litros 5. ¿Cuántos iones de a) H+ y b) OH.40.00 mg 6. Calcule la cantidad en gramos de Tris y el volúmen de HCl 1 M que se requiere para preparar 1 l de un buffer Tris/HCl 0.están presentes en 250 ml de una solución de pH = 4? Resp.03 x 10-7 7. pKa = 8.: 3.5 M se le añaden 100 ml de NaOH 0. ¿Cuál será el valor inicial del pH de la solución? Discuta los resultados. Resp.1 M y pH 6.: a) 11 b) 11 c) 4. Los tampones Tris/HCl se pueden obtener agregando HCl a una solución de Tris.: a) 0. b) OH .78 x 10-5 Resp.: a) 0. ¿Cuál es la concentración de ácido acético y acetato en un tampón acetato de concentración 0. pKa ácido acético = 4.89 13.8 14. c) pH.51 x 1013 4. ¿Cuáles son a) H .51 x 1019 b) 1.80 8.: a) 5 x 10-3 M c) 2.05 M HOAc y 0. 4% b) 5.5% b) 5.3 M y ácido acético 0.8 g b) 1.5 + -7 + - .PROBLEMAS TAMPONES 1. El pH de una solución 0.1.75 Resp.7 12.89 b) 3.2 M. ¿Cuántos milílitros de HCl 0.75) Resp.6.05 N se requieren para neutralizar exactamente 20 g de NaOH? Resp. Resp.¿Cuál es el pH de una solución que contiene acetato potásico 0.7? Resp.01 M. pH 7. a) calcular el pH de la solución resultante b) si esta solución se diluyera 10 veces ¿cuál sería el pH final? Resp.77 10.: 5. con 90 ml de: a) H2O b) NaCl 0.1 M. a) ¿cuál es el grado de ionización de HA en la solución? b) ¿cuál es el Ka? Resp. pKb NH3 = 4. : a) 150 ml H3PO4 2 M b) 200 ml KH2PO4 c) 27.2 g KH2PO4 400 ml KOH 1 M 100 ml Na2HPO4 17.: 24.65 16. Una solución amortiguadora contiene ácido acético 0.070 M OBSERVACION: Grado de ionización de un ácido es la fracción de la concentración total que se encuentra disociada.15 M. Describir la preparación de 2 litros de tampón fosfato 0.9 partiendo de: a) solución 2 M de H3PO4 y solución 1 M de KOH b) soluciones 1 M de KH2PO4 y Na2HPO4 c) KH2PO4 sólido y K2HPO4 sólido Resp.: 21 ml.1 M.1 N a 90 ml del amortiguador. pH 6. 160 ml 15. se suele expresar como porcentaje.: 4.1 M y acetato de sodio 0.1 M con HCl 0.5 titulando 50 ml de piridina 0.Resp.2 g. Resp. Calcular el pH después de la adición de 10 ml de HCl 0. La piridina es una base orgánica que reacciona con los H+ para formar Pyr-H+ Para Pyr-H+ : pKa = 5.36.1 M. . ¿Cuánto HCl se gastará? ¿Cuál será la concentración del tampón? Resp. Se desea preparar un tampón de piridina/HCl de pH 5.4 g K2HPO4 17. 0. Entre cada pH enjuagar con agua destilada. 1/10 v/v y 1/20 v/v. HCl concentrado. acetato de sodio. etc. Solución de NaOH 10M. pipetas Pasteur.Laboratorio 1: Determinación del pH y preparación de soluciones amortiguadoras y diluciones Objetivo: Aprender el uso correcto del pH metro y preparar soluciones con diferentes valores de pH. Ajustar a pH 8 y aforar a 100 ml.M. pH 7.Preparar 100 mL de una solución amortiguadora de acetato de sodio 50 mM. Materiales y métodos Materiales Potenciómetro. después a 4 con soluciones reguladoras comerciales. espátula.. Preparación de diferentes soluciones 1.5 M pH 8 Calcular cuántos gramos de EDTA necesitas. Preparación de diluciones 1. DILUCION 1/2 1/5 1/10 1/20 Volumen mL Cu SO4 H2O Total .. m=masa en gr. 2.. 4. comenzar a disolver con agitador magnético y tratar de ajustar el pH cercano a 8 (el EDTA comenzará a disolverse) y adicionar poco a poco más agua. pH 5. P. refrescos.Calcular la concentración molar y el % p/v de una solución de sulfato de cobre (CuS04) que tiene 10g/L.. primero debe calcular cuántos gramos de acetato de sodio se necesitan. Muestras para determinar pH: leche. agitador magnético. Sulfato de cobre 10g/L Métodos Uso del pH metro y medición del pH 1. bebidas. indicando los volúmenes de cada componente a mezclar. etc. 3. probetas de 100 ml. 1/5 v/v. Para realizar esto.El electrodo del pHmetro siempre debe estar sumergido en una solución de KCl o agua destilada.A partir de esta solución. 2.= peso molecular y V= volumen en litros) para hacerlos cálculos. Enjuagar el electrodo con agua destilada y secar. Reactivos Solución estándar pH 4. jugos. ácido acético. jugo.. diluidas 1/2 v/v. disolverlos en menos de 100 ml de agua destilada (por ejemplo 70mL) y ajustar el pH a 5 con ácido acético.Ajustar el pHmetro primero a pH 7. piseta con agua. 2. EDTA.. calcular la preparación de soluciones de un volumen final de 5 ml. Usar la formula M= (n/V) = (m PM)/V (M= molaridad... vasos precipitados de 250 ml.Determinar el pH de varias muestras como leche.Preparar 100 ml de EDTA 0. poner en 60 ml. F.Explica tu respuesta. Inc. K. and Walker. 2000. 5. Inc. Si quisieras preparar un buffer de fosfatos de potasio pH 11..Principles of Instrumental Analysis. Inc. 1990. J. ¿Porque el pH del potenciómetro se ajusta primero a pH 7 y no a 4 o 10? 2. A laboratory Manual. 3.1986. Boyer. Skoog and Donald M. ¿Porque el electrodo se tiene que mantener en una solución de KCl saturado? En caso de no contar en el laboratorio con KCl. ¿Que otros compuestos pueden usarse? 3. West. Second Edition. Fifth edition. Robert. En la preparación del acetato de sodio. que sales seleccionarías? 4. and White B. Rinehart and Winston. USA.. Biochemical techniques theory and practice. Cambridge University Press. JF. Cold Spring Harbor Laboratory Press . Principles and Techniques of practical Biochemistry.1971. 1989. Wilson. Fritsch and T. Holt. Sambrook. Bibliografía 1. The Benjamin/Cummings Publishing Company. J. Rodney F. 2. Waveland Press. cual es el ácido y cual la base conjugada.J. 5. Maniatis. Molecular cloning. 1st edition. ¿El buffer de acetato de sodio que preparaste está a un pH que se puede considerar adecuado para servir como solución amortiguadora? ..Cuestionario 1. Modern Experimental Biochemistry. 4. Douglas A. E. La relación entre estos parámetros está dada por la ley de Lambert-Beer: . Los diferentes tipos de radiación electromagnética. Se cumple que: c=x c = velocidad de la luz en el vacío = longitud de onda = frecuencia El ojo humano detecta la radiación del rango de longitudes de onda de 400 a 800 nm.Laboratorio 2 : Espectrofotometría: Absorciometria Montaje de una Técnica Fotocolorimetrica PRINCIPIOS DE ABSORCIOMETRIA DE UV/VISIBLE La absorciometría aprovecha la propiedad de ciertos compuestos de absorber radiación electromagnética. luz ultravioleta (UV). Las sustancias coloreadas absorben luz visible. Cuanto mayor es el número de moléculas de este cromóforo encontradas por el haz de luz en su camino. LEY DE LAMBERT-BEER La ley de Beer-Lambert (o Lambert-Beer) es la ley fundamental de la absorciometría. etc. ondas de radio.. ya que contiene radiación de todo el espectro visible. La luz solar es blanca. La luz del espectro visible y del UV cercano (200 a 400 nm) posee la energía necesaria para producir transiciones de electrones desde un orbital molecular de menor energía a otro de mayor energía de ciertos compuestos. El siguiente esquema ilustra la situación: cubeta concentración c solución de I0 luz incidente l Io I l c = intensidad del haz incidente = intensidad del haz transmitido = camino óptico (ancho interior de la cubeta medido en cm). = concentración I luz transmitida Si el compuesto absorbe a la longitud de onda dada. como ser rayos X. llamada luz visible (1 nm = 10-9 m). Dicho número de moléculas depende de la distancia recorrida a través de la solución (camino óptico) y de la concentración. luz infrarroja. Consideremos un haz de luz monocromática (luz de una sola longitud de onda) que atraviesa una solución de un compuesto contenido en un recipiente de vidrio. se propagan a velocidad común pero difieren en longitud de onda y frecuencia. menor será la intensidad de la luz transmitida. I es menor que Io. aparte de otras radiaciones. llamados cromóforos. luz visible. su color corresponde a la radiación no absorbida. ya que relaciona la absorción de la luz con la concentración de soluciones. : para proteínas se usa A (l = 1 cm). (Fig.1% medida en una cubeta de camino óptico dado como referencia. lc (1) La forma de esta ley usada en la práctica es más sencilla y se obtiene de la siguiente manera: Reordenando y aplicando logaritmos: log I = . 