Genética Molecular

MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNASCapítulo 1 - O FLUXO DE INFORMAÇÃO VIA MOLDES Os Ácidos Nucléicos Toda a informação que uma célula necessita durante a sua vida e a de seus descendentes, está organizada em forma de código nas fitas dos ácidos nucléicos que constituem os armazenadores e transmissores de informação nos seres vivos. Esta informação traduzida em proteínas permite que a célula execute todo o trabalho necessário à sobrevivência do organismo. Existem dois tipos de ácidos nucléicos: ácido desoxirribonucléico ou DNA e ácido ribonucléico ou RNA. Ambos são polímeros lineares de nucleotídios conectados entre si via ligações covalentes denominadas ligações fosfodiéster. Os nucleotídios, unidades básicas dos ácidos nucléicos, são constituídos de: • • • Uma base nitrogenada (anel heterocíclico de átomos de carbono e nitrogênio); Uma pentose (açúcar com cinco carbonos); Um grupo fosfato. As bases nitrogenadas são de dois tipos: púricas e pirimídicas. • • Adenina (A) e Guanina (G) são purinas. Timina (T), Citosina (C) e Uracil (U) são pirimidinas. As purinas são constituídas de dois anéis fundidos de 5 e 6 átomos e as pirimidinas de um único anel de 6 átomos. Apenas quatro tipos diferentes de bases são encontrados em um dado polímero de ácido nucléico. No DNA as bases constituintes são A, G, C, e T enquanto no RNA são A, G, C e U. Uracil e Timina são moléculas bastante relacionadas, diferindo apenas pelo grupo metila encontrado no átomo C5 do anel pirimídico da Timina (Figura 1.1). Relação Oxigênio Dissolvido e Saturação de Oxigênio mg/L % 9 100 8 Figura 1. 1. Purinas e pirimidinas são bases nitrogenadas. Os números identificam a posição nos anéis 7 heterocíclicos (mais de uma espécie de átomo). É a presença 80 átomos de nitrogênio que dá a estas dos 6 60 moléculas seu caráter básico. 5 4 40 Dois tipos de pentoses são encontrados nos ácidos nucléicos: ribose e 2-desoxirribose (Figura Ago Out Fev Abr Ago 1.2). Diferem umaDez outra pela presença Jun ausência do grupo hidroxila no C 2' da pentose. É da ou 2002 Oxigênio Dissolvido 2003 Cristina M. Bonato Saturação de oxigênio 1 MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS baseado nesta característica que os ácidos nucléicos recebem o nome RNA (ribose) ou DNA (desoxirribose). A pentose é o elo de ligação entre a base e o grupo fosfato. De um lado, o Nitrogênio 9 das purinas ou o Nitrogênio 1 das pirimidinas liga-se ao C1' da pentose e, de outro lado, o grupo carboxila do átomo de C5' da pentose participa da ligação éster com o grupo fosfato. Figura 1. 2. Ribose e 2-desoxirribose. Os átomos de carbono são numerados como indicado. O grupo hidroxila está ausente no C2' da desoxirribose. É através do C1' que o açúcar conecta-se com a base nitrogenada. No DNA o açúcar é sempre uma desoxirribose e no RNA é sempre uma ribose. Mais de um grupo fosfato pode estar ligado à posição 5' do nucleotídio. As ligações de alta energia entre o primeiro (a) e o segundo (b) e entre o segundo (b) e o terceiro (g) grupos fosfato geram energia quando hidrolisadas. Os nucleosídios trifosfato 5' são precursores na síntese de ácidos nucléicos. Denomina-se nucleosídio à combinação da pentose com a base nitrogenada. Dependendo do número de fosfatos adicionados ao nucleosídio ele é denominado nucleosídio monofosfato, difosfato ou trifosfato. A nomenclatura dos monômeros dos ácidos nucléicos está descrita na Tabela 1.1. As diferenças entre RNA e DNA, todavia, não se restringem aos tipos de monômeros constituintes. Na maioria das vezes o DNA apresenta-se como uma longa hélice dupla com uma estrutura secundária regular e simples, enquanto os RNAs são, geralmente, moléculas de fita única bem menores que o DNA apresentando uma enorme diversidade de estruturas secundárias. Estas características estruturais estão relacionadas às funções destas duas macromoléculas na célula. Tabela 1. 1. Nomenclatura dos monômeros dos ácidos nucléicos Base Adenina Guanina Citosina Timina Uracil Nucleosídio adenosina guanosina citidina timidina uridina Nucleotídio ácido adenílico ácido guanílico ácido citidílico ácido timidílico ácido uridílico RNA AMP GMP CMP UMP DNA dAMP dGMP dCMP dTMP - A letra "d" é utilizada para indicar que o açúcar é a desoxirribose. A molécula de DNA é uma dupla hélice cujas cadeias estão unidas por pontes de hidrogênio estabelecidas entre purinas e pirimidinas complementares. Adenina sempre pareia com Timina (A = T) e Guanina com Citosina (G = C). O modelo de dupla hélice (Figura 1.3), proposto por Watson e Crick (1953a), pautava-se nas fotografias de difração de raio X das fibras de DNA feitas por Rosalind Franklin no laboratório de Maurice Wilkins (Cavendish Institute, Cambridge, UK)e nas razões entre as bases, descritas por Chargaff. 2 Cristina M. Bonato MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 1. 3. Modelo da dupla hélice de DNA. A orientação das duas fitas é antiparalela. As fitas são mantidas unidas por pontes de hidrogênio entre bases complementares as quais se posicionam perpendicularmente ao eixo açúcar-fosfato de cada fita. Interações hidrofóbicas e de van der Waals contribuem para a estabilidade da hélice. Uma volta da hélice é constituída de 10 nucleotídios (3,4 nm). Cada nucleotídio tem 0.34 nm ou 3,4 Angstrons (Å). A estabilidade e regularidade estrutural da molécula de DNA, deve-se principalmente ao fato dos anéis de desoxirribose não possuirem grupos hidroxila no C 2'. Os grupos hidroxila tanto do C2' como C3' são muito reativos e podem participar de uma série de ligações pouco usuais permitindo uma variedade enorme de conformações para a molécula de ácido nucléico. Tal variedade, não seria uma característica desejável para uma molécula que tem armazenado e transmitido a informação genética durante estes milhões de anos de evolução. O exercício de tal função exige estabilidade e regularidade. Já o RNA, constituído de riboses é, por isto mesmo, muito mais reativo e flexível. Além disto, o fato de ser fita simples permite um emparelhamento intramolecular de bases, gerando estruturas bastante complexas. Ao adquirir diferentes conformações numa estrutura tridimensional, as moléculas de RNA podem, inclusive, apresentar sítios ativos que catalisem reações químicas da mesma forma que as enzimas protéicas, nossas velhas conhecidas. As enzimas de RNA são denominadas ribozimas e apesar de exibirem função catalítica são menos versáteis que as enzimas protéicas, uma vez que possuem menos grupos funcionais. A existência de RNA catalítico foi demostrada por Thomas Cech (1984) quando estudava a remoção de introns nas moléculas precursoras de rRNA em Tetrahymena (um protozoário ciliado). É a grande flexibilidade dos RNAs que lhes permite executar uma atividade fundamental na célula, qual seja, a de interpretar o código contido na linguagem de nucleotídios e descodificá-lo para a linguagem de aminoácidos. A molécula de RNA é o intermediário no fluxo de informações dentro da célula, do DNA às proteínas. O Dogma Central e os Moldes Desde meados da década de 50 já se pensava na hipótese do DNA constituir-se num molde para a síntese de moléculas de RNA, as quais, por sua vez, devido a sua mobilidade e flexibilidade Cristina M. Bonato 3 Esta hipótese tem sido confirmada no decorrer de quase quatro décadas de pesquisa. salientando o fluxo unidirecional da informação: do DNA à proteína. poderiam servir de molde para a síntese de proteínas (tradução). ou seja. A e T ou A e U.4). para a síntese de moléculas de RNA (transcrição). purinas emparelham com pirimidinas (Figura 1. Um pouco antes disto. contudo. foi ampliada nos últimos anos com a descoberta. Baseado neste raciocínio. em 1970. Ficou. que é possível sintetizar DNA utilizando-se RNA como molde. Para compreender este fluxo utilizamos a idéia de moldes. Como funcionaria um molde? No caso dos ácidos nucléicos a complementaridade de bases permite facilmente a utilização de moldes. Por outro lado algumas destas moléculas de RNA.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS acoplar-se-iam aos ribossomos e dirigiriam a síntese de proteínas. por Baltimore. 4 Cristina M. Bonato . ao mesmo tempo. da enzima transcriptase reversa por Temin & Mizutani de um lado e. Estes novos conhecimentos permitiram que o dogma central se ampliasse sem. Sintetizando DNA A síntese "in vivo" de uma molécula de ácido nucléico depende sempre da existência de um molde complementar e de máquinas protéicas específicas que adicionem os monômeros ao polímero nascente. Isto foi possível graças ao isolamento da enzima replicase codificada por um vírus infeccioso cuja informação genética está contida numa molécula simples de RNA. que ocorre nos ribossomos. todavia. que denominamos RNA mensageiros (mRNA). ou seja. Esta complementaridade está baseada no fato de que é possível estabelecer pontes de hidrogênio entre G e C. Spiegelman & Haruna haviam demostrado que o RNA também podia servir de molde à síntese de outras moléculas de RNA. por volta de 1965. O DNA serviria de molde para a síntese de novas moléculas de DNA (duplicação) e. esclarecido. jamais as proteínas servem de molde à síntese de ácidos nucléicos ou de outras moléculas de proteína. de ácido nucléico para proteína. perder a unidirecionalidade. A proposta original. Nesta proposta. de outro. Francis Crick propôs em 1956 o dogma central da biologia. então. No momento da polimerização. cada nucleosídio trifosfatado é adicionado à cadeia nascente. Cristina M.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 1. or mould. a pair of templates. Either the template was supposed to copy itself directly or it was to produce a "negative". the complement of the other." . each of which is complementary to the other. and the two chains unwind and separate. Each chain then acts as a template for the formation onto itself of a new companion chain.. We imagine that prior to duplication the hydrogen bonds are broken. Moreover. because of the specific pairing. one could write down the exact order of the bases on the other one.. and it is this feature which suggests how the deoxyribonucleic acid molecule might duplicate itself. in effect. Previous discussions of self-duplication have usually involved the concept of a template. Now our model for deoxyribonucleic acid is. "If the actual order of the bases on one of the pairs of chains were given. so that eventually we shall have two pairs of chains. O pareamento entre bases complementares envolve a formação de duas pontes de hidrogênio entre A e T ou de três pontes de hidrogênio entre G e C. the sequence of the pairs of bases will have been duplicated exactly.5). 4. Thus one chain is. A energia armazenada no nucleosídio trifosfatado é utilizada pela polimerase para catalisar a reação que resulta na adição de um nucleosídio monofosfato à cadeia e conseqüente liberação de um pirofosfato que será posteriormente quebrado em íons fosfato por pirofosfatases (Figura 1. In no case has it been explained in detail how it would do this in terms of atoms and molecules. which in its turn was to act as a template and produce the original "positive" once again. A adição de cada nucleotídio é feita através do estabelecimento de uma ligação éster entre a hidroxila terminal 3' da pentose e o grupo fosfato do nucleotídio ingressante. a qual está pareada com a fita molde. as it were. where we only had one before. A noção de complementaridade está claramente expressa nos parágrafos abaixo retirados da publicação feita por Watson e Crick em 1953 logo após a proposta do modelo da dupla hélice: . Bonato 5 . via um grupo fosfato. desde que a enzima catalisadora seja uma DNA polimerase ou então. Estas enzimas são máquinas protéicas.6). Cada nucleotídio é adicionado utilizando-se a energia armazenada nas ligações fosfato dos nucleosídios trifosfatados. A nova molécula adicionada deixa sempre exposto um terminal 3'OH para receber o próximo nucleotídio. Sintetizando Proteína A síntese "in vivo" de uma cadeia polipeptídica também depende de um molde: a molécula de mRNA. Sempre que tivermos uma seqüência de desoxirribonucleotídios 5' ATCGAAG 3' como molde. Esta molécula é um RNA especial. Figura 1. ilustrada na Figura 1. As polimerases são específicas para desoxirribonucleotídios ou ribonucleotídios. na forma de pirofosfato (2 Pi). Em qualquer dos casos a adição de nucleotídios à cadeia nascente obedece a ordem da seqüência de nucleotídios na cadeia molde. 6. Bonato . com absoluta precisão. Assim. a posição 5' de uma pentose está conectada à posição 3' da próxima pentose. É importante salientar que tanto no caso da síntese de DNA como de RNA as cadeias nascentes e o molde correm em direções opostas ou anti-paralelas (Figura 1. cuja espinha dorsal são as moléculas de açúcar-fosfato. 5. será sintetizada. constituídas de várias subunidades que executam funções específicas durante os processos de polimerização. cresce no sentido 5' 3'. o RNA transcrito a partir de uma seqüência de DNA capaz de codificar uma proteína. A síntese depende da especificidade do emparelhamento das bases. Denomina-se RNA mensageiro (mRNA). O precursor da síntese é um núcleo-sídio trifosfatado que perde os fosfatos g e b. A cadeia molde e a cadeia nascente são antiparalelas. durante a durante a reação. Durante a síntese de DNA as enzimas envolvidas são DNA polimerases enquanto na síntese de RNA as enzimas envolvidas são RNA polimerases. a seqüência da fita complementar 5'CTTCGAT 3'. Para que o RNA sirva de molde para a síntese de proteínas. As bases nitrogenadas fixam-se perpendicularmente ao esqueleto açúcar-fosfato. A síntese dos ácidos nucléicos ocorre com a adição de nucleotídios ao terminal 3'-OH da cadeia nascente de sorte que a síntese é sempre no sentido 5' 3'.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 1. A cadeia. é necessário um descodificador ou molécula adaptadora capaz de "ler" o código genético. a fita 5' CUUCGAU 3' se a enzima catalisadora for uma RNA polimerase. Duplicação do DNA. o RNA transportador (tRNA) cuja cadeia polinucleotídica de 75 a 85 nucleotídios apresenta uma estrutura secundária peculiar na forma de trevo.7.É interessante notar que há 6 Cristina M. Cristina M. Figura 1. A ligação dos tRNAs ao seu aminoácido específico. 7.haste que termina numa seqüência. que ligam um aminoácido particular ao seu tRNA correspondente e a molécula de tRNA propriamente dita que se liga ao códon apropriado no mRNA. Figura 1. Todavia. A posição do anticódon e do braço aceptor de aminoácido estão indicadas. depende da ação das enzimas aminoaciltRNA sintetases que ativam cada aminoácido ligando-o corretamente ao tRNA específico (Figura 1. Alguns nucleotídios apresentam bases modificadas. O tRNA específico recebe a notação do aminoácido correspondente. As aminoacil tRNA sintetases também são moléculas adaptadoras. através de pareamento com o anti-códon. portanto. 20 tipos de aminoacil-tRNA sintetases. A enzima aminoacil-tRNA sintetase acopla um aminoácido particular ao seu tRNA correspondente. numa dada célula devem existir. Cada códon é uma trinca de nucleotídios que corresponde a um único tipo de aminoácido . 8. duas moléculas adaptadoras: as enzimas aminoacil-tRNA sintetases.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS um pareamento interno entre as bases desta fita simples formando hastes que sustentam alças onde se encontram as seqüências de nucleotídios não emparelhadas. • Braço do anti-códon . A trinca do mRNA é denominada códon e a do tRNA é denominada anti-códon. Estas estruturas de haste e haste/alças são os braços da molécula: • Braço aceptor . não emparelhada. B) Estrutura tridimensional determinada por difração de Raio X. contém uma trinca central de nucleotídios específica para cada tipo de tRNA a qual reconhece a trinca complementar no mRNA. Alguns códons não correspondem a nenhum aminoácido. via complementaridade de bases. no mínimo. reconhecerá o códon apropriado no mRNA. O "entendimento" do código genético requer.8). como o código é degenerado este número pode subir para 40 ou 50. O tRNA carregado dirige-se ao ribossomo onde. Do contato entre a enzima e o tRNA participam os braços do anti-códon e a haste D. A) Estrutura secundária de um tRNA.encontrado na posição oposta do braço aceptor. Estes são chamados códons de terminação O códon AUG especifica metionina que geralmente inicia a síntese protéica (veja aqui o Código Genético). Bonato 7 . A modificação das bases ocorre após a síntese do tRNA. Tal sistema de descodificação permite que um mRNA seja utilizado como molde para a síntese de um polipeptídio. Logo. CCA 3'OH na qual se ligará o aminoácido específico deste tRNA. Os ribossomos são partículas compostas de duas subunidades. Uma leitura cuidadosa desta mensagem será feita por tRNA sucessivos. de anti-códon CCC. Cada subunidade ribossômica é constituída de um conjunto específico de proteínas e de moléculas de RNA ribossômico (rRNA). Mecanismo de adição de um único aminoácido à cadeia nascente de polipeptídio durante a tradução do mRNA.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS O processo de síntese de polipeptídios usando como molde os mRNAs é denominado tradução e ocorre nos ribossomos em presença do mRNA. Os aminoácidos de 1 à 5 já fazem parte do polipeptídio. Figura 1. O sítio do ribossomo que recebe o tRNA carregado é denominado sítio A. transcrição e tradução. Bonato . O tRNA vazio. do inglês Small). 9. o sentido de síntese da cadeia polipeptídica é do terminal amino ao terminal carboxila colinear à leitura da mensagem a qual é sempre feita do terminal 5' para o terminal 3' da molécula de mRNA. a molécula de mRNA será utilizada como molde para a construção do polipeptídio nascente. O sítio onde se liga o tRNA carregando a cadeia polipeptídica (peptidil-tRNA) é denominado sítio P. A subunidade grande (L. dos tRNAs carregados e de uma série de outros fatores acessórios e enzimas específicas utilizando energia proveniente da hidrólise do GTP. tais como duplicação do DNA. Quando uma mensagem (mRNA) acopla-se à subunidade ribossômica pequena. A reação fundamental no processo de síntese protéica é a formação da ligação peptídica entre o grupo carboxila no final da cadeia nascente e o grupo amino livre de um aminoácido ingressante. está dado o passo inicial para a síntese da cadeia polipeptídica codificada no mRNA. são executados por máquinas protéicas especializadas que poderão ser estudados com mais detalhes nos capítulos específicos. Large) e a subunidade pequena (S. complementar ao códon GGG (aa4) está abandonando o ribossomo. GUIA DE ESTUDO Qual a característica do DNA que contribui para a enorme estabilidade e regularidade da molécula de DNA? 8 Cristina M. Aqui. juntamente com o tRNA iniciador (tRNAMet). do inglês. carregando os aminoácidos adequados (Figura 1.Logo. Todos os processos delineados acima.9). O aminoácido 6 carregado pelo seu respectivo tRNA está sendo adicionado. tRNA e rRNA. Bonato 9 . Compare as funções da transcriptase reversa.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Discuta o dogma central da biologia. Como a idéia de molde complementar se adequa à síntese dos ácidos nucléicos e à síntese de proteínas? Qual a função das aminoacil tRNA sintetases? Defina códon. Capítulo 2 – LEIS DA GENÉTICA As Leis de Mendel Cristina M. anti-códon. Aprenda a utilizar a tabela de Código Genético indicando a seqüência de aminoácidos correspondente ao mRNA abaixo: 5' AUG CUG AAU CAA CGC GGC GAC GCU UCU UAC CCC UUU UAG 3'. replicase e DNA polimerase. mRNA. Já a linhagem pura verde. Brünn. apresentava 7 características bem definidas: cor da flor (violeta ou branca). mitose e meiose. textura da semente (lisa ou rugosa). a comunidade científica da época não foi capaz de absorver suas idéias que se opunham à noção generalizada de que a herança resultava de uma mistura difusa de substâncias. ex. Em geral. forma da vagem (inflada ou com constrições). Linhagens puras produzem apenas um tipo de gameta. Para realizar suas análises Mendel estabeleceu linhagens puras para cada uma das características que havia escolhido. ou seja. foi cruzar plantas com características singulares distintas e observar a distribuição destas características nas gerações subseqüentes. responsáveis por variações contínuas como as observadas em relação à altura.. Bonato . Todavia. cor da semente (amarela ou verde). denominado a. cor da vagem (amarela ou verde). disposição das flores e vagens (axial ou terminal) e comprimento do caule (padrão ou anão). dentro do núcleo de células eucarióticas. os alelos se separam (segregam) um do outro. Ao conjunto de alelos que determinam tais aspectos fenotípicos. indicando que os traços hereditários em eucariotos deveriam fazer parte dos cromossomos. essencialmente. processo pelo qual são produzidas as células reprodutivas ou gametas (n). em 1866. As regras básicas de transmissão de informação genética de uma geração a outra haviam sido estabelecidas por Gregor Johann Mendel. os gametas produzidos possuem apenas um dos alelos para cada uma das características analisadas. O que Mendel fez. os quais eram herdados como unidades discretas.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Desde o início do século já se sabia que unidades funcionais discretas. Aos atributos observáveis de um organismo. Numa linhagem pura. Os traços hereditários podem ser definidos pela sua habilidade de passarem de uma geração a outra de maneira previsível. A nova forma mutada pode ser herdada e assim se estabelecer na população. denomina-se fenótipo. forma. Se apenas os fatores que determinam a cor verde estivessem presentes. a polinização da planta podia ser controlada. Após o término do processo. O comportamento dos cromossomos durante os estágios de divisão celular. pela Sociedade de História Natural de Brno (então. As formas alélicas surgem numa população em decorrência de alterações ocorridas nos genes. Áustria). mimetizava o comportamento destas unidades funcionais. o alelo mais frequente numa população é denominado selvagem e o alelo alterado é denominado mutante. Considere-se. a cor da semente. Escolheu para estudo a ervilha de jardim Pisum sativum porque era fácil de cultivar. Durante a meiose. 10 Cristina M. P. Mendel demonstrou que as diferentes características da ervilha eram controladas por fatores. Numa linhagem pura de sementes amarelas todos os gametas produzidos conterão o alelo que determina a cor amarela e que será denominado A. Postulava que. dois fatores estariam envolvidos. como cor. com as mesmas características originais. etc. produz uma progênie idêntica a si própria. Atualmente. por exemplo. Se apenas os fatores que determinam a cor amarela estivessem presentes. com a publicação do artigo "Experiments in Plant Hybridization". tamanho. num organismo diplóide (2n) como a ervilha. tinha ciclo de vida curto. só produzirá gametas contendo o alelo que determina a cor verde. as sementes da ervilha poderiam ser amarelas ou verdes. dependendo dos fatores presentes na planta e da interação entre eles. etc. responsáveis pela hereditariedade. estavam localizadas nos cromossomos. longevidade. em relação à característica cor. a semente seria amarela. estes fatores são denominados genes e as formas alternativas existentes numa população recebem o nome de alelos. a semente seria verde. denomina-se genótipo. para cada característica analisada. quando a planta é auto polinizada.. genótipo AA ou aa dizemos que o indivíduo em questão é homozigoto para aquele gene. genótipo Aa. não se expressava no híbrido. Figura 2.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Quando Mendel cruzou linhagens parentais puras (P) de sementes amarelas. Bonato 11 . o alelo verde foi considerado recessivo. Quando os dois alelos são idênticos. Portanto. isto é. dizemos que é heterozigoto. pois resultava da fusão dos gametas A e a (Figura 2. na geração F2. cada planta contem um par de genes governando um traço fenotípico particular. Testando a Lei de segregação Cristina M. através dos gametas. Segregação dos alelos. O fato de todos os indivíduos F1 serem amarelos indicava que o alelo amarelo era completamente dominante sobre o verde. como unidade individual. sendo cada alelo proveniente de um dos pais e transmitido de geração à geração. apresentava fenótipo amarelo e genótipo híbrido (Aa). produtoras de gametas tipo a. Os diferentes tipos de gametas da geração F1 irão se combinar aleatoriamente produzindo. AA : Aa : aa. denominada geração F1. Em função disto. com linhagens parentais puras de sementes verdes. na proporção 1:2:1. ou seja.1). na proporção 3:1 e 3 tipos de genótipos. uma vez que só era notado na ausência do outro. fenótipos amarelos e verdes. A lei da segregação dos alelos constitui o primeiro princípio de Mendel. 1. produtoras de gametas tipo A. Razões fenotípica e genotípica em F2. a primeira geração resultante. Quando os alelos são diferentes. Pela regra da segregação seria possível predizer as freqüências das classes fenotípicas resultantes. Para cada par de alelos. Assim. algumas vezes. As principais conclusões tiradas por Mendel relativas a cruzamentos monohíbridos foram: Para cada uma das características estudadas a ervilha contem dois determinantes hereditários (alelos). onde o organismo em questão é cruzado com um dos parentais. A união das células reprodutivas masculina e feminina é um processo aleatório que reúne os alelos em pares. A razão dominante:recessivo é 3:1. Duas plantas com o mesmo fenótipo podem diferir em seus genótipos. proposta por Mendel. Na formação dos gametas os alelos se separam de sorte que a probabilidade de se formar um gameta A é igual a de formar um a (1:1). 12 Cristina M. Este teste consiste em cruzar o organismo em questão com um homozigoto recessivo. Auto-fertilização de F2. Cada célula reprodutiva (gameta) contem somente um dos alelos de cada par (A ou a). Figura 2. produzindo a geração F3. os membros do par podem ser idênticos (AA ou aa) ou diferentes (Aa).MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS A forma mais simples de testar a hipótese de segregação dos fatores.3). 2. é proceder a uma auto-fertilização da geração F2. o cruzamento teste é um backcross. A Figura 2. Os híbridos da geração F1 só expressam a característica dominante. Neste cruzamento o fenótipo da progênie será determinado pelos alelos do parental que não seja o homozigoto recessivo (Figura 2. Na geração F2 a característica recessiva reaparece. Outra maneira de testar a hipótese de Mendel é efetuar o cruzamento teste (testcross). Bonato .2 esquematiza os cruzamentos e as proporções de cada geração e representa o ponto central da proposta de Mendel sobre o comportamento dos alelos. Outro teste é o do retrocruzamento (backcross). a progênie em F1 apresenta pétalas rosas. o fenótipo que se observa no heterozigoto é diferente do fenótipo dos parentais. Autocruzamento de F1 gera plantas com pétalas vermelhas. Cristina M. Nas plantas com flores vermelhas os dois alelos presentes são funcionais e codificam uma enzima que participa da via metabólica para produção do pigmento vermelho. Um exemplo é a cor das pétalas das flores de Mirabilis jalapa. etc. Em alguns casos. rosas e brancas na razão fenotípica 1:2:1 que corresponde à razão genotípica de 1:2:1 (Figura 2. resultando em pétalas brancas. diferente de uma condição tudo ou nada. 3. Figura 2. em geral é observada quando o traço analisado pode ser medido numa escala contínua. No heterozigoto apenas um alelo está funcional. altura. apresentando características intermediárias entre os homozigotos dominante e recessivo.4). Em F2 as proporções fenotípica e genotípica são idênticas: 1:2:1. como sementes lisas ou rugosas. Nas plantas com flores brancas ambos alelos estão mutados e não há produção de pigmento. Dominância incompleta. Quando linhagens puras de pétalas vermelhas são cruzadas com linhagens puras de pétalas brancas. Dominância parcial ou incompleta na herança da cor da pétala da flor em M. de sorte que é produzido metade do pigmento encontrado nas plantas de pétalas vermelhas o que resulta em plantas com pétalas rosas. quantidade de enzima produzida. 4. Bonato 13 . Quando os alelos comportam-se desta maneira diz-se que ocorre dominância parcial ou incompleta. jalapa. como por exemplo. peso. Cruzamento teste Dominância Parcial A dominância completa de um alelo sobre outro não é um fenômeno universal..MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 2. MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Codominância Um outro caso de ausência de dominância completa é o de codominância. mas codominantes entre si. incapaz de modificar o substrato. Este é o caso do grupo sangüíneo ABO no ser humano. Indivíduos tipo B produzirão anticorpos anti-A e. Na codominância. Em indivíduos do tipo O é produzida uma enzima não funcional. Nas transfusões de sangue é necessário considerar os antígenos e anticorpos para evitar que se agreguem. Neste caso. nos alelos IA ou IB (Figura 2. Tipos sangüíneos ABO Tipo Sangüíneo (correspondente ao tipo de antígeno) O A B AB Anticorpos (no soro) Anti-A e Anti-B Anti-B Anti-A nenhum IOIO IAIA ou IAIO IBIB ou IBIO IAIB Genótipo O sistema ABO é um sistema de múltiplos alelos. os dois tipos de modificação no substrato. pela ação das enzimas codificadas. As enzimas que provocam estas modificações são galoctosiltransferases específicas. respectivamente. nem de AB Indivíduos tipo O são doadores universais. não podem receber sangue nem de A. ou seja. e O. porque não possuem antígenos. produzem anticorpos contra A (anti-A). 1. Bonato . Indivíduos O.1). B. Muitos outros exemplos de múltiplo alelismo existem na natureza. nem de AB. Na superfície das células vermelhas do sangue (eritrócitos) são encontrados mucopolissacarídeos cujos açúcares terminais são modificados diferentemente em indivíduos A ou B. Na 14 Cristina M. portanto. Na população existem quatro tipos de fenótipos (A. de sorte que o alelo IO é recessivo aos alelos IA ou IB. não produzem anti-A nem anti-B. Indivíduos com sangue tipo A produzirão anticorpos anti-B e. os dois alelos são funcionais e expressam-se simultaneamente. B. Antígenos são substâncias estranhas ao organismo. que induzem o sistema imune à produzir anticorpos. produzidos por três alelos: A. não podem receber sangue nem de B. mas só podem receber sangue de indivíduos tipo O. Os anticorpos são proteínas que se ligam aos antígenos inativando-os e/ou destruindo as células que os apresentam. Os alelos IA e IB são dominantes sobre o alelo IO. como no exemplo de dominância parcial. Tabela 2.5). na população existem mais de dois tipos de alelos para o mesmo locus gênico. portanto. o fenótipo do heterozigoto não se encontra em algum ponto na faixa entre os dois fenótipos parentais. que produzem os dois tipos de antígenos. AB e O). As estruturas A ou B expostas na superfície dos eritrócitos funcionam como antígenos. Indivíduos tipo A produzem anticorpos contra indivíduos tipo B (anti-B) e indivíduos B. produzem anticorpos anti-A e anti-B. que não produzem nem antígeno A nem antígeno B. Indivíduos AB. Indivíduos AB só podem doar sangue para indivíduos AB mas são receptores universais (Tabela 2. o que caracteriza o fenômeno de codominância. Indivíduos do grupo sangüíneo AB produzem os dois tipos funcionais da enzima fazendo. portanto. Na Figura 2. Figura 2. O alelo IO codifica uma proteína não funcional. ex. portanto. l) das sementes na geração F2. a razão de cada uma é 1/16. O alelo IA codifica a enzima a-3-N-acetil-Dgalactosaminiltransferase que transfere acetilgalactosamina para a estrutura H. Na construção do quadrado de Punnett assume-se que os 4 tipos de gametas são produzidos por cada pai em quantidades iguais e. híbrida para duas características (diíbrida). Isto ocorre porque a segregação dos Cristina M. observa-se a distribuição 9:3:3:1 citada acima. no quadrado de Punnet. Neste caso a progênie F1. IB e IO. o alelismo múltiplo é a regra e não a exceção. cor (verde ou amarela) e forma das sementes (lisa ou rugosa). Segregando Dois ou Mais Genes Ao analisar o comportamento conjunto de duas características fenotípicas diferentes. a segregação dos pares de alelos que determinam cor (A.6 está esquematizada. Bonato 15 . Mendel observou que a segregação dos fatores que determinavam a cor era independente da segregação dos fatores que determinavam a forma (segregação independente).MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS verdade. cor e forma da semente em F2: 9:3:3:1. Quando Mendel auto fecundou F1 observou 4 tipos de fenótipos para as sementes nas seguintes proporções: 9/16 amarelo liso 3/16 verde liso 3/16 amarelo rugoso 1/16 verde rugoso Esta distribuição refletia a segregação independente de cada uma das duas características. Funções dos alelos IA.. Tais situações de múltiplos alelos na população são descritas como polimorfismo. 5. O alelo IB codifica a-3-Nacetil-D-galactosiltransferase que transfere galactose para a estrutura H. Como existem 16 categorias. p. amarelo indicando que liso era dominante sobre o rugoso e que amarelo era dominante sobre verde. a) e forma (L. de sorte que a estrutura H não é modificada. A combinação aleatória dos 4 tipos de gametas produzidos pela auto fecundação de F1 produzirá os zigotos da geração F2. apresentava o fenótipo liso. Ao se agrupar os descendentes por fenótipos. cada categoria de descendente é igualmente provável. pela cor verde e forma rugosa. as razões fenotípicas e genotípicas serão iguais (Tabela 2. Como os alelos de cada par se separam e os 3 genes são independentes. Caso não haja dominância. a cor amarela e a forma lisa. Figura 2. correspondendo. na geração F1. mostrando o cruzamento entre linhagens heterozigotas para duas características (diíbridas): cor e forma das sementes.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS alelos para estas duas características é independente uma da outra e existe dominância completa entre os alelos de um mesmo gene. As letras a e l referem-se aos alelos recessivos os quais.2). Um bom exercício é calcular quantos tipos de gametas seriam produzidos. Quadrado de Punnett da geração F2. gerando F1 Aa Bb Cc. 6. A lei de segregação independente dos alelos de diferentes genes é o segundo princípio de Mendel. para o caso de 3 genes com segregação independente. Testando a Lei de Segregação Independente Realizando-se o cruzamento teste AaLl x aall. Bonato . As letras A e L referemse aos alelos dominantes os quais determinam. ao se auto cruzarem podem produzir 64 (8 x 8) tipos de categorias entre os descendentes F2. serão produzidos 8 tipos de gametas F1 os quais. 2. respectivamente. podemos predizer que serão gerados quatro tipos de fenótipos na proporção 1:1:1:1. no caso de dominância completa. em homozigose são responsáveis. Tabela 2. Auto-fertilização multi híbrida (n = número de genes segregando 2 alelos cada) Monohíbrido Diíbrido Triíbrido Regra n=1 n=2 n=3 Geral N° de genótipos dos gametas F1 2 4 8 2n 16 Cristina M. respectivamente. Considere o cruzamento de AA BB CC com aa bb cc. a razão de cada categoria é 1/64 e o número de fenótipos diferentes na geração F2. será 8. Neste caso. justamente. à proporção 1:1 de uma par de alelos. multiplicada pela proporção 1:1 do outro par. MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Proporção de homozigotos recessivos em F2 N° de tipos fenotípicos em F2 sob dominância completa N° de tipos fenotípicos em F2 sob dominância incompleta 1/4 2 3 1/16 4 9 1/64 8 27 (1/2)2n 2n 3n Se bem que as regras que governam a transmissão de características de pais para filhos tenham sido definidas no trabalho de Mendel. um resultado bastante diferente de seu recíproco (Figura 2. Walter Sutton propõe a teoria cromossômica da herança sugerindo que os genes estavam localizados nos cromossomos. uma vez que somente entre os machos surgiram moscas de olho branco. Morgan verificou que todas as fêmeas da progênie tinham olho vermelho e todos os machos. Ao cruzar fêmeas selvagens (olho vermelho) com machos mutantes (olho branco). Retrocruzamento Cruzamento Recíproco Cristina M. Em 1903. foram recolocadas por Correns. Ao realizar o cruzamento recíproco. fez o retrocruzamento das fêmeas híbridas de F1 (olho vermelho) com os machos parentais (olho branco). De alguma forma esta característica estava ligada ao sexo. fêmea de olho branco x macho de olho vermelho. indicando que o fenótipo olho branco não era característico apenas dos machos. isto é. num momento em que o desenvolvimento do conhecimento celular permitia a aceitação de suas propostas. Na maioria da população o olho das moscas é vermelho e. o que demonstrava a recessividade do alelo para olho branco. na proporção 1:1:1:1.7). Olho branco é mutante. em 1900. Todas as fêmeas tinham olho vermelho. Nesta época os cromossomos já haviam sido descobertos e muito se aprendera acerca dos movimentos cromossômicos durante o processo de divisão celular. olho branco. Apareceram fêmeas de olho branco e vermelho assim como machos de olho branco e vermelho. Morgan observou que na geração F1 todos os indivíduos apresentavam o fenótipo selvagem. portanto este é considerado o traço selvagem. baseado na semelhança de comportamento entre a segregação dos alelos e a dos cromossomos durante a meiose. então. Morgan. Tschermak & de Vries. metade dos machos tinham olho vermelho e a outra metade olho branco. suas idéias só passaram a ser aceitas cerca de 30 anos mais tarde quando. Na geração F2. Os Genes Encontram-se nos Cromossomos Em 1910 Thomas Hunt Morgan demonstra que os genes encontram-se nos cromossomos ao analisar o padrão de herança do olho branco na mosca de frutas Drosophila melanogaster. Bonato 17 . Na Figura 2. Cruzamentos em Drosófila analisando a segregação do alelo para olho de cor branca. F2: todas as fêmeas tem fenótipo selvagem. uma única cópia do alelo recessivo determina o fenótipo. Com a cor do olho da Drosófila isto não aconteceu.8 está esquematizada a interpretação que Morgan deu ao padrão de herança do olho branco. que o alelo para a cor branca do olho deveria estar ligado ao cromossomo X. O cromossomo Y. 18 Xw Y X+ Y X+X+ x XwY X+ X+Xw X+Y X+ X+X+ X+Y XwXw x X+Y Xw X+Xw XwY X+ Cristina M. Os resultados indicavam que os alelos para cor do olho segregavam juntamente com o cromossomo sexual X e que o alelo vermelho era dominante sobre o alelo branco. Metade dos machos é selvagem. Indivíduos afetados não produzem a proteína coagulante fator VIII e após ferimentos leves. 7. fenômeno denominado pseudo dominância. A fêmea (XX) transmite o X para ambos os sexos. Cromossomos Sexuais Nos experimentos realizados por Mendel. As características analisadas por Mendel encontravam-se em autossomos. Nesta situação. Os cruzamentos recíprocos sempre davam o mesmo resultado. metade é mutante CRUZAMENTO RECÍPROCO F1: todas as fêmeas tem fenótipo selvagem conferido pelo alelo + localizado no cromossomo X do macho. uma vez que este cromossomo é transmitido num padrão diferente entre machos e fêmeas: o macho (XY) só transmite seu cromossomo X para as filhas. esta posição passou a ser denominada locus gênico. homólogo parcial de X. Genes que se encontram no cromossomo X são denominados genes ligados ao X. não podem ser considerados nem homozigotos nem heterozigotos para o locus em questão. então. Todos os machos tem fenótipo mutante conferido pelo alelo w localizados nos cromosssomos X da fêmea. sangram muito. não importava se o alelo mutante estava no macho ou na fêmea. Uma vez que os machos só possuem uma cópia do cromossomo X. Um exemplo humano de padrão de herança ligada ao X é a hemofilia A. Bonato X+ X+Xw X+Y Xw X+Xw XwY Xw X+Xw XwY Xw X+ Y . Morgan percebe. O termo hemizigoto é utilizado para genes ligados ao X nos machos. distinguindo-se dos outros pares de cromossomos denominados autossomos. uma desordem severa de coagulação do sangue determinada por um alelo recessivo.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 2. Os cromossomos X e Y constituem os cromossomos sexuais. CRUZAMENTO F1: todos os indivíduos tem fenótipo selvagem conferido pelo alelo + localizado no cromossomo X da fêmea. A partir do momento que se constatou que um gene ocupa uma posição no cromossomo. não teria um locus equivalente para a cor de olho. MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS F2: 50% das fêmeas tem fenótipo selvagem, 50% fenótipo mutante. 50% dos machos é selvagem, 50% é mutante Xw Y X+Xw X+Y XwXw XwY Figura 2. 8. Padrão de herança do olho branco em Drosophila. Ligação Se os genes estão linearmente localizados nos cromossomos, então os alelos de diferentes genes, dispostos num dado cromossomo, sempre segregariam juntos, constituindo um grupo de ligação. Assim, a segregação independente da forma e da cor das sementes analisadas por Mendel, informa que estes loci estavam localizados em diferentes cromossomos ou grupos de ligação. Os pares de cromossomos que contem os mesmos loci gênicos são denominados cromossomos homólogos. Regra geral: somente genes localizados em diferentes cromossomos apresentam segregação independente; genes localizados no mesmo cromossomo tendem a segregar juntos. Todavia, a ligação não é completa. Isto porque, durante a meiose, quando os cromossomos homólogos pareiam, podem trocar partes entre si (recombinação), mesmo que seja numa freqüência baixa. Este processo implica em quebra e reunião de segmentos do DNA com a participação de um conjunto de proteínas especializadas nos processos de recombinação. Quando ocorre esta troca de segmentos entre homólogos, os alelos aí localizados passam a apresentar uma independência relativa, o que resulta no surgimento de recombinantes. Quanto maior a distância entre dois loci, maior a probabilidade de ocorrer quebra e reunião e maior a freqüência de recombinantes na população. Sturtvent utilizou-se deste fenômeno para localizar a posição relativa dos genes nos 4 cromossomos de Drosophila, ou seja, para construir o mapa genético de Drosophila, demonstrando que os cromossomos são estruturas lineares não ramificadas. Atualmente, com a automatização do sequenciamento dos genomas, a posição dos genes nos cromossomos, determinada nesta época, tem sido geralmente confirmada. Apesar da posição dos genes nos cromossomos ser fixa, constituindo os grupos de ligação característicos de cada espécie, alguns elementos genéticos não possuem uma localização fixa, podendo mover-se de um local a outro genoma sem que isto implique em afetar a arquitetura dos cromossomos envolvidos. Quando estes elementos genéticos saltam de um ponto a outro, em geral, afetam o funcionamento dos genes no qual se inseriram, constituindo uma das causas importantes de variação entre genomas individuais. Este fenômeno foi inicialmente observado e analisado de 194251, por Barbara McClintock, ao realizar análises genéticas do milho. Tais seqüências móveis são denominadas elementos transponíveis ou transposons. Apesar dos grandes avanços ocorridos no início do século, a natureza química dos fatores hereditários ainda não estava definida. Seriam proteínas ou ácidos nucleicos? Durante muito tempo acreditou-se que as proteínas seriam as depositárias da informação genética transmitida de geração à geração, baseado no fato de serem moléculas bastante complexas e de haver um número quase ilimitado de combinações possíveis com os 20 diferentes aminoácidos. Somente em 1944 foi demonstrado cabalmente por Avery, MacLeod & McCarty, que o material genético era o ácido desoxirribonucleico. Ainda foi necessário esperar quase 10 anos para que a estrutura Cristina M. Bonato 19 MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS desta molécula fosse finalmente desvendada por Watson & Crick (1953), com a colaboração fundamental de Rosalin Franklin e Maurice Wilkins. Portanto, mais de 80 anos se passaram desde a proposição de Mendel sobre as regras da hereditariedade até o conhecimento da molécula depositária da informação genética nos seres vivos do Planeta Terra. Guia de Estudo Para desenvolver linhagens puras de plantas de ervilha altas, um estudante cruzou duas plantas altas. Todos os 200 descendentes deste cruzamento (F1) eram altos. Na geração F2, todos eram altos, também. O estudante então, cruzou duas plantas altas de F2 e produziu a geração F3 onde todos eram altos. Todavia, ao cruzar duas plantas altas de F3, produziu plantas anãs na geração F4. Isto não poderia ser encarado como mutação, porque uma proporção razoável da população era anã. Explique o que aconteceu e prediga que proporção da geração F4 era anã (de Zwicker, 1996). Defina dominância completa, parcial, pseudodominância e codominância. Mendel cruzou plantas altas de ervilha, com plantas anãs. A geração F1 era toda alta. Quando auto-cruzadas para produzirem a geração F2, obteve-se uma proporção de 3:1 (altas:anãs). Dê os genótipos, fenótipos e proporções relativas da geração F3 resultante do auto-cruzamento de F2 (de Tamarin, 1996). Defina grupo de ligação. A cegueira para cor vermelha-verde (daltonismo), em humanos, é causada por alelos recessivos ligados ao X. Uma mulher daltônica casa-se com um homem que tem visão normal para cores. Que proporção de seus filhos e filhas espera-se que seja daltônica? Uma mulher normal para visão de cores, cujo pai era daltônico, casa-se com um homem normal. Que proporção de seus filhos e filhas espera-se que seja daltônica? 20 Cristina M. Bonato MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Capítulo 3 – NATUREZA DO GENE O DNA é o Material Genético Trabalhando com Streptococcus pneumoniae, uma bactéria que causa pneumonia no ser humano mas é letal ao camundongos, Griffith mostrou, em 1928, que uma variante não patogênica da bactéria poderia transformar-se em patogênica desde que entrasse em contato com uma variante patogênica morta pelo calor. Portanto, as bactérias mortas liberavam algum fator no meio, capaz de transformar uma bactéria não patogênica em uma patogênica. Para demonstrar a transformação, Griffith utilizou duas linhagens de S. pneumoniae: uma patogênica que formava colônias lisas (S) em meio nutriente sólido e uma não patogênica que formava colônias rugosas (R). A linhagem S produz colônias lisas porque suas células são envolvidas por uma capa de polissacarídeo. Camundongos infectados com esta linhagem morrem. A linhagem R não tem efeito patogênico no camundongo porque suas células são rapidamente destruídas pelas células brancas do sangue, o mesmo não acontecendo com as células da linhagem S, protegidas pela capa de polissacarídeos. Quando células da linhagem S eram mortas pelo calor e depois inoculadas no camundongo, não causavam bacteremia (infecção bacteriana). Células vivas da linhagem R também não causavam bacteremia, pois esta linhagem não é patogênica. Porém, ao inocular no camundongo, células S mortas juntamente com células R vivas, os camundongos desenvolviam uma bacteremia idêntica àquela observada quando infectados com a linhagem S viva (Figura 3.1). Cristina M. Bonato 21 observaram a variação de morfologia das colônias (lisa ou rugosa) em placas de Petri. então. Para realizar este ensaio. Experimento de Griffith com linhagens patogênicas (S) e não patogênicas (R) de S. que a capacidade transformante das células S mortas seria perdida se o extrato fosse tratado com enzimas que destruíssem o DNA (DNases). testaram a capacidade transformante de cada uma delas separadamente (Figura 3. Figura 3. 1. 2. polissacarídeos e lipídios. 22 Cristina M. proteínas. pneumoniae inoculadas em camundongo. Dezesseis anos mais tarde. Os outros componentes celulares testados não transformaram células R em células S. Demonstraram. analisaram o fenômeno de transformação in vitro.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 3. ou seja.2). A seguir. Avery e colaboradores. Transformação de células R em S com moléculas de DNA isoladas de extrato de células S demonstrando que o DNA é o material genético. preparam um extrato de células S mortas e separaram as diferentes classes de moléculas existentes no extrato: DNA. RNA. Que componente da célula S morta teria sido responsável pela transformação ocorrida? O experimento de Griffith não respondeu esta questãomas demonstrou a possibilidade de transformação. sem inocular no camundongo e testaram a capacidade de diferentes macromoléculas transformarem células R em S. Bonato . os pesquisadores aproveitaram-se disto marcando radiativamente os componentes protéico ou nucléico e medindo a radiatividade intra e extra celular após infecção das bactérias Escherichia coli pelos fagos marcados (Figura 3. Experimento de Hershey & Chase usando bacteriófago T 2 marcado com 32P ou 35S. as novas partículas fágicas terão sua capa protéica marcada. também em vírus. lipídios ou RNA. ou seja não transformava mais células R em células S. Bactérias podem expressar genes típicos Cristina M. Figura 3. era o material genético. as novas partículas fágicas tem DNA marcado. Proteínas. então a marcação 35S é detectada praticamente apenas no meio extracelular. Ao infectarem E.3). e não as proteínas. demonstraram o papel do DNA na produção de novos fagos durante o processo infeccioso. Assim. como grande parte do 32P é incorporado nos ácidos nucleicos. Os extratos das células S mantinham sua capacidade transformante após tratamento com enzimas que degradavam proteínas. quando tratavam o extrato das células S com DNAses.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Estes testes demonstraram que os polissacarídeos não transformavam as células rugosas. constituindo-se basicamente de uma capa protéica envolvendo uma molécula de ácido nucléico. MacLeod e McCarty (1944) foi a primeira evidência experimental de que o DNA era o material genético: o DNA transformava células tipo R em células tipo S. Todavia. 3. Por outro lado. o fenômeno de transformação refere-se à alteração genética de uma célula provocada pela incorporação e expressão de DNA estranho à célula. apesar da capa de polissacarídeos estar envolvida na patogenicidade. polissacarídeos ou RNA. coli não marcada. Hershey & Chase (1952) trabalhando com o bacteriófago T2. o desenvolvimento científico e tecnológico tem permitido a incorporação e expressão de DNA estrangeiro em diferentes organismos. também não possuíam capacidade transformante. o DNA. (1944) ao demontrar que. o extrato bruto foi colocado em presença de enzimas degradativas. coli não marcadas. O trabalho de Avery. Posteriormente. o extrato perdia sua capacidade transformante. metionina). Atualmente. Uma vez que os fagos são estruturas muito simples. Somente o DNA induzia a transformação das células R. Este experimento apenas corroborou os dados iniciais de Avery et al. Quando estas partículas infectam bactérias E. a marcação 32P é encontrada intracelularmente e em uma fração das novas partículas fágicas recém montadas. Uma vez que grande parte do 35S será incorporado em proteínas (cisteína. lipídios. Desta forma foi possível deduzir que o DNA era o agente responsável pelo desenvolvimento da capa de polissacarídeos e pela patogenicidade a ela associada. Bonato 23 . uma vez que não mais apareciam colônias lisas. Como contra prova. Valendo-se disto. A B O RNA Como Material Genético Em alguns vírus.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS de eucariotos como os que codificam o fator VIII de coagulação do sangue ou a insulina e cuja produção em grande escala é de enorme interesse à medicina. ao lado de um camundongo não transgênico.5) demonstrando que o RNA e não a proteína era o material genético. Organismos transgênicos. Brinster e colaboradores. Os eucariotos (animais ou plantas) que incorporam DNA estrangeiro na linhagem germinativa são denominados transgênicos. Assim. Na Figura 3. Fraenkel-Conrat & Williams mostraram que os componentes protéicos e nucléicos do vírus podiam ser separados in vitro e a partícula reconstituída com os componentes trocados. o que leva a emissão de luz. A) camundongo transfectado com o gene para hormônio de crescimento de rato. Wood (1989) transfecta uma planta de fumo (tabaco) com o gene da luciferase de vaga-lume. a demonstração de que os ácidos nucléicos são os armazenadores da informação genética é facilmente verificada nos experimentos de transferência de genes de um para outro organismo. 4. um experimento realizado em 1982 por Palmiter. Figura 3. A luciferase catalisa a oxidação ATP-dependente de luciferina. Em 1955.4A. Quando as partículas reconstituídas infectavam uma planta. Quando células eucarióticas são transformadas o processo é denominado transfecção porque o termo transformação já era utilizado para significar crescimento canceroso. atualmente.4B. Fraenkel-Conrat & Singer (1957) reconstituíram partículas virais a partir de duas linhagens diferentes. Na Figura 3. Bonato . 24 Cristina M. B) planta de tabaco transfectada com o gene para luciferase de vagalume. o RNA é o material genético. Tanto o camundongo como a planta receberam DNA exógeno que se incorporou e se expressou provocando alteração fenotípica no organismo transgênico. mostra um camundongo transgênico que recebeu e expressou o gene que codifica hormônio de crescimento de rato. Tobacco Mosaic Virus) que infeta as plantas de fumo e é constituído de uma única molécula de RNA empacotada numa estrutura helicoidal formada por milhares de cópias de um único tipo de proteína. as novas partículas fágicas apresentavam a capa de proteína do tipo originalmente associado ao RNA (Figura 3. mesmo entre indivíduos tão díspares quanto uma planta de fumo e um vagalume ou uma bactéria e o ser humano. Se as plantas transfectadas forem aguadas com luciferina elas se tornam luminescentes. Este é o caso do vírus TMV (do inglês. Este tipo de doença. vírus do mosaico de tabaco. As evidências acima mostram que o DNA é o material genético e que. Os sintomas de cada tipo de doença dependem da região do cérebro que foi afetada. caracterizando-se pela alta resistência à temperaturas elevadas e à ação de proteases. recentemente referida como a doença da vaca louca. Transmissible Spongiform Encephalopaties). As doenças causadas por prion resultam em desordens degenerativas do sistema nervoso central. geralmente antecedida por pneumonia. A proteína infecciosa tem uma conformação diferente da proteína celular normal. é fatal. porém. um tipo de doença infecciosa cujo agente infeccioso é uma proteína. quase sem lâminas beta. em alguns vírus. predominantemente. dependem da existência de uma molécula de ácido nucléico. A morte das células nervosas infectadas dá ao cérebro a aparência de uma esponja. o RNA é o material genético. possivelmente. Além disto esta doença também apresenta caráter hereditário sendo transmitida de geração a geração como traço autossômico dominante. na superfície dos neurônios. fagos. Kuru e Síndrome de Alpers. é sensível à proteases e possivelmente. Síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS). Os prions afetam diferentes regiões do cérebro. fungos ou parasitas. daí o nome genérico da doença. com 30% de alfahélices. BSE (do inglês Bovine Spongiform Encephalopatie). A informação genética está codificada numa molécula de RNA. conhecidos como encefalopatias espongiformes transmissíveis TSE. demência. do inglês. sem participação de DNA ou RNA. Caracterizam-se pela perda de controle motor. Na estrutura da proteína infecciosa prevalecem lâminas beta (43%). A proteína infectiva.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 3. seja de bactérias. As TSE desenvolvem-se muito vagarosamente e podem surgir. encefalopatia espongiforme. via: Cristina M. Na estrutura da proteína normal prevalecem alfa-hélices (42%). encontra-se na forma de agregados no sistema endossomo-lisossomo. com formas diferentes de manifestação nos seres humanos e animais. 5. denominada PrPSc. a encefalopatia bovina espongiforme. Prion: Uma Partícula Protéica Infecciosa e Hereditária Todos os exemplos de infecção. o prion pode causar doenças como Creutzfeldt-Jakob (CJD). Em carneiros. é denominada Prion. A forma normal. Bonato 25 . ligada a uma âncora fosfolipídica glicoinositol. No ser humano. Existe. A partícula protéica infecciosa. TMV. está envolvida em funções sinápticas. paralisia e finalmente a morte. é encontrada. Insônia Familiar Fatal (FFI). o prion causa uma doença denominada scrapie e no gado. denominada PrPc. Prusiner. de ácido homogentísico. capaz de destruir ácidos nucleicos. da vaca para o homem ou do homem para o homem.7). ao estabelecer uma conexão entre genes e enzimas. Os Genes Governam a Expressão das Proteínas Como os genes controlam as características fenotípicas dos organismos? A primeira sugestão à respeito foi feita pelo médico Archibald Garrod (1909). a morte do indivíduo. do carneiro para a vaca. através da dieta ou procedimentos médicos. Garrod estudava uma desordem metabólica benigna denominada alkaptonúria que provoca artrite tardiamente no adulto mas que pode ser detectada desde o nascimento. Num estudo familiar demonstrou que esta desordem resultava de um traço recessivo herdado no padrão mendeliano e que a cor escura da urina decorria da alta concentração. Bonato . não destruía a infectividade do scrapie. pela cor escura da urina exposta ao ar. que escurece ao ser oxidado. juntamente com vários colaboradores. Transmissão vertical (hereditária): uma mutação no gene PrP é transmitida de pais para filhos. ao observar que a radiação ultra-violeta. pois a propagação da PrPSc depende da presença da PrPc. Em 1967 J. A idéia de que o agente infeccioso responsável por esta doença era uma proteína foi aventada pela primeira vez em 1966. Surgimento espontâneo: a proteína muda da conformação não infecciosa para a infecciosa. somente indivíduos que produzam a forma normal da proteína (PrPc) podem ser infectados. particularmente após ingestão de alimentos ricos em fenilalanina ou tirosina.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Transmissão horizontal: p. Griffith propôs que a infectividade do scrapie poderia ser resultante de uma conformação alterada da proteína normal. como um caráter autossômico dominante. S. acúmulo de ácido homogentísico (Figura 3. que recebeu o Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 1997 por sua contribuição no estudo das doenças provocadas por prions. Concluiu que os afetados não possuíam uma enzima capaz de metabolizar esta substância resultando em interrupção da via metabólica e.. As estruturas dos prions podem ser visualizadas nos sites indicados abaixo. Fenilalanina Fenilalanina Hidroxilase Tirosina Tirosina Aminotransferase Ácido Homogentísico Homogentisato desoxigenase Hidroxifenil Piruvato Hydroxifenilpiruvato Desoxigenase 26 Cristina M. A real função das formas normais desta proteína ainda não está totalmente esclarecida. As proteínas com conformação alterada agregam-se formando longos filamentos que se depositam em organelas citoplasmáticas provocando danos ao tecido nervoso e finalmente. por Tikvah Alper. nos indivíduos afetados. Estas idéias só foram desenvolvidas alguns anos mais tarde por Stanley Prusiner que se propôs. Portanto. S. sugeriu que a proteína infecciosa reconhecia a proteína normal e induzia uma modificação conformacional nesta proteína tornando-a também infecciosa. em seu trabalho sobre erros inatos do metabolismo. a explicar como uma proteína é capaz de transmitir uma doença quando ingerida. ex. conseqüentemente. Uma mutação em um dado gene interfere na produção de uma dada enzima. identificaram 3 loci gênicos localizados em cromossomos diferentes: arg-1. arg-3. Esporos selvagens de Neurospora podem crescer muito bem em um meio mínimo. Inicialmente. Na presença de citrulina. A deficiência na enzima provoca um bloqueio na via metabólica. existir correlação entre uma mutação e a ausência de uma atividade enzimática específica. para arginina. qual a deficiência destes mutantes. deve apresentar uma mutação na enzima que transforma um precurssor (ornitina ou citulina). Bonato 27 . Localizaram. Isto significa que as células de Neurospora possuem informação genética para sintetizar todos os aminoácidos. Como sabiam a estrutura da molécula de arginina. Cristina M. que convertesse uma molécula precursora em ornitina. três décadas após a publicação de Garrod. Como o mutante arg-3 não consegue sintetizar arginina na presença de nenhum dos dois precursores. Cada um destes passos é catalisado por enzimas específicas. Quando ornitina era colocada no meio. Mutantes que requerem a adição de um nutriente específico ao meio de crescimento são denominados auxotróficos e apresentam deficiência enzimática em algum passo da via biossintética daquela substância. os campos da Genética e da Bioquímica. A ausência da enzima homogentisato desoxigenase interrompe a via. Beadle & Tatum conseguiram isolar uma série de indivíduos que haviam perdido a capacidade de crescer em meio mínimo. O modelo proposto por Beadle e Tatum ficou conhecido como a hipótese um gene . Ornitina Citrulina Arginina arg-1 + + + arg-2 + + arg-3 + Isto indicava uma hierarquia de eventos.. O intenso trabalho destes pesquisadores utilizando mutantes para desvendar os passos das vias metabólicas de um organismo une. Analisaram. O bloqueio pode ser superado se suprirmos as células com o composto que seria formado se não ocorresse o bloqueio. ou seja. seria deficiente num passo anterior. então. naquele momento. Mostravam que os genes eram responsáveis pelas funções enzimáticas e que cada gene controlava uma enzima específica. através de cruzamentos entre os diversos mutantes obtidos. Tabela 3. vitaminas e tantas outras biomoléculas necessárias a sua sobrevivência. Utilizando o grupo de mutantes deficientes em arginina. mostram. trabalhando com esporos do fungo filamentoso Neurospora crassa.3). Ao tratar uma população selvagem de Neurospora com radiação X. citrulina ou arginina. Crescimento de mutantes arg em meio mínimo suplementado com ornitina. Já o mutante arg-2 que consegue sintetizar arginina na presença de citrulina. mas não de ornitina. novamente.uma enzima e lhes valeu o prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina. ex. em 1958. somente o mutante arg-1 crescia.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS CO2 + H2O Figura 3. de arginina para crescer. Via metabólica de degradação da fenilalanina. em arginina. ou seja. 3. complementando o meio mínimo com aminoácidos. tais como citrulina e ornitina. indica que a citrulina é o precursor imediato da arginina e tem uma deficiência no passo da via que converte ornitina em citrulina. desta forma. em um meio onde as únicas fontes de carbono e nitrogênio são glicose e amônia e que contem ainda alguns sais e ácidos orgânicos além da vitamina biotina. juntamente com Joshua Lederberg. George Beadle & Edward Tatum. arg-2. bases. 7. O mutante arg-1 capaz de sintetizar arginina em presença tanto de ornitina como citrulina. que haviam perdido a capacidade de sintetizar arginina. p. Em 1941. os mutantes arg-1 e arg-2 cresciam. podiam inferir que tipos de moléculas teriam sido seus precursores. Beadle & Tatum puderam deduzir qual a via metabólica para síntese de arginina. provocando acúmulo de ácido homogentísico que é excretado na urina. grupos de indivíduos que necessitavam. O mutante arg-3 só crescia na presença de arginina (Tabela 3. bases ou vitaminas. contendo cada uma das substâncias que poderiam fazer parte desta via metabólica (tabela abaixo). Como foi demonstrado que o RNA. um gene-uma enzima? Qual a função da luciferase? Como os prions estão relacionados com o Dogma Central da Biologia? Relate a evolução do conceito de gene. O sinal + indica crescimento e o sinal . Ela testou o crescimento de cada um dos tres mutantes em meios de cultivo diferentes. Em que posição da via se encontra cada uma das substâncias testadas? Substâncias Linhagem Selvagem Mutante 1 Mutante 2 Mutante 3 Fenilpiruvato + + + Prefenato + + Corismato + Fenilalanina + + + + 28 Cristina M. poderia ser o material genético? O que são prions? Como funcionam? O que são mutantes auxotróficos? Porque indivíduos com alkaptonúria apresentam a urina escura? O que significa a hipótese. a hipótese um gene . na medida em que restringia a definição de gene à de uma atividade enzimática.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Posteriormente. em alguns casos. Guia de Estudo Como foi demonstrado que o DNA é o material genético? Compare as conclusões tiradas a partir do experimento de Griffth com aquelas tiradas a partir do experimento de Avery et al. com o avanço do conhecimento acerca do que seriam os genes.uma enzima mostrou-se pouco abrangente. Uma geneticista estudando a via de síntese da fenilalanina em Neurospora isolou vários mutantes que requeriam fenilalanina para crescer.indica ausência de crescimento. Bonato . Atualmente podemos considerar o gene como qualquer segmento de DNA utilizado como molde para síntese de um RNA funcional. 1. à complementaridade de bases e a estrutura química de cada base. Com estas informações disponíveis. dos nucleotídios. as bases projetavam-se para o interior da hélice a partir dos esqueletos externos de açucar-fosfato (Figura 4. Figura 4. Difração de Raio X Cristina M. A proposta da dupla hélice baseava-se em tres pontos: Na natureza química dos componentes do DNA (desoxirribonucleotídios). confeccionados em arame. A dupla hélice. Cada volta completa da hélice engloba cerca de 10 nucleotídios. Nos dados de difração de Raio X coletados por Rosalind Franklin & Maurice Wilkins. O diâmetro constante de 20Å da dupla hélice é decorrente do emparelhamento de uma base púrica com uma pirimídica. Bonato 29 . com comprimento de 34 Å.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Capítulo 4 – ESTRUTURA DO DNA A Molécula de DNA Em 1953. púricas e pirimídicas. Nas relações entre as bases. estabelecidas por Erwin Chargaff.1). na tentativa de encontrar aquele que se adequasse aos dados de difração de Raio X. Watson & Crick construíram modelos moleculares. Em seu modêlo. Watson & Crick propuseram que a molécula de DNA era constituída de uma dupla hélice de cadeias polinucleotídicas antiparalelas interconectadas pela energia cooperativa de muitas pontes de hidrogênio que se estabeleciam entre bases complementares. 9 20. 2. As Razões de Chargaff Erwin Chargaff (1950) desenvolveu uma técnica para medir a quantidade de cada tipo de base presente no DNA de diferentes espécies. atualmente. quando um feixe de Raio-X atinge um cristal.1 19. Tabela 4.59 0. a quantidade de adenina era igual a de timina e a quantidade de guanina era igual a de citosina.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Para analisar a estrutura do DNA.2 18 35.5 34. Assim.9 18. Bases de DNA de diversas origens Organismo EcoliK12 Sreptococcus pneumoniae Mycobacterium tuberculosis Leveduras Homo sapiens Adenina Timina Guanina Citocina A+T/G+C 26 29. A imagem do padrão de espalhamento é fixada em um filme fotográfico impressionado pelos Raios-X. Figura 4. mas sempre.6 14. Imagem produzida por um feixe de Raio X atravessando um cristal de DNA (Franklin & Gosling.3 24. de sorte que a razão A+T/G+C era característica da espécie analisada (Tabela 4.1 31. 1. Wilkins.3 30.53 30 Cristina M. Em todos os organismos estudados verificava-se a razão 1:1 entre bases púricas e pirimídicas: A + G = T + C.3 23.5 25. espalha-se ordenadamente de acordo com um padrão que reflete a estrutura do cristal.9 1. Bonato . R. a quantidade relativa de cada par AT ou GC podia variar bastante de organismo para organismo. Na Figura 4. Seus dados mostraram que a quantidade relativa de um dado nucleotídio podia ser diferente entre as espécies. Todavia.79 1. denominadas Razões de Chargaff.0 1.6 32.8 15. Em um cristal as moléculas estão arranjadas ordenadamente. 1953).2. no laboratório de M. utilizava o método de difração de Raio-X.1).7 19. o padrão de espalhamento do feixe de Raio-X atravessando um cristal de DNA indica que: A molécula é uma hélice (padrão em cruz no centro) As bases (áreas escuras) dispõem-se perpendicularmente ao eixo principal da molécula. Estas relações entre as bases são.4 17.9 31. Franklin.9 30.42 1. 3).1 25.6 15. Duas purinas emparelhadas aumentariam o diâmetro enquanto duas pirimidinas emparelhadas diminuiriam o diâmetro da hélice. ou seja.8 24. corre no sentido 5' para 3' e a fita à direi-ta. quanto maior a quantidade de pares G-C (3 pontes). estão antiparalelas. Quanto maior for a quantidade de pontes de hidrogênio entre as duas hélices. Todavia. Figura 4.2 15. uma das extreminadades da fita tem um fosfato 5' e a outra tem um grupo hidroxila 3' (Figura 4. A polaridade é relativa à posição dos carbonos 3' e 5' da molécula de açúcar. A fita à esque-rda.3 2. Isto só seria possível se purinas sempre emparelhassem com pirimidinas. da mesma forma que Guanina e Citosina podiam estabelecer facilmente três pontes de hidrogênio entre si e estes eram os pares propostos por Chargaff. Polaridade das fitas do DNA. Bonato 31 . mantinha-se constante em toda sua extensão. fenômeno denominado desnaturação. Ou seja.18 1.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Methanococcus jannaschii Archaeoglobus fulgidus 34. 3. Cristina M.8 34.05 Hélices Antiparalelas Qual a estrutura possível? Os dados de difração mostravam que o diâmetro da hélice. À temperaturas mais elevadas. maior será a temperatura necessária para desnaturar a molécula de DNA. no sentido 3' para 5'. estas ligações se rompem e as hélices se separam. todavia. as bases púricas e pirimídicas dos pares A-T e G-C encaixam-se perfeitamente bem. uma grande quantidade delas é suficiente para manter as duas hélices unidas.5 24. Portanto. o estabelecimento das pontes de hidrogênio entre as bases complementares das duas hélices somente se adequou perfeitamente aos dados de difração quando o modelo foi construído com as hélices invertidas uma em relação a outra. Para isto é necessário considerar que as fitas de DNA tem polaridade. Adenina e Timina podiam estabelecer facilmente duas pontes de hidrogênio entre si.4 25. cerca de 20 Å. Apesar das pontes de hidrogênio serem individualmente muito fracas. maior a temperatura de desnaturação. Quando as duas fitas correm em sentidos opostos. micrometro 1. denominada forma Z do DNA. Além. disso. as fitas da dupla hélice podem se separar transitoriamente e depois. mas dinâmica. Outras conformações são possíveis. todavia isto nem sempre é verdade. Um par de desoxirribonucleotídios tem uma massa molecular média de 660 Da e uma espessura de 3.6 x 102 1. em condições fisiológicas. Tabela 4.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Formas e Tamanhos do DNA A estrutura do DNA descrita no tópico anterior é denominada forma B do DNA.66 x 10 5 # cromossomos haplóides pares de bases comprimento.6 x 103 5.6 x 104 0. Nem sempre a molécula de DNA encontra-se na forma padrão B. localmente.10 x 103 4. As moléculas de DNA são enormes. parece depender de grupos metila ligados às citosinas presentes nas repetições CpG e afetaria o padrão de expressão gênica de células eucarióticas.02 x 1011 4.6 x 103 5.2 mostra o número de pares de bases e o comprimento total do DNA de alguns organismos com diferentes níveis de complexidade.4 nm). uma nova conformação. em constante movimento. Mais de 20 variantes de hélices dextras já foram observadas. Compare peixe pulmonado com Homo sapiens.4 Å.65 x 108 2. em algumas regiões da molécula podem ser encontradas estruturas onde a hélice gira para a esquerda (sentido anti-horário). 2. Em certas regiões e em determinados momentos. poderíamos dizer que a quantidade haplóide de DNA varia com a complexidade. As bases estão dispostas quase que absolutamente perpendiculares ao eixo principal e cada giro completo da hélice corresponde a cerca de 10 bases numa extensão de 34 Å (3. Numa faixa ampla. voltar à conformação original ou adquirir. A Tabela 4.7 x 106 2.7 x 106 (~35m) 7. uma vez que a molécula não é uma estrutura estática. Esta forma. Nesta configuração as hélices enrolam-se para a direita (sentido horário). ocorre quando segmentos pequenos da molécula apresentam seqüências repetidas C-G. de virus à mamíferos.9 x 109 1.6 x 105 4.7 17 55 Modos de Duplicação 32 Cristina M. A estabilidade desta estrutura. Bonato .35 x 107 1.8 x 104 1.99 x 106 (~1m) 34. Tamanho de algumas moléculas de DNA Organismo Vírus SV40 Lambda T4 Bacteria Mycoplasma hominis Escherichia coli Eucarya Levedura Drosophila Homo sapiens Peixe pulmonado 16 04 23 19 1. seria utilizada como molde para construir a sua complementar. a outra poderia facilmente girar em torno dela aliviando a tensão da fita não quebrada. em 1958. b) a seqüência dos pares de nucleotídeos nos genes constituiria informação codificada a qual seria sequencialmente traduzida para a linguagem dos aminoácidos nas proteínas.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS O grande mérito do trabalho de Watson & Crick (1953) foi sugerir um mecanismo de cópia da molécula de DNA baseado na complementaridade de bases: "It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material" Ao decifrarem a estrutura demonstraram como a molécula se auto duplicava garantindo a manutenção e a transmissão da informação genética de geração à geração. 4. separadas. O problema era desenrolar as duas cadeias interconectadas da dupla hélice. conservativo e dispersivo. Bonato 33 . • Haveria quebras continuadas na espinha-dorsal de açúcar-fosfato e subseqüente reconstituição após duplicação que poderia resultar numa mistura entre segmentos velhos e novos na mesma fita (modo dispersivo).4): • As duas fitas se desenrolariam. Modos possíveis de replicação da dupla hélice: semi-conservativo. separadamente. num engenhoso experimento que permitiria distinguir um modo do outro pelo padrão de sedimentação das moléculas de DNA após ultracentrifugação em gradiente de clorento de césio. Três modos possíveis de duplicação da molécula foram considerados (Figura 4. serviriam de molde para a síntese da fita complementar. No ponto de quebra os terminais mantidos bastante próximos. Figura 4. propondo que: a) cada uma das fitas serviria de molde para a síntese de uma fita complementar. unir-se-iam novamente. sem rupturas do esqueleto açúcar-fosfato e cada uma delas. • Similar ao modo anterior. Watson e Crick salientaram ainda que o passo inicial da duplicação deveria ser o desenrolamento das duas hélices do DNA as quais. Ao final do processo existiriam dois pares de cadeias onde a seqüência de bases estaria exatamente duplicada. uma vez que a duplicação baseava-se no emparelhamento específico das bases. Cada par seria constituído de uma fita nova e uma velha. Se apenas uma das cadeias se quebrasse. de sorte que cada nova dupla seria constituída de uma fita velha e de uma nova (modo semi-conservativo). Em artigo posterior publicado ainda em 1953. Cristina M. Watson & Crick analisaram as implicações genéticas da estrutura do DNA. As fitas recém-duplicadas são vermelhas As hipóteses colocadas foram testadas por Mathew Meselson & Franklin Stahl. mas as fitas novas recém sintetizadas constituiriam a nova dupla e a dupla original se manteria como tal (modo conservativo). •A Levando-se em consideração as três hipóteses apresentadas. um gradiente deste sal permitiria que amostras de DNA com diferentes densidades se concentrassem na região do gradiente que correspondesse a sua própria densidade. repetiram-se os procedimentos 3 e 4. uma pesada a outra leve. No intervalo de tempo correspondente à 2a geração. O objetivo era distinguir as moléculas de DNA. 14NH4Cl e permitiram a duplicação de mais duas gerações. a duplicação fosse semiconservativa ou dispersiva. O DNA isolado foi ultracentrifugado (40. No intervalo de tempo correspondente à 1a geração. ultracentrifugação em gradiente de cloreto de césio.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS A Replicação é Semiconservativa Em 1958. ou seja. 4. Esperava-se o seguinte: amostra de DNA da 1a geração contendo tanto isótopo leve como isótopo pesado. Mathew Meselson & Franklin Stahl idealizaram um experimento para testar as hipóteses colocadas acerca dos modos possíveis de duplicação do DNA. Utilizaram como método.7) é correspondente a do DNA. Mas. • Após duas gerações.000 rotações por minuto)/20 horas. coli em um meio contendo o isótopo pesado de nitrogênio na forma de 15NH4Cl. Como a densidade do cloreto de césio (1. antes e depois da duplicação. se o processo de duplicação do DNA gera uma dupla hélice idêntica à original. Após várias gerações todas as moléculas sintetizadas naquela população da bactérias. Transferiram as células para um meio contendo apenas isótopo leve. • Se • Se 34 Cristina M. 3. qual seria a localização das bandas de DNA após o primeiro ciclo de duplicação. deveria sedimentar numa posição diferente daquela das moléculas contendo apenas isótopo leve ou apenas isótopo pesado. que permite separar moléculas com densidades levemente diferentes. após uma geração (Figura 4. a quantidade de moléculas com isótopo leve aumentaria. As bandas podem ser detectadas com luz ultra-violeta no comprimento de onda de 260nm. haveria uma única banda em posição intermediária entre a leve e a pesada. por diferenças de densidade entre elas. formando bandas em diferentes posições do tubo. quando deveria alcançar uma posição no tubo de centrífuga onde sua densidade correspondesse à da solução de CsCl. Bonato . tinham incorporado 15N. qual o truque utilizado para que moléculas de DNA de mesma origem tivessem densidades diferentes antes e depois da duplicação? 1. coletaram uma porção das células e extrariam o DNA. onde os ácidos nucléicos absorvem fortemente. Cultivaram células de E. haveriam duas bandas. 2.5)? a duplicação fosse conservativa. porém mais espessa. no tempo 0. uma intermediária e uma leve. Qual seria a localização das bandas após o segundo ciclo de duplicação? No modo conservativo de duplicação ainda seriam detectadas duas bandas. somente uma banda intermediária era visualizada no gradiente de cloreto de césio. • Os resultados obtidos por Meselson e Stahl mostraram que. encontrava-se uma banda leve e uma pesada. Cairns. 5. em conseqüência. mais espessa. As curvas mostram quantitativamente o montante de absorção da luz ultra-violeta através do tubo. Movimentação Bidirecional Em 1963. na 1a e na 2a geração. verificou fotograficamente o modo semi-conservativo de replicação do DNA em E. Distribuição de moléculas pesadas e leves e posicionamento das bandas em gradiente de cloreto de césio. A radioatividade estava no tritium (3H-timina). utilizando-se da técnica de autorradiografia e microscopia eletrônica. A interpretação da autorradiografia revelou alguns pontos interessantes (Figura 4.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS 15 14 NH4Cl NH4Cl 1o ciclo 2o ciclo Semi-Conservativo Leve Pesado Tempo 0 1a geração Conservativo Dispersivo 2a geração Topo Fundo Figura 4. Células da bactéria foram cultivadas em meio contendo timidina radioativa. • No modo dispersivo continuaria presente uma única banda intermediária. de acordo com os modelos semi-conservativo. o que confirmava a sugestão inicial feita por Watson & Crick.6): Cristina M. agora. Bonato 35 . o que eliminava o modo dispersivo de duplicação. após o 1o ciclo de duplicação. conservativo e dispersivo. descartaram imediatamente a hipótese do modo conservativo de duplicação do DNA. só que a banda leve estaria. J. desta forma que o modo de duplicação da molécula de DNA era semiconservativo. • No modo semi-conservativo surgiriam duas bandas de proporções equivalentes. O DNA foi extraído num tempo pouco superior ao de uma duplicação e tratado com emulsão fotográfica para observação ao microscópio eletrônico. No 2o ciclo. Demonstraram. coli. como indicavam as análises genéticas.DNA dupla fita - 36 Cristina M. qual a porcentagem de cada uma das bases nesta molécula? Qual a relação entre os fragmentos de Okazaki e o fato da DNA polimerase sintetizar DNA no sentido 5'  3'? Para cada uma das moléculas de ácido nucleico abaixo. coli era circular. processo que requeria cortes em uma das fitas para que se efetivasse o desenlace. Qual a composição de bases do DNA em questão? Se o conteúdo GC de uma molécula de DNA é 56%. Guia de Estudos Numa molécula de DNA fita simples.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS confirmou que a molécula de DNA em E. • mostrou. coli. e se é fita simples ou dupla. Molécula % A % G % T A B C D E 33 33 26 21 15 17 33 24 40 40 33 17 0 21 0 %C %U 17 17 24 18 30 0 0 26 0 15 Tipo Ácido Nucléico . Bonato . deduza se é DNA ou RNA. que as duas hélices recém sintetizadas e entrelaçadas são separadas. Modo semiconservativo. produzindo-se os garfos de replicação (junções Y). com crêscimento bidirecional. Estágios de duplicação do cromossomo circular da bactéria E. a quantidade de G é o dobro de A.5:1. até o ponto de término (TER) da replicação. bidirecionalmente. que se movem ao longo da fita. a quantidade de T é três vezes superior a de C e a razão pirimidinas/purinas é 1. 6. liberando as novas dúplex. finalmente. • Figura 4. • mostrou que as duas fitas da dupla hélice de DNA inicialmente se separam em uma posição denominada ponto de origem e as novas fitas começam a ser sintetizadas. Figuras inter-mediárias são as estruturas teta. • enquanto o DNA se replica a integridade do círculo é mantida e uma estrutura teta (Ø) intermediária é formada. MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS F 30 20 15 20 15 - Se a massa de um nucleotídio é ~330 Da. coli? O cromossomo de E. quais são as quantidades relativas de cada uma das quatro bases? Capítulo 5 – MÁQUINAS REPLICADORAS Cristina M. de quantos pares de base é constituída uma molécula de DNA dupla fita cuja massa é 8. A seguir estão as temperaturas de fusão (desnaturação) de 4 moléculas de DNA: 73 0 C.9 x 109 Da? Quantos cm tem esta molécula? Quantos cm teria uma molécula de 2. Bonato 37 . 0 Se a razão A/C = 1/3. Ordene estas moléculas de acordo com a quantidade crescente de pares G-C. coli contem 4.9 x 109 nucleotídios? Quantas voltas completas da dupla hélice devem ser desenroladas durante a replicação de um cromossomo de E. 690 C. 84 C 780 C e 820 C.7 x 106 pb. pol II e pol III. separadas. 38 Cristina M. Então. que recebeu o nome de DNA polimerase I ou pol I. O alongamento da cadeia com adição de desoxirribonucleotídios é feito pela DNA polimerase III e sempre ocorre no sentido 5’ 3’. As polimerases replicativas sintetizam uma nova fita de DNA utilizando uma fita complementar como molde. uma atividade de DNA polimerase. a cadeia sempre cresce no sentido 5’ 3’ (Figura 5.2). visualizada nas autorradiografias dos cromossomos replicantes de E.1). qual seria o mecanismo utilizado para replicar a fita complementar antiparalela? (Figura 5. As duas novas fitas sintetizadas acompanham o movimento do garfo de replicação que avança abrindo a dupla hélice. A dependência das DNA polimerases por um terminal 3’ OH para catalisar a síntese da nova fita colocava alguns problemas na compreensão do processo: Quem era o segmento iniciador (primer) e como era sintetizado? Se a enzima trabalha apenas no sentido 5’ 3’. durante a síntese? • Quais seriam os mecanismos utilizados pela célula para a execução destas tarefas? • • As evidências experimentais eram da: • • • Formação de uma bolha de replicação no ponto de origem de replicação. Assim.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Repicação Semidescontínua A síntese de uma nova fita de DNA depende da colaboração de diferentes polimerases que se enquadram em dois tipos básicos: as primases. Posteriormente foram identificadas mais dois tipos de DNA polimerases. o qual perpetuará o ataque nucleofílico sobre o a-fosfato dos nucleosídios trifosfatados ingressantes. coli? • Como era resolvida a questão topológica do desenlace da dupla hélice e da manutenção destas hélices. desde que haja um grupo 3’ OH livre de uma cadeia iniciadora (primer). Bonato . coli. Dependencia de um primer para iniciar a síntese pela DNA pol III. O segmento de primer é sintetizado pela primase. em E. Figura 5. 