0.301 La ley de Lambert-Beer indica que para un cromóforo a una longitud de onda dada la absorbancia aumenta en forma lineal con la concentración (con l = cte). mientras que la transmitancia disminuye en forma exponencial. 1 y 2). aproximadamente.log T (5) Ejm: Si %T = 50. la transmitancia es la fracción de la intensidad incidente transmitida por la solución. Por otra parte. T se puede expresar como porcentaje (%T). Ejm. . 1 M es una concentración extremadamente alta). y por otra parte el órden de magnitud de los coeficientes de extinción molar importantes corresponde a valores muy superiores al intervalo de absorbancias medibles en la práctica. extinción. Los coeficientes de extinción pueden tomar valores hasta 100. %T = I x 100 Io Aplicando logaritmos a (4) y reemplazando con (2) se obtiene: A = .50 y A = 0. El coeficiente de extinción molar: es una característica propia del cromóforo a una longitud de onda dada y representa la probabilidad de que el cromóforo absorba la radiación. Es importante recalcar el carácter hipotético de esta afirmación. l c Io Se define como absorbancia (A) de una solución: A = log Io ----I A=lc (2) Luego: (3) ley de Beer-Lambert (forma lineal) Por convención se usa el siguiente sistema de unidades: l = camino óptico en cm c = concentración en M = coeficiente de extinción molar. Para explicar el significado se suele señalar que es igual al valor numérico de la absorbancia que tendría una solución 1 M del cromóforo si el camino óptico es igual a 1 cm. en cm-1 x M-1 Sinónimos de absorbancia: densidad óptica. se define como transmitancia (T) de una solución: T=I (4) Io Es decir.000 cm-1 M-1. ya que normalmente no es posible preparar soluciones de concentración 1 M de los cromóforos (si el PM es alto.I = Io x 10. entonces T = 0. Para compuestos de peso molecular desconocido se usa en vez del coeficiente de extinción molar la absorbancia de una solución de concentración estándar expresada en % P/V. y para proteínas típicas a 280 nm tiene valores cercanos a 1. indicando la posición de los máximos de las bandas de absorción ( máx) con los correspondientes coeficientes de extinción. A 260 longitud de onda () 340 420 500 nm El espectro de absorción de UV/visible es característico para un cromóforo determinado. y por lo tanto representa la variación de A con la longitud de onda (según (3)). en la misma cubeta: A1 A2 b) V2 V1 En un espectro: A1 A2 1 2 La aditividad de la absorbancia: La absorbancia de una solución a cierta longitud de onda es igual a la suma de las absorbancias de todos los cromóforos que contiene. 1 Fig.. corresponde a absorción de luz azul.A A=lc T T = 10 - l c pendiente = x l c Fig.. Por ejemplo. debido a que su única banda en la región del visible a 445 nm. AT = A1 + A2 + A3 + . a pH 7.0: máx (nm) 266 373 445 (M-1 cm-1) 31. CALCULOS EN ABSORCIOMETRIA De la ley de Lambert-Beer se puede deducir: a) Para diluciones.0). por lo tanto se puede usar para su identificación.400 12. . A continuación se muestra como ejemplo el espectro de absorción de riboflavina (en fosfato de sodio.800 10. si la absorbancia se mide a una misma longitud de onda.500 La riboflavina tiene color amarillo. Un espectro de absorción se obtiene variando la longitud de onda para l y c constantes. Las características espectroscópicas se pueden resumir. para riboflavina a pH 7. 2 c El gráfico de la absorbancia de un cromóforo en solución en función de la longitud de onda se denomina espectro de absorción. 2. El elemento dispersor separa los haces de luz de diferente longitud de onda. Fuente de luz UV: lámparas de H2 o D2.2. Sirven para 200-375 nm aproximadamente.Detector . que puede ser un prisma o una red de difracción.Compartimento de muestra . Un sistema de espejos permite dirigir el haz de luz de la longitud de onda deseada hacia la ranura de salida: .1.Dispositivo que permite seleccionar la longitud de onda .Fuente de luz . Filtros No proporcionan luz realmente monocromática sino que permiten el paso de un cierto rango de longitudes de onda alrededor de la longitud de onda de máxima transmitancia del filtro. Monocromadores Poseen un elemento dispersor.Dispositivo que permite la lectura directamente o inscriptor Se pueden distinguir dos tipos de instrumentos: a) Fotómetros de filtro: La selección de la longitud de onda se realiza mediante filtros intercambiables. FUENTE DE LUZ: No existe una fuente de luz que proporcione radiación de todo el rango espectral UV/visible de suficiente intensidad. 2. Sirve para 340-850 nm aproximadamente. Espectrofotómetros: Poseen un monocromador. Por otra parte se distinguen instrumentos que operan en el rango visible solamente y otros que abarcan el UV y el visible (tienen 2 fuentes de luz). b) El siguiente esquema muestra el trayecto de la luz en un espectrofotómetro que opera con luz visible: I0 lámpara de Tungsteno Monocromador Cubeta en portacubetas I 0.INSTRUMENTOS DE MEDIDA Los componentes básicos de todos los instrumentos que se usan en absorciometría de UV/visible son: . por consiguiente se usan fuentes diferentes: Fuente de luz visible: lámpara de tungsteno. Además existen instrumentos de 1 solo haz y de doble haz.532 Fototubo Pantalla de lectura 1. SELECCION DE LA LONGITUD DE ONDA: 2. son más sofisticados que los fotómetros de filtro. k. La monocromaticidad de esta luz se mide a través del "ancho de banda" del espectrofotómetro (típicamente es de 1 a 10 nm). Interpolando en la recta con la absorbancia de la solución problema se puede determinar su concentración. dependiendo del modelo. Los detectores más usuales son los fototubos y los tubos fotomultiplicadores o fotomultiplicadores.000. pero siempre pasará un cierto rango de longitudes de onda. de intensidad proporcional a la intensidad de la luz. Si el instrumento informa la transmitancia se calcula A usando la ecuación (5). LECTURA O REGISTRO: La mayor parte de los instrumentos indican o registran el valor de la absorbancia. Luego: . Un método alternativo es construir una curva de calibración de A en función de c. En la práctica se considera que un espectrofotómetro opera con luz prácticamente monocromática. COMPARTIMENTO DE MUESTRAS: Allí se ubica la o las cubetas con las soluciones de muestra y de referencia. APLICACION DE LA ABSORCIOMETRIA EN EL ANALISIS CUANTITATIVO 1. Un monocromador permite variar la longitud de onda en forma continua. DETECTOR: Los detectores son de tipo fotoeléctrico: al incidir luz producen corriente eléctrica. 3. Las cubetas son de vidrio o plástico (para el visible) o cuarzo (para el UV). La absorbancia normalmente se mide con 3 cifras después de la coma.000 ó 3. DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE UN CROMOFORO PURO Midiendo la absorbancia de la solución problema en un espectrofotómetro y conociendo el correspondiente coeficiente de extinción molar se puede calcular la concentración. cuyo valor se encuentra en la literatura.000 hasta A = 2. Con un fotómetro de filtro no es posible obtener espectros de absorción. La pendiente de la curva de calibración se ha llamado factor de calibración. Normalmente se usa la longitud de onda del máximo de una banda. El rango fotométrico de los espectrofotómetros normalmente es desde A = 0.493 nm 492 nm 491 nm 490 nm 489 nm 488 nm 487 nm 486 nm Monocromador ranura 491 nm 490 nm 489 nm luz monocromática Al cerrar más la ranura aumentará la monocromaticidad de la luz. que será una recta si se cumple la ley de Lambert-Beer (ver fig. 4. Una ventaja del método con curva de calibración es que permite usar también un fotómetro de filtro. condición necesaria para obtener espectros de absorción.1). 5. Si se usó solamente una solución. en instrumentos de 1 solo haz. En este caso además es indispensable un test. Esta A será proporcional a la concentración del compuesto que se va a determinar dentro de cierto rango de concentraciones. junto al método. Es necesario destacar que para un test k no es igual a un producto x 1.B.Dean "Instrumental Methods of Analysis". D. se pueden determinar por absorciometría usando un ensayo o "test". se calibra A = 0 con el blanco en el haz.Ewing "Instrumental Methods of Chemical Analysis". 