1992). que iniciam a cadeia e as polimerases replicativas. Há necessidade de um primer para a DNA polimerase sintetizar a fita complementar. que sintetizam a maior parte do DNA (Kornberg & Baker. 1. Arthur Kornberg (1957) identificou e purificou. como explicar a síntese simultânea da dupla antiparalela. a marcação radioativa foi detectada em moléculas maiores cujo tamanho e radioatividade incorporada. explicou a incompatibilidade aparente entre a replicação simultânea das duas fitas antiparalelas e o fato da DNA polimerase só adicionar nucleotídios no sentido 5’ 3’. produzindo pequenos fragmentos de DNA que crescem no sentido oposto ao garfo de replicação e que só serão unidos posteriormente. • Posteriormente. replica descontínuamente. ao mostrar que. em pequenos fragmentos. antiparalela. em direção oposta à do movimento do garfo de replicação. Okasaki propôs. após o pulso. Este tipo de replicação gera fragmentos de 1000 a 2000 nucleotídios. os fragmentos de Okasaki são covalentemente unidos por ação da enzima DNA ligase (Figura 5. em E. Como explicar a replicação simultânea das fitas antiparalelas observada por Cairns. enquanto uma fita replica continuamente. trabalhando com E. se a DNA polimerase só permite o crescimento da cadeia no sentido 5’ 3’ ? Fragmentos de Okasaki Em 1968 Reiji Okasaki. necessariamente.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 5. o modelo semi-descontínuo de replicação do DNA: A nova fita sintetizada que se estende no sentido 5’ 3’ em direção ao movimento do garfo de replicação. Baseado nestas observações. Bonato 39 . implicando numa replicação descontínua. hoje denominados fragmentos de Okasaki. coli. aumentava com o tempo de cultivo no meio não radioativo. acompanhando o sentido de abertura do garfo de replicação. Okasaki adicionou 3H (tritium) por 30 segundos (pulso radioativo) e imediatamente após extraiu e desnaturou o DNA. também é sintetizada no sentido 5’ 3’ mas. Garfo de replicação. denominada fita lenta (lagging). • A fita complementar. é denominada fita líder (leading) e cresce continuamente. coli. Grande parte do DNA fita simples radioativo sedimentou a 7S-11S (moléculas de 1000 a 2000 nucleotídios). a fita complementar. Quando. então.3) • Cristina M. • Os pequenos fragmentos só podem ser sintetizados após movimento do garfo sobre uma extensão razoável da hélice. Experimento realizado por Okasaki: Numa cultura de E. 2. coli. implicando sempre num atraso em relação à fita líder. Isto implicava que os fragmentos iniciais haviam sido unidos posteriormente. transferiu as células para um meio não radioativo (pulso e cassa) por 30 segundos adicionais. Replicação semidescontínua do DNA. arqueotos ou eucariotos. Isto pode parecer estranho num primeiro momento. preenchendo a lacuna resultante da remoção dos primers. de apenas 60kDa. respectivamente. B) Fragmento de Okasaki maior devido a união covalente entre eles catalisada pela DNA ligase. • Ligação dos segmentos de DNA adjacentes. o qual age no sentido 5' para 3'. coli poderiam sintetizar os primers de RNA: a RNA polimerase. Estas enzimas são capazes de iniciar a síntese de RNA estabelecendo uma ligação fosfodiéster entre dois ribonucleotídios livres. O terminal 5’ dos fragmentos de Okasaki é constituído de segmentos de RNA (de 2 a 12 nucleotídios). Primers e Primases Uma análise acurada dos fragmentos de Okasaki permitiu responder à questão do primer. As primases são responsáveis pela síntese dos primers nos fragmentos de Okasaki e não são inibidas por rifampicina. uma enzima monomérica muito menor. Bonato . um conhecido inibidor da RNA polimerase em bactérias. não dependem da existência de um primer. do início da replicação. Três polimerases estão presentes no garfo de replicação. A) Dois fragmentos de Okasaki na fita lagging. Um grupo de proteínas. que contêm uma pequena seqüência de ribonucleotídios seguida de uma seqüência mais extensa de desoxirribonucleotídios sintetizadas. pela primase e pela DNA pol III. possuem atividade exonucleolítica associada. pela DNA pol I. diferentes daquelas que participam da replicação propriamente dita. Convém salientar que todas as DNA polimerases seja em fagos. 3. Novo fragmento é sintetizado conforme o garfo se movimenta. A fita lider é sintetizada continuamente a partir do primer. A fita lagging é sintetizada descontinuamente produzindo fragmentos de Okasaki. mas tem lógica ao considerarmos que a atividade exonucleolítica permite a remoção da base que tenha sido erroneamente adicionada no momento da replicação. uma primase e duas DNA pol III. coli e 100200n em eucariotos). envolvida no processo de transcrição e a primase. produto do gene dnaG. • Síntese de DNA. pela DNA ligase. exercendo um papel 40 Cristina M.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 5. complementares à fita molde. é requerido para transformar os fragmentos de Okasaki numa fita contínua de DNA sem a presença dos primers (ribonucleotídios). Basicamente três passos são necessários neste processo: • Remoção dos primers por ação do domínio de exonuclease da própria DNA pol I. Fragmentos de Okasaki: curtos segmentos de ácido nucléico (1000-2000n em E. Portanto. ou seja. que são complementares à fita molde. bactérias. Duas enzimas de E. ao contrário das DNA polimerases. A adição dos primeiros nucleotídios. é um processo que está sujeito a mais erros do que o alongamento subseqüente. 1995). portanto. como tal. Construa uma dúplex circular e experimente fazer os giros. Enzimas denominadas topoisomerases controlam o estado conformacional de super hélice que é fundamental ao DNA no exercício de suas funções biológicas. para a fidelidade da replicação. uma das fitas.6 de Voegt & Voegt. Todavia. permitindo um desenlace contido da molécula e. Bonato 41 . um pouco à frente do Y de replicação. então será introduzido um super enrolamento positivo (positive supercoiling) e a molécula ficará mais firmemente fechada. induzindo alterações topológicas nas moléculas de DNA que podem culminar com a formação de super hélices (Figura 5. decisivamente. É possível que a utilização de primers de RNA diminua a taxa de erros na replicação do DNA. Se. introduzindo um super enrolamento negativo. tais como os cromossomos de alguns vírus e plasmídios.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS revisor do processo replicativo e contribuindo. as mesmas considerações feitas para estas moléculas são aplicáveis a qualquer região de uma molécula de DNA cujos terminais estejam impedidos de girar livremente. o que alivia a tensão. Origens de Replicação Cristina M. A DNA girase é um exemplo de topoisomerase. Porque os RNA seriam utilizados como primers. contribuindo para a separação das fitas e. Uma propriedade de dúplex circulares é que o número de voltas existentes na molécula não pode ser alterado a não ser que se corte. Corta as duas fitas da super hélice. pelo menos. e removido. sem um primer inicial. consequentemente. Um círculo relaxado não apresenta super hélices. as moléculas de DNA in vivo. ao religar os terminais livres. Se o fragmento inicial for RNA. Em geral. a molécula de DNA o fizer no mesmo sentido de giro das fitas na dúplex. cujas conformações variam de ausência de super hélices para uma estrutura altamente super helicoidal . Figura 5. dos que removem o primer. A re-síntese pela pol I será feita a partir de um primer de DNA (fragmento de Okasaki adjacente). na síntese do DNA? Esta é uma questão de interesse evolutivo. Os domínios de exonuclease com função revisora agem no sentido 3’ para 5’ diferindo. apresentam super enrolamento negativo. ao girar em torno de seu próprio eixo. então se introduzirá um super enrolamento negativo (negative supecoiling) e a molécula ficará mais solta. inverte o sentido do giro. A formação de super hélices é mais estudada em moléculas circulares pequenas de DNA. Super-Hélices Um problema que se coloca com o avanço do garfo de replicação é que a abertura das fitas provoca uma torção na dupla hélice. 6. Micrografia eletrônica de uma dúplex circular de DNA. será reconhecido posteriormente. Caso o sentido de giro da molécula seja oposto (para a esquerda) ao do giro das fitas. para a realização de processos biológicos tais como replicação e transcrição. Os grupos de 9 nucleotídios repetem-se 4 vezes e são denominados caixas de DnaA (DnaA boxes). 4. sempre no mesmo ponto do cromossomo. mas não é suficiente ao desencadeamento do processo replicativo (Baker & Bell. coli inicia-se num sítio específico do cromossomo. Figura 5. formando o complexo aberto. coli. Num cromossomo circular como o da bactéria E. uma vez que pares AT só estabelecem 2 pontes de hidrogênio entre si (Figura 5.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS A replicação em E. porque estas seqüências são reconhecidas pelas proteínas DnaA.000 a 100. denominado origem de replicação. Bonato . Esquema das origens de replicação em bactérias e eucatiotos e do sistema de replicação semidescontínua do DNA. encontram-se no polo oposto do círculo ao completar o processo. na medida em que possuem apenas uma origem de replicação. denominada oriC. As origens de replicação estão localizadas em seqüências específicas do DNA. Os longos cromossomos de eucariotos contem múltiplas origens de replicação. Os dois garfos em movimento. 1998). codificadas pelo gene dnaA. a partir de um dado ponto de origem. A ligação do complexo DnaA à oriC é pré-requisito. Em eucariotos cada cromossomo possui vários replicons. Utilizando a energia de hidrólise do ATP esta máquina protéica facilita o desenlace inicial da dupla hélice. de 9 e 13 nucleotídios. avançam em direções opostas até encontrar os garfos em movimento de origens vizinhas. As proteínas DnaA. 42 Cristina M. o que facilitará a abertura da bolha de replicação. formam um complexo multimérico de 10-20 subunidades de DnaAs que se liga à oriC. em série. A origem de replicação em E.4). Cada segmento de DNA que contem um ponto de origem é capaz de replicação autônoma e é denominado replicon. uma única origem de replicação é suficiente e os dois garfos de replicação. Os cromossomos bacterianos constituem um replicon.5). sendo definidas como o segmento de DNA que é necessário e suficiente para a replicação da molécula (Figura 5. onde se forma a bolha de replicação que se expande bidirecionalmente via garfos de replicação (Y) até encontrar o ponto de término. iniciadoras de replicação. em movimento. Os grupos de 13 nucleotídios estão repetidos 3 vezes e apresentam alta freqüência de pares AT.000 replicons. Estima-se que o genoma humano contenha 10. contem 245 pares de bases (pb) e apresenta seqüências repetidas. coli. Cristina M. sintetizadora do primer. B1. as quais. liga-se ao elemento A do ARS.coli. Para impedir o reanelamento. coli. Está formado o complexo de iniciação da replicação. as quais. o que facilita o carregamento da maquinaria de replicação e expõe as fitas complementares às polimerases aí instaladas. em E. Uma análise detalhada dos 180 pb da região ARS. movendo-se em direções opostas ao longo da dupla hélice. em presença de ATP. cerevisiae. As DnaB formam um complexo hexamérico que se liga à origem de replicação com ajuda de proteínas acompanhantes denominadas DnaC. constituído de 15 pb o qual foi denominado elemento A. Três outros segmentos.às custas da energia de hidrólise do ATP. duas DNA polimerase III acoplam-se ao complexo e iniciam o alongamento da cadeia. Tal abertura iniciada com o complexo DnaA expande-se por ação de helicases. a DNA pol III adiciona nucleotídios nas cadeias nascentes tanto da fita leading como lagging. Processo similar ocorre em eucariotos e arqueotos. O replissomo coordena a replicação nas junções Y. single-strand binding protein). abandonam o local. após a entrega do complexo DnaB. Bonato 43 . Estima-se que existam cerca de 400 origens de replicação distribuídas nos 16 cromossomos da levedura S. proteínas que reconhecem fita simples ligam-se a cada uma das hélices num processo concomitante ao da separação. Estas proteínas são denominadas SSB (do inglês. apresenta múltiplas origens de replicação denominadas ARS (do inglês. B2 e B3 são necessários para um funcionamento mais eficiente do ARS. as helicases que agem neste processo são denominadas DnaB e codificadas pelo gene dnaB. Esta maquinaria protéica instalada passo a passo no ponto de origem de replicação constitui o complexo pré-replicativo (Figura 5. análogo ao complexo DnaA de bactérias. origin-recognition complex). autonomously replicating sequence). para iniciar a replicação. Assim. dá-se o nome de replissomo. revelou a existência de um elemento essencial. O genoma de S.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Um passo crítico neste sentido é a separação das duas fitas de DNA. Origem de replicação em eucariotos: Um eucarioto bastante estudado e utilizado como modelo é a levedura Saccharomyces cerevisiae. cerevisiae. Ao complexo protéico primossomo + 2 DNA pol III. Um heterodímero de 6 subunidades denominado ORC (do inglês. Uma vez sintetizado o primer. Em E. O conjunto helicase/primase é denominado primossomo. uma na fita leading e outra na fita lagging.5). a primase. um eucarioto unicelular. Em seguida. é recrutada. rompem as pontes de hidrogênio entre as bases. movendo-se ao longo do DNA. As outras subunidades estão envolvidas na manutenção da enzima junto ao DNA forçando a enzima a adicionar nucleotídios em seqüência. y). enrosca-se em torno da dupla hélice recém-sintetizada movendo-se livremente ao longo do DNA. A abertura da bolha é garantida pelas SSBs. t. Figura 5. cada uma das subunidades predominantes está presente em duplicata e na sua conformação final expõe dois sítios catalíticos para a adição de nucleotídios. 5. A central enzimática. A subunidade t ajuda dimerizar a central enzimática. q. e (exonuclease) e q (função desconhecida). A ori-gem de replicação oriC é reconhecida pelo complexo multimérico DnaA ao qual se acoplam as helicases com ajuda das DnaC. A subunidade fundamental nesta função é a b. ao mesmo tempo que interage com a helicase e com a primase exercendo o papel de proteína andaime (scaffold) no replissomo.7). portanto. a qual. unidas por ligações fracas. A pol III é uma enzima dimérica. sendo composta de dez polipeptídios diferentes (a. como um anel. Bonato . Papel da subunidade β aumentando a processividade da DNA polimerase 44 Cristina M. sem se desprender da hélice. A replicação se inicia com a síntese do primer dirigida pela primase. primase e polimerase. d’. DNA Polimerases A enzima DNA polimerase III (pol III) é muito grande e complexa (~600kDa). carregando junto. g.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 5. c. Iniciação da replicação em E. b. na forma de um dímero. d. As subunidades. a central enzimática e garantindo a eficiência do processo (Figura 5. 7. constituída das subunidades a (polimerase). ao permitir a ação cooperativa das sub máquinas protéicas helicase. contem os sítios ativos para adição de nucleotídios e para revisão do processo de síntese. coli. e. constituem a holoenzima. está envolvida no reconhecimento e reparo de danos ao DNA.8). em E. alguns podem replicar pelo modo de círculo rolante.000 nucleotídios por minuto enquanto a pol I adiciona cerca de 600. menos estudada. Supõe-se que estas proteínas inibam as helicases impedindo. coli. Com esta inversão os terminais 3’ das cadeias nascentes leading e lagging ficam posicionados próximos aos sítios catalíticos das DNA polimerases permitindo a adição simultânea de desoxirribonucleotídios nas duas fitas. Modelo pro-porsto para a síntese com-comitante das fitas leading e lagging durante a replicação do DNA. com a participação das várias máquinas proteicas (polimerases. helicases e complexos aces-sórios) que cons-tituem o re-plissomo. a direção de crescimento da fita. no sentido de abertura do garfo. desta forma. exonucleases. Adicionam cerca de 30. Ao final da replicação do cromossomo circular de E. invertendo fisicamente porém. Cristina M. Sítios de terminação: Ao sítio de terminação (TER). 8. onde os desoxirribonucleotídios sejam adicionados ao mesmo tempo nas duas fitas (Figura 5. em eucariotos. É possível que a fita molde lagging dê uma volta em torno de um dos sítios catalíticos da pol III. que implica na estrutura q. além da forma bidirecional de replicação.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS A forma dimérica da pol III sugere um mecanismo de síntese das fitas leading e lagging. Cerca de 400 unidades de pol I são encontradas dentro da célula para cada 10-20 unidades de pol III. não bioquimicamente. Figura 5. Isto se reflete na quantidade de moléculas necessárias para os processos em questão. como encontrado no DNA das mitocondrias e dos cloroplastos. As DNA pol III trabalham numa velocidade superior à da pol I. A enzima pol II. coli são produzidos dois cromossomos filhos interconectados que serão separados pela ação de topoisomerases. Bonato 45 . ligam-se proteínas denominadas Tus. o avanço do garfo de replicação e provocando a parada da síntese. Modos Alternativos de Replicação em Cromossomos Circulares Nos DNA circulares. como encontrado em bacteriófagos e plasmídios ou pelo modo de alça D. O terminal livre 5’. contínua.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Na Figura 5. Durante a transferência o cromossomo replica-se pelo modo de círculo rolante. Figura 5. em posições diferentes do círculo. inicia-se a replicação da fita complementar em sentido oposto.9 está representado um esquema do círculo rolante na replicação do plasmídio F. A replicação se inicia em um ponto de origem. 10. uma para cada fita.10. que vai sendo deslocado com o avanço do replissomo. coli. Bonato . com a formação de uma alça (D loop) como esquematizado na Figura 5. As letras representam marcas genéticas no cromosssomo. será utilizado como molde para a síntese descontínua da fita complementar. 9. No processo de conjugação. 46 Cristina M. Figura 5. a replicação se inicia com um corte em uma das fitas. as informações genéticas contidas no plasmídio de uma célula. O deslocamento da outra fita da dúplex cria a alça D. O resultado são dois círculos duplicados. Ao final do processo uma endonuclease separa as dúplex. O DNA presente em cloroplastos e mitocôndrias. No modo de círculo rolante. Isto cria um modo de replicação diferente. de sorte que. será utilizado como primer para o replissomo que se moverá desenlaçando as duas fitas originais enquanto sintetiza uma fita nova. sintetizando apenas uma fita. Replicação de DNA mitocondrial no modelo de alça D. de E. O terminal 3’ que expõe um grupo OH livre. no sentido 5’ 3’. Este corte produz dois terminais distintos. durante a conjugação. apresenta duas origens de replicação. Círculo rolante. são transferidas para outra célula que não continha este plasmídio. Quando a fita recém sintetizada passa pelo ponto de origem da outra fita. ao final do processo as duas células carreguem o mesmo tipo de plasmídio. Figura 5. Tal estrutura. 11. portanto. típica de vertebrados. gera uma lacuna não preenchida. 1. 1998). Logo. 1999).11). uma enzima capaz de resolver este problema. coli e de cromossomos lineares como os de eucariotos e de algumas bactérias. 1998 A fita rica em nucleotídios G (fita G) estende-se em direção ao terminal 3'. Como superar este problema? Em 1978 Elizabeth Blackburn & J. a qual passou a ser denominada telomerase. não possui. durante a replicação pela DNA polimerase III as moléculas filhas perderiam esta projeção (Figura 5. As seqüências teloméricas encontradas em vários organismos (Tabela 5. é essencial para a estabilidade dos cromossomos e também importante na segregação dos mesmos durante a meiose (veja Price. A degradação do RNA primer no terminal. é a necessidade de um mecanismo especial para replicar os terminais do cromossomo. Isto poderia resultar em cromátides filhas progressivamente menores a cada ciclo de replicação pelo modo convencional. Replicar o terminal é complicado uma vez que a DNA polimerase requer um primer e somente pode alongar a fita a partir do terminal 3'. por ação da DNA polimerase III (Adaptado de Lingner & Cech. Gall (veja Blackburn.1) consistem de repetições em série de seqüências simples tais como 5'-TTAGGG-3'. Tabela 5. Cristina M.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Replicação dos Telômeros Uma diferença marcante na replicação de um cromossomo circular como o de E. o molde correspondente. A telomerase é uma enzima ribonucleoprotéica e age como uma transcriptase reversa para alongar o terminal 3' telomérico. Perda de nucleotídios nos terminais teloméricos no modo comvencional de replica-ção. projetando-se na forma de fita simples e. Bonato 47 . denominada telômero. 1990) descreveram a estrutura dos terminais cromossômicos do protozoário ciliado Tetrahymena. de Tetrahymena. Seqüências teloméricas repetidas em série Tetrahymena Trypanosoma Dictyostelium Neurospora 5' T2G4 3' 5' T2AG3 3' 5' AG1-8 3' 5' T2AG3 3' Caenoharbditis 5' T2AG2C 3' Bombyx Vertebrados 5' T2AG2 3' 5' T2AG3 3' 5' T3AG3 3' Saccharomyces 5' T1-6GTG2-3 3' Arabidopsis Fonte: Hartl & Jones. No final dos anos 80. que possui centenas de pequenos cromossomos lineares. Blakburn e colaboradores isolaram. a fita complementar é sintetizada via mecanismos usuais à síntese da fita lagging. Deve-se salientar a diferença entre as polimerases que atuam nas fitas leading e lagging. as polimerases envolvidas na síntese do DNA são as DNA polimerases a. uma vez que apresenta uma região complementar à projeção (RNA guia). tanto a pol a como a pol d atuam conforme o garfo se move sobre o cromossomo. 48 Cristina M. Em eucariotos. específicos de células de mamíferos. Uma molécula de RNA com ~160pb é parte integrante desta enzima e funciona como molde para a síntese das repetições teloméricas. a pol d é preponderante na síntese da fita leading e a pol a. agindo como uma cola entre eles e permitindo recombinação e segregação adequadas. as proteínas teloméricas também participam do alinhamento de cromossomos homólogos durante a meiose. A utilização de telomerases e repetições em série nos terminais teloméricos. Estudos mais detalhados da replicação em eucariotos foram feitos com o vírus SV40. retroposons. Os mecanismos são basicamente os mesmos dos encontrados em bactéria. apesar de amplamente utilizada não é universal. Figura 5. Provavelmente. Bonato . é preponderante na síntese da fita lagging. 12.12).MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS adicionando mais desoxirribonucleotídios na projeção da fita G. Em Drosófila. correspondentes às DNA polimerases I. fortemente associada à primase. Aparentemente. II e III de bactérias. Mas. b e d. Múltiplas proteínas ligam-se à região telomérica do DNA compactando o terminal telomérico num complexo DNA/proteína onde não se encontram nucleossomos. o telômero é composto de elementos transponíveis especializados. Com esta tática o cromossomo pode ser estendido até 10 kb (Figura 5. Ainda são encontradas as DNA polimerases g (mitocôndrias) e e. Após adicionar novas repetições a telomerase desliza sobre a dupla para adicionar mais desoxirribonucleotídios complementares ao segmento de RNA. por exemplo. As proteínas associadas ao terminal protegem a projeção de degradação e recrutam a telomerase. Aparentemente. Bactérias com cormossomos lineares também não utilizariam telomerases para a manutanção dos terminais cromossômicos. O RNA guia pareia com a seqüência complementar das repetições teloméricas e é utilizado como molde para o alongamento do telômero conforme a telomerase deslisa sobre o DNA. cuja transposição mantem os terminais cromossômicos. MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Guia de Estudos Progeria é uma desordem humana na qual os indivíduos afetados envelhecem prematuramente. Uma criança de 9 anos é semelhante, fisica e fisiologicamente, a um indivíduo de 60-70 anos. Você isolou o DNA de um paciente e, ao invés de encontrar longas moléculas de DNA como era esperado, encontrou grande quantidade de fragmentos pequenos de DNA. Que enzimas poderiam estar deficientes neste paciente? O que é uma nuclease? Qual a diferença entre exonucleases e endonucleases? Qual a função das helicases? Qual seria a conseqüência, para o organismo, de uma mutação com perda de função no gene que codifica a proteína DnaA? Explique. Qual a função das proteínas SSB? Dos dados constantes neste capítulo, quanto tempo leva para replicar o cromossomo de E. coli, a 37oC se dois garfos de replicação partem, bidirecionalmente, da origem? Em boas condições, as células de E. coli dividem-se a cada 20 minutos. Como isto é possível? Durante a replicação do cromossomo de E. coli, quantos fragmentos de Okasaki, aproximadamente, são formados? Qual poderia ser a conseqüência de uma mutação que diminuisse a atividade da enzima telomerase? Capítulo 6 – TRANSCRIÇÃO EM BACTÉRIAS Antecedentes Históricos Ao se desvendar a estrutura da molécula de DNA o princípio da replicação pôde ser visualizado sem dificuldades. Todavia, a forma com que as proteínas eram geradas a partir desta molécula informacional ainda constituía um mistério. Em 1954, o astrofísico George Gamow, tomando conhecimento dos trabalhos de Watson & Crick, sobre estrutura e replicação do DNA, propôs que os quatro tipos de bases dos desoxirribonucleotídios seqüencialmente dispostos na molécula de DNA constituiriam as letras de um código e que este código comandaria a seqüência dos aminoácidos nas proteínas. A questão inicial era descobrir como o sistema de 4 bases estava organizado para sinalizar aos 20 tipos de aminoácidos que participam das proteínas. De 1954 a 1966, intensas discussões e experimentações foram realizadas por todos aqueles que se interessavam pelo assunto, particularmente Crick, que já postulava a existência de uma molécula intermediária para estabelecer a complementaridade necessária entre as bases dos ácidos nucléicos e os aminoácidos das proteínas. Cristina M. Bonato 49 MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Finalmente, os trabalhos realizados por Nirenberg & Leder (1964) e por Khorana e colaboradores (1966), desvendaram por completo o código genético, estabelecendo que aminoácido correspondia a cada códon (cada uma das possíveis combinações das quatro bases, três a três). Este assunto é discutido em "Desvendando o Código da Vida". A Síntese de Proteínas Ocorre no Citoplasma Em 1954 Zamecnik & Keller mostraram que para haver síntese protéica in vitro, ou seja, num sistema livre de células, era necessária a presença dos seguintes componentes num tubo de ensaio: • aminoácidos, os quais eram marcados radioativamente (14C) para serem detectados nas proteínas, após precipitação das mesmas ao término do processo de síntese; • ATP, como gerador de energia; • retículo endoplasmático rugoso (RER), ou seja, retículo endoplasmático acoplado a ribossomos, local de síntese protéica. O RER é sedimenta no fundo do tubo após centrifugação do extrato bruto celular a 100.000xg; • sobrenadante de 100.000 x g, onde fora detectada atividade enzimática capaz de produzir aminoácidos ativados (aminoacil-AMP). Com isto ficava claro que a síntese protéica ocorria no citoplasma, na presença de ribossomos, estabelecendo-se uma relação entre rRNA e síntese protéica. Apesar de, neste momento, já estar claramente demonstrado que o material genético era o DNA, cuja estrutura também já era conhecida, os autores não fizeram qualquer conexão entre o processo de síntese protéica que ocorre no citoplasma e a molécula de DNA presente no núcleo. Em 1958 Hoagland e colaboradores detectaram um outro tipo de RNA no sobrenadante de 100.000 x g. Este RNA passou a ser denominado RNA solúvel, em contraposição ao rRNA que sedimentava com os ribossomos. O RNA solúvel era uma molécula pequena que se ligava covalentemente aos aminoácidos ativados. Atualmente o RNA solúvel é denominado RNA transportador (tRNA). Paulatinamente sedimentava-se a idéia de que o molde para a síntese de proteínas era RNA e não DNA, baseado em evidências tais como: • Existência de um tipo de RNA que transportava aminoácidos (tRNA); • Ocorrência de síntese protéica nos ribossomos localizados no citoplasma da célula eucariótica, portanto, separado do DNA, que se encontra no núcleo. De início imaginou-se que a informação contida no DNA era trazida do núcleo para o citoplasma via rRNA. Mas Davern & Meselson (1960), trabalhando com E. coli, demonstraram que as moléculas de rRNA eram muito estáveis mantendo-se íntegras após várias divisões celulares. Moléculas tão estáveis e pouco variáveis, não poderiam ser responsáveis pela rápida mudança nos níveis de síntese enzimática observada nas bactérias em resposta a diferentes estímulos. Particularmente importantes, para o compreensão do que estava acontecendo, foram os experimentos realizados no Instituto Pasteur por François Jacob, Jacques Monod e diversos colaboradores. 50 Cristina M. Bonato MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Caracterização de um RNA Instável Jacob & Monod estudavam a atividade de b-galactosidase em E. coli, cultivada em presença ou ausência de lactose. A b-galactosidase degrada lactose em glicose + galactose. Células de E. coli produzem cerca de 0,5 a 5 moléculas ativas da enzima, quando cultivadas na ausência de lactose. Ao adicionarem lactose ao meio observaram que: • A atividade de b-galactosidade, nas células, aumentava paulatina e drasticamente; • O aumento de atividade dependia de síntese protéica; • A síntese da enzima b-galactosidade era induzida ~1.000 vezes • A transferência das células para um meio sem lactose, mas com glicose como fonte de carbono, implicava em parada imediata da síntese de b-galactosidase (Figura 6.1). Dedução: uma variação tão grande e tão rápida não poderia depender de moléculas tão estáveis como os rRNAs, constituintes dos ribossomos. Num conjunto paralelo de experimentos o análogo 5-fluor-uracila foi adicionado à culturas de E. coli, que estavam produzindo b-galactosidase. Quando presente no meio este análogo é incorporado em lugar de uracil durante a síntese de RNA. Observou-se, então, que a atividade de bgalactosidase produzida a partir da incorporação do análogo, caía abruptamente. Quando as células retornavam a um meio sem 5-fluor-uracila, a atividade era recuperada (Bussard et al., 1960). Isto sugeria fortemente a existência de RNA não estável, que podia ser sintetizado e degradado rapidamente, o qual serviria de molde para a síntese da proteína. A dificuldade em se detectar tal RNA devia-se a sua alta labilidade. Figura 6. 1. Indução da síntese β-galactosidase na presença de lactose. de Já existiam, então, algumas evidências da existência de um RNA instável associado aos ribossomos. Hibridização Quando um DNA dupla fita é desnaturado pelo calor (90oC), suas hélices se separam devido ao rompimento das pontes de hidrogênio entre as bases. Se a solução contendo DNA desnaturado Cristina M. Bonato 51 1961). Bonato . Hibridização DNA/RNA-Após desnaturação da molécula de DNA uma das fitas pode hibridizar com a molécula complementar de RNA. o qual associava-se fracamente aos ribossomos. com bactérias e seus bacteriófagos. complementares entre si. definitivamente. Antes da infecção. Utilizando esta técnica Hall & Spiegelman (1961) demonstraram que o DNA agia como molde para a síntese de moléculas instáveis de RNA e que havia uma correlação entre o aumento de RNA instável e síntese protéica.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS for resfriada lentamente. era responsável por carregar a mensagem contida na molécula de DNA até os ribossomos. Isto implicava que as mesmas máquinas produtoras de proteína serviriam tanto para sintetizar proteína bacteriana como proteína fágica. até os ribossomos. que a espécie instável de RNA. parando a síntese de suas próprias proteínas. Ou seja. Os trabalhos acima e outros publicados entre 1957-1961. Ao isolarem o RNA instável. Após algum tempo uma grande quantidade de partículas fágicas é produzida e liberada com a lise da célula bacteriana. Finalmente estabelecia-se uma conexão entre genes e proteínas via uma molécula instável de RNA. apresentava as características desejáveis a uma molécula capaz de transferir a informação genética do DNA. coli após infecção com o fago T2. Figura 6. o RNA extraído da célula bacteriana hibridizava com o DNA bacteriano. Hall e Spiegelman estudavam os tipos de RNAs produzidos em E. O mRNA é o Intermediário Entre Genes e Ribossomos Em trabalho publicado em 1961 (Brenner et al) assumiu-se. cuja síntese e degradação podia ser perfeitamente regulada pela célula em resposta a suas necessidades (Leia Jacob & Monod. recém sintetizado. mostravam que um intermediário instável e heterogêneo em relação ao peso molecular. agora denominada RNA mensageiro (mRNA). 2. observaram que formava híbridos apenas com o DNA desnaturado de T2 mas não com o DNA desnaturado de E. os segmentos complementares conseguem "se encontrar". voltam a se anelar (hibridizar). A existência de complemetaridade RNA/DNA é uma forte indicação de que o DNA é molde para a síntese de moléculas de RNA. refazendo a dupla hélice. seja de bactéria ou fago. Quando o fago T2 infecta a bactéria. Como foram feitos estes experimentos? 52 Cristina M. esta passa a sintetizar uma série de proteínas típicas do fago. coli. as duas hélices. carregando seus respectivos aminoácidos. • As proteínas sintetizadas após a infecção. marcado radioativamente com 32P. necessariamente. Figura 6. identificadas pelo 35 S. não houve síntese nova de rRNA. ao mesmo tempo. as moléculas de tRNA. 3. Portanto. coli foram cultivadas em presença de 15N. estavam associadas à partícula ribossômica "pesadas". as proteínas do fago. sintetizada a partir do DNA do fago. Tais máquinas de tradução. os ribossomos "pesados" de E. os ribossomos produzidos continham 15N incorporado em suas moléculas (ribossomos pesados). ou seja. as proteínas recém-sintetizadas estariam marcadas radioativamente com 35S e os RNAs recémsintetizados estariam marcados radioativamente com 32P.coli: A partir de uma seqüência do DNA seria produzida uma fita complementar de RNA do tipo instável. as células foram infectadas com bacteriófago T4 e. após a infecção. coli associam-se. seriam capazes de traduzir qualquer texto que lhes fosse apresentado pelos RNAs instáveis. • A seguir. esta informação deve ter sido provida pela fração de mRNA. contendo a mensagem. Bonato 53 • . um RNA instável (mRNA). Após infecção fágica. produzidas antes da infecção. após infecção fágica. transitoriamente. • No momento da infecção as células bacterianas foram expostas a curtos pulsos radioativos de 32P ou 35S que marcam. • Do processo participariam.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS • Células de E. todas as moléculas produzidas incorporariam nitrogênio leve (14N).3): • Não se detectou partícula ribossômica leve radioativa. respectivamente. transferidas para um meio contendo 14N. à um tipo instável de RNA (32P) e à moléculas de peptídios (35S) Estas observações sugeriam fortemente que a proteína do fago era sintetizada a partir de mRNAs do fago. Uma vez que as informações para proteínas fágicas não poderiam residir em ribossomos bacterianos. Cristina M. Portanto. nos ribossomos bacterianos. poderia explicar as observações feitas com a síntese de b-galactosidase em E. associado às partículas ribossômicas "pesadas". Resultados obtidos após isolamento dos ribossomos e ultracentrifugação em gradiente de densidade (Figura 6. Logo: a partir da infecção fágica. complexos macromoleculares estáveis. que haviam sido produzidos antes da infecção. constituídas de rRNA e proteínas. • Esta molécula se dirigiria aos ribossomos. antes de serem liberadas na solução citoplasmática. ácidos nucléicos e proteínas. a qual se associava transitoriamente aos ribossomos A presença de um intermediário instável que utilizava o DNA como molde. onde ocorreria a síntese protéica. • Foi detectado. a partir de um molde de DNA. onde a molécula intermediária é nomeada mRNA: "Since it seems to be established that proteins are synthesized in the cytoplasm. No processo de transcrição. O valor S indica a velocidade de sedimentação de uma molécula numa ultracentrífuga. The rate of information transfer. or upon the activity of the messenger in sinthesizing the protein. Os três tipos de RNA. rather than directly at the genetic level. A síntese dos diferentes tipos de RNA. O local de síntese protéica é o ribossomo. tRNA e mRNA participam do processo de síntese protéica. uma vez que foram eles que estabeleceram os conceitos básicos de regulação coordenada de expressão gênica em E. Os tRNA carregam os aminoácidos específicos para cada códon. this transfer of structural information must involve a chemical intermediate synthesized by the genes. Figura 6. é um processo enzimático denominado Transcrição do DNA. haviam obtido sobre a ação dos genes e explicitam claramente o conceito de RNA mensageiro (mRNA). Este assunto será discutido no capítulo referente à regulação da expressão gênica em bactérias. Jacob & Monod analisam todos os resultados que. i. é reescrita em uma fita simples de RNA que apresenta uma seqüência de ribonucleotídios 54 Cristina M.4). rRNA. of protein synthesis. até então. This hypothetical intermediate we shall call the structural messenger. de sorte que a seqüência de bases no mRNA determina a seqüência dos aminoácidos no polipeptídio. a informação genética contida num segmento do DNA. may than depend either upon the activity of the gene in synthesizing the messenger. Os tipos de RNA que participam do processo de síntese protéica são: RNA mensageiro (mRNA).e. Bonato . 4. RNA transportador (tRNA) e RNA ribossômico (rRNA)(Figura 6. Tipos de RNA As células possuem muitos tipos diferentes de moléculas de RNA que executam trabalhos diversos." O trabalho realizado pelos pesquisadores do Instituto Pasteur teve uma amplitude maior do que a colocada no contexto deste capítulo. um extrato da introdução do artigo. Os mRNA contem a mensagem que será traduzida em proteína. A seguir. coli. usando as regras da complementaridade. um complexo ribonucleoprotéico onde rRNAs associam-se à proteínas específicas.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Em revisão publicada em 1961. 6. O sentido da transcrição está indicado pela flecha. estão apresentadas no Quadro 6. Diferentes genes codificam os tRNAs específicos para cada aminoácido. fita molde e RNA.106 0.. 5. As moléculas de mRNA. com substituição de T por U (Figura 6. por convenção. as percentagens das bases são: A=24. Os genes que codificam rRNAs são encontrados em múltiplas cópias no cromossomo. Em alguns sistemas a fita molde é também identificada como fita menos (-) e a fita codificadora como fita mais (+). G=32. Moléculas de RNA em E. Estruturas do RNA A molécula de RNA é fita simples. com a ajuda dos tRNAs.106 3. juntamente com os diferentes tipos de proteínas ribossômicas. coli. Também. transcritas a partir de diferentes regiões do DNA. U=22. As moléculas de rRNA estão envolvidas nos processos de atração de moléculas de mRNA para o ribossomo e de catálise na formação das ligações peptídicas. estão na forma de fita simples é dada pelo fato de não apresentarem as razões de Chargaff entre purinas e pirimidinas. quando se escreve um seqüência de nucleotídios correspondente a um gene.5).55.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS complementar a uma das fitas da dupla hélice de DNA (fita molde) e idêntica à seqüência da outra fita (fita codificadora).2. As características de cada um dos tipos predominantes de RNA. coli Tipo rRNA tRNA mRNA % RNA Total Coefic.4. 1. sempre é representada a fita codificadora.104 heterogêneo Cristina M. nos ribossomos. ex. em RNA isolado de E. P. Os diferentes tipos de rRNAs. Por convenção. S 80 15 5 23 16 5 4 PM 1. carregam a mensagem que será descodificada em polipeptídios. em geral. Os tRNAs "leem" a mensagem contida nos mRNA. Figura 6. a seqüência é sempre escrita no sentido 5'  3'. Assim. Isto implica que as moléculas de mRNA apresentam tamanhos bastante variáveis. arranjada em estruturas secundárias e terceárias. Fita codificadora. a cada códon. constituem o complexo macromolecular ribonucleoprotéico (máquina de tradução) denominado ribossomo.1.10 4 no nucleotídios 3700 1700 110 75 variável 2. onde ocorre a síntese protéica. em E. corresponde um único amino ácido carregado por um tRNA particular. ao mesmo tempo que carregam o aminoácido correspondente aquele códon. via pareamento de bases complementares (códon/anti-códon). Bonato 55 . Quadro 6. Sedim. C=22. A evidência de que as moléculas de RNA. coli. gerando domínios estruturais tipo haste/alça. grampos e pseudo-nó Neste sentido. até o terminador (Figura 6. o cromossomo inteiro é copiado. eventualmente. Tais conformações sofisticadas conferem à molécula de RNA a possibilidade de interagir especificamente com proteínas e outras moléculas e de apresentar. como uma enzima ou Ribozima. denominada promotor. são fundamentalmente diferentes em um aspecto: durante a replicação. A partir daí a RNA polimerase move-se ao longo do molde. que é o primeiro par de bases a ser transcrito em RNA. Portanto. grampos e outras estruturas secundárias. As interações entre tais estruturas resulta num dobramento tridimensional. 56 Cristina M. durante a transcrição. ou seja. sintetizando RNA. A transcrição de um segmento se inicia quando a RNA polimerase reconhece e liga-se a seqüências específicas de nucleotídios em uma região especial. o processo de transcrição deve ser bastante seletivo e as enzimas e proteínas reguladoras que dele participam devem ser capazes de distinguir sinais que demarquem as seqüências de interesse. até alcançar uma outra seqüência específica que sinaliza o término da transcrição. Transcrever regiões não-gênicas ou genes cujos produtos não são necessários num determinado momento. as moléculas de RNA assemelham-se à proteínas. no início do gene.