2. y restar la absorbancia del blanco de todas las absorbancias. si se analiza una muestra con varias proteínas. L. "Physical Biochemisty". BIBLIOGRAFIA (Espectrofotometría) 1. señalados normalmente en la literatura. 3. . 2. S.Brown. como se explicó anteriormente. En el ensayo se agrega uno o varios reactivos cromogénicos que interaccionan o reaccionan específicamente con el compuesto a determinar. G. se calcula la concentración por proporción directa: C (problema) = A (problema) C (estándar) A (estándar) Si se usaron varias soluciones estándar se construye la curva de calibración del test. debe tomar en cuenta la posible presencia en la muestra de compuestos que interfieran con el test. con una o varias soluciones del compuesto a determinar. de coeficientes de extinción desconocidos. Normalmente en los test se genera un color (absorbancia de luz visible). 4. de concentración conocida (soluciones patrón o estándar) y con el solvente (blanco del test).A=kc (6) Si se ha usado un espectrofotómetro de buena calidad: k = x 1 Si el número de muestras es alto. DETERMINACIONES A TRAVES DE UNA ENSAYO O "TEST" Muchos compuestos que no pueden ser determinados directamente (midiendo su propia absorbancia). J. pero no se puede efectuar la determinación directa porque la muestra o "solución problema" es una mezcla que contiene otros compuestos que absorben en la misma región que el compuesto a determinar o/y la absorbancia es demasiado baja Ejemplo: Determinación de proteínas. Casos en los cuales se realiza un test: 1. por lo que se denominan ensayos colorimétricos. desde el gráfico y usar la ecuación (6) que interpolar. El compuesto no absorbe en todo el UV/visible: Ejemplo: Determinaciones de azúcares. 2. El compuesto absorbe en una región espectral (generalmente UV). generándose un compuesto o complejo que absorbe. Ed. Para determinar la concentración del compuesto en la muestra problema se puede interpolar en la recta o usar el factor de calibración.Merrit. Freifelder. es decir. H. El test se realiza en paralelo con la muestra problema. Posteriormente se miden las absorbancias "contra" el blanco. Alternativamente se pueden medir contra agua. "An Introduction to Spectroscopy for Biochemists". específico para cada test. determinación de fosfato.Willard. será más práctico determinar k. Al usar un test. Prepare 100ml de una solución de KMnO4 que tenga absorbancia cercana a 1 a 525 nm. En forma previa al práctico: Efectúe los cálculos necesarios para 1 y 3 y prepare una tabla de la siguiente forma: Tabla 1 Solución ml KMnO4 1mM Concentración 525nm A (medida) ___nm _____nm Nº 1 2 3 4 5 6 7 Contenido del informe adicional: Espectro de absorción del KMnO4 Cálculo de la concentración de la solución problema Tabla Nº 1 Curvas de calibración: Gráfico de A en función de C para cada longitud de onda ( en el mismo gráfico) Determinación de la concentración de la solución problema usando la curva de calibración más adecuada. Procedimiento: 1. Mida la absorbancia de las soluciones en el máximo y a dos longitudes de onda situados en los flancos.Trace el espectro de absorción de la solución problema en el rango espectral 400-600 nm Efectuar las lecturas a intervalos de 10. Grafique los valores en papel milimetrado. No es necesario efectuar una dilución rigurosamente cuantitativa.Parte Experimental: En el presente práctico se estudiará la validez de la ley de Lambert Beer para soluciones acuosas de permanganato de potasio. Materiales: Solución de permanganato de potasio 0. 5. En estos casos es indispensable construir una curva de calibración para la determinación.Prepare 7 soluciones estándar cuya absorbancia en el máximo cubra en el rango entre 0 y 1. Este compuesto presenta en el espectro visible una banda de absorción ancha. 3. Método de Bradford. determinando la posición de los máximos con mayor exactitud posible.. Para la determinación fotocolorimétrica de sustancias que no absorben en la región del visible.. cuyo máximo está a 525nm ( = 2.500M-1 cm-1). Ejemplos típicos son las determinaciones de proteínas (método de Biuret. matraces aforados de 100 ml Pipetas. . se usa una reacción específica que lleva a la formación de un producto (o productos) coloreado. 2 o 1 nm.4 Utilice para ello una solución prediluida de permanganato 1mM.1M Buretas. Esta solución se usará como muestra problema 2. provista de hombros. etc).. se muestran las estructuras de los principales mono. la sacarosa y la trealosa son ejemplos de los disacáridos no reductores (ver anexos). En el anexo. Disacáridos y Polisacáridos) 1. funcional y metabólica. Los carbohidratos se clasifican dependiendo del número de átomos de carbono que posee y la función aldehídica o cetonia. polisacárido. se originan como producto de la hidrólisis de polisacáridos. Objetivos: Identificar por métodos colorimétricos cualitativos los principales monosacáridos. Todos los disacáridos que posean un carbono anomérico libre. Si este enlace se efectúa entre dos carbonos anoméricos. por lo tanto no dan positivas aquellas pruebas que involucren la participación de estos grupos. Los disacáridos son azucares formados por la unión de dos monosacáridos mediante el enlace glucosídico. es el producto de la hidrólisis del glucógeno y el almidón. se denomina monosacárido. disacáridos y polisacáridos. por dos. llamándose azucares reductores. debido a que promueven la reducción del reactivo usado y ellos mismos se oxidan.Prueba de Molish Es una reacción general para carbohidratos que contienen más de 5 átomos de carbono. la maltosa. Cuando el carbohidrato está formado por una sola molécula de carbohidrato. con algunas excepciones como la sacarosa. Material y Metódos A. 1: Reacción de Molish .Laboratorio 3y 4: Reconocimiento de Hidratos de Carbono “Métodos cualitativos para la identificación de carbohidratos” (Monosacáridos. constituido por solo moléculas de glucosa es sin lugar a dudas la base alimenticia del globo terrestre. recibiendo el nombre de azúcar no reductor. si son abundantes y representan para el hombre la principal fuente de energía metabólica de fácil aprovechamiento. por ejemplo. el almidón. Introducción Los carbohidratos están distribuidos ampliamente en vegetales y animales en los cuales tiene participación estructural. su estudio se debe a que disacáridos como la maltosa y la celubiosa. Los polisacáridos. Aunque la mayoría de los disacáridos carecen de importancia para el hombre. darán positivas estas reacciones. 2. el disacárido no tendrá el potencial aldehído o cetona libre. 3. la reacción se muestra en la siguiente figura: Fig. di y polisacáridos. estas a su vez le confiere la base para la mayoría de las reacciones usadas para su identificación y cuantificación. disacárido y por más de dos. especialmente en la población de bajos recursos.. ya que así se hidroliza el disacárido. C. El color azul. La reacción se presenta en la figura 3.Prueba de Bial o de Orcinol-HCl Es una prueba específica para pentosas la cual se muestra en la figura 2. 3: Reacción de Seliwanoff E. pero se usa casi exclusivamente para identificar fructosa. posiblemente a la formación de un complejo: Ioduro de almidón.. La positividad se reconoce por la formación de una coloración verde botella brillante.Prueba de Seliwanoff: Es específica para cetosas que contengan 5 o más átomos de carbono. El fundamento radica en la reducción del acetato cúprico a oxido cuproso..B.Prueba de Lugol: Es una prueba que se usa para identificar almidón.. pero con mas tiempo de calentamiento. aunque algunos disacáridos (los reductores) dan positiva la reacción. .. Fig.Prueba de Barfoed: Es una reacción para identificar monosacáridos. 2: Reacción de Bial D. Fig. se debe. Prueba Fenilhidrazina Es una prueba para distinguir asas (y oligosacáridos).G. La figura 5 muestra la reacción.. 