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS O pareamento de bases entre segmentos complementares distantes da molécula de RNA permite contatos intramoleculares substanciais.6). onde começar e onde terminar a transcrição de um segmento. Bonato . com diferentes domínios estruturados que se conectam por regiões mais flexíveis.7). o promotor engloba o ponto de início. Apesar dos processos de transcrição e replicação do DNA apresentarem várias características em comum. Assim. A Unidade de Transcrição A síntese de qualquer dos tipos de molécula de RNA é catalisada pela enzima RNA polimerase. 6. Figura 6. produzindo-se fitas filhas idênticas às originais enquanto. a unidade de transcrição estende-se do ponto de início (+ 1) no promotor. seria uma perda de tempo e de energia. atividade catalítica agindo. portanto. apenas segmentos selecionados de uma das fitas do DNA são utilizados como molde resultando na transcrição apenas dos genes necessários em um determinado momento da vida do organismo. Estruturas secundárias e terceárias: alças. Além destas seqüências. criando estruturas terceárias como o pseudo-nó (Figura 6. Em princípio. Uma das evidências mais convincentes de que apenas uma das fitas do DNA é transcrita num determinado segmento. ao qual se atribui o valor +1. Após Cristina M. Se. qualquer uma das fitas da dupla hélice de DNA poderia ser utilizada como molde para sintetizar uma molécula de RNA. sendo possível separar as duas fitas em gradiente de CsCl. uma das fitas do DNA tem um percentual de purinas superior ao da outra. A unidade de transcrição é uma seqüência de DNA transcrita pela RNA polimerase. a partir do ponto de início. Figura 6. Evidências genéticas e bioquímicas indicam. A posição das bases é numerada nos dois sentidos. apenas uma das fitas do DNA é utilizada como molde para síntese de RNA. 8. Diz-se que as seqüências que antecedem o ponto de início localizam-se à montante (upstream) e as que o sucedem localizam-se à jusante (downstream). o que a torna mais densa.8). dois tipos diferentes de RNA seriam gerados. dentro de uma mesma unidade. é dada pelo bacteriófago SP8 ao infectar a bactéria Bacillus subtilis (Figura 6. que infecta E. A) No bacteriófago SP8. 7. Bonato 57 . as duas fitas fossem transcritas. qualquer das duas fitas pode ser utilizado como molde. Fita Molde Numa unidade de transcrição. No bacteriófago SP8. que para um dado segmento informacional do DNA (gene) só um dos dois tipos possíveis de moléculas de RNA é produzido. apenas uma das fitas do genoma é utilizada como molde. mas para um dado segmento apenas uma delas funciona como molde. todavia. B) No fago T4. coli. Os valores aumentam (valor positivo) à jusante e diminuem (valor negativo) à montante. com início no ponto +1 e término no sinal de terminação à jusante.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 6. qualquer uma das duas fitas pode ser transcrita. As seqüências de nucleotídios aí presentes.10). Bonato . apenas uma das fitas é utilizada como molde. executa diferentes funções: desenrola e enrola as fitas de DNA. a fita "superior" será utilizada como molde e a molécula de RNA produzida terá a mesma seqüência do segmento correspondente da fita "inferior". previamente separadas pela densidade. somente uma das fitas do DNA era utilizada como molde para transcrição dos genes do fago SP8. O posicionamento da RNA polimerase. Ao se hibridizar o RNA viral coletado da bactéria. No segmento A. No segmento B. sintetiza o RNA. a dupla fita de DNA à frente da bolha vai se abrindo enquanto. mantém as fitas molde e codificadoras separadas no local de síntese. Na Figura 6. Conforme a RNA polimerase avança ao longo da fita molde. que define qual das fitas será utilizada como molde.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS infecção da bactéria pelo fago. neste caso.9. o suficiente para dar estabilidade à reação de pareamento do nucleotídio específico. enquanto máquina protéica de transcrição. envolvida pela RNA polimerase. O emparelhamento DNA/RNA desfaz-se rapidamente com o avanço da bolha de transcrição. a fita "inferior" será utilizada como molde e a molécula de RNA produzida terá a mesma seqüência do segmento correspondente da "superior". este híbrido abarca 2 a 10 pares de bases. Figura 6. depende da configuração da região promotora. implicando que fitas complementares estão sendo utilizadas como molde. 9. observou-se que o RNA só hibridizava com a fita mais pesada. determinando o sentido da transcrição. com cada uma das duas fitas de DNA do fago. por sua vez. num dado segmento de DNA. determinam o acoplamento e posicionamento da holoenzima (veja Reconhecimento do promotor).em função do emparelhamento transitório entre o segmento de RNA nascente e a fita de DNA que serve como molde. 58 Cristina M. com cerca de 17 pares de bases. Híbridos DNA/RNA na Transcrição O início da transcrição exige o rompimento localizado de algumas pontes de hidrogênio entre as duas cadeias de DNA formando-se a bolha de transcrição. Não está ainda claramente definida qual a contribuição de cada uma das subunidades da RNA polimerase neste processo inicial (Figura 6. Em vírus maiores como o T4. Como é determinado qual das duas fitas será utilizada como molde? É o posicionamento da RNA polimerase holoenzima. demonstrando que. A RNA polimerase. Transcrição utilizando fitas diferentes como molde. Geralmente. a fita enrola-se novamente. a RNA polimerase caminha em sentidos opostos sobre os genes adjacentes A e B. Outros fagos pequenos apresentavam o mesmo comportamento. atrás da bolha. Na região da bolha ocorre a formação de híbridos DNA/RNA. só será sintetizado RNA viral. no segmento de DNA a ser transcrito. mas. um análogo de adenosina que perdeu o oxigênio no C3. não existe um oxigênio reativo no C3. RNA Polimerases No processo de transcrição as RNA polimerases catalisam a formação de ligações fosfodiéster entre ribonucleotídios. Se utilizarmos o inibidor 3' desoxiadenosina (cordicepina). O DNA se desenrole localmente. O molde determina a ordem em que os ribonucleotídios serão adicionados via emparelhamento de bases onde uma purina forma pontes de hidrogênio com uma pirimidina na seguinte combinação: A=U e G=C. Bonato 59 .MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 6. apenas com substituição de T por U. Isto implica que: • • A atividade desta enzima é dependente da presença de DNA. Uma curta molécula híbrida DNA/RNA é formada no local da bolha de transcrição. A fita não-codificadora é utilizada como molde no processo de transcrição.11). a síntese de RNA não seria inibida. similar ao que ocorre no alongamento de uma cadeia de DNA. As RNA polimerases sempre adicionam ribonucleotídios ao polímero. utilizando a energia armazenada no nucleosídio trifosfatado. O molde está orientado no sentido 3'  5' e a molécula de RNA nascente. nele. o análogo nem sequer seria incorporado já que. GTP. no sentido 5'-->3'. O transcrito produzido tem uma seqüência idêntica à da fita codificadora do DNA. 10. no análogo. Se o crescimento fosse pelo terminal 5'-trifosfato. impedindo que se estabeleça uma ligação fosfodiéster com potenciais ribonucleosídios trifosfatados ingressantes. CTP. o grupo 3’OH está ausente. haverá uma parada na síntese de RNA assim que o análogo for incorporado. O sentido 5'-->3' da síntese de RNA pode ser comprovado experimentalmente. UTP) que utilizam a energia armazenada na ligação pirofosfato de cada nucleotídio ingressante para estabelecer a ligação fosfodiéster entre os monômeros do RNA nascente. Os precursores imediatos na síntese de RNA são os ribonucleosídeos trifosfatados (ATP. Isto demonstra que a cadeia cresce do terminal 5' para o terminal 3' (Figura 6. Cristina M. os quais são complementares aos desoxirribonucleotídios do molde (DNA). Esta reação necessita da presença dos ions Mg2+ e Zn2+. Neste caso. via ligação fosfodiéster entre o terminal 3'-OH do polímero pré-existente e o fosfato do ribonucleosídio 5'-trifosfato ingressante. Isto ocorre porque. MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 6. na fita molde. corrigindo erros eventuais. coli a RNA polimerase é uma proteína multimérica constituída de cadeias polipeptídicas diferentes: b (beta). as RNA polimerases não fazem revisão do processo de transcrição. Uma das conseqüências disto é que a síntese de DNA requer primers de RNA (veja "Primers e primases"). um erro ocasional não teria conseqüências graves.coli Em E. 11.000 daltons é a forma predominante na célula e também é conhecida como s70. durante o processo de replicação. parece que sintetizar muitas moléculas de RNA rapidamente é mais interessante do que revisar cada uma das moléculas que está sendo sintetizada. A união entre estas moléculas é assegurada por ligações fracas. Todavia. Quando todas estas moléculas estão associadas.2). Subunidades da RNA polimerase de E.000 kDa). A subunidade s de 70. A DNA polimerase é incapaz de realizar tal façanha.000 kDa) e uma s (70. todavia. é adicionado ao terminal 3'OH da cadeia nascente com liberação de pirofosfato. o complexo bb'a 2 s é denominado RNA polimerase holoenzima (Figura 6. uma b' (160. utiliza-se outra cópia. Quadro 6. Uma das características das RNA polimerases que as distinguem das DNA polimerases é a capacidade de iniciarem a síntese de uma molécula de ácido nucléico na ausência de um iniciador ou primer.12. 12. a RNA polimerase liga os dois primeiros ribonucleotídios entre si. uma b (150. Bonato . outras formas de subunidades sigma são sintetizadas 60 Cristina M. selecionado pela sua capacidade de parear com o desoxirribonucleotídio comple-mentar na fita molde de DNA.000 kDa). muitas das substituições de aminoácidos nas proteínas são funcionalmente inócuas. A adição do análogo 3'desoxiadenosina bloqueia o alongamento da cadeia. coli: duas a (40. Assim. uma vez que ela só consegue adicionar novos nucleotídios a um polímero preexistente. Do ponto de vista evolutivo. Estima-se que uma base errada é incorporada a cada 104 bases transcritas. como fazem as DNA polimerases. RNA Polimerase de E. pode ser tolerada porque uma grande quantidade de moléculas de RNA é sintetizada a partir de um gene. Se uma cópia foi sintetizada com erro. Figua 6. nem seria permanente. uma vez que não possui grupo 3'OH. as moléculas de RNA tem vida curta. de acordo com sua complementaridade às bases da molécula de DNA. 2a (alfa) e s (sigma). O ribonucleotídio. b' (beta linha). Por outro lado. Para iniciar a cadeia. Esta taxa de erro.000 kDa). MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS na célula e substituem a s70 em condições particulares. A determinação do sítio correto de iniciação da transcrição depende das subunidades sigma. O processo de alongamento da cadeia de ribonucleotídios depende do sítio catalítico existente na subunidade b. Quadro 6. 2. Subunidades da RNA polimerase de E. coli Subunidade Gene Massa (d) rpoA rpoB rpoC rpoD ~40.000 ~150.000 ~160.000 Quantidade Funções possíveis 2 1 1 montagem ligação dos nucleotídios ligação ao molde ligação ao promotor α β β' σ 32-92.000 1 A holoenzima tem um peso molecular aproximado de 450 kDa e apresenta uma forma alongada recobrindo cerca de 40 a 70 pares de nucleotídios no DNA. A associação da subunidade s ao complexo constituindo a holoenzima é transitória, dissociando-se do agregado bb'a2 logo após o início da transcrição. O agregado bb'a2, denominado central enzimática (core enzyme, em inglês), é responsável por catalisar as ligações fosfodiéster para formação do polímero, independente da subunidade sigma, mas é incapaz de iniciar a transcrição a partir do local correto. Para isto, depende da subunidade sigma. A função da subunidade s é reconhecer o sítio correto para o início da transcrição. O processo de alongamento do polímero é realizado pela central enzimática e não pode ocorrer enquanto a subunidade s estiver presente. Qual a extensão do DNA ocupada pela RNA polimerase holoenzima? Isto pode ser determinado por digestão do DNA com nucleases como esquematizado na Figura 6.13. Figura 6. 13. A RNA pólimerase protege o segmento do DNA ao qual está ligada, contra a digestão pela DNAse I. Isolamento do DNA protegido e seu seqüenciamento determinam o número de nucleotídios abrangidos pela RNA polimerase e identificam as sequencias de reconhecimento Cristina M. Bonato 61 MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS na região promotora. As nucleases são enzimas que digerem ácidos nucleicos. Alguns tipos de nucleases são específicas para DNA (DNAses), outras para RNA (RNAses). Todavia, quando um segmento de ácido nucleico está associado à proteínas, ele fica protegido da ação das nucleases. Baseado nisto pôde-se estimar a extensão do DNA ocupada pela RNA polimerase. Reconhecimento do Promotor O processo de transcrição pode ser subdividido em quatro momentos fundamentais: reconhecimento do promotor, iniciação, alongamento e terminação. Cada uma destas fases está sujeita à modulação via diversos mecanismos reguladores. Para que este processo ocorra é necessário, antes de mais nada, que a RNA polimerase identifique sinais específicos no DNA, os quais direcionarão a transcrição de genes específicos no momento adequado. A região do gene que contem estas seqüências de reconhecimento é o promotor. Uma enorme variedade de sinais pode ser encontrada nas regiões promotoras de diferentes genes. É por este motivo que os promotores são locais extremamente importantes no controle da expressão gênica. Analisando-se as seqüências de nucleotídios, de mais de 100 promotores diferentes de bactérias, observou-se que dois tipos de seqüências estão sempre presentes, centradas nas regiões -10 e -35 do promotor. Apesar destas seqüências não serem perfeitamente idênticas entre os diferentes genes analisados, alguns nucleotídios são encontrados com maior freqüência do que outros, numa determinada posição, constituindo o que se denomina seqüência consenso. Dois consensos, com 6 nucleotídios cada, foram determinados a partir da análise referida acima. A seqüência consenso -10, também conhecida como Pribnow box é T77 A76 T60 A61 A56 T82. A seqüência consenso -35 é T69 T79 G61 A56 C54 A54. Os índices representam o percentual com que cada base é encontrada entre os promotores analisados. Os consensos estão separados entre si por cerca de 16-18 nucleotídios em 90% dos casos analisados. A posição destas seqüências dá orientação ao promotor e esta orientação direcionará a RNA polimerase holoenzima. Sem a subunidade s, a central enzimática não pode iniciar a transcrição de modo específico, mas pode alongar um transcrito pré-iniciado. Mutações nas regiões promotoras podem afetar o processo de transcrição. Regiões promotoras cujas seqüências divergem muito do consenso são promotores fracos, pois sua afinidade pela holoenzima é menor resultando num número menor de transcritos por unidade de tempo. Nas células bacterianas existem diferentes fatores s os quais são codificados por diferentes genes. Cada tipo de fator s reconhece seqüências específicas nas regiões promotoras dos genes a serem transcritos. Dependendo da concentração celular de um determinado s, um conjunto específico de genes será expresso. Uma vez que os diferentes fatores s diferem entre si pelo peso molecular (PM), convencionou-se denominá-los de acordo com seu PM. Quadro 6. 3. Seqüências -35 e -10 de alguns promotores de E. coli gene trp tRNAtyr lac 62 seqüência -35 TTGACA TTTACA TTTACA distância seqüência -10 N17 N16 N18 TATGTT TATGAT TATGTT distância +1 N5 N7 N6 A G A Cristina M. Bonato MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS recA araB, A, D bioB rrnA1 Consenso s70 Consenso s54 Consenso s28 TTGATA CTGACG TTGTAA TTGACT TTGACA CTGGNA CTAAA N16 N18 N17 N16 TATAAT TACTGT TAGGTT TATTAT TATAAT TTGCA CCGATAT N8 N6 N8 N6 A A T C - Consenso s32 TxtCcCcTTGAA N13-15 CCCCATtTA Em vermelho, as bases que diferem do consenso para s70, o qual está envolvido no metabolismo geral da célula. • • • Genes cuja transcrição é induzida por choque térmico são reconhecidos por s32. A expressão dos genes relacionados ao metabolismo de nitrogênio é controlada por s54. A expressão dos genes relacionados à motilidade e quimiotaxia é controlada po s28. Iniciação da Transcrição As taxas com que os genes são transcritos variam diretamente com a taxa com que seus promotores formam complexos de iniciação estáveis com a holoenzima RNA polimerase. O fator s liga-se ao DNA somente enquanto subunidade da holoenzima. Sem ele, a central enzimática associa-se inespecificamente a qualquer segmento do DNA, promovendo uma varredura da molécula ao deslizar sobre a fita até que o fator s encontre o sítio promotor e ligue-se a ele fortemente, com uma constante de associação 1000 vezes superior à da central enzimática. Estabelece-se um complexo binário (RNA polimerase/DNA) estável ou complexo fechado. O fator sigma interage, via terminal carboxila, com as seqüências -10 e -35 do promotor. A região central do fator sigma interage com a central enzimática da RNA polimerase. A região amino terminal do fator sigma tem função reguladora, impedindo que o C-terminal interaja com o promotor na ausência da central enzimática. Após a formação do complexo fechado ocorre a abertura local da dupla hélice (bolha), promovida pela RNA polimerase holoenzima, com o rompimento das pontes de hidrogênio e a exposição de cerca de 17 bases em cada uma das fitas. Note que no consenso -10, reconhecido pelo s70, predominam nucleotídios de adenina e timina o que facilita a formação do complexo aberto, com a RNA polimerase articulada corretamente à fita que será utilizada como molde. Estabelece-se, então, a primeira ligação fosfodiéster entre dois ribonucleotídios trifosfatados complementares às bases expostas na fita molde. Está constituído o complexo ternário: DNA, RNA polimerase holoenzima e RNA nascente (Figura 6.14). Cristina M. Bonato 63 então.15). Neste ponto NusA dissocia-se e a enzima desliga-se do molde de DNA e do RNA nascente ficando livre para reassociar-se ao fator s disponível e iniciar outro ciclo de transcrição. aparentemente. Iniciação da transcrição: o fator s reconhece a seqüência do promotor e a subuni-dade β adiciona os pri-meiros ribonucleotí-dios sem necessidade de um primer. dissociando-se da região promotora. abrindo a dupla hélice mais à frente e expondo novos nucleotídios. na molécula de DNA. uma seqüência específica de nucleotídios. O processo de alongamento só termina quando a RNA polimerase encontra um sinal de terminação. 14. a enzima move-se. caso contrário à enzima permaneceria fortemente ligada ao promotor e não poderia deslocar-se sobre o DNA. a central enzimática interage com a proteína NusA que se mantém ligada à central enzimática até terminar a polimerização. Proteínas ativadoras ou repressoras podem alterar a eficiência do processo de iniciação ao se ligarem à seqüências específicas à montante ou à jusante do início da transcrição (veja Regulação da Expressão Gênica). que é também. o promotor ficará disponível para receber uma nova RNA polimerase holoenzima.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 6. Assim que o s é liberado. Bonato . NusA influencia tanto o alongamento da cadeia como o processo de terminação e. Este movimento é acompanhado pela liberação do fator sigma provocando uma mudança conformacional na central enzimática a qual se tornará apta a promover o alongamento da cadeia. Só. Em seguida. 64 Cristina M. serve de "âncora" para outros fatores que podem exercer papéis específicos na transcrição (Figura 6. Alongamento do Transcrito A dissociação do fator s é fundamental para que o processo de alongamento da cadeia ocorra. Consequentemente. Terminação da Transcrição Sinais de terminação são variados e o processo de terminação depende da formação de estruturas secundárias. coli: Rho-dependente e Rho-independente. as moléculas de mRNA recém-sintetizadas precisam atravessar a barreira imposta pela membrana nuclear antes de alcançarem os ribossomos que se localizam no citoplasma. Cristina M. A extremidade 5' do RNA liberado fica. centradas entre 15 e 20 nucleotídeos do término. As características de um terminador Rhoindependente são: • Seqüências repetidas invertidas ricas em GC. mesmo antes do término da transcrição. permite o deslizamento da central enzimática sobre a fita de DNA. a velocidade média de polimerização é de ~ 40 nucleotídeos/segundo/37oC. Terminação Rho-independente: Neste caso. sofrendo uma série de modificações antes de serem exportadas para o citoplasma (veja Processamento pós-transcricional). Em eucariotos. a terminação da cadeia cabe totalmente à RNA polimerase. na molécula de DNA. não dependendo de proteínas auxiliares. na molécula de RNA nascente e/ou da participação de proteínas auxiliares. Uma vez que em bactérias o material genético não está compartimentalizado pela membrana nuclear os processos de transcrição e tradução podem estar acoplados e a extremidade 5' livre de uma molécula de mRNA poderá ser imediatamente engajada no processo de tradução. disponível. uma cadeia de RNA com 6. Alongamento do transcrito: liberação do fator sigma e interação com NusA. até encontrar o sinal de terminação da transcrição No processo de alongamento.000 nucleotídios é sintetizada em aproximadamente 3 min. 15. portanto. em forma de grampo. Há dois tipos de terminadores em E. Bonato 65 . A hélice híbrida DNA/RNA formada durante o processo é de curta duração porque as duas fitas do DNA voltam a se enrolar deslocando o segmento de RNA recém sintetizado.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 6. é relativamente mais instável. A região híbrida polidA/poliU. Bonato . numa velocidade comparável a do próprio processo de transcrição. A presença de seqüências repetidas invertidas (auto-complementares) permite a formação de estruturas em grampo ou haste-alça (hairpin. a formação do grampo e a pausa da RNA polimerase são cruciais na terminação da transcrição. Após a adição da série de Us. a formação de um grampo na molécula de RNA provoca uma pausa no movimento da RNA polimerase logo após a transcrição da seqüência de As. Assim. Além disto. porém ela apresenta baixa complementaridade entre as bases de sorte que um grampo "fraco" é formado. a parada da transcrição lança mão de uma proteína auxiliar. após transcrição desta região. Na presença de RNA liga-se ao mesmo e usa a energia de hidrólise do ATP em ADP + Pi. Sinal de parada. forma-se um grampo entre as seqüências auto-complementares e a síntese do RNA pára. ocorre uma pausa no movimento da RNA polimerase o que é suficiente para permitir que a proteína Rho alcance a polimerase aprisionando-a e provocando o desenovelamento do híbrido DNA/RNA com liberação final da enzima RNA polimerase. uma seqüência auto-complementar de ribonucleotídios é seguida de uma série de As. Rho. Assim que o grampo fraco se forma no transcrito. não existe uma seqüência rica em As após a dupla simetria. A habilidade de desenovelar o híbrido seria dada pela atividade de helicase da proteína Rho . Se forem incorporadas bases alteradas nesta região. Figura 6. Os detalhes deste processo ainda não são conhecidos (Figura 6. Terminação Rho-dependente: Em terminadores Rho-dependentes também é encontrada uma região de simetria dupla no terminal. em inglês) via emparelhamento dos segmentos complementares (Figura 6. stem-loop.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS • Uma série de 6 ou mais As na fita molde que serão transcritas em Us no terminal 3' da fita de RNA. a terminação não ocorre. Como funcionaria o processo de terminação. neste caso? Provavelmente. Na fita molde. 66 Cristina M. 16.16).17). Neste caso. com atividade de ATPase. para deslizar sobre a molécula de RNA recém-transcrita. facilitando a expulsão da fita de RNA e terminando o processo. afetando a formação do grampo. no RNA. A proteína Rho é um hexâmero constituído de seis unidades idênticas (~46kDa). Guia de Estudos Qual a função da b-galactosidase? Que evidências levaram os pesquisadores a identificação do mRNA como molécula intermediária entre a informação contida no DNA e as máquinas de síntese protéica? Quais os tipos de RNA? Quais suas funções principais? Quais as subunidades constituintes da RNA polimerase holoenzima de E. coli? Quais são as seqüências consenso reconhecidas pelo fator sigma? Quais as diferenças entre s70 e s32? Como é determinado qual das fitas será transcrita? Cristina M. Terminação Rho-dependente. A pausa da RNA polimerase após a formação do grampo fraco permite que a proteína Rho alcance a enzima aprisionando-a e desenovelando o híbrido DNA/RNA. em E. Bonato 67 .000 nucleotídios? Qual o sentido de polimerização de uma cadeia de RNA? Como ficou demonstrado que a cadeia de RNA cresce do terminal 5' para o 3'? Qual é a funço da região promotora? Qual a função das subunidades sigma da RNA polimerase.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 6. coli? Qual o tempo médio gasto por uma bactéria para sintetizar uma molécula de RNA de 2. 17. Porque não seria tão importante reparar os erros cometidos pela RNA polimerase? A seqüência de bases. de uma molécula de DNA. Bonato .. identifique o Pribnow box. Diferente das DNA polimerases. coli. em vermelho. que tamanho relativo você esperaria para estas moléculas? Explique. determine a seqüência e polaridade no RNA. em cada caso.O que os nucleotídios em vermelho poderiam estar indicando? Baseado nesta análise. as RNA polimerases não fazem revisão da síntese do RNA. reconhecidos pela RNA polimerase. a fita codificadora e a fita molde. Explique porque você fez esta opção. e depois isolar o RNA recém sintetizado. como pontos de início e pontos de término da transcrição? Explique. em ambas as temperaturas. na molécula de DNA. 3' CCTCTTGTCAGGCCGGAATAACTCCCTATAATGCGCCACCACTAGCTAATCGTACACCTTAA 5' 5' GGAGAACAGTCCGGCCTTATTGAGGGATATTACGCGGTGGTGATCGATTAGCAUGTGGAATT 3' 68 Cristina M. Se T. transcreva este segmento. Uma unidade de transcrição pode conter mais do que uma unidade de tradução? O que são fatores de transcrição? Como se inicia a transcrição? Porque a dissociação do fator sigma é importante no alongamento da cadeia de RNA? Quais as diferenças entre terminação da transcrição dependente de Rho e terminação da transcrição independente de Rho? Você isolou um mutante de bactéria que fabrica uma proteína Rho termo sensível: a proteína funciona normalmente a 30oC mas não funciona a 40oC. foi transcrita em RNA: CCAGGTATAATGCTCCAGTATGGCATGGTACTTCCGGATC. A seqüência abaixo representa o início de um gene de E. por um curto período de tempo.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Quais os sinais. Indique a polaridade do transcrito.. é a primeira base transcrita. Se você cultivar a linhagem mutante. abaixo. coli permitiu determinar que muitos dos genes com funções relacionadas. Cerca de 30% do genoma bacteriano está organizado em operons. 1994) e em tripanossomatídeos como T. Organização de um operon hipotético em E. o transcrito primário não é. C. e sua transcrição é controlada por uma única região promotora. monocistrônicos. p. brucei. a maioria deles precisa sofrer uma série de modificações que podem envolver adição ou remoção de nucleotídios ou ainda. estão agrupados numa região específica do cromossomo. Dentro da região promotora localiza-se uma pequena seqüência regulatória denominada operador. Quando a proteína repressora liga-se ao operador. a estrutura operônica já foi identificada no nematóide C. Em eucariotos este tipo de organização é mais rara. necessariamente. modificação de alguns nucleosídeos específicos. na qual se ligam proteínas repressoras específicas que dificultam a transcrição dos genes quando seus produtos gênicos não são necessários à celula (vide Regulação da Expressão Gênica). tanto Archaea como Bacteria. Os transcritos são. Este tipo de organização do genoma é comum nos procariotos. BACTERIA E EUKARYA Organização dos Genes em Operons O mapeamento genético em E. Tanto o mRNA como o tRNA ou rRNA podem ser alterados de diferentes formas para se transformarem num RNA funcional. B e A codificam proteínas cuja expressão é comtrolada por um mesmo promotor. não ocorre transcrição deste conjunto de genes. uma entidade funcional. ex. via de regra. Cristina M. 1. elegans (Zorio.(Figura 7. O conjunto das modificações sofrida pelo transcrito primário é conhecido por processamento pós-transcricional. Para se tornar funcional. coli. D. Bonato 69 . Figura 7. Este grupo de genes é transcrito numa única molécula de RNA mensageiro (RNA poligênico ou RNA policistrônico). os componentes de uma via biossintética. Os genes E. O segmento que compreende os genes mais a região promotor/operador é denominado operon.. à montante.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Capítulo 7 – PECULIARIDADES A TRANSCRIÇÃO EM ARCHAEA. Todavia. Processamento Pós-Transcricional O produto imediato da transcrição. Tais grupamentos de genes sob regulação de um único promotor/operador são denominados operons. permitindo que os parceiros de uma mesma via metabólica sejam ativados ou reprimidos em conjunto.1). 2. Poliadenilação do terminal 3'. no nucleotídio adjacente pode ser ou não metilado (Figura 7. pronto para migrar para o citoplasma. só então. A transcrição do DNA ocorre no núcleo e a tradução no citoplasma. antes mesmo de terminar a transcrição a tradução já se inicia. 2). o grupo 2'-OH da ribose é metilado. Montagem de segmentos codificadores ("splicing"). O segundo açúcar da cadeia. Coroamento do Terminal 5' ("Capping") Assim que o terminal 5' do transcrito primário é liberado (em geral com cerca de 30 nucleotídios de extensão). um nucleotídio de guanina é adicionado bloqueando o terminal. migra para o citoplasma.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS A ausência de compartimentalização do genoma em procariotos permite que os processos de transcrição e tradução sejam acoplados de formas que. Os transcritos primários que originarão mRNAs. o transcrito primário é modificado dentro do núcleo e. Esta estrutura é denominada cap. Figura 7.3). sofrem extensiva modificação antes de atravessarem a barreira imposta pela carioteca (Figura 7. A ligação do nucleotídio de guanina se dá via ligação fosfodiéster 5'. formando a estrutura 3'-G-5'ppp5'-N-3'p. os processos de transcrição e tradução estão temporal e espacialmente isolados. Este conjunto de modificações no transcrito nuclear originará o mRNA. Em eucariotos. Transcritos originados na mitocôndria ou cloroplastos não sofreriam tais modificações. transcrição e tradução ocorrem simultâneamente. Nos Procariotos. Após a formação do cap. Bonato . em geral. os mRNAs de procariotos não sofreriam modificações. Nos eucariotos. na sua migração do núcleo para o citoplasma. As modificações que podem ocorrer nos transcritos nucleares são. uma reação pouco usual. Uma das conseqüências disto é que.5'. comportando-se de forma similar aos de bactérias. basicamente de três tipos: • • • Coroamento ("capping") do terminal 5'. 70 Cristina M. Em seguida um grupo metil é adicionado à posição 7 do anel de purina (7-metilguanosina). que transcreve. Aparentemente esta estrutura metilada é utilizada para ajudar na interação entre ribossomos e mRNA de forma tal que a tradução inicie-se no códon AUG correto. A seguir. Cristina M. Imagina-se que as enzimas necessárias ao processo de adição do cap estejam associadas à RNA pol II. usualmente. 3. Inicialmente. uma endonuclease específica reconhece a seqüência consenso AAUAAA.4). se bem que. 2) poderia afetar a estabilidade do mRNA no citoplasma e. a enzima poli-A polimerase adiciona os resíduos de adenina a partir do ponto de quebra. Bonato 71 . cerca de 200 resíduos adenílicos. o nucleotídio que inicia uma cadeia de RNA é uma purina (A ou G). clivando o transcrito 11-30 nucleotídios à jusante do consenso. o cap e a cauda poli A agiriam combinados. aparentemente. é adicionada ao terminal 3' da molécula após o término da transcrição (Figura 7. 3) é importante na eficiência da tradução. Várias funções têm sido associadas à cauda poli A: 1) poderia facilitar a exportação do mRNA do núcleo para o citoplasma. especificamente. CAP no terminal 5' de moléculas de RNA sintetizadas pela Pol II. os mensageiros possuem uma seqüência 5' complementar ao terminal 3' do rRNA 16S posicionando corretamente o mRNA nos ribossomos (veja Tradução).MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 7. Poliadenilação do Terminal 3' A adição de uma longa cauda de resíduos de adenina (poli A) no terminal 3' é também uma modificação sofrida por grande parte dos transcritos RNAPII. seqüências que originarão mRNAs em eucariotos. Os transcritos das RNA Pol I e Pol III não tem cap. A letra N representa qualquer um dos 4 ribonucleotídios. Neste caso. A cauda poli A. Outra função que tem sido atribuída ao cap é a de proteger o transcrito de degradação. impedindo que se inicie a tradução de moléculas de mRNA que não estejam intactas. Nos procariotos isto seria desnecessário uma vez que. neste caso. Não há utilização de molde para a síntese da cadeia de poli A. recebe o nome de RNA mensageiro. O transcrito processado e pronto para migrar para o citoplasma. montagem) e ocorre dentro do núcleo. em pontos de junção definidos. Em eucariotos as distâncias intergênicas são grandes e. Posteriormente. Montagem do mRNA (“Splicing”) Uma das características do genoma de eucariotos é que os genes podem ser fragmentados. de sorte a garantir que a mensagem contida na seqüência de nucleotídios dos exons não seja alterada durante a montagem. Bonato . 4. podendo ser auto-suficientes (autosplicing) ou. mas aquelas regiões do DNA que correspondem aos introns não têm equivalente no mRNA e. Existem diferentes mecanismos de retirada dos introns. O processo de remoção dos introns e união dos exons ocorrem via reações altamente específicas. dependentes de partículas ribonucleoprotéicas (spliceossomos). O sítio AAUAAA é reconhecido por uma endonuclease que cliva a molécula 11 a 30 nucleotídios à jusante. O resultado da retirada dos introns pode ser visualizado quando o mRNA é hibridizado com o segmento de DNA que lhe deu origem. porém como um evento raro tanto nos genomas indivíduais como no próprio domínio Bacteria. 72 Cristina M. As regiões complementares entre mRNA/DNA pareiam. descartando-se os introns e unindo-se os exons em seqüência ordenada. tendo lhes valido o prêmio Nobel de 1993. dentro dos próprios genes a freqüência de introns é alta. O transcrito resultante não é funcional e só poderá ser traduzido se for devidamente montado. então. A descoberta de que os genes de eucariotos poderiam ser interrompidos ou fragmentados. o que nos permite identificar o número de introns no gene (Figura 7. em 1977. O que significa isto? Num segmento do DNA. Em geral. Ao contrário do que ocorre nas bactérias.6). Segmentos não codificadores são muito frequentes no genoma eucariótico. foram detectados genes interrompidos também em bactérias. onde os genes estão mais compactamente organizados. foi realizada por Philip Sharp & Richard Roberts.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 7. Este tipo de modificação do transcrito primário é denominado "splicing" (cortar e colar. Poliadenilação do transcrito RNAPII. Aí são adicionados resíduos de Adenina pela enzima poli A polimerase. são encontradas regiões codificadoras (exons) alternando-se com regiões não-codificadoras (introns). os introns são muito mais extensos que os exons. formam-se alças de DNA fita simples. portanto. correspondente a um gene que codifica uma determinada proteína. estabelecendo uma nova ligação. se bem que como evento raro (The Xylella fastidiosa Consortium. GDP ou GTP). Auto-Montagem ("Auto-splicing") A auto-montagem (auto-splicing) do transcrito RNA pol II depende da configuração do próprio intron. Existem duas classes de introns que sofrem auto-splicing: introns do grupo I e do grupo II. uma vez que é a própria molécula de RNA que catalisará as reações químicas que culminarão na retirada de si própria e na união dos exons. RNAs com atividade catalítica recebem o nome de ribozimas. as moléculas de RNA precederam as de DNA neste processo. Ferat & Michel. provavelmente. sem gasto de energia. mas como nucleófilo. 6. Cristina M. Em introns do grupo II o ataque nucleofílico é perpetuado pelo 2' OH de um resíduo de adenilato do próprio intron. mantendo o equilíbrio energético. Bonato 73 . Grupos hidroxila 2' ou 3' de uma ribose perpetuam um ataque nucleofílico a um fósforo. 2000 . sem necessidade de um cofator externo (Figura 7. a reação de automontagem do mRNA implica em dois passos consecutivos de transferência de ligação fosfodiéster de um ponto para outro. Em ambos os casos. sugerindo que. o primeiro passo depende da presença de uma molécula de guanosina (GMP. às custas da velha. Em introns do grupo I. que receberam o prêmio Nobel de 1988. Intron de grupo II tem sido detectado em bactérias. que não é usada como fonte de energia.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 7. O mecanismo de auto-splicing foi descoberto em 1982 por Thomas Cech e Sidney Altman. A descoberta de ribozimas tem trazido uma grande contribuição para a compreensão da evolução dos seres vivos no planeta. ao demonstrarem que moléculas de RNA podem apresentar propriedades catalíticas.7). 1993). Alças formadas após hibridização do mRNA com a fita complementar de DNA que lhe serviu de molde. similar ao que ocorre no auto-splicing. Ao complexo de proteínas específicas e de seus snRNAs. As moléculas de snRNA que participam dos diferentes snRNPs variam de tamanho entre 100 e 215 pares de base (pb). não é alterado (Figura 7. 7. U2. Funções específicas são atribuídas a cada um dos tipos de partículas ribonucleoprotéicas.8). Reação de trans esterificação. Introns do grupo I: no primeiro passo. No segundo passo. Neste processo não há consumo de energia. na molécula. 5' com o terminal 5' do intron.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS GRUPO I GRUPO II Figura 7. denomina-se snRNPs (pronuncia-se "snarps"). U4. estabelecendo-se uma ligação fosfodiéster 2'. 5'. Bonato . As reações que culminam com a montagem do mRNA são reações de trans esterificação. as partículas snRNP recebem a denominação U1. a qual dirige a montagem do mRNA. dentro do núcleo. De acordo com o seu tipo. constituindo a máquina ribonucleoprotéica denominada "spliceossomo". indicando que é quase tão grande quanto um ribossomo. o grupo 3' OH livre do exon age como um nucleófilo no terminal 3' do intron. Introns do grupo II: um laço intermediário é formado entre a guanosina 5' terminal do intron e o 2' OH do adenilato interno. O resultado é a excisão exata do intron e ligação dos exons. O segundo passo é similar ao do grupo I. O "spliceossomo" sedimenta à 60S. U5 ou U6. onde uma ligação fosfodiéster entre dois nucleotídeos no terminal 5' do intron é transferida para um outro ponto no teminal 3' do intron. Diferentes snRNPs participam do processo de montagem de um transcrito primário. small nuclear RNAs). uma vez que o número de ligações éster-fosfato. 74 Cristina M. do inglês. o 3' OH da guanosina estabelece uma ligação fosfodiéster 3'. Algumas vezes depende da ação de proteínas e de RNAs nucleares pequenos (snRNAs. Spliceossomo Nem sempre a montagem dos exons é do tipo auto-splicing. Genes Interrompidos e a Taxa de Evolução Porque a fragmentação dos genes é um evento comum em eucariotos? Seria um resquício da evolução. U2.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 7. Em seguida. mas nem todos os genes eucarióticos são interrompidos. os múltiplos genes que codificam as diferentes histonas. uma vez que. sintetizadas pela célula em resposta a condições adversas.. Esquema simplificado de splicing dependente de ribonucleproteínas. o 3' OH terminal do primeiro exon une-se ao início do segundo exon. proteínas envolvidas no empacotamento do DNA em nucleossomos. Um OH reativo de uma purina localizada próxima ao sítio 3' de splicing do intron. proteínas produzidas por vertebrados contra infecção viral. não são. em seqüência. P. as vantagens de genes interrompidos para o eucarioto poderiam ser elencadas como: • Aumentar a taxa de recombinação entre genes e diminuir a probabilidade da junção recombinante cair dentro do exon. clivando-o e liberando o terminal 5' do intron que se liga covalentemente à purina. hoje descartado pelas bactérias em função de uma pressão seletiva no sentido de tornar seu genoma o mais compacto possível permitindo taxas máximas de reprodução ou estas interrupções foram adquiridas pelos eucariotos porque deveriam cumprir objetivos muito especiais? As evidências em favor de uma ou outra alternativa não são conclusivas. formando um laço (lariat). Também não são interrompidos a grande maioria dos genes que codificam as proteínas de choque térmico (HSPs). ou os genes que codificam interferons. U5 e U4/U6 entre outros componentes. interrompidos. um complexo ribonucleoprotéico constituído de U1. ex. clivando o sítio de splicing 3'. Bonato 75 . De qualquer forma. A marca registrada de eucariotos é a presença de genes interrompidos. O intron é liberado como um laço e os dois exons unem-se. ataca o sítio 5'. quanto maior a distância entre dois segmentos Cristina M. via de regra. A montagem de transcritos da polimerase II é catalisada pelo spliceossomo. 8. Assim. Uma variante do splicing é o trans RNA splicing. Já em mamíferos os introns não são encontrados nos genes mitocondriais mas são a regra entre os genes nucleares. Este fenômeno é comum nos mRNA mitocondriais de tripanossomos e depende da presença de um RNA guia (gRNA). Entre os eucariotos inferiores a freqüência de introns cai muito. 