5 Reacción de la prueba de Fenilhidrazina . que son isomeros de función. Los carbohidratos que solo se diferencian en sus átomos de carbono 1 y/o 2 darán la misma osazona. como es el caso de la glucosa y la fructosa. 4 Reacción de la prueba de Benedict cualitativo H.Prueba de Benedict: Es una prueba específica para las sustancias reductoras con grupos carbonilos libres. Fig.. Fig. Anotar el tiempo que corresponda a cada carbohidrato. amarillo o rojo indica la presencia de un AZUCAR REDUCTOR. brillante y totalmente transparente indica la presencia de una PENTOSA. Sustancia problema Reactivo de Bial: MEZCLAR Llevar a baño maría hirviente durante 3 minutos. La aparición de un escaso precipitado rojo.Procedimiento: Materiales Tubos de ensayo. La aparición de una coloración azul indica la presencia del ALMIDON y una coloración roja indica el GLUCOGENO o Eritrodextrina. La formación de un color rojo cereza indica la presencia de FRUCTOSA. Cubrir con la laminilla cubreobjeto evitando dañar los cristales con movimientos bruscos o exceso de muestra. Al final del periodo de calentamiento. el carbohidrato es un monosacárido o un disacárido. Sustancia problema Reactivo de Seliwanoff: Llevar a baño maría hirviente durante 10 minutos.5 ml 2 ml Fenilhidrazina 2 ml 5 ml . Sustancia problema Reactivo de Lugol: Mezclar y observar. Sustancia problema Reactivo de Fenilhidrazina: MEZCLAR BIEN Coloque los tubos en agua de baño María hirviendo durante 10 minutos. Si el color no cambia. La aparición de un anillo violeta-rojizo en el sitio de contacto de los dos líquidos indica que la muestra contiene carbohidratos.50 ml de Barfoed 1 ml 2. mechero.5 ml de Bial 1 ml 1. Volumen 1 ml 2 gotas 0. La aparición de un precipitado rojo antes de los 6 minutos indica la presencia de un monosacárido. pinzas de madera Prueba de Molish Procedimiento: En un tubo de ensayo colocar: Sustancia problema Reactivo de molish: MEZCLAR Agregar H2SO4 concentrado Dejar caer lentamente por las paredes del tubo el ácido. entre los 9 y 12 minutos indica la presencia de LACTOSA o MALTOSA. Sustancia problema Reactivo de Benedict cualitativo: MEZCLAR Llevar a baño maría hirviente por 5 minutos. La aparición de un color verde botella. enfríe los tubos en chorro de agua. contando los minutos y sacra del baño cada tubo inmediatamente después que haya aparecido el precipitado rojo ladrillo de Cu2O. Sustancia problema Reactivo de Barfoed: Mezclar y calentar en baño de agua hirviente.5 ml de Seliwanoff 1 ml 2 ml de Lugol 2 ml 1 gota de Benedict 0. La aparición de un precipitado verde. pero ésta es opaca. Algunos azucares dan con el Bial una coloración verde. DEJAR EN REPOSO POR 5 MINUTOS Examinar al microscopio la forma característica de los cristales de osazona colocando con mucho cuidado una gota en el portaobjeto. Ud. En la casilla “Nº Muestra”. para reportar la positividad o negatividad de la reacción. disacáridos y polisacáridos INFORME RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS 1. coloque el numero de cada tubo de las muestras problemas que se le entrego. Use los signos (+) o (-). N° Muestra 1 2 Molish Barfoed Bial Seliwanoff Lugol Benedict .Marcha analítica para monosacáridos. Sobre la base de los resultados de sus pruebas. puede identificar la muestra problema. Complete el siguiente cuadro con la información deseada. .REPRESENTACIÓN DE FISCHER DE MONOSACÁRIDOS Representación de Fischer de los monosacáridos más frecuentes en la naturaleza: 2. Disacáridos más importantes: ..REPRESENTACIÓN DE HAWORTH Representación en estructuras de Haworth: 3..ANEXO 1.DISACÁRIDOS MAS IMPORTANTES Y ESTRUCTURAS DEL PIRANO Y FURANO. 4..ANÓMEROS DE LA GLUCOSA Y REPRESENTACIÓN EN SILLA . muestras de una proteína pura. En general los métodos utilizados para la determinación cuantitativa de proteínas consisten en la determinación absorciométrica directa o en ensayos de tipo colorimétrico. sacarosa y pigmentos biliares también generan el color. conocida. fracciones de una columna cromatográfica. Estos métodos difieren entre sí en sensibilidad. La literatura describe métodos para efectuar estimaciones de concentración utilizando la absorbancia en esta región. . Por consiguiente. cuyo coeficiente de extinción se ha determinado previamente. cisteína y cistina también presentan bandas de absorbancia en el ultravioleta cercano. pero se encuentran a menores longitudes de onda y son de menor intensidad. Se han efectuado estimaciones de la concentración total de proteínas en mezcla a partir de la absorbancia a 280 nm (A 280) o usando la razón A 280/A 260 (método de Warburg). que permite corregir el error debido a la contaminación por ácidos nucleicos los cuales presentan un máximo de absorbancia a 260 nm. Sin embargo. todas estas estimaciones pueden llevar a un error considerable debido a la presencia de contaminantes o a una composición aminoacídica atípica.0.5 mg/ml). así como el coeficiente de extinción molar de una proteína depende de su composición aminoacídica. El ensayo de Biuret se utilizará en el presente práctico. se puede calcular la concentración a partir de su absorbancia. turbidimétrico o fluorométrico. de Lowry y el ensayo usando ácido bicinconínico. debido principalmente a la contribución de los residuos de aminoácidos aromáticos. El método de Biuret sirve para la determinación de concentraciones entre 1 y 10 mg/ml. de Bradford. Absorciometría de proteínas La mayoría de las proteínas presentan un máximo de absorbancia a 280 nm aproximadamente. La selección del método adecuado se realiza considerando las características de las muestras que se desean analizar. Ensayos colorimétricos Los ensayos más usados son los de Biuret. Los dipéptidos y los aminoácidos (excepto serina y treonina) no dan esta reacción. así como de los enlaces peptídicos (bajo los 220 nm). y en menor proporción fenilalanina. La posición exacta del máximo de absorbancia. etc. Interferencias: Péptidos. que pueden ser extractos de tejidos animales o vegetales. Las proteínas también absorben fuertemente a longitudes de onda menores a 240 nm. es más confiable. orina). reacciona con compuestos que contienen dos o más enlaces peptídicos dando una coloración violeta. pero es más complicado. debido principalmente a la presencia de residuos de triptófano y tirosina. Tris.Laboratorio 5 INTRODUCCION: Cuantificación de Proteínas Se han descrito muchos métodos diferentes para la determinación cuantitativa de proteínas. solamente para soluciones de una proteína pura.025 . Los residuos de histidina. existencia de interferencias. exactitud y sencillez. sales de amonio y sacarosa afectan el color. muestras obtenidas en el curso de la purificación de una proteína. El ensayo de Lowry es de sensibilidad algo menor al de Bradford (0. El color desarrollado se debe a un complejo de coordinación entre el Cu++ y cuatro átomos de nitrógeno que provienen de dos cadenas peptídicas. Cuantificacion de proteínas por el método de Biuret El reactivo de Biuret (sulfato cúprico en medio alcalino). líquidos biológicos de interés en bioquímica clínica (suero. 8 y 10 mg de albúmina. Este reactivo es estable indefinidamente. (En forma previa la práctico. use la muestra prediluída. prepare una tabla que indique para cada tubo: volumen de agua. coloque 1 ml de agua destilada en vez de albúmina.5 N. Agregar alrededor de 500 ml de agua destilada y agitar hasta disolución. ENSAYO DE BIURET MATERIALES Reactivo de Biuret: Preparación: Colocar 1. . Si es necesario.0 g de ioduro de potasio y agitar hasta que esté totalmente disuelto. 447 Bradford. 4.M. volumen de solución estándar.5 g de sulfato de cobre (CuSO4 X 5 H2O) y 6 g de tartrato de sodio y potasio (NaKC4H4O6 x 4 H2O) en un vaso de 1000 ml. 248 . M. luego mida A a 540 nm contra el blanco. Agregar lentamente y agitando constantemente.254 (1976). Complete a 1 ml con agua destilada (De esta forma Ud. 3 pág. El sexto tubo úselo como blanco. Espectrofotómetro. considerando prediluciones. Agregue 4 ml del reactivo de Biuret Deje desarrollar color durante 30'. BIBLIOGRAFIA Methods in Enzymology Vol. Disponga de seis tubos y coloque en ellos volúmenes de solución estándar que contengan 2. Las dos soluciones deben estar a temperatura ambiente. DETERMINACION DE PROTEINAS EN UNA MUESTRA En un tubo coloque 1 ml de la muestra a determinar. Agregue 4 ml del reactivo de Biuret. A. INFORME Contenido (aparte de lo habitual): Tablas de valores Curva de calibración: gráfico de absorbancia en función de concentración. Deje desarrollar color durante 30' y mida A a 540 nm. Agregar 1. (Se entregará preparado).PARTE EXPERIMENTAL 1. 6. Diluir a 1000 ml y guardar en frasco de polietileno. mg/ml (proteínas). 300 ml de hidróxido de sodio 2. Solución patrón de albúmina 10 mg/ml PROCEDIMIENTO CURVA DE CALIBRACION Atención: realice el ensayo de la muestra en forma paralela a la curva de calibración.. Calculo de la concentración de la muestra. ha preparado soluciones de albúmina de la concentración correspondiente al rango del test). Analytical Biochemistry 72. un ácido nucleico -nucleoproteínas. por lo que su número de recambio es 5. etc. Así mismo. La acción de la enzima es extremadamente selectiva sobre un substrato específico. Sumner en 1926.6 x 106. que varía entre 100 y 36 millones (anhidrasa carbónica). muchas enzimas requieren activadores metálicos. En la actualidad se conocen más de 2000 enzimas que han sido aisladas en forma cristalina. Pasteur descubrió que la fermentación del azúcar mediante levaduras. Algunas enzimas son proteínas conjugadas. ácido tetra hidrofólico. FAD (flavina adenina dinucleótido). tiamina. aisló en forma cristalina la enzima ureasa. Comprobar la acción de la temperatura sobre la actividad de las enzimas y comprobar la acción hidrolítica de la AMILASA. un azúcar glucoproteínas. 2º No se alteran durante las reacciones en que participan. a partir de extractos obtenidos de Cannavalia enzyformis (Fabaceae) la que hidroliza la urea según la siguiente reacción: UREASA (NH2)2 CO + H2O CO2 + 2 NH3 En 1930. Northrop aisló en forma cristalina las enzimas digestivas: pepsina. MATERIAL Y METODOS Gradilla Pipetas Soluciones de Fehling A y B Trocitos de hígado Tubos de ensayo Agua oxigenada Baño María Trocitos de tomate Mechero Solución de Lugol Almidón . piridoxal. La sustancia sobre la que actúa una enzima se denomina substrato. se define como la cantidad de substrato transformado en la unidad de tiempo por una cantidad dada de enzima. y está formada por una parte proteica (apoenzima) y un cofactor no proteico (coenzima). 3. En 1897 Buchner logró extraer de las células de levadura las enzimas que catalizan la fermentación alcohólica. Todas las reacciones químicas del metabolismo celular se realizan gracias a la acción de catalizadores o enzimas.000 y un millón. cobalamina. con su conversión en alcohol etílico y anhídrido carbónico es catalizada por fermentos o enzimas.Laboratorio 6: “Reconocimiento de Enzimas” 1. por Ej. 3º Aceleran el proceso para la obtención del equilibrio de una reacción reversible. y he de allí la importancia de los minerales para el buen funcionamiento y crecimiento de las plantas. Las enzimas tienen pesos moleculares que oscilan entre 12. Objetivos: Poner de manifiesto la presencia de la enzima CATALASA en tejidos animales y vegetales. Una enzima completa se denomina holoenzima. Tienen un número de recambio alto. la catalasa hidroliza 5. por ej. 4º Muestran especificidad. NAD (nicotinamida adenina dinucleotido). El número de recambio o actividad molar. tripsina y quimotripsina. En términos generales los catalizadores se caracterizan por las siguientes propiedades: 1º Son eficaces en pequeñas cantidades. 2. Introducción Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica. biotina. un lípido -lipoproteínas.6 x 106 moléculas de H2 O2 por molécula de enzima por minuto. HOLOENZIMA = APOENZIMA + COENZIMA Entre los cofactores que requieren las enzimas para su funcionamiento están las coenzimas: NADPH+H (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido). ya que poseen un grupo no proteico o prostético. por lo que no podrá descomponer el agua oxigenada y no se observará ningún tipo de reacción cuando hagamos la experiencia anterior con muestras de tejidos hervidos. 5. Esta enzima actúa sobre el polisacárido Almidón. Mediante esta experiencia. Añadir 5 ml de agua oxigenada. La enzima descompone el peróxido de hidrogeno en agua y oxigeno.. La reacción de la Catalasa sobre el H2 O2. En esta primera experiencia vamos a demostrar su existencia: 1. Colocar en tubo de ensayo unos trocitos de hígado 2.Desnaturalización de la catalasa. Se observará un intenso burbujeo debido al desprendimiento de oxigeno. 4. Hervir durante unos minutos. .1... Al perder la estructura terciaria. (H2 O2). por lo que se soluciona el problema. hidrolizando el enlace o-glicosídico. vamos a ver una propiedad fundamental de las proteínas. 2 H2 O + O2 3. Ya que la catalasa químicamente es un proteína. Añadir 5 ml de agua oxigenada 3. La función de esta enzima en los tejidos es necesaria porque durante el metabolismo celular. colocar en un tubo de ensayo varios trocitos de hígado. vamos a ver la actividad de otra enzima. la AMILASA o ptialina. 2. 3. 2. se forma una molécula toxica que es el peróxido de hidrogeno o agua oxigenada. según el tejido con el que se realice la experiencia. por lo que el almidón se terminara por transformar en unidades de glucosa. Como muchas de las bacterias patógenas son anaerobias mueren con el desprendimiento de oxigeno que se produce cuando la catalasa de los tejidos actúa sobre el agua oxigenada. Puede ser interesante ir observando la mayor o menor actividad. 2. Es importante que recuerden las reacciones características de glúcidos para comprender esta experiencia. En el tubo 1 hacer reacción de Fehling. Añadir agua para hervir la muestra. Nota: Se debe repetir esta experiencia con diferentes tejidos animales y vegetales. Después de este tiempo. 1. Observar el resultado. se aprovecha para utilizar el agua oxigenada como desinfectante cuando se echa sobre una herida. que es la DESNATURALIZACION. retirar el agua sobrenadante. A los tubos 3 y 4 añadir una pequeña cantidad de saliva. Añadir a cada tubo 5 ml de una solución diluida de almidón 3. Poner en una gradilla 4 tubos de ensayo numerados del 1 al 4.Reconocimiento de la Catalasa La Catalasa es una enzima que se encuentra en las células de los tejidos animales y vegetales.Hidrólisis del Almidón. podemos desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. es la siguiente: 2 H2 O2 Catalasa REACCION: La existencia de la catalasa en los tejidos animales. presente en la saliva. Mediante esta experiencia. perderá también la función y como consecuencia su función catalítica. Procedimiento: 1. por eso la reacción de de Fehling es ahora positiva. .Tomar la muestra que se quiera analizar (normalmente una cantidad de 3 ml. Si el glúcido que se investiga es reductor. ahora nos da la reacción de polisacáridos negativa. Calentar el tubo al baño María o directamente en un mechero de Laboratorio. La reacción será positiva si la muestra se vuelve de color rojo-ladrillo. de color azul. se oxidará dando lugar a la reducción del sulfato de cobre (II). ya que el almidón se ha hidrolizado. de Fehling B. de color rojoanaranjado. 3. De forma similar. apareciendo la coloración azul violeta. 2. El almidón en contacto con unas gotas de Reactivo de Lugol (disolución de yodo y yoduro potásico) toma un color azul-violeta característico. ya que lo que intentamos es que la enzima de la saliva actué a 37 ºC. Poner en un tubo de ensayo unos 3 ml del glúcido a investigar. al que se le ha añadido saliva. Añadir 1 ml. 4. No es por tanto. Colocar los tubos precipitados al baño maría.Reacción de Fehling: . se puede interpretar el resultado del tubo 4. En el tubo 2 realicen la reacción de Lugol Reacción del Lugol: Este método se usa para identificar polisacáridos. 3. Añadir unas gotas de Lugol. una verdadera reacción química. Fundamento: La coloración producida por el Lugol se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molécula de almidón. controlando la temperatura del agua que no hierva. Mantener por 15 minutos.) 