76 Cristina M. Aparentemente. • Facilitar a duplicação de exons. (Figura 7. alterando a mensagem original. Os genes de imunoglobulinas e colágeno são um exemplo disto. presentes em seu terminal 3'. Edição O fenômeno de Edição do RNA consiste em adicionar ou deletar nucleotídios no mRNA antes do mesmo ser traduzido. maior a probabilidade de recombinação entre eles. aumentando a variedade de tipos de uma dada proteína. Tais eventos permitem combinações de diferentes domínios protéicos (exons). A transferência dos nucleotídeos de uridina do gRNA para o mRNA depende de duas reações de trans esterificação. Durante o splicing. Bonato . O gRNA apresenta uma seqüência não inteiramente complementar ao mRNA que será editado porque neste segmento do RNA guia estão presentes nucleotídios (As) ausentes no mRNA. independente de uma duplicação gênica anterior. originando dois mRNAs diferentes. tanto a proteína "velha" como a nova poderão ser produzidas simultaneamente. • Permitir que uma nova proteína seja testada enquanto o organismo retém a expressão do produto original. Sabe-se que uma mutação pontual pode criar um novo sinal de junção 5' ou 3' para splicing do transcrito primário.9). a presença de introns é tanto maior quanto mais alto estivermos na escala evolutiva. Genes nucleares de levedura praticamente não possuem introns. Por causa disto o gRNA servirá de molde para a inserção de Us na fita do mRNA. O interessante neste processo é que o próprio gRNA é o doador de Us. montada de duas formas diferentes. quando a montagem ocorre entre terminais de moléculas de mRNA provenientes de dois genes diferentes.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS dados. apesar dos mesmos serem encontrados nos genes mitocondriais das leveduras.Vários ciclos podem ocorrer. agora. Tais exons provavelmente surgiram devido a crossingover desigual entre seqüências de introns. Na maioria das vezes. possibilitando que uma única mensagem seja. seguida por divergência dos exons duplicados para prover novas funções. Há uma série de exemplos de genes que contem dois ou mais exons que são muito semelhantes entre si. um sítio de junção 3' pode unir-se a um dos dois (ou mais) sítios de junção 5' (ou vice-versa). as deleções ou inserções são exclusivamente de Us. apresentando múltiplas cópias de exons relacionados. as célula eucarióticas contem RNA polimerases separadas nas mitocôndrias e nos cloroplastos. 5S RNA e outros RNAs pequenos. Estima-se que em uma célula de mamífero sejam encontradas 40. especializadas na síntese de dos diferentes tipos de RNA: RNA polimerase I (RNAP I). As diversas enzimas eucarióticas devem ter evoluído de uma mesma enzima ancestral a qual se especializou no decorrer do tempo. Na segunda trans esterificação. enquanto a RNAP bacteriana holoenzima apresenta as 4 subunidades centrais. Pareamento do gRNA ao mRNA e duas reações consecutivas de trans esterificação que permitem a adição de um nucleotído de uridina pareado ao nucleotídeo de adenosina do gRNA. Em Archaea. cerca 10-15. que reconhece o promotor. Nos procariotos estima-se que o número de moléculas de RNAP seja 7.000 de RNAP I e cerca de 20.000/célula.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 7. todavia. (a2. o terminal 3' OH da molécula linear ataca a região rica em Us do gRNA. Na primeira transferência. Bonato 77 .1995). A maioria das subunidades arqueanas apresenta maior similaridade de seqüência com as subunidades da RNAP dos Eukarya do que de Bacteria (Keeling & Doolittle. o terminal 3' OH do gRNA ataca uma ligação fosfodiéster interna do mRNA pré-editado. Nos Archaea. uma vez que as subunidades dos diferentes tipos apresentam similaridade entre si. e o fator s. RNA polimerase II (RNAP II). é mais complexa do que a RNAP encontrada no domínio Bacteria. b'). Além destas três RNA polimerases nucleares. 9.000 de RNAP III. apenas uma RNAP transcreve todos os tipos de RNA. os eucariotos necessitam de pelo menos três tipos de RNA polimerases. A RNAP arqueana é constituída de 8-13 componentes. O peso molecular varia de 500-700 kDa. que exercem funções específicas no processo de transcrição.000 moléculas de RNAP II. as duas subunidades maiores da RNAP são denominadas A e B. para mRNAs e RNAs nucleares pequenos (snRNAs) e RNA polimerase III (RNAP III). para tRNAs. liberando o gRNA e editando o mRNA. RNA Polimerases em Eukarya e Archaea Enquanto as bactérias utilizam apenas um tipo de RNA polimerase (RNAP) para transcrever todos os diferentes tipos de RNA encontrados na célula. A Cristina M. 40. para sintetizar rRNA. As RNAP eucarióticas são constituídas de várias subunidades. gerando uma molécula linear 5' e um híbrido 3'-gRNA. b. geralmente.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS subunidade A corresponde à RpoC (b') de E. então. upstream). modulando a expressão do gene. Em Archaea os moduladores e estimuladores de transcrição são mais similares aqueles do domínio Bacteria. TFII e TFIII. proposto para esta região é: Py Py A N T/A Py Py. estes genes contem uma região rica em GC (20–50 nucleotídios). Um consenso. • Iniciador (Inr) . selecionando o sítio de iniciação (equivalente ao sigma em Bacteria) e contribuindo ao acoplamento da RNAPII. Ligam-se previamente ao DNA propiciando. eTF (do inglês. Uma distinção importante entre as enzimas dos três domínios é o reconhecimento do promotor e início da transcrição. os quais ligam-se à seqüências à montante. eukaryotic Transcription Factor) não fazem parte da holoenzima. necessários à síntese de qualquer mRNA. Estes promotores são característicos de genes expressos seletivamente em alguns tipos de células. Nos Archaea são encontradas subunidades de fatores de transcrição bastante similares a dos TFII basais de Eukarya.a maioria dos iniciadores apresentam um C na posição –1 e um A na posição +1. denominada GC Cristina M. parte integrante da holoenzima. gerando mRNAs com terminais 5' diversos. Alguns destes fatores já foram isolados. como os Pribnow box de E.coli e à RpoA da RNAP II de Eukarya. No caso da RNAP II.seqüência consenso centrada aproximadamente na posição – 25. estimulam ou reprimem a iniciação da transcrição pelo complexo RNAP II/GTF. à montante ou à jusante e são necessários à máxima atividade dos promotores cognatos. próximas do ponto de início. é uma purina.1997). Em bactérias. é responsável pelo reconhecimento do promotor. rica em pares AT (T82A97T93A85A63A50). da unidade de transcrição. coli. É importante no posicionamento da RNAPII para iniciação da transcrição. • GC box . os eTF requeridos em cada caso também são diferentes e designados de acordo com a polimerase correspondente. nos genes contendo TATA box. podendo iniciar-se em qualquer ponto numa extensão variável de 20 a 200 pb.em alguns genes. Nos procariotos as seqüências reconhecidas por moduladores ou estimuladores estão. os fatores de transcrição. o fator de transcrição sigma. Em eucariotos. os quais são transcritos pela RNAPII. Em ~75% dos casos. o início da transcrição não está bem definido. de um modo geral. A seqüência ao redor do ponto de início determina a força do promotor. Py é pirimidina (C ou T) e N é qualquer nucleotídio. a primeira base a ser transcrita. em Eukarya. A expressão de genes que codificam proteínas. Estimuladores de transcrição (enhancers). os quais ligam-se à seqüências específicas distantes do promotor basal. onde A é o ponto de início (+1). coli e à RpoB da RNAP II de Eukarya (Brown & Doolitlle. ou seja: TFI. • Fatores de transcrição à montante. alguns tipos característicos de promotores são reconhecidos: • TATA box ou Hogness box . Bonato 78 . suportam níveis basais de transcrição (promotor basal). próximas ao ponto de início de transcrição do gene e são denominados elementos à montante ou elementos UP (do inglês. posicionada entre 100–200 pb à montante do início de transcrição. a ligação das RNA polimerases. altamente degenerado. Diferentes sigmas reconhecem diferentes promotores. Uma vez que existem três tipos de RNA polimerases nos eucariotos. com predominância de adenina. A subunidade B corresponde à RpoB (b) de E. de três classes de TFII: • Fatores de transcrição gerais (GTF) ou basais. por sua vez. dependem. Em geral. Os fatores de transcrição TFI e TFII ligam-se à montante dos sítios de iniciação de transcrição e os TFIII ligam-se à jusante. Transcrição Basal em Eukarya O início da transcrição implica no reconhecimento do promotor pela RNA polimerase. • CCAAT box . como ligante do TATA box. Transcrição basal pela RNAPII: • Reconhecimento do promotor: depende de ligação prévia do fator de transcrição TFIID. também. Iniciação da transcrição. onde os resíduos de serina (S) e treonina (T) podem ser fosforilados por TFIIH. Figura 7. o qual. Em mamíferos. Os dados disponíveis até o momento mostram que a maquinaria de transcrição basal é partilhada por Archaea e Eukarya. TFB e aTBP. Da máquina protéica de transcrição participam várias proteínas que se aglomeram numa seqüência específica permitindo a ação da RNA polimerase II. da mesma forma que a RNA polimerase de E. 10.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS box. Cristina M.coli livra-se do sigma. Entre as subunidades do TFIID encontra-se a proteína TBP ("TATA-Binding Protein"). o terminal carboxila da RNAPII apresenta 52 repetições da seqüência YSPTSPS. em promotores que não contem TATA box. consideradas universais. que forma um complexo ternário com aTBP e TFB. juntamente com a RNA polimerase II. • Ligação de outros fatores de transcrição ao complexo inicial. o qual é um complexo protéico composto de várias subunidades.Todavia esta proteína está sempre presente na máquina basal de transcrição atuando. Em Archaea foram encontrados homólogos dos fatores de transcrição eucarióticos TFIIB e TBP. A grande maioria dos componentes reguladores são partilhados por Archaea e Bacteria. denominados respectivamente. Bonato 79 . a qual recebeu este nome por ter sido identificada. juntamente com o TATA box poderia ser o sítio inicial de ligação da RNAPII e de outras proteínas envolvidas na iniciação da transcrição. por causa disto. O fator de transcrição TFIIH. Além disto os promotores de Archaea apresentam uma região rica em A-T na posição -25 à montante do início de transcrição. uma serina/treonina proteína quinase que fosforila o domínio carboxi-terminal da RNAPII é um elemento preponderante neste desengate. • Caminhada da RNA polimerase ao longo do gene: para tanto. a RNAPII precisa livrar-se dos fatores de transcrição. inicialmente. denominados genes de rotina (housekeeping). Algumas proteínas associadas à transcrição são comuns aos três domínios e. bastante similar à estrutura encontrada em eucariotos. Genes que são expressos em todos os tecidos. costumam apresentar GC box.elemento localizado à -50 e -110. Eukarya e Bacteria.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Guia de Estudos O que é um operon? O que é um RNA policistrônico? O que são introns e exons? Desenhe o produto de hibridização DNA/RNA. Se o gene não tivesse introns. Como o spliceossomo funciona? Quais são seus componentes? Onde você esperaria que se acumulassem mais mutações. Marque todas as regiões. Bonato . desenvolvendo a idéia da existência de um código genético onde o DNA serviria de molde para a síntese de proteínas. gerado por um gene que contem 5 introns. 80 Cristina M. muitas perguntas surgiram e vários experimentos fascinantes foram realizados na tentativa de respondê-las. qual seria o produto de hibridização? Que tipos de modificações podem ocorrer em transcritos produzidos pela RNA polimerase II de eucariotos. nos introns ou exons? Haveria vantagens em genes interrompidos? O que significa edição do mRNA? Desenhe uma molécula típica de mRNA em bactérias e eucariotos. Faça um quadro comparativo dos elementos e eventos chaves da transcrição em Archaea. Capítulo 8 – O CÓDIGO GENÉTICO Mutações Gênicas e Proteínas Alteradas Como o DNA codifica a informação genética? Desde a publicação de Watson & Crick (1953) sobre a estrutura do DNA e da carta de George Gamow a eles endereçada. antes de migrarem para o citoplasma? O que são ribozimas? Explique os tipos de auto-splicing que você conhece. hemoglobina tipo HbA • HbS/ HbS . Val His Leu Thr Pro Glu Glu é substituída pela seqüência Val His Leu Thr Pro Val Glu da hemoglobina falcêmica (S).células vermelhas normais. que possui carga negativa. A anemia falciforme já era conhecida como uma doença hereditária. Bonato 81 . no segmento da cadeia b. constituída de duas cadeias polipeptídicas a idênticas (141 aminoácidos) e duas cadeias polipeptídicas b idênticas (146 aminoácidos). o que confere uma vantagem seletiva a estes indivíduos em regiões onde a malária é endêmica. Cristina M.células vermelhas em forma de foice só ocorrem sob baixa concentração de oxigênio. a sequência de aminoácidos da hemoglobina normal (A). caracterizada como uma doença molecular. praticamente 100% da hemoglobina é tipo HbS. agrega-se em filamentos suficientemente grandes para deformar os eritrócitos. conseqüência da alteração conformacional sofrida pela molécula de hemoglobina. As moléculas de hemoglobina provenientes de um falcêmico. apresentando caráter de codominância ao nível da molécula: • HbA/HbA . o pigmento dos eritrócitos. migram diferente das normais devido a diferença de carga entre elas. Assim. Pauling havia mostrado que a hemoglobina normal (HbA) apresentava uma carga aniônica cerca de duas unidades mais negativa do que a da hemoglobina proveniente de células falcêmicas (HbS). modificando as interações intramoleculares que se refletem na conformação da proteína que perde a capacidade de transportar oxigênio. de acordo com as leis da genética Mendeliana. curiosamente. o ácido glutâmico. quando submetidas a um campo elétrico. 40% da hemoglobina é tipo HbS. desoxigenada. A hemoglobina. e migração da hemoglobina num campo elétrico. onde esta mutação pode ocorrer. os heterozigotos apresentam resistência aumentada à malária. é uma proteína tetramérica.células vermelhas em forma de foice. cuja função é transportar oxigênio através de todo o corpo. Que tipo de alteração ocorrera na molécula de DNA provocando a substituição de um aminoácido por outro na proteína? Por esta época. No mutante. A hemoglobina HbS. Figura 8. Indivíduos com anemia falciforme apresentam eritrócitos em forma de foice. um aminoácido apolar. 1. nada se sabia sobre a natureza do Código Genético e várias propostas estavam sendo feitas e analisadas pelos pesquisadores. Vernon Ingram mostrou que havia uma relação entre mutações gênicas e proteínas alteradas ao comparar a hemoglobina de indivíduos normais com a de indivíduos com anemia falciforme. resultante da troca de um aminoácido com carga negativa por um aminoácido apolar (Figura 8. por Linus Pauling em 1945. foi substituído por valina.1). que provoca anemia falciforme.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Em 1957. A) Célula normal de eritrócito e célula falcêmica. B) Relação entre uma mutação geneticamente transmissível. devido a uma mutação afetando o 6o aminoácido da cadeia b onde ácido glutâmico é substituído por valina. geralmente a anemia é fatal • HbA/HbS. Todavia. ou 44 códons não especificariam nenhum aminoácido ou então.2: se houvesse sobreposição.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Características do Código Genético O Código Genético é a fórmula que converte a informação hereditária dos genes em proteínas. Neste caso. cada aminoácido poderia ser especificado por mais de um códon. De quantas bases seria constituído cada códon? Uma combinação dos quatro tipos de bases. uma combinação de bases três a três seria minimamente necessária. Figura 8. BDA. acerca das propriedades do código: "There is now a mass of indirect evidence which suggests that the amino-acid sequence along 82 Cristina M. a combinação de algumas bases seria necessária para especificar cada um dos aminoácidos. uma mudança em C afetaria apenas o aminoácido 1. simplesmente. DCB. não havendo sobreposição o primeiro aminoácido seria codificado pela trinca ABC. não tem vírgulas. Abaixo. dá-se o nome de códon. Assumindo-se que o códon é uma trinca. como as trincas estariam organizadas para codificar proteínas? Haveria ou não sobreposição das trincas? Observe a Figura 8. uma mu-dança em C poderia alterar os aminoácidos 1.. no caso de não sobre-posição. 2 e 3 emquanto. está organizado em trincas e é degenerado. não existiriam? Como identificar o início e o fim das seqüências a serem "lidas"? A resposta a estas questões foi resultado do trabalho intensivo de Crick.. Sobreposição ou não sobreposição de codons. Existiria pontuação na leitura do código? Ou seja. etc. CBD o terceiro. Uma seqüência de bases poderia especificar uma seqüência de aminoácidos de diferentes maneiras. Bonato .. o código seria degenerado. A esta combinação de bases especificando um determinado aminoácido. BCB o segundo. Assim. e assim sucessivamente. dois a dois. ACD. o terceiro por DCB.. num código de trincas. culminando com a demonstração de que o Código Genético é lido a partir de um ponto fixo. na seqüência: ABC... a trinca ABC codificaria o primeiro aminoácido. por uma combinação delas ou. seria insuficiente para especificar todos os aminoácidos. No caso de sobreposição de codons. Já que existem só 4 bases diferentes para os 20 tipos de aminoácidos encontrados nas células. Brenner e colaboradores no final dos anos 50 e início dos 60. não se sobrepõe. o primeiro parágrafo do trabalho publicado em 1961 por Crick e colaboradores. as vírgulas entre os códons seriam representadas por uma das bases. já que 42 = 16. 2. já que 43 = 64. o segundo por BDA.. If the starting point is displaced by one base. onde analisaram uma mutação induzida por proflavina no bacteriófago T4. redundando na troca do par G-C por A-T. but only four common bases. a guanina que originalmente deveria estar naquela posição teria sido substituída por adenina. less likely. The code is not of the overlapping type.2). os pesquisadores observaram que apenas um aminoácido. Bonato 83 . The sequence of the bases is read from a fixed starting point. and thus becomes incorrect. uracil pareará com adenina e. Cristina M. As evidências de não sobreposição vieram dos trabalhos realizados por alguns pesquisadores que estudavam mutações produzidas no vírus do mosaico do fumo (TMV). Se o código fosse sobreposto. pode converter citosina em uracil e adenina em hipoxantina. como esquematizado a seguir. Brenner e colaboradores. it has often been surmised that the sequence of the four bases is in some way a code for the sequence of the amino-acids. Além disso. O ácido nitroso é um agente mutagênico que causa desaminação das aminas aromáticas e. a multiple of three bases) codes one amino-acid. one particular amino-acid can be coded by one of several triplets of bases. that is. portanto. por vez. suggests that the genetic code is of the following general type: A group of three bases (or. There are no special 'commas' to show how to select the right triplets. a alteração de uma base geraria mudanças em aminoácidos adjacentes da cadeia polipeptídica (Figura 8. Sem Vírgulas As evidências sobre a leitura contínua das trincas estão descritas no trabalho de Crick. Todavia. todas as hemoglobinas humanas anormais estudadas em detalhe até então. Since there are twenty common amino-acids found throughout Nature. In this article we report genetic experiments which. then the reading into triplets is displaced. portanto. na próxima duplicação. ao seqüenciarem as proteínas mutantes da capa do vírus. in general.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS the polypeptide chain of a protein is determined by the sequence of the bases along some particular part of the nucleic acid of the genetic material. A conseqüência disto é que. mostraram alterações em um único aminoácido levando a conclusão de que os códons são lidos sem sobreposição. Os Códons São Lidos a Partir de um Ponto Fixo. por ação de ácido nitroso. together with the work of others. além de restringir o tipo possível de vizinhos para cada aminoácido. This determines how the long sequences bases are to be correctly read off as triplets. The code is probably 'degenerate'." Os Códons São Lidos Sem Sobreposição A análise das seqüências de proteínas mutantes obtidas de células tratadas com diferentes agentes químicos levou ao entendimento de como agiam os mutagênicos utilizados e de como o código genético funcionava. era alterado como resultado do tratamento com ácido nitroso. 4). O gene rIIB controla a morfologia das placas de lise. 84 Cristina M. mas multiplicam-se em E. A inativação do produto gênico rIIB provoca uma lise rápida das bactérias. Tratamento com proflavina. localizada no gene rIIB. Estas regiões são denominadas placas de lise. coli provoca lise celular produzindo milhares de partículas fágicas (vide Transferência de informação genética em bactérias). desorganizando a leitura dos códons a partir do ponto do evento (Figura 8. coli B e K12 (Figura 8. 3. a qual multiplica-se nas duas hospedeiras. não estava ocorrendo substituição de bases mas sim inserção ou deleção de nucleotídios. produzindo-se placas de lise maiores que as do selvagem. Mutantes FC0 não multiplicam-se no hospedeiro E. designada FC0.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Proflavina é um agente mutagênico que intercala na molécula de DNA provocando deleção ou inserção de nucleotídios. então. coli B. ou seja. coli K12. Os pontos claros marcam os locais onde partículas fágicas individuais se multiplicaram resultando na lise das bactérias destas regiões. não comprometem totalmente a função dos genes. diferindo da ação dos análogos de base que. a leitura à direita da inserção. provoca uma mutação no fago T4. O fago T4 é um fago lítico. ao substituirem uma base por outra.3). O fato da proflavina provocar ausência completa de função sugeria que. Os pesquisadores haviam observado que proflavina gerava mutantes completamente não funcionais para o gene em questão. quando infecta a bactéria E. O gene foi nomeado r. produzindo placas de lise muito maiores que as produzidas pela linhagem selvagem do fago. Considerando que uma mutação tenha sido produzida pela inserção de uma base na seqüência selvagem. por causa da lise rápida observada nos mutantes. Figura 8. estaria deslocada de uma base e geraria um produto completamente alterado daí para frente. Portanto. a retomada da fase de leitura dependeria da deleção de um nucleotídio. provavelmente. Bonato . E. o que explicaria a ausência de função em mutantes produzidos pela ação de proflavina. o código é degenerado. trinca a trinca. a partir de um ponto inicial. Assim. coli. A nova mutação era antagônica à original. resultando nas diferentes morfologias das placas de lise. Indicavam também que cada uma das 64 trincas possíveis poderiam codificar um aminoácido e. só retomando com a deleção de outro C (-) mais à frente. se a mutação FC 0 fosse uma inserção. ou seja. B e C representa uma base diferente do ácido nucléico. Porém. Estas observações confirmavam a hipótese de que o código genético é representado por trincas. Quando duas mutações de mesmo tipo (+. sem nenhuma pontuação entre elas. A explicação dada pelos autores ao fenômeno observado foi a seguinte: uma seqüência de bases é lida. está representada pelos col-chetes. quando três mutações de mesmo tipo são combinadas. Esta região está fora de fase. o produto sintetizado no revertente será mais semelhante ou menos semelhante ao do selvagem. a mutação supressora seria uma deleção. ocorriam inserções ou deleções em posições diferentes. 4. Cada uma das letras A.-) são combinadas. deveria ocorrer adição ou deleção de um nucleotídio no momento da replicação. neste segmento (vide Figura 8. dependendo se a mutação original fora causada por uma deleção ou inserção. portanto. Para simplificar está representada uma seqüência repetida de bases ABC. sempre ocorre alteração no quadro de leitura. permitindo que o fenótipo mutante fosse suprimido. A idéia era que. A fase de leitura. Uma mutação que suprime o efeito da outra dentro de um mesmo gene provoca uma supressão intragênica. buscaram por indivíduos que tivessem revertido para o fenótipo selvagem (placas pequenas de lise). O Código Genético é Constituído de Trincas e é Degenerado Nos fagos revertentes FC0 a morfologia das placas de lise é variável porque depende da região compreendida entre as duas mutações. readquirindo a capacidade de infectar as duas linhagens de E. respectivamente. Dependendo das alterações sofridas por este segmento. Partindo do mutante FC 0 (placas grandes de lise). a partir de um ponto fixo localizado à esquerda. resultante do tratamento com proflavina. codificando um polipeptídio onde todos os aminoácidos são idênticos.+) ou (-. a leitura saiu de fase. Bonato 85 . Isolaram 18 revertentes da mutação FC 0.4). nos revertentes. implicando que a leitura é feita em conjuntos de três à partir da esquerda. porém não muito distantes das originais. Observaram então que. o que implica na codificação de aminoácidos diferentes do selvagem. livre de vírgulas. Com a adição do nucleotídio C (+). para reverter ao fenótipo selvagem. Cristina M.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 8. o fenótipo selvagem pode ser restaurado. MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 8. para saber a posição de cada nucleotídio no gene. em seguida. Uma vez que o cromossomo da célula infectada pelo fago defectivo contem um fragmento homólogo de DNA. Por outro lado. Bonato . ainda não estava desenvolvida a técnica de seqüenciamento gênico. A freqüência de recombinação entre os diferentes mutantes trpA permitiu construir um mapa determinando-se a posição das diferentes mutações no gene trpA (mapa genético). Um dos grupos de pesquisa envolvidos na resolução deste problema isolou e analisou uma série de mutantes do gene trpA. nesta época. será possível a recombinação entre o segmento carregado pelo fago e aquele presente no cromossomo da bactéria. constituída de 286 resíduos de aminoácidos. converte indol glicerol fosfato em triptofano. foi utilizada a técnica de impressão digital (fingerprint) ou mapa peptídico. 1964). algumas (1/1000) das partículas fágicas produzidas poderão carregar um fragmento do cromossomo bacteriano (veja Transferência da informação genética em bactérias). o qual codifica a enzima triptofano sintetase (Charles Yanofsky et al. Uma vez que. clivá-la com enzimas proteolíticas para obter peptídios e 86 Cristina M. Quando uma bactéria é infectada por um fago e. Esta enzima. lisada. Transdução é o processo de transferência de informação genética de uma bactéria para outra via fago. Yanofsky e colaboradores fizeram um mapeamento genético usando a técnica de transdução. A adição ou a deleção de três nucleotídios recupera o qua-dro de leitura. de E. Esta técnica consiste em purificar a proteína. em cada uma das proteínas mutantes. Tais partículas fágicas (fagos defectivos) podem injetar este segmento de DNA em outra célula bacteriana. 5. para saber qual a alteração causada pelas mutações. coli. O Gene é Colinear ao Peptídio que Ele Codifica A demonstração pontual de que a seqüência de códons corresponde exatamente a seqüência de aminoácidos na proteína foi feita no início dos anos 60. Mutantes neste gene não sintetizam triptofano. uma vez que os introns não são traduzidos. Open Reading Frames). Em vermelho estão especificadas as substituições ocorridas nos diferentes mutantes analisados. que a seqüência de aminoácidos na proteína pode ser lida diretamente a partir da seqüência de nucleotídeos no gene. onde NDP representa um ribonucleosídio difosfato: • (RNA)n + NDP  (RNA)n+1 + Pi Cristina M. permitiu desenhar o mapa peptídico. Posteriormente.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS separá-los por eletroforese e cromatografia. A que aminoácido cada uma delas correspondia? Atualmente. a descoberta de que os genes podem ser fragmentados. da triptofano sintetase. alertava para o fato da colinearidade estava restrita aos módulos codificadores. A posição ocupada pelos fragmentos peptídicos durante a migração no suporte de separação. nos diferentes mutantes. O sequenciamento das manchas com migração alterada. 6. Em seguida a seqüência de aminoácidos de cada um é determinada. Os resultados mostraram que a posição das mutações no gene correspondia à posição ocupada pelos aminoácidos alterados. ou seja. isolaram da bactéria Azobacter vinelandii. depende dos aminoácidos que os constituem. Bonato 87 . Conclui-se. então. como o código já foi desvendado e a técnica para seqüenciamento de genes já está automatizada.6). por ele especificada. Segmentos de DNA que contem informação potencial para codificar um peptídio são denominados quadros de leitura aberta ou ORFs (do inglês. Após determinar as propriedades do Código Genético restava elucidá-lo. Decifrando o Código Genético: Homopolímeros e Copolímeros Aleatórios Em 1955. Grunberg-Manago & Ochoa. Figura 8. Os fragmentos que contiverem o aminoácido alterado migrarão de forma diferente do selvagem. é possível seqüenciar genomas inteiros e identificar todos os segmentos passíveis de codificarem proteínas atribuindo-se a cada um destes fragmentos de DNA a seqüência putativa de aminoácidos nele codificada. na cadeia polipeptídica (Figura 8. posicionando-se num ponto específico do suporte (spot). Colinearidade do gene trpA e cadeia polipeptídica a. descobrir qual era o significado de cada uma das possíveis 64 trincas. Os spots (manchas) são então cortados e eluídos do suporte onde se encontram. apresentando regiões codificantes (exons) e não-codificantes (introns). uma enzima capaz de juntar ribonucleotídios na reação esquematizada abaixo. 04 para cada 0. Em 20 tubos de ensaio contendo os requisitos necessários à síntese proteica. GGG Códon UUU UUG. Tabela 8.76:0. respectivamente. Incorporação de aminoácidos estimulada por um copolímero aleatório de U e G numa razão molar 0.24.76 x 0. em presença de lisina (Lys) e prolina(Pro) marcadas. Nos casos de mRNA poli A e mRNA poli C.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Esta enzima. Conhecendo esta enzima. denominada polinucleotídio fosforilase. Ligando Trincas Específicas aos tRNAs Em 1964 Nirenberg & Leder verificaram que trincas de nucleotídios são capazes de promover a ligação de aminoacil-tRNAs específicos aos ribossomos. UGU ou GUU (2 UU e 1 G) é 0. Para elucidar o significado das outras trincas foram sintetizados copolimeros aleatórios.76 x 0. que era diferente em cada tubo. precipitado protéico radioativo foi encontrado.14 para cada 0. recuperava uma quantidade significativa de radioatividade no precipitado protéico do tubo que recebera fenilalanina (Phe) radioativa.44.76 = 0. 1.. AAA especifica lisina Lys e CCC especifica Pro. O homopolímero poli U (mRNA poli U).01 100 32 9 2 Aminoácido Phe Quantidade Relativa aminoácido incorporado 100 de Leu ou Cys Leu 36. uma dada trinca e uma mistura de tRNAs 88 Cristina M. GGU GGG a Probabilidade de Incidência Ocorrência Relativa 0.1). poli A e poli C. Se apenas um tipo de ribonucleosídio estiver disponível. Quando o aminoacil-tRNA liga-se ao ribossomos. pg 964.24 x 0. Com estes homopolímeros fizeram ensaios de síntese protéica "in vitro". A utilização de diferentes copolímeros permitiu que se inferisse os códons para alguns aminoácidos e comprovou o fato do código ser degenerado.76 x 0. UUU é códon para Phe. Bonato . Cys 35. • UUG. Gly 12 - Incidência relativa é aqui definido como 100 x probab. Os ensaios foram feitos em tubos contendo ribossomos.76 x 0.24 = 0. Nirenberg e Matthaei sintetizaram três tipos de homopolímeros de RNA: poli U.44. a probabilidade de uma trinca desta mistura ser • UUU é 0. sintetizará um homopolímero.14 para cada uma das configurações possíveis. ligando aleatoriamente os ribonucleosídios difosfatados disponíveis. portanto. misturando-se a enzima polinucleotídio fosforilase com quantidades diferentes de cada tipo de nucleotídio. GUG. 1995. adicionavam um dos homopolímeros e uma mistura de 19 aminoácidos não marcados + 1 marcado radioativamente. Assim. não utiliza um molde para sintetizar a nova molécula. Adaptado de Voet & Voet.24 x 0. Val 37 ou Val Trp ou Gly Trp 14. UGU. ocorrência/0. Logo. Difere. fica retido no filtro. Utilizaram um filtro de nitrocelulose cujos poros eram suficientemente pequenos para impedir a passagem dos ribossomos mas não dos aminoacil-tRNAs livres. ao misturar 76% de U e 24% de G. • GGG é 0.44 0. da RNA polimerase.01 (Tabela 8. GUU UGG. Por ex.24 = 0. 8). em cada caso.Ile(I). Nos casos B) e C) são gerados apenas tripeptídeos com as composições de aminoácidos Ile(I). 8. Os aminoacil-tRNAs não ligados atravessam o filtro. três homopolímeros diferentes poderiam ser especificados. Bonato 89 . Figura 8. Ser(S). alanina ou leucina (Figura 8.Leu(L). gerando. num poli UGC.ex. Arg(R) e Val(V). Analise os três copolímeros abaixo: No caso A) é gerado um polipeptídio onde 4 aminoácidos se repetem em seqüência: Tyr(Y).7). No tubo contendo o aminoacil-tRNAcognato. O aminoacil-tRNA complementar à trinca liga-se a ela. Códons de Terminação e Iniciação A utilização de tetranucleotídios repetidos permitiu a identificação dos códons de terminação. gerando homopeptídios de cisteína. Ensaio de ligação do tRNA à trinca específica. Cerca de 50 códons foram determinados neste ensaio de ligação. Asp(D).. um polipeptídio diferente. Este procedimento foi repetido para os vinte aminoácidos (Figura 8. marcado radioativamente. Uma trinca de ribonucleoídios associa-se ao ribossomo e captura o aminoacil-tRNA cognato. uma vez que a leitura do polímero pelos ribossomos pode acontecer em três fases possíveis (UGC UGC UGC UGC ou GCU GCU GCU GCU ou CUG CUG CUG CUG). P. Um mRNA pode ser lido em qualquer um dos três quadros de leitura.Ser(S). Este complexo não atravessa o filtro de nitocelulose. será possível detectar radioatividade aprisionada ao filtro. Cristina M. A resolução do Código finalmente foi completada por Khorana. Figura 8. 7.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS carregados com seus respectivos aminoácidos. sendo que apenas um dos aminácidos daquela mistura estava marcado radioativamente. utilizando poliribonucleotídos de trincas conhecidas e repetidas em seqüência. não provocam mudanças de aminoácidos sendo fenotipicamente silenciosas. Isto porque UAG e UAA são sinais de parada da síntese protéica. Os outros são especificados por 4 ou 2 códons. GUG é um iniciador mais raro. Códons que especificam o mesmo aminoácido são denominados sinônimos. Acredita-se que grande parte das variações genéticas observadas entre indivíduos de uma população humana (polimorfismo) seja decorrente de alterações em um único nucleotídio no gene. mutações na 3a posição. I e V. O códon AUG inicia a cadeia polipeptídica na maioria dos casos. Bonato . • A maioria dos sinônimos difere apenas na 3a posição e. • O código é altamente degenerado.. Os códons de terminação UAA. Assim. Algumas variações em torno da regra são encontradas (veja Universalidade do Código Genético). porque basea-se em propriedades do código. • Códons com pirimidinas na 2a posição codificam. sendo que três aminoácidos. aminoácidos hidrofóbicos (verde). Observando estes códons verifica-se que se os códons codificando os aminoácidos hidrofóbicos F. amber (UAG) e opala (UGA). Freqüentemente são denominados ochre (UAA). especificando metionina (AUG) e valina (GUG). A maioria das mutações que levam a substituição de um aminoácido por outro na cadeia polipeptídica são provocadas pela mudança de uma única base. Arg. exceto os que possuem 6 códons e. aminoácidos polares. ou seja. Tabela do Código Genético O arranjo da tabela do código não é aleatório. portanto. Leu e Ser podem ser especificados por 6 códons cada. UUU. São três os códons de terminação. UGA é outro sinal de parada. recebendo a denominação SNP.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Lys(K). Tabela do Código Genético 1a posição U UUU U UUC UUA UUG C CUU CUC Phe(F) Leu(L) Leu(L) UCU UCC UCA UCG CCU CCC Pro(P) Ser(S) C UAU UAC UAA UAG CAU CAC 2a posição A Tyr(Y) TERM His(H) UGU UGC UGA UGG CGU CGC G Cys(C) TERM Trp(W) Arg(R) U C A G U C 3a posição 90 Cristina M. ocupam mais de uma caixa. Códons com purinas na 2a posição codificam. bastante diferente das condições fisiológicas. por esta razão são denominadas mutações de ponto. em geral. p. do inglês single nucleotide polymorphism. ex. respectivamente. em geral. num único ponto do polímero de ácido nucléico e. Aparentemente o código evoluiu de modo a minimizar os efeitos deletérios das mutações. Somente metionina e triptofano são especificados por um único códon. acontece "in vitro". em geral. A síntese de proteínas a partir dos polímeros sintéticos acima descritos como. Estes mesmos códons são encontrados em posições internas do gene. assim. sob condições muito altas de Magnésio. sofrerem mudanças na 1a ou 3a posição continuarão codificando aminoácidos com características similares de sorte a preservar o funcionamento da proteína resultante. UAG e UGA são denominados códons sem sentido (nonsense) porque são os únicos códons que não especificam nenhum aminoácido. que não possui o iniciador. L. estão agrupados na mesma caixa da Tabela. que qualquer seqüência de nucleotídios apresente três fases potenciais de leitura. também ocorrem variações em relação ao padrão. A preferência de códons (codon usage.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS CUA CUG AUU A AUC AUA GUU G GUC GUA GUG Val(V) Ile(I) CCA CCG ACU ACC ACA GCU GCC GCA GCG Ala(A) Thr(T) CAA CAG AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG Gln(Q) Asn(N) Lys(K) Asp(D) Glu(E) CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG Gly(G) Ser(S) Arg(R) A G U C A G U C A G AUG Met(M) ACG A Universalidade do Código O fato de ser possível traduzir genes de um organismo em outro. em mitocôndrias de mamíferos o códon para a Met iniciadora pode ser AUG ou AUA (Ile no padrão). ou 2) a ambiguidade CUG seria vantajosa. ao invés de especificarem parada. p. Nas mitocôndrias de plantas. isto é. foi relatado em Candida spp (Santos et al. onde a seqüência de um gene está completamente contida na seqüência de um gene maior. o estudo de diferentes seqüências de DNA a partir dos anos 80 revelaram algumas divergências em relação ao padrão. uma dada seqüência poderia codificar até três polipeptídios diferentes. um códon codificando mais de um aminoácido. codificam Gln.2 era universal. coli. devendo ser mantida como tal. permitindo rápida adaptação a desafios ambientais. os códons UAA e UAG. sugeria que o código padrão apresentado na tabela 8.. Drosófila e protozoárias. se bem que amplamente utilizado. 1998). não é universal. Todavia. em inglês) nos permite fazer conjecturas acerca da origem de determinados genes dentro de um grupo taxonômico. UGA especifica Trp e não terminação. genes humanos. Nos protozoários ciliados. Em bactérias pode-se observar sobreposição nos terminais de genes que pertencem ao mesmo operon: o terminal de um gene sobrepõe-se ao início do próximo. Em Borrelia burgdorferi . em relação à utilização de códons. Estas são algumas das evidências de que o código genético padrão. fungos. as alterções no Código Genético ainda não estariam completamente estabelecidas. Mas. em E. Mais recentemente podese verificar preferência de códons dentro de um mesmo genoma dependendo do posicionamento dos genes. Este tipo de organização do genoma foi encontrado no fago fX174. Logo. ex. o seqüenciamento dos genomas nos permitiu verificar que existe uma preferência por determinados códons de acordo com os grupos taxonômicos. lido em outro quadro de leitura e codificando proteínas não relacionadas (Figura 8. Bonato 91 .8). denotando ambigüidade e nos remetendo as seguintes questões: 1) em Candida. em princípio. 1997). Ainda. No caso citado. a existência de códons polissêmicos. eucariotos unicelulares. CUG codifica tanto Leu como Ser. AGA e AGG especificam terminação e não Arg. sobreposição completa de um gene só foi detectada em fagos pequenos de Cristina M. Genes sobrepostos: O fato dos códons serem lidos sem pontuação e de cada códon ser uma trinca. Além disto. Por exemplo. permite. genes localizados na fita líder (leading) de duplicação do DNA apresentam uma preferência diversa daqueles localizados na fita lenta (lagging). revelando um novo paradigma para seleção de códons em procariotos (McInerney. no início da cadeia de mRNA.Glu -Asp . abaixo? Assuma que a tradução se inicia no primeiro códon de iniciação transcrito. Figura 8.Leu . com uma única mutação de ponto mudam para um códon âmbar (UAG)? 92 Cristina M.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS DNA fita simples.CGAUGCGAACCACGUGAUAAGCAU . sempre que possível. dos mRNAs que especificam os dois peptídios.His . Região do genoma de fX174.Gln – Asp Quais as propriedades do código genético? A impressão digital (fingerprinting) de uma proteína de um mutante fenotipicamente revertente do fago T4 indica a presença de um peptídio alterado em relação ao selvagem: Selvagem: Cys-Glu-Asp-His-Val-Pro-Gln-Tyr-Arg Mutante: Cys-Glu-Thr-Met-Ser-His-Ser-Tyr-Arg Explique como surgiu o mutante e dê as seqüências. Note que o gene B está completamente contido em A. Bonato .3’ • Transcreva a fita molde indicando seu sentido • Transcreva a fita codificadora indicando seu sentido • Deduza a seqüência de aminoácidos. este pequeno segmento do DNA executa uma tarefa tripla. o gene E está completamente contido em D. indicando o terminal amino e carboxila • Deduza a seqüência de aminoácidos caso haja a inserção de um A. Também. 5’TCTGACTATTGAGCTCTCTGGCACATAGCA3’ A seqüência abaixo é um mRNA: 5’ . como fX174. os terminais dos genes D e E sobrepõem-se a seqüência controle de iniciação da tradção do gene J. Este tipo de organização permite o uso máximo daquela quantidade de DNA. Além disto. 8. que é a quantidade disponível para ser empacotada em seus capsídios. Quais são os aminoácidos especificados por códons que. Qual seria a seqüência possível de um mRNA que codificasse o polipeptídeo abaixo? (Indique as variações) His . Logo.Thr . Guia de Estudos Qual é o polipeptídio especificado na fita molde de DNA.Trp . . ala. leu... val. ile.. his Murante 2: gly... ser. cys... prolina ou leucina.. ala. a seqüência correspondente a esta região é: Ser-Lys-Tyr-Arg-Gln-Ala-Gly. ala. provavelmente.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS O mRNA especificando a cadeia a da hemoglobina humana contem a seqüência: . ser. ser. his. Mutante 1: gly. o códon utilizado para histidina? Cristina M... Numa hemoglobina mutante.UCCAAAUACCGUUAAGCUGGA. ser Qual é a provável seqüência de bases no RNA normal? Uma proteína normal tem histidina numa dada posição.... que codifica o tetrapeptídio C-terminal da cadeia anormal: Ser-Lys-Tyr-Arg... ala. ala. Quais os possíveis códons para estes aminoácidos e qual era.. phe Mutante 3: gly. Quatro mutantes foram isolados com os seguintes aminoácidos na posição da histidina: tirosina. leu. Bonato 93 . leu. glutamina. phe.. cys.. Que tipo de mutação provocou esta alteração? Um segmento de uma proteína normal e de três mutantes aparece abaixo: Normal: gly. a função do tRNA é assegurar que cada um dos aminoácidos incorporados na proteína corresponda ao seu códon particular na molécula de mRNA. Hipótese do adaptador. necessária à ocorrência da tradução: carrega um aminoácido. 1. Figura 9. 94 Cristina M.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Capítulo 9 – TRADUÇÃO EM BACTÉRIAS A Molécula Adaptadora A molécula de tRNA preenche todas as características da molécula adaptadora proposta por Crick.1). Desta forma. que aí se ligou por ação enzimática e reconhece o códon correspondente por complementaridade de bases (Figura 9. Bonato . deixando livre a seqüência 5´CCA 3´ que é constante em todos os tipos de tRNAs. Variações nesta estrutura são encontradas nos tRNAs mitocondriais de mamíferos. Não está claro qual é a função destas modificações. A partir de então. de fato. de leveduras. • O braço TyC posiciona-se próximo ao terminal 3´. • Entre o braço TyC e o braço do anticódon. incidindo sobre os braços D e T. centenas de moléculas de tRNA de diferentes organismos já foram seqüenciadas. encontrada em procariotos e eucariotos (núcleo. Bonato 95 . que atua no terminal 5´ dos tRNAs é uma ribozima. A RNase P. algumas bases dos terminais 3´ e 5´ da molécula estão pareadas. coli contem aproximadamente 60 genes para tRNAs. Estrutura planar e estrutura terceária do tRNA. para as aminoaci-tRNA sintetases. resultante de pareamento intramolecular. constituem a outra perna. onde o braço aceptor e o braço TyC constituem uma perna do L e os braços D e do naticódon. 2. Análises de cristalografia sugerem que as moléculas de tRNA assumem uma estrutura terceária na forma de um L. possui atividade catalítica. metilguanosina. Os transcritos iniciais dos tRNAs apresentam seqüências extras nos terminais 3´ e 5´ as quais são retiradas por diferentes RNases. Os cromossomos de E. • Oposto ao braço aceptor encontra-se o braço do anticódon.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS A primeira molécula de tRNA a ser seqüenciada foi tRNAAla. ou seja. inosina. Esta ribozima apresenta um componente ribonucléico e um componente protéico. Ao grupo 3´ OH ou 2´OH livre do adenilato terminal conecta-se o aminoácido específico. Figura 9. Nos eucariotos são encontradas várias centenas de genes para tRNAs. Os outros encontram-se agrupados em diferentes posições do cromossomo e o transcrito inicial pode incluir vários tRNAs. variando na faixa de 60 a 95 (18 a 28kDa). Algumas foram associadas à restrição ou expansão no reconhecimento do códon. produzindo três estruturas tipo haste/alça e uma haste. A molécula de tRNA pode ser representada na forma de uma folha de trevo. os 3 nucleotídios complementares ao códon da molécula de mRNA. Cristina M.2). • No braço aceptor de aminoácido. Este braço não está presente em todos os tRNAs (braço extra). caracterizando os quatro braços da molécula (Figura 9. etc. • O braço DHU posiciona-se próximo ao terminal 5´. alguns dos quais participam dos operons de rRNA. Outras seriam necessárias como elementos identificadores. mitocôndria e cloroplastos). flagelados e nematóides. Um grande número de bases nos tRNAs são modificadas após a sintese da molécula gerando diidrouridina (D). em 1965. pseudouridina (y). encontra-se um braço de tamanho bastante variável quando se comparam os diferentes tRNAs. Em geral apresentam 76 nucleotídios. mas é o RNA que. espalhados no genoma. é típico de cada organismo a preferência de códons dentre os vários possíveis num sistema degenerado. 5’GCC3’ e 5’GCA3’. com o anti-códon 5’IGC3’. Ele assumiu que os dois primeiros pares códon-anticódon. na interação códonanticódon. os quais são excisados antes da molécula migrar para o citoplasma. não existe um tipo de tRNA para cada códon. Todavia. Hipótese Oscilatória Nem sempre é necessário um pareamento perfeito entre as bases. 1966). Para explicar como o anticódon de um dado tRNA pode reconhecer códons degenerados Crick propôs a hipótese oscilatória (wobble)(Crick. correspondentes aos 61 códons. Em E. Outra característica de eucariotos é que os tRNAs são transcritos sem a seqüência CCA típica do terminal 3´ de todos os tRNAs. podem ser reconhecidos dois ou três códons. ex.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Muitos transcritos primários para tRNAs de eucariotos contem introns adjacentes ao braço do anticódon. Se isto fosse imprescindível. Tabela 9. pode parear com 5’UUC3’ e 5’UUU 3’ (lembre-se que as fitas são antiparalelas). todavia. maior será a eficiência de tradução dos mesmos. O 3o par. as células contem apenas cerca de 30 a 40 tRNAs diferentes em bactérias e ~50 em eucariotos.códon G U A ou G U ou C U. com variação na 3a posição (Tabela 9. a qual será adicionada posteriormente. utilizando CTP e ATP como substrato. É interessante observar que esta quantidade está associada à preferência dada por um organismo na utilização de certos códons.1).anticódon C A U G I Base 3' .. Ou seja. Quando U.1 Pareamentos permitidos na 3a posição Base 5' . podia apresentar oscilação no pareamento. G ou I ocupam a 1a posição do anticódon. dentro da célula.ArgRS. de cada espécie de tRNA isoaceptor varia de acordo com o organismo. Portanto. obedeciam o pareamento normal Watson-Crick. A quantidade. Quanto maior a quantidade de tRNAs para estes códons. observa-se que a 3a base do códon é menos restritiva que a 1 a e a 2a. pode parear com 5’GCU3’. leucil t96 Cristina M. • O tRNAAla. para cada um dos 20 tipos de aminoácidos (p. Analisando o código genético. pelo menos. as células deveriam possuir 61 tipos de tRNAs. Por exemplo: • O tRNAPhe com o anticódon 5’GmAA3’. pela enzima tRNA nucleotidil transferase. arginil t-RNA sintetase . Bonato . C ou A As Aminoacil tRNA Sintetases As enzimas aminoacil tRNA sintetases são responsáveis pela ligação correta de cada aminoácido a seu tRNA correspondente. coli existe uma amino acil tRNA sintetase. ou seja. gerando aminoacil-tRNA + AMP. respectivamente. ao grupo 2’OH ou 3’OH do adenilato livre no terminal 3’ da molécula. As evidências atuais são de que os identificadores de cada um dos tipos de tRNA encontram-se no braço aceptor e na alça do anticódon (Figura 9. • Ligação do aminoacil-AMP ao tRNA. Uma vez que todas estas enzimas exercem o mesmo papel. catalisadas pela mesma aminoacil t-RNA sintetase são necessárias. Uma enzima particular reconhece um aminoácido particular e todos os tipos de tRNAs que transportam aquele aminoácido (Como o código genético é degenerado.3). Interação do tRNA com a enzima aminoacil tRNA sintetase (AARS) Acoplando o Aminoácido ao tRNA Específico Para carregar um tRNA específico com o aminoácido correto duas reações consecutivas. "carregar" o t-RNA com o aminoácido correto e. gerando aminoacil adenilato (aminoacil-AMP) + PPi. variando de proteínas monoméricas à tetraméricas. 3.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS RNA sintetase . Em eucariotos existe um conjunto de pelo menos 20 diferentes aminoacil t-RNA sintetases nucleares e um outro conjunto mitocondrial. considerando-se que os diferentes tipos de tRNAs tem estrutura bastante similar. Figura 9. Geralmente. Elas são um grupo bastante heterogêneo. este não é o caso. utilizando-se energia de hidrólise de uma molécula de ATP: • Ativação do aminoácido ao reagir com ATP. esperava-se que as enzimas também apresentassem uma estrutura similar.. p. é a face interna (côncava) do L que interage com as aminoacil t-RNA sintetases. que serão reconhecidos por diferentes anti-códons e. de acordo com sua habilidade de conectar o aminoácido. existem diferentes códons para leucina. Bonato 97 . diferentes tRNAs).LeuRS. etc). I e II. ex. portanto. Os diferentes tipos de amino acil tRNA sintetases pertencem a duas classes. Cristina M. Todavia. Se o aminoácido errado (nãocognato). o alanil-tRNACys agrega alanina aos polipeptídios em resposta ao códon de cisteína no mRNA. a seqüência de aminoácidos ficará alterada uma vez que o reconhecimento do aminoacil tRNA é via pareamento códon-anticódon. transitoriamente. No momento da síntese "in vitro". tRNAS e mRNAs. Este fenômeno foi demonstrado experimentalmente da seguinte forma: um resíduo de cisteína ligado ao tRNACys. Ribossomos. tornando-se alanil-tRNACys (Figura 9. Assim. alanina passa a ocupar posições que deveriam ser ocupadas por cisteína. de sorte que. foi modificado para alanina. no polipeptídio. 98 Cristina M. O confinamento das moléculas envolvidas no processo de síntese torna-o extremamente eficiente.4). as Máquinas Tradutoras O processo de síntese protéica está confinado à complexas e abundantes estruturas ribonucleoprotéicas denominadas ribossomos. sem qualquer envolvimento do aminoácido. às quais se agregam. 4. ligar-se ao tRNA. Figura 9. Demonstração experimental de que o pareamento codonanticódon direcio-na a adição de aminoácidos ativados durante a síntese protéica. a tradução correta do código genético em proteínas depende de dois eventos de reconhecimento por parte do tRNA: reconhecer o aminoácido ativado e reconhecer o códon equivalente no mRNA. Isto significa que somente o anticódon do aminoacil-tRNA participa do processo de reconhecimento do códon. Bonato . cisteinil-tRNACys.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS O processo de aminoacilação do tRNA é altamente específico. Se bem que a seqüência primária de cada tipo de rRNA varie consideravelmente entre diferentes organismos. A subunidade pequena (30S) é constituída de uma molécula de rRNA 16S e 21 tipos de proteínas. o que era de se esperar de proteínas interagindo intimamente com moléculas polianiônicas como o RNA. Os Estágios da Tradução Três estágios podem ser considerados no processo de síntese protéica: iniciação. 16S. Subunid. seguidas de um número indicativo de sua posição no gel após corrida eletroforética em duas dimensões. A subunidade pequena (40S) é constituída de ~ 33 proteínas e de uma molécula de rRNA 18S (1900 nucleotídios). Large) e S (do inglês. coli. grande. as proteínas das subunidades grande e pequena são designadas. Cerca de 50 proteínas fazem parte desta subunidade. os quais assemelham-se aos de bactéria. 30S Massa: 930 kDa RNA: 16S Proteínas: 21 Ribossomo. O rRNA 16S consiste de 1542 nucleotídios com pareamento intramolecular. A subunidade grande (60S) é constituída de 3 espécies de rRNA: 28S (4. alongamento e terminação. uma vez que o genoma já foi completamente sequenciado. A maioria das proteínas ribossômicas é rica nos aminoácidos básicos Lys e Arg.5 x 106 Da. Bonato 99 . com os prefixos L (do inglês. Cristina M. Estas partículas são formadas por duas subunidades desiguais. Por convenção. Small). A subunidade grande (50S) é constituída das moléculas de rRNA 23S e RNA 5S mais 31 proteínas diferentes (Figura 9. A subunidade pequena combina-se com a subunidade grande formando o ribossomo completo (70S) Os ribossomos de eucariotos (80S) são maiores e mais complexos que os de E. respectivamente. pequena. 70s Massa: 2520 kDa RNAs: 23S. coli já está determinada.8S (160 nucleotídios) e 5S (20 nucleotídios). contendo poucos resíduos aromáticos. com coeficiente de sedimentação 70S e massa aproximada de 2.800 nucleotídios). O rRNA 5S é constituído de 120 nucleotídios e o 23S de 2904 nucleotídios. Os cloroplastos e mitocôndrias também possuem ribossomos.5). A seqüência de aminoácidos de todas as 52 proteínas ribossômicas de E. determinando uma estrutura secundária complexa com 4 domínios bastante conservados. a estrutura secundária que acabam adotando é muito similar em todos os casos analisados. 50S Massa: 1590 kDa RNAs: 23S e 5S Proteínas: 31 Subunid. 5. coli são partículas esferóides de ~250 Å. A estrutura da molécula de RNA determina sua interação com as proteínas ribossômicas e a própria conformação da subunidade ribossômica pequena. 5. 5S Proteínas: 52 Figura 9.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Os ribossomos de E. coli. o outro tRNAMet.) . está centrada a cerca de 10 nucleotídios do ponto de início da tradução. designado formilmetionil-tRNAfMet ou fMet-tRNAfMet. Um deles.3' 5' CAGGAGCAAA -(4 nucl. o sítio de iniciação da síntese protéica.AUG . é parcialmente complementar a uma seqüência do terminal 3´ do rRNA 16S. inicia a cadeia. mRNA da replicase do fago Qb mRNA da prot. com o terminal 5´ da molécula de mRNA a ser traduzida. a iniciação requer a presença de metionil-tRNAMet. Uma vez que o aminoácido iniciador é sempre uma metionina. 1974). L10 mRNA do trp leader Terminal 3' do 16S rRNA 5' UAAGGAUGAA-(5 nucl. O Complexo de Iniciação da Tradução Ribossomos intactos (70S) não se ligam a novos mensageiros para iniciar a síntese protéica.AUG. da subunidade pequena. 6. É necessário que as subunidades se dissociem. cujo códon é AUG (códon de iniciação).).. a interação inicial entre a molécula de mRNA.. Em E.6).MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS A iniciação implica na ativação do aminoácido iniciador.3' 3' AUUCCUCCAC . O pareamento entre as duas moléculas não é absoluto e devem ser considerados pares G. denominada seqüência Shine-Dalgarno (a dupla de pesquisadores que a identificou). mas somente o metioniltRNAiMet pode se ligar à subunidade pequena do ribossomo para iniciar a síntese protéica.U.. incorpora metionina na cadeia crescente. coli..5' Em E. Estruturas da Metionina e N-formil metionina.7) requer os seguintes passos: 100 Cristina M. o grupo amino da metionina do metionil-tRNAiMet é modificado pela adição de um grupo formil sendo. A mesma aminoacil-tRNA sintetase acopla metionina aos dois tipos de tRNA.) . este aminoácido não é encontrado no terminal amino de todas as proteínas funcionais uma vez que é modificado ou removido após a síntese.(4nucl.) . algumas vezes. ribos. IF2 e IF3). é identificado pela interação do terminal 3´ do rRNA 16S. o tRNAiMet. no mRNA. na molécula de mRNA. Em bactérias. O aminoácido iniciador é a metionina. Apesar da síntese protéica sempre iniciar com metionina.. Figura 9. a subunidade pequena do ribossomo e o fMet-tRNAfMet forma o complexo de iniciação de tradução.3' 5' AAAGGGUAUC . Em vermelho. o grupo formil.AUG . A seqüência Shine-Dalgarno. Uma seqüência de nucleotídios no terminal 5´ do mRNA. A enzima responsável pela formilação utiliza N10-formil tetrahidrofolato como doador do grupo formil (Fig. Tal interação é facilitada por proteínas que se associam transitoriamente aos ribossomos conhecidas pelo nome genérico de fatores de iniciação da tradução (IF1. A formação do complexo de iniciação da tradução (Figura 9. 9.(~1400 nucl.. Existem dois tipos de tRNAMet. rica em pirimidinas (Shine & Dalgarno. Bonato . Bonato 101 . 7. • Forma-se o complexo 30S de iniciação: subunidade ribossômica 30S. • O acoplamento estimula IF2 a hidrolisar GTP a GDP + Pi. 50S.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS • O fator de iniciação da tradução. Alongamento da Cadeia de Aminoácidos O alongamento da cadeia (Figura 9. • IF1 aumenta a taxa de dissociação. IF3. IF2GTP e fMet-tRNAfMet). Na iniciação da síntese protéica.8) implica na adição consecutiva de resíduos de aminoácidos aos terminais carboxila do polímero em crescimento. após liberação do fator IF3. acopla-se ao complexo 30S. Iniciação da síntese protéica em E. Este processo que ocorre na Cristina M. cedida por GTP. • O mRNA e o fMet-tRNAfMet ligam-se à subunidade 30S. mRNA. colinear ao 5´ —> 3´ mRNA. IF3. de sorte que o polipeptídio cresce no sentido amino ao carboxila. provocando rearranjo conformacional na subunidade 30S que resulta na liberação dos fatores IF1 e IF2. assessorados por IF3. Figura 9. e assistência do fator IF2 (IF2-GTP + fMet-tRNAfMet). • A subunidade ribossômica grande. o fMet-tRNAfMet ocupa o sítio ribossômico P enquanto o sítio ribossômico A está posicionado para receber o aminoacil-tRNA ingressante cujo anticódon seja complementar ao códon imediatamente adjacente ao iniciador AUG. IF1. • O acoplamento do fMet-tRNAfMet ao mRNA exige energia. coli. liga-se à partícula 70S propiciando a dissociação das duas subunidades. Nesta reação a formil metionina é deslocada para o sítio A. • O complexo EF-Tu.GDP é reciclado pelo fator de elongação EF-Ts. EFTu é uma GTPase porque hidrolisa GTP a GDP + Pi. Este processo é denominado transpeptidação. Terminação da cadeia de aminoácidos 102 Cristina M. A atividade de peptidil transferase reside no rRNA 23S. Bonato . localizada no sítio P.GDP + Pi são liberados. • A enzima peptidil transferase faz a ligação peptídica entre fMet-tRNAfMet. e o aminoacil-tRNA ingressante. formando um complexo ternário com EF-Tu e GTP. ligando-se ao aa-tRNA aí presente. uma ribozima. O peptidil-tRNA. um segundo ribossomo pode ligar-se ao ponto de início. Ciclo de alongamento nos ribossomos de E.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS velocidade de 40 resíduos/s exige a presença de três fatores de alongamento (EF-Tu. O processo de translocação exige a participação do fator EF-G + GTP que liga-se ao ribossomo e só será liberado após hidrólise do GTP. A energia liberada permite o pareamento do códon ao anticódon. coli • O aminoacyl-tRNA liga ao sítio A. no sítio A e o mRNA a ele acoplado por interações códon/anticódon. Uma vez que o sítio de iniciação foi liberado. A seguir EF-Tu. • O tRNAfMet descarregado é transferido para o sítio E do ribossomo e depois descartado. Neste momento o ribossomo está pronto para os ciclos subsequentes de alongamento. EF-Ts e EF-G) e da energia cedida por moléculas de GTP: Figura 9. 8. num processo denominado translocação. movem-se para o sítio P. que substitui GDP por GTP restaurando EF-Tu-GTP o qual voltará a capturar novos aminoacil-tRNAs. localizado no sítio A. ligando este complexo ao ribossomo. portanto. ao invés de um aa–tRNA. Também são descartados os RF. os únicos que não possuem um tRNA correspondente. O fator RF-3. o qual reconhece os tres códons de terminação. Em eucariotos um processo similar ocorre mas requer apenas um fator de liberação denominado eRF. release factors). 9. quando complexada à GTP estimula a ligação de RF–1 ou RF-2 ao sítio A do ribossomo. Com a liberação do peptídeo. os polipeptídeos produzidos são liberados no citoplasma da célula. RF-1 reconhece os códons UAA e UAG. Terminação da tradução em E. os códons de terminação. RF-2 reconhece UAA e UGA. A hidrólise do GTP dissocia o fator do ribossomo Figura 9. UGA ou UAG. RF2 reconhece UAA e UGA.9). Neste momento. uma GTPase. o qual será degradado (Figura 9. Bonato 103 . após hidrólise de GTP a GDP + Pi pela GTPase RF–3 e o mRNA. coli. são reconhecidos por fatores de liberação ou RF (do inglês. o tRNA presente no sítio P fica descarregado e é expelido do ribossomo. Polissomos Cristina M. A ligação do RF ao códon de terminação apropriado induz peptidil transferase a transferir o peptidil–tRNA para a água.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS A tradução de mRNAs termina nos códons de terminação UAA. Em E. RF1 reconhece os códons de termi-nação UAA e UAG. coli. Liga-se ao ribossomo junto com a molécula de GTP. transporte e degradação de proteínas. potencialmente. O termo chaperone molecular foi utilizado pela primeira vez. para descrever a função da nucleoplasmina na montagem ordenada dos nucleossomos. Vários dos chaperones conhecidos são proteínas de choque térmico. proteínas cuja expressão é induzida em resposta à elevação de temperatura. formavam-se os nucleossomos. numa freqüência de 1 ribossomo a cada 80 nucleotídios. Síntese protéica em um polissomo. Uma série de eventos celulares relativos a enovelamento. Quando DNA e histonas de Xenopus eram misturados sob condições fisiológicas de força iônica. Os chaperones moleculares ajudam no enovelamento das proteínas ao interagir com o peptídio nascente. Todavia. associa-se à proteínas especiais denominadas chaperones moleculares cuja função é permitir que os polipeptídios recém-sintetizados adquiram sua estrutura final ativa. Cada ciclo de enovelamento requer energia provida por moléculas de ATP. A nucleoplasmina é requerida apenas para a montagem dos nucleossomos. Bonato 104 . se nucleoplasmina fosse adicionada à mistura. Uma dada seqüência de aminoácidos pode se enovelar. Assim. Figura 9. impedindo interações espúrias com outras moléculas. Muitas destas estruturas poderiam ser não-funcionais e/ou altamente instáveis. compostas de um chaperone molecular principal (o qual se liga promiscuamente à cadeias polipeptídicas nascentes. conforme vai deslizando sobre a molécula de mRNA. como as contas de um colar. Os polissomos são uma evidência de que o sítio de iniciação da tradução é imediatamente ocupado por outro ribossomo assim que o ribossomo inicial desliza sobre a molécula de mRNA liberando o ponto de início. Cada um sintetiza uma cadeia polipeptédica completa.10). 10. ou seja . ocorria precipitação das moléculas.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Tanto em bactérias como em eucariotos. Ela também não carrega nenhuma informação estérica para a montagem dos nucleossomos. em diferentes estruturas. Um dos papéis presumido para proteínas de choque térmico seria o de proteger a célula reparando os danos provocados pelo calor. cuja função seria aumentar a eficiência do processo e permitir a reciclagem (Georgopoulos. o que poderia interfirir na conformação final da proteína (Ellis & van der Vies. em diferentes tipos de células dependem da participação das máquinas chaperônicas moleculares. Chaperones Moleculares Conforme uma cadeia polipeptídica emerge do ribossomo. não participando do produto final. desenoveladas ou agregadas) e um conjunto de outros chaperones (côrte). oligomerização. O papel dos chaperones moleculares seria ajudar os peptídeos encontrarem um estado funcional estável. Micrografias eletrônicas revelam que os ribossomos engajados no processo de síntese protéica localizam-se na moléculas de mRNA. 1992). Proteínas desnaturadas pelo calor poderiam ser re-enoveladas na forma apropriada por ação dos chaperones Cristina M. um em seguida do outro. os ribossomos lêem a molécula de mRNA no sentido 5´ —> 3´ e a cadeia polipeptídica cresce do terminal amino para o carboxila. Esta informação está contida nas histonas. O mRNA mensageiro é ocupado por vários ribossomos. os chaperones moleculares agem sem modificar covalentemente seu substrato e sem participar do produto final. 1991). O complexo mRNA. ribossomos ativamente engajados na síntese protéica e polipeptídeos nascentes é denominado polissomo ou polirribossomo(Figura 9. Cria-se uma situação de bloqueio. o sistema tmRNA talvez não seja necessário porque a tradução de mRNAs danificados é evitada utilizando-se outros controles de qualidade. coli. Guia de Estudos Cristina M. não podem associar-se aos ribossomos. Em eucariotos. O peptídio nascente é transferido para o resíduo de alanina no terminal 3' do tmRNA.. tais como a seleção positiva de mRNAs com cap no terminal 5' e cauda poliA no terminal 3´. 1996). Figura 9. portanto. o tmRNA promove a destruição de produtos muito pequenos do processo de tradução. Na ampla alça que se forma. Uma vez que estes peptídios não terminaram de ser traduzidos. Modelo de ação das moléculas de tmRNA. mas não foram encontrados entre os Archaea nem Eukarya. Assim. A etiqueta é constituída dos resíduos de aminoácidos (A)ANDENYALAA. antes do caule (Figura 9. Bonato 105 . A etiqueta adicionada pelos tmRNA é um sinal para as proteases degradarem tais peptídeos (Keiler et al. uma vez que. de liberação dos peptídios. Nestas circunstâncias. prisioneiros dos ribossomos. em E. mesmo que sejam liberados não serão funcionais e.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS moleculares (Hartl et al. os peptídios nascentes continuam acoplados ao peptidil-tRNA. é conveniente para a célula que eles sejam degradados. O terminal 3' da molécula de tmRNA apresenta similaridade com o braço T de moléculas de tRNA e sempre está associado a um resíduo de Alanina. O tmRNA está envolvido num processo notável trans-traducional. O tmRNA reconhece ribossomos com tradução bloqueada e ocupa o sítio A. tmRNAs O tmRNA bacteriano é assim denominado devido sua dupla natureza: tipo tRNA e tipo mRNA. 11. Sua função é adicionar uma etiqueta polipeptídica no C-terminal de peptídeos incompletos. 1994). Os chaperones moleculares são encontrados tanto em bactérias como em árqueas e eucariotos e são proteínas altamente conservadas na evolução..11). O mRNA danificado é descartado e substituído pela seqüência de códons do tmRNA. encontra-se uma seqüência de códons especificando a etiqueta (Tag) que sinaliza para proteólise. gerando peptídios não funcionais. Moléculas de tmRNA tem sido identificadas em diferentes grupos do domínio Bacteria. os fatores RF. Porque estes peptídios estariam aprisionados? Alguns mRNAs podem ter sido danificados e perderam seus códons de parada. em bactérias. Este RNA também é conhecido pela denominação 10Sa RNA ou SSrA. Os ribossomos estão aprisionados ao polissomo. mRNAs danificados não são discriminados e entram no processo de tradução. A síntese protéica recomeça e continua até encontrar um códon de parada convencional. coli? Quem determina o reconhecimento do códon? O aminoácido carregado pelo tRNA ou a seqüência de anti–códon da molécula de tRNA? Qual a função da seqüência Shine–Dalgarno? Quais são os fatores de iniciação da tradução? Como atuam? Quais são os fatores de alongamento da cadeia polipeptídica? Como atuam? Como ocorre a terminação da tradução? Qual o sentido de crescimento da cadeia polipeptídica? Qual a ação dos análogos de base sobre a síntese protéica? Qual a conseqüência. Bonato . Quais são as características estruturais da molécula adaptadora? Qual a constituição dos ribossomos de E.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Quais os passos de iniciação de tradução em E. da ação dos corantes de acridina? Comente esta frase: somente o anticódon do aminoacil-tRNA participa do processo de reconhecimento do códon. na síntese protéica. coli? Qual o papel das aminoacil-tRNA sintetases (AARS)? Qual o papel da tRNA-nucleotidil transferase? Como funciona o sistema tmRNA? Capítulo 10 – RECOMBINAÇÃO GENÉTICA EM BACTÉRIAS Crescimento de Bactérias em Laboratório 106 Cristina M. Uma vez que as bactérias são unicelulares. Este processo é denominado plaqueamento. ou seja 102 células por mililitro. sais inorgânicos e uma fonte de carbono orgânico. em condições estéreis. o tempo de geração de E. Crescimento de bactérias em laboratório. tais como um gel de ágar. 1. isto é. seu tempo de geração coincide com o tempo de duplicação da célula.1. espalhamos um pequeno volume desta cultura sobre um meio sólido e contamos o número de colônias formadas. Assim. A Figura 10. podem crescer em meio mínimo (MM) que contem apenas água. invisíveis a olho nú. denominados colônias. não visíveis a olho nu. um DNA circular dupla fita. todos originários de um único ancestral genético. são denominados clones.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS As bactérias podem crescer tanto em meio líquido como em uma superfície semi-sólida. imobilizadas no gel. mostra que após plaqueamento de 100 ml de uma cultura líquida inicial foram obtidas 10 colônias na superfície do ágar. pois são clones das originais. é 20 minutos. por exemplo. As células individuais isoladas. Portanto. na superfície do ágar. coli. A aparência das colônias ou a capacidade de formar ou não formar colônias em meios particulares pode ser utilizada para identificar o genótipo das células bacterianas. ao se duplicarem formam uma cobertura contínua de células (tecido) após um dia de cultivo. O tempo de geração das bactérias é muito curto. contém cerca de 109 células por mililitro (cel/ml). simplesmente dividem-se ao meio depois que seu único cromossomo. Identificação de Mutantes Bacterianos Em geral as bactérias selvagens são prototróficas. Bonato 107 . sobre uma superfície semi-sólida contida em placas de Petri. Cada uma das células individuais. Os membros de uma colônia. Uma única célula bacteriana num meio líquido irá se multiplicar geometricamente até exaurir os nutrientes do meio ou até que dejetos tóxicos se acumulem num tal nível que bloqueiem o crescimento populacional. se duplicou. Figura 10. irá se dividir várias vezes formando aglomerados de células. Assim. por exemplo. isto é. Um pequeno volume de células crescidas em meio nutriente líquido é espalhada sobre a superfície de um meio semi-sólido. Clones incapazes Cristina M. As bactérias dividem-se por fissão binária. Se uma pequena quantidade desta cultura líquida for espalhada. em 1ml de meio líquido teríamos 100 células. irão se posicionar em pontos diferentes. irão proliferar formando colônias. desde que alguns ingredientes nutritivos tenham sido adicionados. Uma cultura líquida típica da bactéria Escherichia coli. Quando uma quantidade muito grande (> 104) de células é colocada numa mesma placa contendo meio semi-sólido. enquanto o tempo de geração da mosca de frutas é 14 dias e dos seres humanos cerca de 20 anos. visíveis a olho nú. células isoladas. Todas as células de uma colônia apresentarão o mesmo fenótipo e genótipo. não é possível identificar colônias isoladas porque estando muito próximas. se quisermos determinar o número de células presentes numa cultura líquida de bactérias. Na genética bacteriana o fenótipo é designado por três letras. isto porque são defectivos ou na enzima que coloca a lactose dentro da célula ou na enzima que degrada a lactose para a obtenção de glicose. 2. de forma a se obter colônias isoladas. Figura 10. Tal mutante não crescerá em MM a não ser que se adicione arginina neste meio (veja Os genes governam a expressão das proteínas). são sensíveis a antibióticos. as quais ocupam posições definidas no meio semi-sólido. mutantes ou selvagens. Strr ou Strs. O meio é denominado seletivo quando permite o crescimento de apenas um tipo de célula. mutantes Lac. arg2. um meio seletivo contendo todos os requerimentos nutricionais exceto arginina.ou Arg+. etc. desenvolvida por Lederberg & Lederberg. mas formam no meio completo. que é um meio não-seletivo porque contem todos os nutrientes. Um número é adicionado para identificar o passo da via que está alterado: arg1. substrato básico para o crescimento bacteriano. na placa original. as bactérias são plaqueadas em meio completo. conjugação e transdução. podem ser facilmente identificados. Se uma colônia cresceu na placa de meio completo e não cresceu na placa de meio seletivo. A facilidade em se determinar o fenótipo de diferentes clones permitiu a descoberta da troca de informação genética entre bactérias. Replica plating – Após a réplica é possivel identificar os mutantes porque não formam colônias na placa seletiva. Em seguida o veludo é pressionado sobre um meio seletivo. Na transformação a célula bacteriana capta DNA livre diretamente do meio ambiente e o incorpora ao seu genoma via recombinação. Um exemplo de mutação auxotrófica é a deficiência em uma das enzimas que participam da via biossintética de arginina (mutante arg1). Após um dia de incubação comparase o posicionamento das colônias nas duas placas. Em meio completo (MC). Esta placa é pressionada sobre um pedaço de veludo esterilizado ao qual ficarão aderidas as células bacterianas de cada posição. Por exemplo. era um mutante biossintético de arginina e será identificado como Arg -. não-seletivo. é designado por letras minúsculas itálicas: arg. Bonato . seja selvagem ou mutante. um mutante arg-. não cresce num meio seletivo que não contenha arginina enquanto o selvagem cresce. cresceriam tanto o mutante como o selvagem. Outro tipo de mutante é aquele incapaz de utilizar uma determinada fonte de carbono orgânico. O genótipo. Por exemplo. permite a rápida identificação de clones mutantes (Figura 10. A transferência do material genético de uma bactéria para outra pode ocorrer por três vias: transformação. por exemplo. Outra característica das bactérias selvagens é que. de sorte que os mutantes resistentes são facilmente selecionados porque formam colônias em meio contendo o antibiótico. em geral. como estreptomicina (Str) ou tetraciclina (Tet).denotando a presença ou ausência do fenótipo em questão e um s ou r denotando a sensibilidade ou resistência a antibióticos: Arg.2). mutantes auxotróficos. Nesta técnica. Uma técnica conhecida como plaqueamento de réplicas (replica plating). Na conjugação.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS de crescerem em meio mínimo. podemos inferir que a colônia que ocupava aquela posição. strr ou strs .ou arg+ .não crescem em meio mínimo cuja única fonte de carbono seja lactose. a primeira maiúscula e um super escrito + ou . uma molécula de DNA autônoma e auto-transmissível é transferida para outra célula bacteriana via 108 Cristina M. Um meio nutriente é denominado não-seletivo quando todas as células bacterianas. por sua vez. formam colônias. o DNA doador passará a integrar o genoma da célula receptora conferindo-lhe novas características fenotípicas. Desenvolvimento e eficiência da competência durante o ciclo de crescimento de B. capaz de sintetizar leucina (Strr Leu+). transformadas ou não transformadas (Tabela 10. tanto gram-positivas quanto gram-negativas. pneumoniae (vide O DNA é o material genético). Um volume conhecido da mistura é espalhado na superfície de meios seletivos para seleção dos transformantes. Misturando-se células competentes Strs Leu. a informação genética é carregada de uma bactéria para outra por um vírus de bactéria (bacteriófago). uma vez que a população competente é originalmente sensível à estreptomicina e não sintetiza leucina. sensível à estreptomicina (Str s Leu-) e um mutante resistente à estreptomicina. Este período coincide com um decréscimo ou bloqueio na duplicação do DNA. subtilis. as bactérias são induzidas ao estado fisiológico de competência. obtém-se células transformadas. a transformação ocorre naturalmente quando moléculas de DNA estão disponíveis no meio e a célula bacteriana encontra-se num estado propício à captação destas moléculas. A transferência do DNA só é geneticamente visível se modificar pelo menos um dos caracteres da célula receptora. No meio seletivo contendo estreptomicina ou no meio seletivo sem leucina. Em geral. dois mutantes da bactéria gram-positiva Bacillus subtilis: um mutante auxotrófico para leucina. num período definido ao final do ciclo de crescimento. Transformação O fenômeno de transformação foi descoberto por Frederick Griffith (1928). durante 60 minutos a 37oC. Em qualquer dos mecanismos utilizados. Tabela 10.1). Bonato 109 . Concentração celular total (em azul). Na natureza. quando investigava o modo de infecção da bactéria S. 3.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS contato célula-célula. só podem crescer transformantes.em células Strr ou Leu+ Adição ao meio # clones crescendo sob condição seletiva Cristina M.3). quando os nutrientes começam a escassear e a densidade populacional é alta (Figura 10. por exemplo.com o DNA extraído de células doadoras Strr Leu . pouco antes da população atingir a fase estacionária. Já em um meio não seletivo crescem todas as células. + Figura 10.1 . Concentração dos recombinantes para uma determinada marca (em vermelho). Na transdução.Transformação de células Strs Leu. O estado de competência tem sido detectado em diferentes espécies bacterianas. Bactérias aptas a serem transformadas são denominadas competentes. Considere. 4). Bonato . uma vez que a freqüência de mutação espontânea é de 2 em 10 milhões para leucina ou menor do que 1 em 100 milhões para a resistência à estreptomicina enquanto entre as células tratadas com DNA doador. Os resultados obtidos comprovam que DNA exógeno foi captado pela célula competente e passou a integrar o seu genoma. do inglês single-strand fragment) que é transportada para o citoplasma.10-3 4. atravessa a membrana celular onde estão localizadas exonucleases que digerem uma das fitas gerando uma fita simple (SSF.000 (4-5. No processo de integração ao cromossomo.10-3 B (controle) cel/ml 1. • Integração do segmento de DNA exógeno. Mecanismo de Transformação A passagem do DNA transformador de fora para dentro da célula se dá basicamente em 3 passos: • Captação do DNA doador. A presença de CaCl2.10-8 F* (Freqüência) corresponde ao no de recombinantes dividido pelo no total de células A possibilidade de mutação espontânea na população de células competentes é checada nos mesmos meios seletivos. por exemplo.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS LEU Fenótipos selecionados Todos (total de células receptoras) Leu+ Strr + + + STR cel/ml 1. do inglês double-strand fragments) com ~15kb. O fragmento dupla fita (DSF. O DNA fita simples resultante é degradado por exonucleases bacterianas. uma bactéria gram-positiva. ao cromossomo bacteriano via recombinação (Figura 10. A eficiência da transformação pode ser aumentada se as células forem submetidas a tratamentos químicos adequados.108 5. próximas ao sítio de ligação. sem que estas células tenham sido previamente misturadas com o DNA extraído da célula doadora (coluna B). o DNA que acaba de atravessar a membrana é entregue diretamente ao seu alvo. Como o cromossomo bacteriano está ligado à membrana.108 2. Em B. Uma vez ligado o DNA é digerido em fragmentos menores por endonucleases localizadas no espaço periplasmático. 110 Cristina M. subtilis. regiões transitórias de heteroduplex são formadas.105 A F* 5.101 <1 F* 2. é importante na transformação de alguns tipos de bactérias. este segmento de DNA fita simples irá reconhecer uma região homóloga no cromossomo bacteriano e integrar-se a ele via recombinação.10-3). o qual será adsorvido a um complexo protéico (fator de competência) na superfície da célula receptora.10-7 <1. Uma vez no citoplasma.105 4. a freqüência de bactérias com o genótipo da doadora é 4 ou 5 em 1. o DNA fita dupla presente no meio extracelular liga-se a receptores específicos na superfície da célula bacteriana. • Transporte do DNA através da membrana. posicionarem-se muito longe um do outro no cromossomo doador. se dois genes estão suficientemente próximos um do outro. participarão do mesmo fragmento doador e. eventualmente. de duplos transformantes / no. Conjugação Cristina M.10 -3. Bonato 111 . Assim. Com isto. sendo que a e b estão a uma distância tal que dificilmente participariam do mesmo fragmento de DNA. criando poros nas parede e membrana celular. então podemos supor que a ordem destes genes é a c b. neste caso. Estando em fragmentos diferentes. Por exemplo. Por outro lado. Mapeamento Genético Transformação pode ser. de simples Quanto maior o índice r. a análise sistemática de vários loci permite a obtenção de sua ordem relativa no cromossomo. Entrada do DNA transformador em B. grosseiramente. dificilmente farão parte do mesmo fragmento cromossômico após ação das endonucleases (vide Mecanismo de transformação). a e b não são cotransformados. uma técnica conveniente de mapeamento genético. Através deles. não sofreriam transformação genética. 1. Se a probabilidade de transformação de uma marca é ~1. Na eletroporação. 10-6 (10-3 x 10-3) (vide Transformação). Se a e c são cotransformados. o DNA que se quer introduzir na célula é adsorvido à micropartículas de tungstênio ou ouro as quais perfuram as células como projéteis ao serem impulsionadas por um equipamento tipo revólver. a freqüência de cotransformação é praticamente a de um único gene.b-. 4. subtilis. é calculado como: r = no. Atualmente são utilizadas técnicas que aumentam muito a eficiência de transformação como eletroporação e biobalística. então a probabilidade de ocorrer transformação das duas marcas (a+ b+) seria. que sob condições naturais. mais próximos dois genes devem estar. Na técnica de Biolística (de Biologia e Balística). O índice de co-transformação (r). b e c são cotransformados.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 10. podem agora ser transformadas uma vez que o DNA entra através destes poros artificiais. dificilmente serão transferidos simultaneamente (cotransformação) para uma célula receptora a. de duplos + no. mesmo aquelas células. utilizados como marcadores de transformação. substâncias podem entrar ou sair de acordo com seu respectivo gradiente de concentração. se dois genes a+ e b+. uma corrente elétrica de alta voltagem atravessa uma suspensão bacteriana por mili segundos. Esta técnica foi inicialmente desenvolvida para transformação de células vegetais. sendo encontrados em quase todos os tipos de bactérias. no sítio oriT (origem de transferência). Plasmídios Os plasmídios são moléculas de DNA dupla fita. Toda célula F+ é um doador potencial porque pode transferir DNA para uma célula receptora. o DNA de uma célula doadora é transferido para uma célula receptora através de contato célula-célula. Da mesma forma que os cromossomos. O sítio oriT é clivado por uma endonuclease codificada por um dos genes tra(violeta) do plasmídio. Tais moléculas circulares de DNA comportam-se como mini cromossomos. uma vez que ao se retrair o pilus aproxima completamente as duas células. Tais acontecimentos sinalizam uma endonuclease que faz um corte numa das fitas do DNA plasmidial. independentes do cromossomo bacteriano. O pilus sexual atraca na célula F. É interessante observar que os genes plasmidiais não codificam funções essenciais ao crescimento celular. Os diferentes tipos de plasmídios apresentam tamanhos variados. propiciando a transferência do DNA.e mantém as duas unidas. células F+ produzem pilus sexual. importantes na sua manutenção e distribuição nas células. Células com plamídio F são denominadas F+ e sem plasmídio F são denominadas F-. Nas bactérias gram-negativas. oriv. neste caso são denominados fatores R. IS são seqüências de inserção. Por. os plasmídios codificam proteínas e moléculas de RNA. replicam durante o crescimento celular e as cópias replicadas são distribuídas entre as células filhas no momento da divisão celular. além dos genes tra contêm outros genes e elementos de seqüência particulares. constituído de monômeros de pilina. que é uma bacteriocina que mata as bactérias que não albergam 112 Cristina M. O fator F é membro de uma ampla classe de moléculas de DNA extracromossômicas. 