1. sino que se forma un compuesto de inclusión que modifica las propiedades físicas de esta molécula. o cambia a un tono azul-verdoso. Si la disolución del tubo de ensayo se torna de color azul-violeta. a óxido de cobre (I). Después de este tiempo realizar las siguientes reacciones: En el tubo 3 realice la reacción de Fehling En el tubo 4 realizar la prueba de Lugol El resultado positivo obtenido en el tubo 3 nos indica que la amilasa de la saliva ha hidrolizado el almidón transformándolo en glucosa. 1. la reacción es positiva. Los resultados son los esperados para un polisacárido como el almidón Los tubos 3 y 4 contienen el almidón. de Fehling A y 1 ml. Fundamento: Se basa en el carácter reductor de los monosacáridos y de la mayoría de los disacáridos (excepto la sacarosa). El líquido del tubo de ensayo adquirirá un fuerte color azul. La reacción será negativa si la muestra queda azul. 2. provocando su desnaturalización. 2. 1. Baño termorregulado y de agua hirviendo .0. Actividades Objetivo: Estudiar el efecto de las variaciones de pH y temperatura sobre la actividad de la amilasa salival.-REACTIVOS Y MATERIALES 1. Conozcan algunos procedimientos para determinar la actividad de una enzima en muestras biológicas. contribuyendo además a su regulación. pH 6. Comprueben el efecto que tiene en la actividad de una enzima las variaciones de pH y temperatura. Debido también a su naturaleza proteica la enzima presenta numerosos grupos ionizables. Las enzimas son activas en un rango estrecho de pH.03 M 4. filtrado y mantenido en hielo. factores que pueden alterar la estructura molecular de la enzima. los que derivan de los radicales de sus aminoácidos constituyentes. que presenta sólo enlaces α 1-4 y amilopectina (ramificada). Por tal motivo la actividad enzimática se mide en presencia de tampones o amortiguadores de pH.Laboratorio 7: “Efecto temperatura y pH sobre la actividad enzimática” 1. solución de almidón 1% p/v 5. afectando su actividad catalítica.0 3. 2. La hidrólisis del almidón por amilasa salival da como producto una mezcla de maltosa. pero en el caso de las reacciones catalizadas por enzimas.-OBJETIVOS Estas actividades prácticas tienen como objetivo que los alumnos. con enlaces α 1-4 y α 1-6 El almidón se reconoce químicamente por el color azul intenso que desarrolla en presencia de yodo. La amilasa salival es una enzima que rompe específicamente los enlaces glicosídicos α 1-4 de los polisacáridos. Tampón fosfato 0. Las alteraciones del pH pueden cambiar el grado de ionización de los grupos químicos involucrados en el sitio activo de la enzima. este efecto se observa sólo entre 0 y 40 ºC. maltotriosa (dextrinas) y glucosa. 3. 2.0 y pH 8. Preparación enzimática: Lavado bucal con agua destilada. ya que a temperaturas mayores la enzima se desnaturaliza debido a la ruptura de enlaces débiles. por lo que la hidrólisis enzimática del almidón se puede determinar por la pérdida del color azul de una mezcla de reacción. solución de Cloruro de sodio 0. pH 5. Debido a su naturaleza proteica las enzimas pueden modificar su actividad por cambios de temperatura y pH.-INTRODUCCIÓN Las enzimas son biocatalizadores proteicos esenciales para mantener los procesos metabólicos a velocidades compatibles con la vida.1 M. con una actividad máxima a un valor de pH denominado pH óptimo. pH 7. En general una reacción química aumenta su velocidad de reacción al aumentar la temperatura. El almidón es un polisacárido formado por 2 tipos de cadena: amilasa (lineal). principalmente puentes de hidrógeno y la pérdida de su conformación nativa.0. solución de lugol 6. cloruro de sodio Preparación enzimática Temperatura incubación Lugol (gotas) 1 2 ml 1 ml pH 5. Anote y discuta sus resultados. 1 ml buffer pH 7. mezcle y observe.Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa salival.0 y 2 ml de solución de almidón. Tubo Solución Almidón Tampón fosfato Sol.. Incluya un quinto tubo sin cloruro de sodio en la mezcla de Reacción a temperatura ambiente.0 al tubo 3 y 1 ml buffer pH 8. Anote y discuta sus resultados. 1 ml de la solución de cloruro de sodio. Al cabo de los 15 minutos agregue 1 gota de lugol.0 1 ml 2 ml TA 1 4 2 ml 1ml pH 8. Mezcle y deje incubando a temperatura ambiente por 15 minutos. Numere 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno 2 ml de preparación enzimática. Tubo Solución Almidón Tampón fosfato pH 7. mezcle y observe. Al cabo de ese tiempo agregue una gota de lugol.0 al tubo 4.0 1 ml 2 ml TA 1 2 2 ml 1 ml pH 6. el tubo 2 a 37ºC en un baño termorregulado. 1 ml buffer pH 6. cloruro de sodio Preparación enzimática Temperatura incubación Lugol (gotas) 1 2 ml 1 ml 1 ml 2 ml 0ºC 1 2 2 ml 1 ml 1 ml 2 ml 37ºC 1 3 2 ml 1 ml 1 ml 2 ml 100ºC 1 4 2 ml 1ml 1ml 2 ml TA 1 5 2 ml 1 ml 2 ml TA 1 B.0 al tubo 2 .0 al tubo 1.0 Sol. Posteriormente adicione 1 ml de tampón fosfato pH 5.. Numere 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno 2 ml de la preparación enzimática. Mezcle suavemente sin agitar e incube durante 15 minutos en las siguientes condiciones: tubo 1 a 0ºC (sobre hielo). 1 ml de solución de cloruro de sodio y 2 ml de solución de almidón.0 1 ml 2 ml TA 1 3 2 ml 1 ml pH 7. 1 ml de la solución tampón fosfato pH 7. el tubo 3 a 100ºC (baño maría) y el tubo 4 a temperatura ambiente.PROCEDIMIENTO A.0 1ml 2 ml TA 1 .Efecto de la Temperatura sobre la hidrólisis enzimática del almidón. Incube a 37 grados.Para verificar que la solución de glucosa es un azúcar reductor.. Levadura de panadero seca activa.Añadir 1 ml..Pipetear 0. hay presencia de azúcares reductores. En estos tres productos se emplea el mismo microorganismo que es la levadura común o Saccharomyces cerevisae...3 g (la punta de una espátula) de levadura con 10 ml de agua destilada. en el proceso denominado glucólisis. Efectúe una prueba de Benedict tomando 0. Los seres humanos han aprovechado este proceso para hacer pan. comienza después de que la glucosa entra en la célula. de Reactivo de Benedict. realizar un blanco de reacción (control) de la siguiente manera: Mezcle 0. de la solución problema en un tubo de ensayo 2.5 ml. realice una prueba de Benedict a la solución de glucosa. agregar 10 ml de la solución de glucosa y añadir 0.En un vaso de precipitado de 25 ml. y a la hora y media de incubación. La glucosa se degrada hasta ácido pirúvico. 3. Realizar la prueba de Benedict a esa mezcla a: los 30 min. La fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico realizado por las levaduras y algunas clases de bacterias. Agitar hasta que la mezcla sea homogénea. Si la muestra cambió de color azul a rojo ladrillo.5 ml de esta solución de levadura. cerveza. . y vino. La fermentación alcohólica. Nota: La prueba de Benedict se efectúa de la siguiente manera: 1.. Reactivos: Solución de glucosa (1 g en 100 ml) Reactivo de Benedict. Procedimiento 1. Este ácido pirúvico se convierte luego en CO2 y etanol. 2.Laboratorio 8: FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA POR LEVADURAS (Sacharomyces cereviceae) Fundamento: La glucosa es un carbohidrato fermentable por las levaduras..Para verificar que la levadura no contiene ningún azúcar reductor.Calentar en baño de agua hirviente durante 3 min..3 g (la punta de una espátula) de levadura. Estos microorganismos transforman la glucosa en alcohol etílico y dióxido de carbono. 3. trastornos de la nutrición y digestivos. El catabolismo de la glucosa se realiza durante la glicólisis. glucosuria (concentración de glucosa en orina). suprarrenales. Normalmente una glicemia en ayunas superior a 126 mg/dl es francamente sospechosa de diabetes Mellitus. hiperinsulismo.Algodón (tórulas) . tratamiento insulínico.Tiras reactivas para determinación Glucosa en sangre . afecciones nerviosas. pancreatitis aguda. como la Diabetes Mellitus. infarto miocardio.Alcohol 70% . glucagón. etc. tóxicos. encefalopatía. 