5. por Joshua Lederberg e Edward Tatum. seus produtos podem beneficiar a célula em circunstâncias especiais. é a origem de replicação do vetor. exemplo. Replicam-se independente do cromossomo bacteriano. Já os plasmídios ColE1 carregam um gene para produção de colicina. têm aproximadamente 100 kb e. resistência a antibióticos e. de alguns milhares a centenas de milhares de pares de bases. de sorte que a célula receptora se transformará em F+ enquanto a doadorá continuará F+. Isto permitirá a transferência e replicação concomitante do fator F. auto-replicativas. Bonato . encontra-se em uma molécula circular de DNA denominada fator de fertilidade ou fator F.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS O processo de conjugação foi descoberto em 1946 na bactéria Escherichia coli. Quando as bactérias conjugam. sob o controle de um conjunto de genes que confere ao doador a capacidade de transferir DNA. Podem ser circulares ou lineares. Figura 10. com replicação independente do cromossomo bacteriano. os plamídios podem codificar proteínas que confiram à célula hospedeira. Este conjunto de genes conhecidos como tra. Um poro se forma no local de junção das duas membranas. denominadas plasmídios. que é um filamento protéico longo e flexível. todavia. sendo utilizado pelos cromossomos bacterianos e por plasmídios como ColE1. F e P1 (Movimentação bidirecional). Atualmente a nomenclatura para plasmídios está padronizada. RK2. 2. mas podem coexistir com RSF1010. construído por Bolivar e Rodriguez. Em função disto. os plasmídios também possuem sua origem de replicação (Origens de replicação). coli Pseusomonas putida Agrobacterium tumefaciens Rhizobium meliloti Streptomyces coelicolor Resistência à ampicilina. Bonato 113 . Por exemplo. um plasmídio muito utilizado como vetor de clonagem é o pBR322. Alguns plasmídios. replicam numa ampla faixa de hospedeiros porque eles próprios codificam as proteínas que necessitam para iniciação da replicação. Assim. como ColE1. A origem de replicação dos plasmídios é denominada oriV (origem do vetor) e deve ser reconhecida por proteínas que participam da maquinaria de iniciação da replicação. como é o caso de ColE1 e pBR322. Algumas destas proteínas são codificadas pelo cromossomo da célula hospedeira.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS o mesmo plasmídio. O mecanismo q é o mais comum. Dois mecanismos podem ser utilizados na replicação dos diferentes tipos de plasmídios: a replicação em teta (q) e a replicação do círculo rolante. apresentam um alto número de cópias dentro da bactéria enquanto outros. do grupo IncQ. Estas letras são acompanhadas de números que identificam uma construção particular. mesmo porque muitos destes plamídios originais foram extensivamente modificados para sua utilização como vetores de clonagem. como o plasmídio F têm apenas 1-2 cópias/célula. que carregam genes para iniciação do tumor em plantas (Tabela 10. Uma célula bacteriana pode conviver com plasmídios de tipos diferentes durante muitas gerações. de Staphylococcus aureus e pIJ101 de Streptomyces lividans (Modos alternativos de replicação). Mas. Em Agrobacterium tumefaciens são encontrados plasmídios Ti (do inglês.4-D (dicloroacetato) Alcaligenes eutrophus Assim como todo replicon. Tumor iniciation). coli Degradação de tolueno e ácido benzóico Iniciação de tumor em plantas Nodulação nas raízes de plantas leguminosas Biossíntese do antibiótico metilenomicina Fonte original E. RP4 e RK2. Portanto. às vêzes. a existência de um plasmídio dentro de um determinado hospedeiro dependeria deste reconhecimento. cada tipo de plasmídio recebe letras e números como as linhagens bacterianas. do grupo IncP não coexistem. Alguns plasmídios de ocorrência natural e seus traços característicos Plamídio ColE1 Tol Ti pSym SCP1 RK2 pJP4 Característica Bacteriocina que mata E. Cristina M. tetraciclina e kanamiKlebsiella aerogenes cina Degradação de 2. alguns plasmídios tem uma faixa restrita de hospedeiros onde podem se duplicar. Este fenômeno é denominado incompatibilidade plasmidial.2). Assim. Tabela 10. como o RK2. a letra minúscula p refere-se a plasmídio e antecede letras maiúsculas que descrevem o plasmídio ou são as iniciais de quem os construiu. Já o mecanismo de círculo rolante foi identificado nos plasmídios pUB110 e pC194. alguns tipos não podem coexistir. Na nova nomenclatura. Plasmídios com alto número de cópias são denominados plasmídios relaxados (relaxed plasmids) e os com baixo número são denominados plasmídios rígidos (stringent plasmids). daí sua independência em relação ao hospedeiro que os alberga. só coexistem plasmídios de grupos Inc diferentes. Plasmídios que não podem coexistir são membros de um mesmo grupo de incompatibilidade ou grupo Inc. Outros plasmídios. Logo. ~2mm de comprimento. • O processo de transferência é unidirecional. das múltiplas cópias da molécula. seja durante a mitose ou meiose. O corte de uma das fitas em oriT libera terminais 3'OH e 5'P. gera os terminais 3'OH e 5'P. do inglês autonomous replication sequence). • Um corte. é rica em AT e contem seqüências repetidas invertidas. • Após completa transferência e replicação da molécula. cerevisiae é encontrado um plamídio de DNA circular dupla fita com 6. Na célula receptora o terminal 5' serve de molde para síntese descontínua do DNA. daí ser designado 2-micron. Uma linhagem serve de doadora do material genético e a outra de receptora. Na levedura S. Agora. Entre os Archaea. Além disto. Conforme o terminal 3' cresce. • O terminal 5'P é utilizado como molde para a síntese descontínua que se processa na célula receptora. entre mãe e filha. O cromossomo bacteriano não está representado no esquema. As moléculas do plasmídio 2-micron residem no núcleo e são empacotadas como cromatina.318pb.está acoplado à duplicação da molécula pelo mecanismo de círculo rolante (Modos alternativos de replicação). Mecanismo de conjugação O mecanismo de transferência do plasmídio de uma célula F+ para uma F. transformaram-se numa arma poderosa na tecnologia do DNA recombinante uma vez que são veículos eficazes no transporte de genes oriundos de organismos próximos ou distantes na escala evolutiva. os terminais dos DNAs replicados são religados na região oriT. 6. feito em apenas uma das fitas no sítio oriT. O terminal 3' OH livre é utilizado como primer para síntese contínua em torno do círculo. A replicação inicia-se assim que o terminal 5' ingressa na célula receptora porque juntamente com o DNA é transferida a primase codificada pelo plasmídio. Figura 10. recompondo o círculo.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Tanto em leveduras como em fungos filamentosos já foram detectados plasmídios. os plasmídios estão amplamente distribuídos nos diferentes grupos. em larga escala. Bonato . Os plasmídios. Cada célula haplóide pode albergar 60-100 cópias do plasmídio. A seqüência oriT do plasmídio F possui <300pb. Mecanismo de transferência do DNA durante a conjugação. Contem uma única origem de replicação (ARS. o plasmídio codifica um sistema de partição que promove a dispersão aleatória. as duas células são F+. Os círculos se fecham e o par conjugante se separa. A adição de nucleotídios no terminal 3'OH desloca o terminal 5'P que invade a célula F -. sua autonomia replicativa permite a amplificação. No plasmídio ainda são codificados genes que catalisam recombinações sítio-específicas e regulação da expressão gênica. 114 Cristina M.6). o terminal 5' vai sendo deslocado do círculo e direcionado para o poro que se formou após contato das células F+ e F-. O processo de corte da fita simples e preparação da transferência do terminal 5' é denominado mobilização(Figura 10. da informação que carregam. Células Hfr A transferência de genes cromossômicos de uma bactéria para outra. o plasmídio F abandona sua vida livre e integra-se ao cromossomo da bactéria hospedeira (Figura 10. Entre duas células F+ o contato é muito menos eficiente. Plasmídios capazes de existirem tanto no estado livre como no integrado são denominados epissomos. Uma vez que existe homologia entre estes pequenos segmentos. Linhagens Hfr propiciam alta freqüência de recombinação. seu cromossomo via plasmídio F integrado são denominadas células Hfr (do inglês.7). 7. Hfr X FCristina M. Figura 10. A integração de F é um evento raro. com eficiência. pode ser mediada pelo pelo plasmídio F. mediada por plamídio. originando uma célula Hfr. Células com o F integrado. comportando-se como doador daqui para a frente. Bonato 115 . pode ocorrer recombinação entre o IS cromossômico e o IS plasmidial. A unidirecionalidade da transferência foi demonstrada por William Hayes em 1952 e em 1953 quando relata a existência de linhagens Hfr. carregam consigo genes cromossômicos para a hospedeira F -. o plasmídio F ficará ladeado por cópias do elemento IS que participou da integração. o segmento de DNA transferido pode recombinar com a região correspondente do cromossomo da receptora. As células das linhagens que conseguem transferir. Uma vez dentro da célula F -. Em artigo de revisão publicado em 1956. A transferência completa de F requer de 2 a 3 minutos. Inserção do plasmídio F via recombinação homologa entre elementos IS do plasmídio e do cromossomo bacteriano. resultando em recombinação. A integração de F ocorreu entre os loci a e b. define os diferentes passos envolvidos nos processos de conjugação e recombinação em E. Ocasionalmente. high frequency of recombination). coli K-12. A integração do plasmídio no cromossomo hospedeiro dá-se via elementos de inserção. mas células com F integrado podem ser isoladas e mantidas. Após integração. estavelmente. ao conjugarem.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS • Ao término do processo uma cópia permanece no doador F+ e outra se instala no novo hospedeiro que se torna F+. entre genes bacterianos cromossômicos. neste estado. juntamente com Wollman e François Jacob. • O contato celular para transferência do fator F só é permitido entre uma célula F+ e outra F-. Bonato .8): • A transferência do DNA de uma célula Hfr para uma F. Estudavam dois mutantes auxotróficos: a linhagem A. mas apresenta particularidades (Figura 10.inicia-se com um corte na região oriT.e Thi -. porém continua F-. • A primeira porção do DNA a ser transferida é o terminal 5' do F. 8. 116 Cristina M.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS O processo de conjugação de Hfr x F. pois não recebeu o plasmídio integral. mas dezenas de marcas cromossômicas chegam à célula F-. • A transferência do cromossomo inteiro é um evento raríssimo e o par acasalante separa-se antes disto. Observando Recombinantes Foi observando o surgimento de recombinantes que Lederberg & Tatum (1946) descobriram o fenômeno de transferência de informação genética entre células bacterianas. Thr -. • O segmento replicado (exogenoto) pode incorporar-se ao cromossomo da célula receptora (endogenoto) via recombinação com regiões homólogas. Met . situada numa posição mediana do plasmídio integrado. por último. • Num curto lapso de tempo a célula F – possui duas cópias de cada um dos loci transferidos. da outra porção do F. Leu . Transferência de DNA cromossômico via plasmídio integrado.tem aspectos semelhantes ao de F+ x F-. seguido dos genes cromossômicos e.e Bio . Logo.e a linhagem B. • O DNA não incorporado é degradado. • O segmento linear transferido se replica porém não se circulariza. • A célula receptora torna-se um recombinante. nenhuma das duas crescia em meio mínimo (MM). Figura 10. Os pesquisadores concluíram que deveria estar passando informação genética de uma célula para outra (Figura 10. logo a transferência de informação fora bloqueada. B.10-14. bio+. Analisando-se os recombinantes produzidos pelo acasalamento Hfr x F-.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Quando misturavam A (met-.10-7. Os poros do filtro não permitiam a passagem de bactérias e nenhum recombinante cresceu nas placas de MM. A possibilidade de mutação foi descartada por duas razões: a) linhagens A ou B isoladamente não produziam colônias prototróficas em MM. também. a de duas mutações seria ~1. Apenas nas placas que receberam a cultura mista houve formação de colônias. Transferência de informação genética entre mutantes auxotróficos. o contato físico entre as células era fundamental para transferência da informação genética. necessariamente prototróficas. A interrupção pode ser feita simplesmente com uma agitação vigorosa do tubo de cultura. Portanto. Para isto interrompe-se a conjugação em tempos definidos. thr+. foi possível construir o mapa genético do cromossomo bacteriano. bio+. A freqüência era de 1. No tubo em U. muito menor do que a freqüência com que apareciam os recombinantes. O fato de que as células precisavam entrar em contato uma com a outra para transferir informação foi demonstrado por Bernard Davis ao construir um tubo em U. Figura 10. thr-. b) no mínimo duas mutações seriam requeridas para surgirem colônias prototróficas.e thi-).10-7. uma prototrófica em cada 10. leu+ e thi+). Mapa Genético Via Conjugação O mapa genético do cromossomo é construído de acordo com a ordem em que os genes são transferidos. ou seja. estas células deviam ser prototróficas (met+. A. Cristina M. Bonato 117 . Com este experimento ele eliminou. leu. Este processo foi denominado conjugação. leu+ e thi+) e B (met+. bio-. algumas colônias se desenvolviam. thr+. A partir daí.000 de auxotróficas. o estabelecimento de linhagens puras Hfr permitiu que o processo de transferência se realizasse com uma eficiência muito maior. a possibilidade de estar ocorrendo transformação. como a freqüência de mutação é ~1. pressão e sucção alternadas forçam o liquido e macromoléculas atravessarem o filtro que separa as duas culturas. 9. Culturas de linhagens diferentes eram colocadas em cada um dos braços do tubo.9 A). onde os 2 braços estavam isolados por um filtro (Figura 10. Portanto.9 B). durante algumas horas e depois plaqueavam em MM. mas recombinantes não são gerados.000. As placas contendo MM foram inoculadas com 108 células. c+ x F.a-.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Quanto mais longe uma marca estiver da origem de transferência. • As distâncias genéticas entre as marcas podem ser medidas pelos minutos que decorrem entre seus tempos de entrada. em cada uma das placas com meio seletivo. A mistura de uma linhagem Hfr com uma F-. coli foram assim mapeados.10). o acasalamento Hfr a+. b-. permitiu concluir que o plasmídio podia se integrar em pontos diferentes do cromossomo e que o cromossomo de E. A técnica de acasalamento interrompido para mapear genes bacterianos foi desenvolvida 118 Cristina M. Após misturar as duas linhagens. com marcas genéticas diferentes.strr c+. 10. Por exemplo. Assim. as que crescerem em c) serão F. onde a unidade de distância é o minuto. strr (Figura 10. nos diferentes tempos. as que crescerem em b) serão F. por exemplo. O gráfico mostra que o número de reco-mbinantes aumenta com o tempo de contato entre as células e que existe um gradiente de transfe-rência destas marcas.strr a+. coli. a conjugação foi interrompida aos 10. 20 e 30 minutos e amostras dos diferentes tempos foram plaqueadas em meio mínimo (MM) contendo estreptomicina (Str) e todos os outros componentes menos um. permite a construção de um gráfico (Figura 10.strr b+ . gera recombinantes identificados em meios seletivos. c-. os meios seletivos devem conter: a) b) c) MM + Str + A + B MM + Str + A + C MM + Str + B + C % recombinantes tempo de entrada a+ 25 9' b+ 20 18' c+ 20 25' As colônias que crescerem em a) serão F. • A transferência inicia-se num ponto particular do cromossomo Hfr (oriT). O gráfico nos diz que o número de recombinantes aumenta com o tempo de acasalamento e que para cada marca existe um período (tempo de entrada). O número de recombinantes. coli era circular. antes do qual nenhum recombinante é detectado. mais tempo ela demorará para ser transferida.10). b+. de sorte que apenas recombinantes pudessem formar colônias. • Os genes são linearmente transferidos do doador ao receptor. Cerca de 1500 genes de E. O mapa genético. Figura 10. 15. Bonato . recombinantes c+ só são detectados aos 25' de conjugação enquanto recombinantes a+ já estavam presentes nos 10 primeiros minutos. Portanto existe um gradiente de transferência. Isto significa que: • Nem todas as células iniciam a conjugação ao mesmo tempo. As que estão bem próximas ao oriT serão as primeiras a serem transferidas. seria: A comparação de mapas construídos com diferentes marcas e linhagens de E. correspondente ao gráfico acima. Considere. na década de 60. consequentemente. a célula receptora se tornará diplóide.ele poderá continuar livre no citoplasma e. Diplóides Parciais Eventualmente. A utilização de diplóides parciais é muito útil na verificação de dominância e dosagem gênica. no Instituto Pasteur. Todavia.11). O que difere é o ponto de origem e a direção da transformação. A passagem do plasmídio F' para uma célula F .3 mostra a ordem de transferência dos genes de alguns recombinantes de E. no cromossomo da F-. É preciso lembrar que apenas um pequeno segmento cromossômico foi excisado juntamente com o plasmídio do cromossomo Hfr. A Tabela 10. Plasmídios que se encontram na forma livre carregando um segmento do DNA cromossômico são denominados plasmídios F' (F primo). Tranferência de informação de diferentes tipos de Hfrs. 3. uma vez que apresentará dois alelos para os loci gênicos transferidos: um contido no plasmídio F' e outro. o fator F integrado é excisado do cromossomo via recombinação entre as mesmas seqüências envolvidas na inserção.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS por Jacob & Wollman. Bonato 119 . Cristina M. coli analisados por estes pesquisadores. pode acontecer que o processo de excisão não seja exatamente o reverso da inserção. uma vez que a diploidia diz respeito apenas àqueles loci gênicos (Figura 10. Tipos de Hfr Ordem de transferência das marcas genéticas 1 Pro Lac Ade Gal Try His Sm Iso 2 Iso Sm His Try Gal Ade Lac Pro 3 Pro Iso Sm His Try Gal Ade Lac 4 Ade Lac Pro Iso Sm His Try Gal 5 Iso Pro Lac Ade Gal Try His Sm 6 His Try Gal Ade Lac Pro Iso Sm 7 Sm Iso Pro Lac Ade Gal Try His Se você se detiver nesta tabela por alguns minutos vai perceber que a ordem relativa dos genes é sempre a mesma. junto com os genes plasmidiais podem ser excisados genes cromossômicos. Tabela 10. Neste caso. Portanto os diplóides acima referidos são diplóides parciais ou merozigotos. Quando um plasmídio F’ é transferido para uma célula F .é denominada sexdução ou F-dução. A tradução dos mRNAs virais. não sobrevive ao processo. Uma célula que permite infeção por um determinado vírus é denominada célula hospedeira. ao infectar a bactéria. para se reproduzirem precisam infectar uma célula. Todavia. Os genomas dos fagos são lineares. Em geral. uma vez que se reproduzem às expensas da bactéria hospedeira a qual. Normalmente. específicas para cada tipo de partícula viral. Se. livrando-se da capa protetora. O volume interno do capsídeo. Os genomas dos fagos são replicons possuindo. portanto. Se. agindo como parasitas celulares. Ao infectar a bactéria o fago injeta uma molécula de ácido nucléico dentro dela. Diplóide parcial do operon lac Transdução No processo de transdução o DNA bacteriano é transferido de uma célula bacteriana para outra por um vírus. leva à produção de uma série de enzimas e proteínas estruturais envolvidas no ciclo de desenvolvimento do fago. Bonato . os genomas fágicos adotam a forma circular. Os fagos são estruturas especiais e simples constituídas. quando replicam. uma origem de replicação. normalmente. é apenas levemente superior ao volume ocupado pelo próprio ácido nucléico.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 10. A molécula de ácido nucléico contem a informação genética do fago. envolvida por uma capa protéica protetora. 11. é constituída de uma pequena variedade de proteínas. de uma molécula de ácido nucléico (DNA ou RNA). o comprimento do genoma do fago é 1. A infecção da bactéria por fagos pode levar a sua lise ou não. literalmente. ao infectar a bactéria o genoma do fago integrar-se ao genoma do hospedeiro e aí permanecer 120 Cristina M. dizemos que instalou-se o ciclo lítico que resultará na lise da célula hospedeira. na maioria das vezes. o capsídeo é construído como uma concha vazia e o ácido nucléico é inserido posteriormente. O termo bacteriófago significa. condensando-se comforme vai entrando (empacotamento). utilizando a maquinaria da bactéria.000 vezes maior que o diâmetro do capsídeo o que exige um empacotamento considerável da molécula. No caso do T4. o genoma do fago replica-se vegetativamente originado novas partículas fágicas. via de regra. A capa protetora do fago. denominada capsídeo. a qual será transmitida às novas gerações de partículas fágicas. "comedor de bactéria". por exemplo. A molécula invasora será utilizada como molde para a síntese de mRNAs virais e também para a síntese de novos genomas virais. Em geral as células apresentam sítios receptores específicos para determinados vírus de sorte que a interação célulavírus é específica. dependendo do tipo de fago que a infecta. Vírus que infectam bactérias são denominados bacteriófagos ou simplesmente fagos. • Tradução destas mensagens utilizando-se a maquinaria do hospedeiro. • Empacotamento do DNA dentro do capsídeo. Mutantes h podem lisar os dois tipos de bactérias e produzem placas de lise bem claras enquanto o selvagem h+ produz placas de lise turvas porque só consegue lisar um dos tipos de bactérias que recobrem a superfície da placa (Figura 10. mas não infectam uma variante resistente da bactéria. Linhagens selvagens do fago infectam E. cauda e fibras. Estas zonas claras são denominadas placas de lise e refletem a destruição das bactérias. • Montagem dos capsídeos. A seqüência de eventos no ciclo lítico pode ser resumida em: • Aderência do fago à superfície da bactéria seguida de injeção do DNA no citoplasma bacteriano. típica. A contagem das placas permite que se calcule a concentração de fagos na suspensão inicial. As novas partículas liberadas infectam as células bacterianas vizinhas. O fago reconhece o receptor específico na superfície da bactéria. • Replicação do DNA do fago. pela progênie de fagos liberados consecutivamente a partir de uma bactéria inicialmente infectada. Mutação neste locus é denominada r (lise rápida).MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS silencioso por longo tempo. • Liberação de dezenas de partículas virais (Figura 10. sem lisar a célula. O ácido nucleico do fago é utilizado como molde para duplicação e para transcrição dos genes virais que codificam as proteínas da cabeça. • Transcrição dos genes virais.coli pelo fago T4. Este ciclo se repete inúmeras vezes redundando na formação de zonas claras numa camada de bactérias que cobrem um meio de cultivo semi-sólido. Todavia. Mutantes no locus de lise podem lisar a bactéria mais rápidamente que o selvagem (+). localizadas naquela região.13). na compatibilidade com o hospedeiro.coli. 12. Figura 10. instalou-se o ciclo lisogênico. mutantes do fago são capazes de infectar a variante resistente e a selvagem. duplicando-se juntamente com o cromossomo do hospedeiro. Ciclo Lítico Dizemos que houve infecção lítica quando novas partículas virais são produzidas. Cada tipo de fago apresenta uma morfologia de placa de lise.12). Diferenças de morfologia refletem mutações em dois loci. Mutação neste locus é denominada h. Um dos loci interfere na lise da bactéria e o outro. Cristina M. Bonato 121 . Infecção de E. produzindo placas de lise maiores. • Lise da célula hospedeira. MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 10. duplo mutante hr. diferentes conjuntos gênicos serão transcritos a partir do genoma viral. Na condição de profago não provocará qualquer dano à célula hospedeira. Quatro tipos de placas produzidas por uma mistura de formas mutantes e selvagem do fago T2. O fago l insere-se no genoma bacteriano via crossing-over. O desenvolvimento lisogênico permite a integração do genoma do fago ao cromossomo bacteriano por ação de recombinases codificadas pelo genoma do próprio fago. Integrado não tem replicação autônoma. placas turvas e grandes. Ciclo lisogênico. bactérias que contem o DNA do fago integrado a seu cromossomo recebem o nome de lisogênicas que significa. Ocasionalmente as linhagens lisogênicas podem produzir fagos infectivos. o fago l integrado poderá permanecer latente no 122 Cristina M. 14. Figura 10. Duplica-se a cada divisão celular da bactéria. lítico ou lisogênico. O genoma viral integrado e inativo é denominado profago. recombinantes h+r. Por esta razão. como parte integrante do cromossomo hospedeiro. Uma vez estabelecido o padrão de transcrição. A conseqüência disto será a lise celular. Ciclo Lisogênico Dizemos que houve infecção lisogênica quando o DNA do fago integra-se ao cromossomo do hospedeiro. Em fagos temperados. Fagos capazes de estabelecerem este tipo de interação com a célula hospedeira são denominados fagos temperados. Agentes agressivos como raios ultra violeta (UV) e certos produtos químicos podem induzir o profago.14). O fago lambda (l) é um exemplo de fago temperado (Figura 10. Selvagens h+r+ produzem placas pequenas e turvas. uma vez que a expressão da maioria dos genes virais estará reprimida. a opção entre a via lítica e a lisogênica de desenvolvimento é governada por proteínas codificadas pelo genoma do fago e da bactéria assim como pelas condições de infecção. Fagos temperados como o bacteriófago pode optar pelo ciclo lítico ou lisogênico. Bonato . literalmente. Esta forma de perpetuação do genoma do fago não implica nem na morte do hospedeiro nem na liberação de partículas virais. "dar origem à lise". coli. 13. Dependendo dos estados escolhidos. placas claras e grandes. por exemplo. ele é estavelmente mantido. provocar sua excisão do cromossomo bacteriano. O ponto de crossing-over é entre o sítio de ligação do l e um sítio do cromossomo bacteriano localizado entre os genes gal e bio. recombinantes hr+ produzem placas claras e pequenas. O fenômeno de lisogenia foi descoberto por André Lwoff em meados da década de 40. sobre uma cobertura de dois tipos de E. Assim. ou seja. Este tipo de interação fagohospedeiro é denominado lisogenia e as células hospedeiras são denominadas lisogênicas. Outras vezes.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS genoma hospedeiro de E. a recombinase Xis. Em ambos os casos. Do evento de permuta participam apenas os pares de bases assinalados em azul na seqüência O: GCTTT TTTATAC TAA. O evento de integração do fago ao cromossomo bacteriano depende da recombinase Int (integrase) do fago. utilizando-se diplóides parciais. attP e na bactéria. attB. informação bacteriana poderá ser carregada para outra célula bacteriana por infecção fágica. Uma pequena seqüência de homologia com ~15pb (O) é flanqueada por segmentos não similares. Cristina M. attachment) presente no fago. o capsídeo engloba fragmentos do DNA cromossômico provenientes de qualquer região do cromossomo bacteriano. Na sexdução o erro ocorre durante a excisão do plasmídio F enquanto na transdução especializada o erro ocorre durante a excisão do profago. permitiram um enorme avanço no conhecimento da genética bacteriana: centenas de mutantes em diferentes vias metabólicas foram isolados. genes bacterianos. constituem o sítio att (do inglês. Bonato 123 . Este sistema de recombinação que envolve um sítio específico em cada uma das moléculas é denominado recombinação sítio-específica. As descobertas dos processos de transferência de informação genética em bactérias associadas ao conhecimento da fisiologia bacteriana. o bacteriófago l é integrado e excisado do cromossomo bacteriano pela ação de endonucleases específicas que reconhecem elementos de seqüência típicos. coli. O processo de transferência de DNA bacteriano de uma célula a outra via fago é denominado transdução. As seqüências envolvidas no reconhecimento e permuta. tanto no cromossomo bacteriano como no cromossomo do fago e catalisam as reações de recombinação entre estas moléculas. P e P’ no fago e B e B’ na bactéria. O fago P1 é um exemplo de transdutor generalizado e o fago lambda (l) é um exemplo de transdutor especializado. são carregados juntos e serão encapsulados nas partículas fágicas. Partículas fágicas que transferem DNA cromossômico de uma bactéria a outra são denominadas transdutoras. Os bacteriófagos têm um importante papel na transferência de genes entre bactérias. No cromossomo bacteriano este sítio encontrase entre os operons gal e bio. Transdução Especializada Na transdução especializada. se uma bactéria lisogênica for infectada por um fago de mesmo tipo ele não poderá se multiplicar. finalmente. O evento de excisão também depende de outra recombinase codificada pelo fago. adjacentes ao sítio de integração. na excisão. coli por milhares de gerações celulares. bastante desenvolvida no Instituto Pasteur de Paris. Dois tipos de fagos transdutores são conhecidos: transdutores generalizados e transdutores especializados. Bactérias lisogênicas são imunes à infecção por outras partículas virais do mesmo tipo. O desenvolvimento deste modelo culminou com o trabalho publicado por Jacob & Monod (1961) onde os princípios básicos da regulação gênica em bactérias são claramente enunciados e se constituiram num suporte vigoroso para as futuras investigações no campo do controle gênico. Ambos infectam E. foi possível se estabelecer um modelo acerca de como a expressão destes genes era regulada. Às vezes. O processo de transdução especializada é análogo ao de sexdução uma vez que ambos dependem de um erro durante a excisão de uma molécula integrada ao cromossomo do hospedeiro. foi possível determinar as relações de dominância e recessividade entre alelos. ou seja. foi possível mapear os genes ao longo dos cromossomos e. 3) 1 5 6 7 8 0 0 L 0 2 M M 0 L 3 M M 0 L 4 0 0 M 0 Baseado nestes resultados determine o tipo sexual de cada linhagem (Hfr. 10. considerando-se os dados abaixo? (Tamarin.6. Os dois genótipos foram misturados em todas as combinações possíveis e.C e D e com uma linhagem receptora sensível a todas as quatro drogas.. Qual seria a ordem provável dos três genes intimamente ligados? (Griffiths et al. 0 = nenhum recombinante. cap. A. O triptofano foi usado como marcador para determinar se a transformação ocorrera (marca seletiva).MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Guia de Estudo Um experimento de transformação em bactérias foi realizado com uma linhagem doadora que é resistente às drogas. Obteve-se o resultado abaixo. e 4. os quais parecem estar intimamente ligados. 1993 Genetic Analysis. após incubação.foram marcadas 1. espalhados para determinar a frequência de recombinantes a+b+.3.2.B.1996) trp+ pyrC + purB + 124 86 Cristina M..Genetic Analysis. Qual a ordem dos genes e a freqüência de co-transformação. coli foi isolado e usado para transformar linhagens auxotróficas deficientes na síntese de purinas (pirB-). 1993 .7. Qual é o gene mais distante? b. L = poucos recombinantes. onde M = muitos recombinantes.8. Quatro linhagens de E. cap. as células foram distribuídas em 4 placas contendo várias combinações das drogas e incubadas para desenvolvimento de colônias. no. Quatro linhagens com genótipo a-b+ foram marcadas 5. F+ ou F-).coli com genótipo a+b. Drogas adicionadas nenhuma A B C D AB AC AD Número de colônias 10. Após transformação. Bonato . 10. Um dos genes está obviamente mais distante do que os outros três. (Griffiths et al. Resultados na tabela abaixo. 16).000 1156 1148 1161 1139 46 640 942 Drogas adicionadas BC BD CD ABC ABD ACD BCD ABCD Número de colônias 51 49 786 30 42 630 36 30 a. pirimidinas (pyrC-) e do aminoácido triptofno (trp-). no. O DNA de uma linhagem prototrófica de E. Não cresceu nada. Baseado nestas informações. As colônias originais também foram replicadas em MM + valina e 6% cresceram. Baseado nestes dados. Transformantes iniciais foram isolados em meio mínimo + histidina + valina. Estas colônias foram replicadas em MM + histidina e 75% das colônias originais cresceram. Quais os genótipos das colônias que cresceram neste meio? c. Finalmente.his. Como se dá a inserção do plasmídio F no cromossomo do hospedeiro? Como funciona a técnica de "replica-plating"? Quais as diferenças e semelhanças entre os processos de conjugação.. Que genótipos crescerão neste meio? b. transformação e transdução? O que é um plasmídio? Que exemplos você conhece? Quais as funções dos genes tra? Porque o plasmídio F é um mutante que expressa constitutivamente os genes tra? O que significa competência? O que são elementos de inserção (IS)? O que é uma placa de lise? Cristina M. Qual dos dois genes está mais próximo de lys? f. Exemplifique. Bonato 125 . a. que genótipos cresceriam em MM + histidina e em MM + valina? e. as colônias originais foram replicadas em MM.val. Formaram-se 50 colônias. A transformação original foi repetida só que o plaqueamento original foi feito em MM + lisina + histidina. qual a possível ordem dos genes? (Tamarin. 1996) O que é recombinação sítio-específica.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS trp+ pyrC + purB trp+ pyrC – purB + trp+ pyrC – purB 04 67 14 Uma linhagem bacteriana que é lys+ his+ val+ é usada como doadora e lys. como receptora. As colônias foram replicadas para determinar seus genótipos e se obeteve os seguintes dados: val+ his+ lys+ 0 + + val his lys 37 + + val his lys 03 g. Qual o genótipo possível destas? d. A partir da década de 70 têm sido desenvolvidas várias técnicas onde o genótipo de um organismo pode ser modificado diretamente. O estabelecimento de uma correlação entre mutações específicas e proteínas singulares. bastante complexos. Estes processos são essencialmente aleatórios e a identificação de recombinantes com as características desejadas. O enorme interesse na tecnologia do DNA recombinante é motivado pela grande variedade de aplicações. tais como: • Isolamento de um gene. entre todos os produzidos . às vezes. tais como plantas que não dependam de fertilizantes ou de animais que exibam alta taxa de crescimento. até então. Assim. O conjunto destas técnicas recebeu o nome de Tecnologia do DNA Recombinante. todas as manipulações feitas com material biológico. b) Cruzamento entre mutantes diferentes permitindo o isolamento de recombinantes. constituíram um avanço considerável no entendimento da Genética. Os fragmentos dos dois tipos são então unidos na combinação desejada e reintroduzidos no organismo vivo. Moléculas de DNA provenientes de dois organismos diferentes são isoladas e cortadas em fragmentos menores utilizando-se enzimas especiais.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Capítulo 11 – TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE Visão Geral Do final do século XIX até meados do século XX. nenhum gene havia sido isolado nem uma seqüência de nucleotídios examinada diretamente. ou Engenharia Genética ou Clonagem Gênica. para se obter organismos com novos genótipos e fenótipos fundamentavam-se nos conceitos de mutação e recombinação e consistiam basicamente em: a) Tratamento com agentes mutagênicos que induziam o surgimento de mutantes na população. Bonato . • Produção de um RNA ou proteína específica em quantidades muito maiores do que se obteria por métodos convencionais. mas aumentam a eficiência na construção dos tipos genéticos desejáveis e permitem. • Criação de organismos com características desejáveis. Todavia. criar genótipos novos que seriam impossíveis utilizando as técnicas de genética clássica. Neste tipo de manipulação as mutações e recombinações são realizadas "in vitro". pautadas nas razões fenotípicas resultantes de cruzamentos controlados. de parte de um gene ou de uma região genômica particular. tais como enzimas e drogas. o estudo da genética foi baseado em inferências indiretas acerca dos genes. de maneira pré-determinada. Correção potencial de defeitos genéticos em organismos superiores. Até os anos 70. como inicialmente proposto por Mendel. • Eficiência cada vez maior na produção de compostos orgânicos de interesse. assim como a descoberta do código genético e da estrutura do DNA. 126 Cristina M. ao geneticista. os fundamentos continuam os mesmo dos cruzamentos tradicionalmente praticados pelo ser humano em plantas e animais. exige procedimentos seletivos. As enzimas de restrição tipo II fazem parte de um sitema mais amplo da célula bacteriana denominado sistema de modificação-restrição. a ligação fosfodiéster 5'GpG3' é clivada em cada uma das fitas. Centenas de enzimas de restrição já foram isoladas de diferentes microrganismos. vírus) que será clivado pela Enzima de Restrição da bactéria que não ataca seu próprio genoma pois este está modificado (Linn & Arber. 1970). P. O nome dado à enzima refere-se ao organismo de onde foi isolada. 1968). Tabela 11. Sítios de reconhecimento. Este sistema consiste de uma endonuclease de restrição e de seu par. são complementares entre si. Bacillus amyloliquefaciens. a enzima EcoRI.1. As bases alvo de metilação são Adenina (grupo amino) ou Citosina (grupo amino ou posição 5). após a clivagem. Enzimas de Restrição Uma enzima de restrição ou endonuclease de restrição é um tipo de nuclease que cliva uma fita dupla de DNA sempre que identificar uma seqüência particular de nucleotídios que seja o sítio de restrição da enzima (Smith & Wilcox. Por exemplo. 1. se o genoma do vírus for modificado após a invasão ele será capaz de se reproduzir no seu novo hospedeiro. como indicado pelas setas. modificação e clivagem Cristina M. uma metilase de modificação. Isto significa que os fragmentos produzidos podem formar espontaneamente um novo círculo. No caso. produzindo grupos 3'OH e 5'P em cada posição. Desta forma o sistema de restrição-modificação protege a bactéria da invasão de DNA exógeno (em geral. ligarem-se uma a outra. Bonato 127 . ex. Grande parte destas enzimas ao clivarem as duas fitas de DNA geram terminais coesivos enquanto outras geram terminais abruptos (Tabela 11. A metilase metila uma base específica da mesma seqüência reconhecida pela endonuclease de restrição. Quando o DNA está modificado a enzima de restrição não é capaz de clivá-lo. a enzima BamH1 reconhece a seqüência dupla fita: Uma vez reconhecida a seqüência acima. gerados com a clivagem de cada uma das fitas.1). Figura 11. Os terminais fita simples. gera terminais coesivos ao clivar as duas fitas nas ligações fosfodiéster 5'GpA3'.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS A possibilidade de se criar novas combinações informacionais na molécula de DNA dependeu fundamentalmente do isolamento de endonucleases (Enzimas de Restrição) que reconheciam e clivavam sítios específicos da molécula de forma tal que moléculas de origem diferentes pudessem. Estas propriedades da molécula de DNA e das enzimas de restrição permitem que se construa moléculas recombinantes a partir de fragmentos de DNA originários de organismos até bastante distantes do ponto de vista evolutivo. Se a enzima DNA ligase estiver presente no meio.. Outras enzimas reconhecem outras seqüências. como exemplificado na Tabela 11.1. Todavia. os terminais 3' e 5' podem ser covalentemente unidos. ambos formarão o mesmo tipo de terminal coesivo e poderão ser covalentemente ligados. Figura 11. B. A. então cerca de mil fragmentos podem ser gerados quando o 128 Cristina M.106 pares de bases. Terminais coesivos gerados por ação da enzima de restrição EcoRI.7. Como existem apenas 4 tipos de bases. Assim. após pareamento por complementaridade. 1. portanto. A seqüência de nucleotídios reconhecida pela EcoRI contem 6 nucleotídios. Tipos de cortes feitos por enzimas de restrição. Bonato . Terminais abruptos gerados por ação da enzima de restrição SmaI. um sítio deste poderá ser encontrado a cada ~4096 pares de bases. se o DNA de um mamífero e o da uma bactéria forem digeridos com EcoRI. Observe o eixo de simetria.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS por algumas enzimas de restrição Enzima EcoRI HindIII Sítio de Restrição Organismo de origem Escherichia coli Haemophilus influenza TaqI PstI HaeIII SmaI Thermus aquaticus Providencia stuartii Haemophilus aegyptius Serratia marcescens As seqüências reconhecidas pelas Enzimas de Restrição caracterizam-se pelo fato de que as duas fitas complementares apresentam seqüências idênticas. gerando uma quimera. constituindo um palíndromo. Se o DNA de E. porém invertidas. Este é um dos fundamentos básicos da tecnologia do DNA recombinante. a probabilidade de se encontrar a seqüência específica GAATTC é 1/4 6.coli é formado por ~ 4. A letra m refere-se a modificação das bases A ou C por metilação. o DNA exibe polimorfismo em relação ao comprimento dos fragmentos de restrição (RFLPs. p. Um RFLP resultante de um número variável de repetições em série é denominado VNTR (variable number of tandem repeats). de um indivíduo para outro. Cada fragmento aparece como uma banda horizontal no gel. por comparação. As vezes o RFLP resulta de diferenças no número de cópias de pequenas seqüências de DNA repetidas em série num determinado local do cromossomo. O tratamento concomitante com as duas enzimas permite que se estabeleça. cromossomos homólogos quando digeridos com uma dada enzima de restrição geram fragmentos de tamanhos diferentes. R. tratada com BamH1 e HindIII. se a mesma molécula de DNA for tratada paralelamente com BamHI. Se o sítio de restrição de uma determinada enzima flanqueia esta região. 