2. afectando a una 5% de la población. Introducción: La glucosa es el principal monosacárido del organismo y constituye un metabolito que aporta energía vital para las funciones celulares. alcoholismo agudo. diabetes gestacional. 3. Su determinación en sangre es útil para el diagnóstico y monitoreo de trastornos en el metabolismo de los hidratos de carbono. Objetivo: Determinar la concentración de glucosa sanguínea (Glicemia) en una muestra de Sangre. Se utilizará un instrumento para la determinación enzimática de la concentración de glucosa en una muestra de Sangre Discuta los resultados obtenidos y realice un informe. tiroideas. pudiendo considerar el anexo proporcionado a continuación: ANEXO: METABOLISMO GLUCIDICO La glicemia normalmente se encuentra en el rango de 70 – 110 mg/dL. insulina. r La principal causa de hiperglicemia es la Diabetes Mellitus.Laboratorio 9: “Determinación de Glicemia” 1. . Cualquier alteración metabólica relacionada con la glicemia puede asociarse a la alteración de otros analitos como: hemoglobina glicosilada.Gluco tester . insuficiencia suprarrenal.Guantes desechables Actividades : Determinación de glicemia. Pueden encontrarse hiperglicemias severas (400 mg/dl). tumores de los islotes pancreáticos y otras patologías. proteinuria. afecciones hepáticas.Lancetas . infección aguda. hipotiroidismo. Sin embargo pueden existir otras causas de hiperglicemia. hipoglicemias. MATERIAL Y METODOS: . Causas de Hipoglicemia: Esfuerzos musculares agotadores. péptido C. una enfermedad endocrina altamente prevalente en nuestro país. Otras causas de Hiperglicemia: Hipofisiarias. albuminuria. INSULINA: Hormona producida por el páncreas que es esencial para la utilización de la glucosa por la célula. por lo tanto. Normalmente la excreción de proteínas por la orina puede alcanzar unos 200 mg/24 horas o 20 mg/dL. Las proteínas que en condiciones normales aparecen en la orina son: la proteína de Tamm-Horsfall (40-70 mg) y la albúmina (10-20 mg).2% a 8. La nefropatía en la diabetes insulino dependiente puede ser reconocida en sus fases iniciales a través de la pesquisa de la microalbuminuria. La proteinuria o concentración de proteínas en la orina es un buen indicador de la función del riñón.. La microalbuminuria es considerada como un marcador precoz de daño renal. En otras palabras es una forma indirecta de evaluar la glicemia promedio de los 2 a 3 meses previos Valores referencia: 6. MICROALBUMINURIA: La microalbuminuria se define como pequeñas cantidades de albúmina que son excretadas en la orina. PEPTIDO C: La insulina es una proteína que se secreta como una pro-hormona. conducen a la glicación no-enzimática de las proteínas.2% PROTEINURIA: Los pacientes diabéticos suelen presentar durante el curso de su patología. En el plasma sufre una hidrólisis que conduce a la hormona activa más un péptido denominado PÉPTIDO C. . Sobre 1000-2000 mg/24 hay que sospechar de insuficiencia renal avanzada.10 ng/mL 4. pero sobre todo una falta de respuesta de secreción de insulina frente a la ingesta de glucosa. Procedimiento: Se entregará con anticipación el protocolo del Kit a utilizar para este procedimiento. Valores normales: hasta 10 mg/L NOTA Emia: sufijo con el cual se denomina la concentración de un determinado analito en el suero o plasma Uria : sufijo con el cual se denomina la concentración de un determinado analito en la orina. el cual tiene una vida media biológica superior a la de la insulina. la insulinemia basal suele ser alta y luego de la administración de glucosa su aumento es tardío y alcanza cifras superiores a lo normal (250 μU/mL o más). que es un tipo de insuficiencia renal. En la diabetes juvenil se observa una disminución de insulina en ayunas. Una proteína susceptible a glicarse es la hemoglobina.2 ng/mL HEMOGLOBINA GLICOSILADA HbA1c: Los prolongados estados de hiperglicemia que presentan los pacientes diabéticos. aún en los enfermos tratados con insulina es un índice indirecto de la secreción de insulina endógena residual del paciente diabético. cifras superiores son consideradas como macroalbuminuria y se asocian a insuficiencia renal severa. Valores ayuno: Post-prandial: 2. la denominada Nefropatía diabética. Estos valores pueden ocurrir entre 30 a 300 mg/24hr. por sobre los niveles considerados normales. La determinación de este péptido es útil para determinar la actividad secretora de las células beta del páncreas. la Hipertensión Arterial es otra condición que puede conducir a microalbuminuria. En condiciones patológicas como la obesidad y en los diabéticos obesos adultos. cuya vida media es de 120 días. Esta hormona se encuentra en concentraciones normales en el plasma entre 2 –5 μU/mL. Rangos superiores a 20 mg/dl requieren exploración adicional y cifras superiores a 250 mg/24 requieren exploración uronefrológica. la glicación de la hemoglobina indica que el paciente no ha tenido un buen control de su glicemia durante los 120 días previos a la evaluación de este parámetro. . Además de la diabetes Mellitus. aislante térmico y regulador del metabolismo. Clasificación de lípidos Los lípidos pueden clasificarse de acuerdo a su estructura química.Mechero o baño maría .Gradilla . los que reciben el nombre de esenciales. Desde el punto de vista nutritivo. glicéridos se denominan lípidos hidrolizables y los que no presentan enlaces éster. Saponificación Es una reacción típica de los ácidos grasos.Cloroformo . denominados no hidrolizables en los que se encuentran los esteroles. de esta manera aquellos que reaccionan con disolución de NaOH al 40%. gasolina o acetona. Los lípidos se clasifican en dependencia de las reacciones químicas que experimentan . Objetivos: Identificar por métodos cualitativos las características de los lípidos. Además de la función energética cumplen otras funciones en el organismo: estructural.Aceite común . Las grasa y los aceites son insolubles en agua pero solubles en disolventes orgánicos como benceno. y los no esenciales son producidos por el metabolismo animal no necesitan ser ingeridos. encontrando en la naturaleza aquellos que realizan la función de reserva y lípidos citoplasmáticos (presentes en orgánulos celulares. Los lípidos hidrolizables. mitocondrias y membrana celular). 3.Tubos de ensayo . son producto del metabolismo. y los que no experimentan este tipo de reacción se consideran lípidos no saponificables.Tinta china roja . originando sales.Pipetas . se clasifican en: lípidos simples. terpenos y terpenoides. MATERIAL Y METODOS: .Varillas de vidrio . éter. se denominan lípidos saponificables.Laboratorio 10: “Reconocimiento de Lípidos” 1. compuestos. los lípidos no hidrolizables se clasifican en isoprenoides y esteroides. Los Lípidos se pueden clasificar en dependencia de las funciones que realiza en los organismos vivos. La formación de jabones favorece la solubilidad y la formación de micelas de ácidos grasos. 2. aquellos que presentan enlaces éster y pueden ser hidrolizados. en la cual reaccionan con álcalis o bases y dan lugar a una sal de ácido graso que se denomina jabón. esteroides.Solución de Sudán III . Los lípidos también se clasifican considerando si aportan ácidos grasos que no son sintetizados por los organismos animales.Solución de NaOH al 20% . constituyen una de las reservas energéticas más importantes de los seres vivos. Introducción: Los lípidos son un grupo heterogéneo de sustancias que se encuentran tanto en animales como en vegetales.Vasos de precipitados . La clasificación de los lípidos se puede hacer atendiendo al criterio de si producen o no esta reacción y así se habla de lípidos saponificables y no saponificables. tales como ceras. como el éter. que son en consecuencia las sales sódicas o potásicas de los ácidos grasos. etc. otra intermedia semisólida que es el jabón formado y una superior lipídica de aceite inalterado. Observe y anote sus resultados . Por el contrario. Éstos se combinan con los iones sodio o potasio del hidróxido para dar jabones. En los seres vivos. SOLUBILIDAD: Los lípidos son insolubles en agua. Añadir a uno de los tubos 4-5 gotas de solución alcohólica de Sudán III. Agitar enérgicamente y colocar el tubo al baño María de 20 a 30 minutos. mientras que en el tubo con tinta. Al otro tubo añadir 4-5 gotas de tinta roja. benceno. Procedimiento: Poner 2ml de aceite en dos tubos de ensayo. que es transitoria. cloroformo. por su menor densidad. Observar los resultados: en el tubo con Sudán III todo el aceite tiene que aparecer teñido. la hidrólisis de los triglicéridos se realiza mediante la acción de enzimas específicos (lipasas) que dan lugar a la formación de ácidos grasos y glicerina. en cambio no lo hace en el agua y el aceite subirá debido a su menor densidad. pues desaparece en reposo por reagrupación de las gotitas de grasa en una capa que. se pueden observar en el tubo 3 fases: una inferior clara que contiene la solución de sosa sobrante junto con la glicerina formada. Pasado este tiempo. se sitúa sobre el agua. ésta se irá al fondo y el aceite no estará teñido. Procedimiento: Disponer en una gradilla 2 tubos de ensayo colocando en ambos 2ml de aceite.SAPONIFICACIÓN : Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido sódico o potásico descomponiéndose en los dos elementos que las integran: glicerina y ácidos grasos. las grasas son solubles en disolventes orgánicos. Procedimiento: Colocar en un tubo de ensayo 2ml de aceite y 2ml de NaOH al 20%. TINCIÓN: Los lípidos se colorean selectivamente de rojo -anaranjado con el colorante Sudán III. Agitar ambos tubos y dejar reposar. acetona. Agitar fuertemente ambos tubos y dejar reposar. Añadir a uno de ellos 2ml de agua y al otro 2ml de cloroformo u otro disolvente orgánico. Observar los resultados: Se verá cómo el aceite se ha disuelto en el éter y. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en pequeñísimas gotas formando una emulsión de aspecto lechoso. Se estima que aproximadamente tres cuartos de colesterol se forman por neo síntesis y una cuarta parte proviene de la dieta. Introducción: El Perfil lipídico consta de la determinación de Colesterol Total. especialmente en combinación con triglicéridos elevados se asocian a un elevado riesgo cardiovascular. síntesis de ácidos biliares y síntesis de vitamina D. La determinación del perfil lipídico sirve para el screening del riesgo aterogénico de un determinado paciente. . un alcohol trivalente con tres ácidos grasos de cadena larga. triglicéridos y colesterolHDL. Una parte de ellos se ingiere por la dieta y se transporta a través de los quilomicrones (triglicéridos exógenos). los cuales son transportados a través de la VLDL (triglicéridos endógenos). Adicionalmente. para su posterior excreción por la vía biliar. El Colesterol es una molécula de naturaleza esteroidal con un grupo hidroxilo secundario en la posición C3. MATERIAL Y METODOS: . El hígado además sintetiza triglicéridos. Objetivos: Determinar colesterol en una muestra de sangre 2.Kit Para medición de Colesterol y LDL . Procedimiento: Se les entregará el Protocolo del Kit a utilizar con anticipación. Valores elevados de HDL protegen contra las cardiopatías coronarias. mientras que valores disminuidos de HDL. 3. una ruta esencialmente antiaterogénica. síntesis de hormonas esteroidales. con estos parámetros se puede calcular el colesterol de LDL. transporte reverso de colesterol. El colesterol de LDL o lipoproteína de baja densidad es proveniente del catabolismo de las VLDL (lipoproteína de muy baja densidad) y constituye una fuente de aporte de colesterol para ciertos requerimientos celulares como son: la síntesis de membranas. Este proceso de denomina.Laboratorio 11: “Determinación de Colesterol” 1. Los triglicéridos son ésteres de glicerol. Se sintetiza principalmente en el hígado y se absorbe aquel que proviene de la dieta.Guantes desechables 4. El colesterol de HDL o lipoproteínas de alta densidad representa el transporte de colesterol desde los tejidos periféricos hacia el hígado.Muestra de Suero . ya que se descubrieron en el núcleo de la célula. como las mitocondrias y los cloroplastos. biológico. Con el fin de eliminar en forma definitiva la actividad de las nucleasas. a excepción de las células anucleadas de los eritrocitos maduros en humanos. 3. constituye la porción prostética de los nucleoproteidos. las cadenas están unidas entre sí por las bases que la hacen en pares. uniéndose al ácido fosfórico. Introducción El ácido desoxirribonucleico (polímero de unidades menores denominados nucleótidos) junto con el ácido ribonucleico. que acompañan los procesos de purificación de las moléculas de ADN deben ser evitadas al máximo y las nucleasas inhibidas. son insolubles en agua y en soluciones de baja fuerza iónica pero solubles en soluciones de alta fuerza iónica. la unión de los nucleótidos entre sí en enlace diester nos da el polinucleótido. las etapas de remoción de las proteínas deben ser llevadas a cabo tan rápido como sea posible y en frío. Factores como los iones Ca2+ y Mg2+ son importantes para la actividad del las DNAasas . éste. Analizar sobre la importancia del conocimiento de la molécula de la vida en la medicina del futuro. El ADN es la base de la herencia. Muchos tejidos contienen alta actividad de desoxirribonucleasa (DNAasa) que rompe la macromolécula en pequeños fragmentos. Se trata de una molécula de gran peso molecular (macromolécula) que está constituida por tres sustancias distintas: ácido fosfórico. propiedad que debe ser tenida en cuenta durante los procesos de extracción inicial. . Las nucleoproteínas. la acción de las enzimas que digieren estas moléculas. para ser empleado en diferentes estudios de carácter genético. cuyo nombre tiene un contexto histórico. El estrés o tensión mecánica o físicoquímica. por este motivo no representa una fuente conveniente de extracción. de esta forma. La unión de la base nitrogenada (citosina. guanina o timina) con la pentosa (desoxirribosa) forma un nucleósido. contienen ADN en sus núcleos celulares. La cantidad de ADN presente en algunos tejidos es muy pequeño. 2. son proteínas que aparecen asociadas con los ácidos nucleicos de las células eucariotas. Después de extraído el ADN suele ser rápidamente desnaturalizado y por lo tanto se debe tener mucho cuidado en su remoción. Los apareamientos son siempre adenina-timina y citosina-guanina. aislamiento y purificación. Estructuralmente la molécula de ADN se presente en forma de dos cadenas helicoidales arrolladas alrededor de un mismo eje (imaginario). Para seleccionar un tejido como fuente de ADN debe reunir dos condiciones: contener gran cantidad de material genético y poseer baja actividad de DNAasa. También podemos encontrar ADN dentro de otros compartimentos celulares diferentes al núcleo. aislamiento y purificación con el fin de obtener un producto que conserve la identidad e integridad estructural con el ADN de la célula de la cual proviene. El tejido linfoide. adenina. Objetivos: Aislar ADN cromosómico de sangre periférica total de humano.El citrato de sodio presente en las soluciones empleadas para la extracción y purificación del ADN. EXTRACCIÓN DE ADN HUMANO : Todas las células.Laboratorio 12: “Aislamiento de ADN” 1. nos da un nucleótido. atrapa estos iones e impide. la relación adenina + timina / guanina + citosina es de valor constante para cada especie animal. Las bases nitrogenadas se hallan en relación molecular 1:1. en este caso el ácido desoxirribonucleico. y una base nitrogenada cíclica que puede ser púrica (adenina o citosina) o pirimidínica (timina o guanina). y en este caso el timo y el bazo representan materiales biológicos que son utilizados con mucha frecuencia como fuente de cantidades considerables de ADN para diferentes estudios. un monosacárido aldehídico del tipo pentosa (la desoxirribosa). y/o bioquímico. 5 ml Micropipetas de volumen variable Puntas para micropipetas Microcentrífuga Kit de extracción de DNA Procedimiento: Se les entregará en forma oportuna el procedimiento del KIT .4.-Materiales y métodos: Venoject con EDTA Aguja Venoject Capucha Venoject Liga Tubos Eppendorf de 1.