2002). a posição relativa dos sítios de restrição presentes na molécula. 2. ex. O comprimento de cada fragmento gerado com os diferentes tratamentos está indicado. Tais variações podem criar ou eliminar sítios de restrição na molécula de DNA. Devido à especificidade de seqüência. isto é. geraria milhões de fragmentos.. Bases únicas do DNA que diferem em pelo menos 1% da população. do inglês. Uma molécula de DNA com vários sítios para HindIII produzirá vários fragmentos de DNA de tamanhos diferentes. produz fragmentos de tamanhos diversos que podem ser separados por eletroforese em gel de agarose. A informação obtida dos géis permite deduzir as posições relativas dos sítios de restrição na molécula de DNA. Mapa de restrição de uma molécula linear de DNA com 4kb. ou seja. dependendo da posição dos sítios na molécula de DNA.2). ou seja variação. uma dada enzima de restrição produz um conjunto único de fragmentos para uma molécula particular de DNA. É possível construir mapas de restrição de segmentos de DNA analisando-se os fragmentos gerados após tratamento com diferentes enzimas de restrição. Restriction-Fragment Lenght Polymorphisms). Como as diferenças de tamanho dos fragmentos de restrição podem facilmente ser visualizadas em géis após eletroforese. isoladamente e em conjunto. na seqüência equivalente do DNA. Os mapas de restrição são convenientes na localização de seqüências particulares de bases no cromossomo e para se estimar o grau de diferenças entre cromossomos relacionados. Portanto. A individualidade nos seres vivos resulta de polimorfismo genético. cerca de 1 a cada 1250 bases (Lewis. Já o genoma de um mamífero. que é muito maior do que o de uma bactéria. muito provavelmente gerará fragmentos de tamanhos diferentes. os RFLPs são valiosos no diagnóstico de doenças Cristina M. Portanto. é claro que os fragmentos terão tamanhos diferentes. Bonato 129 . permite que se determine o mapa de restrição da molécula (Figura 11. Figura 11.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS cromossomo de E. HindIII. coli é digerido com EcoRI. Mapa de Restrição e RFLPs O tratamento de uma molécula de DNA com uma enzima de restrição. Os fragmentos maiores movem-se mais vagarosamente que os menores durante a migração num campo elétrico. caracterizam polimorfismo de um único nucleotídio (SNPs. dependendo do número de repetições em cada um dos cromossomos homólogos que estão sendo comparados. single nucleotide polimorfism) e salpicam o genoma humano irregularmente. então. 3.3). Círculo representa fêmea e quadrado representa macho. seqüências similares podem hibridizar. Northern. Os RFLPs são herdados de acordo com as regras da genética mendeliana (Figura 11. Figura 11. A utilização desta técnica tem fornecido informações interessantes sobre as populações humanas. portanto. A primeira coisa a se fazer é desnaturar o DNA. as bandas do gel. Como funciona esta técnica desenvolvida por Edwin Southern (daí o nome)? Ela baseia-se no conhecimento de que as fitas de DNA são complementares e. A seguir. Bonato . 1987). é desejal sempre que possível. Estas moléculas vão hibridizar com a banda ou bandas onde houver DNA complementar a elas. este método identifica um segmento de DNA com uma seqüência de bases específica. são carimbadas (blot) numa membrana de nitocelulose ou de nylon. Um gene com quatro alelos que se caracterizam pelas posições diferentes dos sítios de restrição (marcadores diferen-tes) podem ocorrer em qualquer das combinações possíveis e segregar independentemente a cada geração. com tratamento alcalino do gel. Southern. Logo. Depois de revelado o filme apresentará bandas escuras que indicam a posição de hibridização. Os descendentes em F1 são AC e BB. Na geração parental dois indivíduos são homozigotos (AA e BB) e dois são heterozigotos (CD e BD) para o gene em questão.. Western Blots A visualização de um fragmento de interesse num gel que separou milhares de fragmentos de um DNA submetido a ação de uma determinada enzima de restrição pode ser feita via Southern Blot. Desta forma é possivel detectar.. aquele que lhe interessa (Figura 11. (1997). gerando uma molécula dupla fita. in loco. entre os milhares de fragmentos produzidos.4). analisando 109 marcadores de DNA (79 RFLPs e 30 micro satélites) de 16 populações mundiais verificaram que 84. utilizando-se sondas fluorescentes.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS hereditárias de genes desconhecidos. o que facilita o manuseio e permite que elas continuem ocupando as mesmas posições originais.000 anos (Cann et al. Detecção não radioativa.4% da variação mundial destas marcas encontra-se entre os membros de uma mesma população e apenas 10% ocorria entre "raças" predominantes. Barbujani et al. 130 Cristina M. na identificação de indivíduos nas investigações criminais e no desvendamento da nossa história evolutiva. que agora contem DNA fita simples. Portanto só podem gerar filhos que herdem o traço B do pai e A ou C da mãe (F2). fixando o DNA permanentemente e. exposta a uma solução que contenha moléculas radioativas de DNA desnaturado ou RNA cujas seqüências são conhecidas (sonda). Estudos dos padrões de restrição do DNA mitocondrial de 145 indivíduos representando diferentes populações mundiais concluiu que todo DNA mitocondrial humano originase de um ancestral comum pertencente a uma população Africana há 200. A radioatividade é detectada num filme de Raio-X que será exposto a membrana. detectado no gel pela utilização de uma sonda específica. A membrana contendo todos os fragmentos é seca a vácuo (800C). A sonda só hibridiza com o fragmento complementar entre os milhares de fragmentos gerados pela digestão de um cromosso com enzima de restrição. Bonato 131 . as proteínas de um extrato de células são separadas por eletroforese. 4. dTTP) ingressantes no terminal livre 3´OH de uma seqüência pré-existente (primer). Sequenciando o DNA O método atualmente utilizado para sequenciamento automático do DNA é aquele proposto por Frederick Sanger em 1975 e baseia-se nos princípios de duplicação do DNA e na utilização de um terminador da cadeia nascente. Cristina M. adicionando os desoxirribonucleosídeos trifosfatados (dATP. Por exemplo.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 11. Onde houve interação antígeno-anticorpo sugem bandas coloridas. Ou seja. Desta forma. Neste caso utilizam-se anticorpos para reagir com suas proteínas específicas dentre aquelas separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida. Uma proteína específica também pode ser analogamente detectada num procedimento denominado Imunoblotting ou Western Blotting. dGTP. Fragamentos de DNA obtidos por ação das enzimas de restrição. ou seja. Esta técnica é denominada Northern blot (apenas por referência ao Southern blot). O mesmo princípio descrito acima permite que imobilizemos RNA no papel e utilizemos DNA ou RNA como sonda. obedecendo a ordem determinada pela fita molde (Figura 11. separados por eletroforese e identificados pela técnica de Southern Blot podem ser lidos. Um fragmento de interesse pode ser detectado usando-se sonda radioativa. Como isto é visualizado? Trata-se o papel com um anticorpo secundário que reage com o anticorpo primário. Southern blot.5). dCTP. a DNA polimerase só trabalha no sentido 5´ > 3´. Ao anticorpo secundário está associada uma enzima cuja atividade é fácil de visualizar (geralmente por reação colorimétrica). transferidas para o papel de nitrocelulose e exposta ao anticorpo que deverá detectar a proteína de interesse. utilizando-se como sonda o fragmento de um gene ou mRNA bacteriano podemos procurar por similares entre os fragmentos de um cromossomo humano. podemos saber exatamente qual é a seqüência de bases do fragmento de interesse. A ordem das bases na molécula é lida. ddGTP. gerando fragmentos de diferentes tamanhos. Portanto. Na proposta do terminador. além de todos estes componentes adiciona-se também aos tubos de reação uma pequena quantidade de um 2´. ddTTP). de sorte que os fragmentos de cada tubo pudessem ser visualizados. das enzimas apropriadas e de desoxirribonucleosídeos trifosfatados (dNTP). Bonato .MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 11. que corresponde ao sentido 3´ > 5´ (Figura 11.6). 5.3´didesoxinucleotídio trifosfato (ddNTP) específico. ddCTP. 132 Cristina M. em seqüência. O terminador competirá com o desoxirribonucleosídeo trifosfatado análogo (dNTP) e interromperá a cadeia sempre que for incorporado. uma vez que não possuem um grupo 3’ OH livre para perpetuar o ataque nucleofílico sobre o a-fosfato dos nucleosídios trifosfatados ingressantes. do fragmento maior para o menor. Após a migração. Duplicação do DNA. Como visualizar estes fragmentos? Em geral marcava-se radioativamente o primer ou um dos dNTPs e os fragmentos de cada tubo eram separados por eletroforese. um filme de Raios-X era exposto ao gel e então revelado (autorradiograma). Os ddNTPs são os terminadores. do primer. Como isto é feito? Quatro tubos de reação são utilizados e em cada um adiciona-se uma pequena quantidade de um dos ddNTP (ddATP. onde os fragmentos maiores migram mais lentamente que os menores. a duplicação implica na presença de um molde. Cristina M. Como isto é feito? 1. a polimerase necessita de nucleosídeos trifosfatados de adenina. Tal amplificação do segmento de DNA desejado pode ser obtida pela reação de polimerização em cadeia (PCR) ou pela clonagem em vetores multi-cópia. Atualmente. por alguns segundos. deu grande impulso a utilização automatizada desta técnica. 7. primers e fragmento de DNA dupla fita. 6. Para sequenciar um fragmento de DNA é conveniente partirmos de um grande número de cópias deste fragmento. As letras especificam as bases e os números indicam a posição das bases no segmento sequenciado. A replicação no tubo de ensaio mimetiza o que ocorre na natureza. Para separar as duas fitas. a polimerase sintetiza as novas fitas. O primeiro passo é "abrir o DNA". Em 2001 foi completado o rascunho da seqüência do genoma humano por dois grupos: a) International Human Genome Sequence Consortium e b) Celera Genomics. separando as duas fitas da dupla hélice. denominada Taq polimerase. milhões de cópias de um único segmento de DNA em questão de horas. preto e azul para ddATP. USA (Venter et al ).MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 11. Detectores de fluorescência presentes nas máquinas de sequenciamento são controladas pelo computador de sorte que a aquisição dos dados é automatizada (Figura 11. citosina e guanina e de primers. ddTTP. amplamente utilizada em laboratórios de pesquisa e clínicos. faz cópias utilizando cada uma das fitas como molde. específico para cada ddNTP: verde. Em seguida a DNA polimerase de T. Tal façanha depende da habilidade das enzimas copiadoras de DNA permanecerem estáveis em alta temperatura. Figura 11. Para copiar o DNA. Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) A técnica de PCR. aquaticus. automaticamente. Produto de sequenciamento automático. timina. Taq polimerase. As curvas indicam a intensidade de fluorescência de um corante particular. Bonato 133 . ligado ao primer. vermelho. A DNA polimerase isolada da bactéria hipertermófílica Termus aquaticus.7). nucleosídeos trifosfatos. A partir dos primers. no seqüênciamento automático. o tubo de ensaio contendo. encontrada em fontes termais do parque florestal de Yellowstone-USA. como veremos a seguir. ddGTP e ddCTP respectivamente. é submetido à temperatura de 90-95oC. não se utiliza mais marcação radioativa e sim um corante fluorescente. consiste em produzir. Esquema do método Terminador de Cadeia (di-desoxi). Bonato . A seguir a temperatura é novamente elevada porque a Taq polimerase trabalha melhor à 75 oC. Na clínica é utilizado no diagnóstico de doenças infecciosas e na detecção de eventos patológicos raros. mais de um milhão de cópias de um determinado pedaço do DNA foi produzido (Figura 11. Na paleontologia molecular.8). Na criminalistica. 3. Então. Em seguida o tubo é resfriado para a temperatura de ~55 oC. um único fio de cabelo pode identificar o doador. Quando um fragmento de DNA é inserido num vetor diz-se que está clonado. Vetores e Estratégias de Clonagem Moléculas de DNA capazes de auto-duplicação (replicons). Este ciclo é repetido 30 ou mais vezes de sorte que após ~3 horas. podem ser utilizadas como veículos para carregar fragmentos de DNA obtidos por ação das enzimas de restrição. 134 Cristina M. finalmente. Técnica formulada por Kerry Mullis. Figura 11. 4. a molécula recombinante é colocada dentro do hospedeiro via transformação. Os veículos são denominados vetores. Reação de Polimerização em Cadeia. a polimerase começa a adicionar nucleotídios a partir dos primers fazendo. uma cópia completa dos moldes. a amplificação de amostras de DNA extraídas de fósseis incrustados e preservados no ambar há mais de 120 milhões de anos permite a determinação da seqüência desta molécula para estudos evolutivos. Isto leva alguns segundos. Em geral. Ao final tem-se um ciclo completo de PCR. Nesta temperatura os primers vão se anelar às seqüências complementares no fragmento de DNA. uma vez que várias cópias deste fragmento poderão ser produzidas com a auto-duplicação do vetor no hospedeiro apropriado.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS 2. coli e moléculas derivadas dos bacteriófagos l e M13. Os vetores mais utilizados até o momento são plasmídios de E. 8. Este processo leva menos do que dois minutos. O PCR tem inúmeras aplicações. lembrando sempre que o vetor deve possuir genes que confiram à célula receptora um fenótipo facilmente identificável. podendo ser inseridos neste único ponto de abertura do vetor gerando uma molécula constituída de vetor + inserto. Pode ser introduzido numa célula hospedeira. 9. Desta forma os terminais de qualquer dos fragmentos do DNA doador complementam-se ao do vetor. EcoRI. por um gene presente no vetor como. Se o gene clonado estiver apropriadamente flanqueado por seqüências que controlem a síntese de RNA (transcrição) e de proteínas (tradução). Digestão do vetor com a mesma enzima de restrição. etc. denominado DNA doador. eletroporação. b. Tanto o vetor como o DNA estrangeiro são cortados com a mesma enzima de restrição gerando terminais coesivos que podem se anelar produzindo uma quimera.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS As características básicas de um vetor são: a. resistência a antibióticos. p. Estratégias de clonagem A clonagem de fragmentos em um vetor pode seguir os passos abaixo: a. Introdução do vetor na célula hospedeira. Figura 11.(Figura 11. Resumindo. O resultado é uma quimera que. coli ou levedura. é necessário selecionar as transfor-mantes. Para tanto. os terminais do próprio vetor podem se reanelar e neste caso não será produzido um DNA recombinante. a célula hospedeira também será capaz de produzir grandes quantidades de RNA e da proteína codificada no gene inserido. Cristina M. Portanto. Células contendo o vetor podem ser facilmente selecionadas pelo fenótipo conferido ao hospedeiro. Clonagem de fragmentos de DNA num vetor. as células são espalhadas em meio sólido seletivo. de sorte que o fragmento seja replicado com o vetor. Digestão do DNA de interesse. Como distinguir entre as células que receberam o vetor "vazio" e o vetor com inserto? Veja no item pBR322 e outros vetores. Desta forma. ao ser clonada num organismo hospedeiro apropriado como E. o meio seletivo deve conter o antibiótico em questão. permitindo o fechamento do círculo e gerando um DNA recombinante. as células que não foram trans-formadas com o vetor não sobreviverão neste meio. a idéia central na clonagem molecular é inserir um segmento de DNA de interesse numa molécula de DNA de replicação autônoma (veículo ou vetor de clonagem). seja por transformação clássica. que cria terminais coesivos. Tratamento com DNA ligase para selar os terminais. produz uma enorme quantidade do segmento de DNA ali inserido. ex. observando-se que o vetor deve possuir um único sítio de restrição para a enzima. o que permite sua duplicação no hospedeiro. Contem uma origem de replicação. p. b. produzindo-se centenas de fragmentos com o mesmo tipo de terminal. ex. Ao se transformar uma população bacteriana com um vetor nem todas as células são transformadas. Com esta população de vetores serão transformadas as células hospedeiras. com uma enzima de restrição apropriada. c. biobalística. d. que permitirá o crescimen-to apenas das células que receberam o vetor. c. Bonato 135 . Todavia.9). Se o vetor conferir resistência à antibiótico. inativando-o. Tais segmentos de DNA com múltiplos sitios de clonagem são denominados polylinkers. crescerão todos os transformantes. a partir das placas de Amp podemos isolar as bactérias que receberam o inserto. Como selecionar apenas as colônias que contem o vetor com inserto? Se os transformantes forem semeados em um meio seletivo contendo Amp. Ainda não tinha polylinker. representado na Figura 11. isto é. estão presentes em várias cópias na célula. É esta população de vetores que será utilizada para transformar E. 10. Observe que o gene que confere resistência à Tet possui sítios para as enzimas de restrição BamHI e SalII e o gene que confere resistência à Amp possui um sítio para PstI. não crescerão as colônias que possuam o vetor + inserto. Outros vetores vão simplesmente ligar suas extremidades novamente sem incorporar o inserto. O tamanho 136 Cristina M. Figura 11. Bonato . em série. Se em qualquer destes sítios for introduzido um inserto o gene correspondente ficará inativado. O DNA recombinante é então empacotado "in vitro" e a partícula madura é utilizada para infectar células bacterianas. coli. Contem a origem de replicação de plasmídios bacterianos e dois genes conferindo resistência aos antibióticos Tetraciclina (Tet) e Ampicilina (Amp). carregam genes de resistência a um ou mais antibióticos e contêm uma série de sítios de restrição estrategicamente localizados. Se as colônias AmpR forem então transferidas. Estas bactérias serão estocadas e nomeadas para posterior identificação do inserto aí inserido. para diferentes enzimas de restrição.10. via carimbo (replica plating). Suponha que um fragmento de DNA humano. Um dos primeiros vetores de clonagem construídos foi o plasmídio pBR322. coli. pBR322 . replicam sob controle relaxado. com e sem inserto.Nos vetores construídos para clonagem. Isto permite que distintos fragmentos estrangeiros cortados com diferentes enzimas de restrição sejam inseridos no vetor. justamento porque o inserto entra no gene que codifica resistência a Tet. Assim. Os plasmídios são usualmente utilizados para clonar fragmentos pequenos de DNA (5-10 kb). Quando se quer clonar fragmentos um pouco maiores pode-se utilizar o bacteriófago l cujo DNA tem ~50kb de comprimento.Vetor de Clonagem apropriado para duplicar em E. Os diferentes sítios de restrição estão indicados. Alguns vetores vão se ligar ao fragmento exógeno (inserto) e. o sítio de clonagem contem sítios de clivagem. Em geral são pequenos. A porção central do genoma do fago não é essencial ao crescimento lítico podendo ser retirada e substituída pelo DNA exógeno.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS pBR322 e Outros Vetores Existem vários plasmídios interessantes para clonagem. para um meio contendo Tet. cortado com BamH1 foi colocado num tubo de ensaio contendo pBR322 também clivado com BamH1. com ajuda da ligase formar a quimera. Isto porque em eucariotos são freqüentes genes muito grandes devido a presença de introns. 4. pode variar de 12 a 20kb.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS do inserto. Às vezes a quimera é construída à partir de um mRNA. genes com introns clonados em bactérias não poderiam gerar o produto. inativando-o. Origem de replicação do fago de DNA fita-simples f1. Nestas condições o plasmídio pode ser empacotado "in vitro" para infectar a célula hospedeira. porque não seriam processados. Portanto. com 2961 pares de base contendo: 1. 5. Um polylinker de 108 pb contendo sítios de clonagem para 23 enzimas de restrição diferentes na porção N-terminal do gene lac Z. A inserção do fragmento na região do polylinker vai alterar o quadro de leitura do gene lac Z. nem menor). Bonato 137 . liberando um corante azul forte. Como um gene é clonado a partir o mRNA? Utiliza-se a transcriptase reversa para sintetizar uma molécula de DNA dupla-fita a partir de um RNA fita simples. a inserção do fragmento exógeno inativa o gene lac Z. O gene que confere resistência à ampicilina para selecionar as células transformadas. sem interfirir no quadro de leitura do gene. Tais vetores denominados cosmídios podem existir como plasmídios mas contêm os terminais coesivos do fago lambda (sítio cos) numa distância de 36 a 51 kb. são as colônias brancas que contem o plasmídio recombinante.11). A enzima b-galactosidade produzida pelo gene lac Z quebra o composto X-gal adicionado ao meio de cultura. ao ser introduzido na célula reproduz-se como um plasmídio. O gene lac Z que permite a detecção dos plasmídios recombinante por coloração das colônias. Um vetor de clonagem mais moderno é o plamídio pBluescript II (Figura 11. Esta seqüência é então inserida no vetor apropriado Cristina M. facilitando a clonagem. A origem de replicação do plasmídio ColE1 que permite um alto número de cópias (~300 cópias/cel). caso contrário não será possível empacotá-lo. em colônias azuis o gene lac Z está funcional. devendo ser proporcional ao segmento excisado (nem maior. Uma vez que o cosmídio não tem genes do fago. O DNA obtido é denominado DNA complementar ou cDNA. No plasmídio recombinante. Portanto. Os introns são retirados no processamento da molécula gerando um mRNA bem menor que o gene. todavia. Alguns vetores combinam características de plasmídio e do fago l e aceitam insertos maiores (40-45kb). 2. 3. Além disto. neste caso. 99787234 N= 2162 clones 138 Cristina M. N= log(1 . marcas seletivas e sítio para clonagem. que se duplica em bactéria. coli como levedura.10 6pb) e decidindose por clonar fragmentos de 10kb. qualquer plasmídio capaz de se propagar em células de duas ou mais espécies diferentes é um plasmídio bifuncional (shuttle vector). portanto.(1 .99) / log (1-10/4700) N= log 0. Tal biblioteca é feita uma única vez porque ela pode ser perpetuada para uso sempre que uma nova sonda estiver disponível. que possui 4700 kb (4. f= fração do genoma representada pelo fragmento clonado.7. BACs: podem receber fragmentos de 100. com uma probabilidade de 99%? N= log (1-0. Aliás. permite a clonagem de milhares de pares de bases. Como calcular o número de clones para assegurar que uma dada seqüência esteja presente pelo menos uma vez na biblioteca? P= 1 . coli. em pares de bases.f) Por exemplo. não possui as seqüências reguladoras de iniciação (promotor) e terminação de transcrição.01 / log 0. o DNA de um organismo é isolado e submetido a digestão parcial por uma dada enzima de restrição. Assim. as quais deverão estar presentes no vetor onde o gene será inserido se quisermos que o mesmo seja expresso. o vetor YAC é bifuncional já que pode se replicar e ser selecionado tanto em E. obtidos do genoma completo de um organismo. Os BACs funcionam como um cromossomo bacteriano. considerando o genoma de E. Um destes vetores é o YAC (yeast artificial chromosome) que se duplica em levedura e o outro é o BAC (bacteria artificial chromosome). As bibliotecas genômicas podem ser geradas por uma técnica denominada "shotgun cloning". contendo apenas a região codificadora do gene. YACs: podem receber fragmentos de DNA de até 1Mb. Os YACs contem um sítio de clonagem. N= conjunto de clones. Bibliotecas Genômicas e de cDNA Uma biblioteca genômica refere-se ao conjunto dos fragmentos de DNA. um par de seqüências teloméricas.000 a 300. Resumidamente. de sorte que o conjunto de fragmentos gerados contenha representantes intactos de cada um dos genes do genoma. o centrômero de leveduras. Os fragmentos com tamanho adequado serão inseridos no vetor escolhido. coli e marcas genéticas para seleção tanto em levedura como em E.f)N Onde P= probabilidade. qual o número de clones necessários para representar todos os genes do genoma.P) / log (1 . No sequenciamento do genoma humano. longos fragmentos do DNA cromossômico humano foram clonados em BACs para serem posteriormente sequenciados.coli.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS como descrito acima. Um outro tipo de vetor é aquele que mimetiza um cromossomo e. clonados no vetor escolhido. É necessário salientar que esta molécula. Portanto. Bonato . portanto possuem origem de replicação. origens de replicação de levedura e de E.000 pb que serão herdados mais estavelmente que nos YACs. na célula bacteriana. Se o gene clonado for de origem eucariótica uma série de providências devem ser tomadas: Cristina M. Na membrana as células são lisadas e o DNA desnaturado e fixado in loco. Após isolar a população de mRNAs de uma célula. Hibridização in situ. menor o número de clones necessários para representar o genoma. ela será exposta à transcriptase reversa que irá sintetizar DNA dupla fita a partir do molde de RNA. A síntese da proteína codificada por tais genes. As células expressam diferentes mRNAs durante o desenvolvimento do organismo e quando expostas a diferentes condições. dependerá de sinais contidos no mRNA e que serão reconhecidos pelo aparato tradutor da bactéria. Este DNA complementar (cDNA) ao RNA será então clonado no vetor escolhido. Estas placas constituem as placas mestres. ou seja. A secagem da membrana fixa o DNA in loco. aqueles que nos interessam. a exposição ao filme de raio X revela a colônia que continha o fragmento de DNA com quem a sonda se hibridizou. A membrana é então mergulhada numa solução contendo a sonda radioativa para o gene de interesse sob condições ideais para anelamento. Estes fragmentos contem basicamente a seqüência codificadora do gene. o que permite sua ligação a membrana. Após hibridização da membrana com a sonda radioaativa. o qual contem seqüências controle de transcrição e tradução apropriadamente localizadas. em grande escala. já que o mRNA não contem introns nem as seqüências controladoras de transcrição. volta-se à placa mestre e recupera-se o clone de interesse. Como a posição da colônia está fixada durante todo o processo. Colônias que cresceram no meio seletivo contem o DNA recombinante. Uma biblioteca de cDNA refere-se a clonagem de fragmentos de DNA obtidos a partir de uma população de mRNAs. Bonato 139 . Uma vez clonados os fragmentos é necessário que encontremos entre os milhares clonados. As colônias que cresceram em meio seletivo são transferidas via replica plating para uma membrana de nitocelulose.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Assim. a população de mRNAS de uma célula num dado momento não representa o genoma.12). Por esta razão são utilizados vetores BAC ou YAC quando se pretende clonar genomas muito maiores que os de Bacteria ou Archaea. Figura 11. A partir delas é feita a réplica para a membrana de nitrocelulose. Portanto. quanto maior o inserto clonado. Um plasmídio de controle relaxado da replicação e um promotor eficiente permitirão a síntese de um grande número de cópias do gene de interesse. Tratamento da membrana com NaOH lisa as células e desnatura o DNA. proteínas raras ou totalmente novas. é preciso passar pela peneira (screen). Autorradiografia da membrana permite identificar as colônias que carregam o fragmento de interesse (Figura 11. Proteínas Recombinantes O domínio da tecnologia do DNA recombinante permite que se produza. Para isto é necessário que o gene recombinante seja clonado num vetor de expressão. 12. Isto pode ser feito por hibridização "in situ". contendo o gene que sintetizará a proteína recombinante carregando a modificação desejada (Figura 11. complementar à região de interesse. vacinas (como a da hepatite B. Bonato . Caso sítios de restrição não estejam disponíveis próximos ao local que se deseja alterar. 3. Os escritórios de patente da Europa e dos USA já emitiram milhares de patentes para uso clínico de produtos de genes humanos geneticamente engenheirados. O plasmídio dupla fita transformará bactérias onde irá se duplicar gerando plasmídios com genes alterados e plasmídios com genes não-alterados. Duas abordagens têm sido utilizadas para alterar o gene e consequentemente. o qual será substituído pelo segmento sintético equivalente (oligonucleotídio). Isto é possível via mutagênese sítio-dirigida. onde proteína derivada da capa viral é tão eficiente em desencadear uma resposta imunológica quanto o próprio vírus morto. visto que existe uma alteração de bases (mismatch). cancer. fator VIII de coagulação do sangue (para hemofílicos). Algumas vezes há interesse em clonar um gene com alguma alteração que modifique uma dada proteína de forma específica para servir a um determinado propósito. interleucinas (ativam diferentes classes de leucócitos e poderiam ser utilizadas na cicatrização de feridas. Os elementos de controle para síntese de RNA e proteínas dos eucariotos devem ser substituídos pelos de procariotos. engenheirar a proteína: 1. Todavia. Para as modificações pós-tradução que ocorrem nos eucariotos não existe uma estratégia universalmente aplicável. caso contrário não seriam reconhecidos. Mutagênese Sítio-Dirigida Na mutagênese sítio-dirigida.13). clonado num vetor específico. O oligonucleotídio funcionará como um primer para sintetizar a fita complementar do plasmídio. o desenvolvimento de vetores que se propagam em eucariotos eliminou muitos destes problemas. principalmente. Se o gene possui introns deve-se clonar o cDNA do mRNA correspondente. contendo a alteração desejada. porém mais segura). alterado em um único par de bases. num "site" de busca mundial. por exemplo. porém. interferons (interfere na reprodução viral e também é usado no tratamento de alguns canceres). fatores estimuladores de colônia (estimula a produção de leucócitos. altera-se a seqüência de bases (1 ou 2 pb) do DNA do gene de interesse. Em meio seletivo serão isolados os plasmídios alterados. fator de crescimento humano (tratamento de nanismo). sintetiza-se um pequeno segmento de DNA (oligonucleotídio). 140 Cristina M. Algumas proteínas recombinantes já são rotineiramente utilizadas na clínica médica. infecção por HIV. comercializando os produtos. Um pequeno segmento do gene que se deseja alterar é removido pela ação de uma enzima de restrição que possua sítios próximos. uma vez que as bactérias não tem a maquinaria para retirada dos introns e união dos exons (splicing). ladeando o segmento. eritropoietina (fator de crescimento secretado pelo rim que estimula a produção de eritrócitos). imuno deficiências). etc. 2. Se. utilizado nos casos de imunodeficiência). O plasmídio contendo o gene é desnaturado e a fita simples do plasmídio anela-se a fita simples do oligonucleotídio síntético. 2.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS 1. Este anelamento não é perfeito. tais como: insulina humana (tratamento de diabetes). você colocar a palavra chave "Recombinant Protein" aparecerão dezenas de "sites" tratando do assunto. As plantas de algumas espécies podem se desenvolver a partir de uma única célula. O salmão da espécie coho é um peixe pequeno (~10cm) do oceano Pacífico e foi engenheirado com o hormônio de crescimento sob controle da região regulatória do gene da metalotioneína. alta temperatura ou seca.. plasmídios com gene A selvagem e sensibilidade à ampicilina (ampS). ambos provenientes de uma espécie maior de salmão (sockeye). em média. Vejamos alguns exemplos de transgênicos: Salmão gigante engenheirado com hormônio de crescimento . O gene que codifica a proteína metalotioneína contem elementos reguladores altamente eficientes podendo induzir um alto nível de expressão da proteína na presença dos estimuladores adequados. 1994). As bactérias contendo o gene A mutado serão selecionadas em meio contendo tetraciclina e ampicilina. vírus. ele será transmitido a todas as células do indivíduo adulto e às gerações futuras. Plantas transgênicas: A introdução de DNA recombinante em plantas poderia propiciar a produção de alimentos mais nutritivos e assegurar uma alta produção de grãos. Cristina M. sendo gerados. de outro. geralmente. Quando esta região regulatória é associada ao gene do hormônio de crescimento do salmão. plasmidios com gene A alterado e resistência à ampicilina (ampR) e. Após a síntese da fita complementar o plasmídio híbrido dupla fita transforma células bacterianas e se duplica. Organismos Transgênicos O termo transgênico refere-se a animais ou plantas nos quais um novo segmento de DNA tenha sido incorporado na célula germinativa. Bonato 141 . carrega uma alteração e apesar do emparelhamento defeituoso funciona como um primer.Sabemos que a expressão de um gene depende dos elementos reguladores encontrados. resistindo a estresses ambientais tais como o ataque de insetos. Também funciona como primer o oligonucleotídio complementar ao gene amp que corrige a mutação existente no plasmídio. Os salmões coho transgênicos mediam. 13. Um oligonucleotídio complementar a uma porção do gene A do plasmídio.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 11. aos quais se ligam proteínas reguladoras (fatores de transcrição) que podem ativar ou inibir a transcrição. vai induzir uma alta expressão deste gene. 42 cm e eram 11 vezes mais pesados que os originais (Devlin et al. à montante da região codificadora. de um lado. de sorte que se introduzirmos um gene modificado nesta célula. nematóides. O DNA T codifica proteínas que estimulam a divisão celular da célula infectada (tumor) e enzimas que convertem o aminoácido arginina em nopaline ou octopina. denominado DNA T (23kb). thuringiensis). Este segmento mimetiza o T DNA. O segmento T. Este é um exemplo natural de engenharia genética. que invade plantas sensíveis. induz a formação de um tumor na planta (crown gall tumor). O fenótipo de resistência à kanamicina permite selecionar as plantas recombinantes. O vetor que tem sido utilizado é o plasmídio Ti (Tumor-inducing). depois de integrado. uma vez que está flanqueado pelas repetições de 25pb mas. Figura 11. contem um gene de Bacillus thuringiensis que codifica uma toxina e outro gene codificando resistência à kanamicina. transforma as células da planta integrando-se em qualquer sítio dos cromossomos vegetais. flanqueado por repetições diretas de 25pb. A bactéria Bacillus thurigiensis produz uma proteína que é tóxica para a larva de certas espécies de mariposa que atacam o tomateiro. Um segmento do plasmídio. O processo de transferência do DNA T depende de seis genes presentes na região vir do plasmídio. Estratégia de dois plasmídios para criar uma planta recombinante de tomate. quando transferido para a planta torna-a resistente ao ataque da larva (Figura 11. Esta toxina. Este plasmídio está presente na bactéria de solo Agrobacterium tumefaciens. Utilizando tal sistema. Bonato . Plantas resistentes ao herbicida glyphosate: a primeira planta recombinante de valor comercial foi desenvolvida em 1985.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS A introdução na planta do gene modificado depende de um vetor. A. 14.14 B). coli e reclonada no DNA T de Agrobacterium. num local onde exista um ferimento. O gene que codifica esta toxina. foi possivel criar plantas de tomate resistentes ao ataque da larva de mariposa. de ~ 200kb.14 A). todavia. Um mutante de Salmonella typhimurium resistente ao glyphosato permitiu que a forma resistente do gene fosse isolada. Um dos plasmídios está envolvido no processo de transferência (genes vir) e o outro contem o segmento que será transferido (toxina de B. necessários ao crescimento da própria bactéria e metabolizados apenas por ela. A produção agrícola tem dependido de herbicidas utilizados contra as hervas daninhas da cultura. B. não é tóxica aos seres humanos. O problema é na sua aplicação. Tomateiros expostos a larva da mariposa: à direita está a planta transgênica que resistiu ao ataque. clonada em E. A expressão dos genes vir é induzida por um composto fenólico (acetilsiringona) que é produzido e excretado pelas células da planta na região do ferimento. Um dos herbicidas mais comercializados no mundo é o Roundup cujo ingrediente ativo é o glyphosate que ataca plantas e microrganismos. 142 Cristina M. porque só pode atingir as ervas daninhas uma vez que também é tóxico para a colheita. ao invés dos genes indutores de tumor. com transferência de informação de um procarioto para um eucarioto (Figura 11. localizada ¾ adiante do terminal 5'do mRNA (linha 4) · Deleção de um nucleotídio do códon de parada de tradução.5kb. resistentes ao herbicida. Submeteu a proteína à eletroforese em gel de acrilamida. foi clivado com as duas enzimas ao mesmo tempo.5 kb. isolada de uma linhagem selvagem de E.0 kb e 2. Paralelamente. tendo surgido uma banda que representa um fragmento de 1. O peso molecular da proteína W é 40kDa. Marque o sítio de clivagem de EcoRI no mapa de restrição. na linha 1: Que resultados você esperaria obter se ocorressem as seguintes mutações: · Inativação do promotor do gene W (linha 2) · Mutação nonsense no gene W. Foram obtidos os seguintes fragmentos: tubo 1 (HindII): 2.0 kb e 5. Guia de Estudo Porque as enzimas de restrição produzidas por uma dada bactéria não degradam seu próprio DNA? Quais as características de uma biblioteca genômica e de uma biblioteca de cDNA? O que as técnicas de Southern. respectivamente? Um fragmento linear de DNA foi clivado individualmente com as enzimas HindII e SmaI. localizada ¾ adiante do terminal 5'do mRNA (linha 3) · Mutação missense. Você isolou a proteína W e produziu o anticorpo anti-W. a) desenhe o mapa de restrição b) os fragmentos do tubo 3 foram submetidos à clivagem com a enzima EcoRI. O anticorpo anti-W liga-se à proteína alvo (W). coli. Num gel de agarose colorido com brometo de etídio.0 kb. tabaco e outras. a banda original de 3kb desapareceu.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Plantas transformadas com o gene de resistência ao glyphosato produziram variedades de milho. Qual a metodologia utilizada por Sanger para seqüenciar o DNA? A proteína W. algodão.0 kb tubo 2 (SmaI): 2. permitindo que a tradução continue ainda por mais 90 nucleotídios ao longo do mRNA (linha 5) Cristina M.5 kb tubo 3 (HindII e SmaI): 2. 3. pode ser detectada pelo anticorpo anti-W. Northern e Western Blot permitem visualizar. O resultado é mostrado abaixo. Bonato 143 .5kb e 5. Transferiu para nitrocelulose. Expôs a nitrocelulose ao anticorpo marcado anti-W. utiliza-se um antibiótico para seleção. (A) Eco RI e canamicina. (C) Sal I e ampicilina. A enzima e o antibiótico apropriados são. O que é o DNA T? Como funciona? O que é mutagênese sítio-dirigida? O que é um vetor de expressão? O que são cosmídios? O que são YACs e BACs? O que são RFLPs? O que é o sistema de modificação-restrição? Capítulo 12 – Regulação da Expressão Gênica em Bactéria Visão Geral 144 Cristina M.: O peso médio de um aminoácido é 110 daltons. (D) Sal I e canamicina. Bonato . respectivamente. Para obter clones positivos. (E) Hind III e ampicilina. em seguida. (B) Eco RI e ampicilina. Os mapas de restrição são dados abaixo. como marca de seleção. Deseja-se clonar um gene que confere resistência à ampicilina (ampr ) em um plasmídeo que possui o gene de resistência a canamicina (canr ).MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Obs. Desenhe as bandas nas linhas correspondentes a cada tipo de mutação. digere-se o DNA genômico e de plasmídeo com certa enzima e. na posição relativa a seu peso molecular. Por exemplo. um dissacarídio encontrado no leite. As modificações podem implicar em proteólise parcial. portanto. Neste capítulo iniciaremos o estudo dos mecanismos que regulam a expressão gênica e usaremos como modelo. dimerização.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Nem todos os genes são continuamente expressos numa célula. o número de cópias de mRNA existentes em nível basal. A expressão destes genes. como citado anteriormente. numa dada situação. se uma determinada atividade precisar ser "desligada". Pós-tradução: o peptídeo resultante poderá ser modificado para exercer sua função. Uma célula de bactéria. é codificada pelo gene lacZ. sob condições de estresse. como E. coli como fonte de carbono e energia. pois nem sempre é sintetizado na forma ativa. só são ligados em circunstâncias muito especiais onde seus produtos são necessários. tais como aumento de temperatura. responsável pela degradação da lactose (via degradativa) e que só é induzido quando lactose é a única fonte de carbono disponível. Também. coli. É o conjunto de proteínas encontrados numa célula. a cada momento. a célula "ligará> certos genes específicos. genes bacterianos que codificam polipeptídios. Genes com expressão constante são denominados genes de expressão constitutiva. Por outro lado. O fenômeno de indução implica em aumentar espetacularmente (1. acetilação. Esta mesma enzima é também capaz de modificar a lactose convertendo-a em alolactose a qual. estão ligados. ou seja. ao nível da transcrição. durante o ciclo celular. é a molécula indutora do operon lac (Figura 12. aumento de concentração salina ou diminuição da quantidade de O2 disponível. Bonato 145 . predominantemente. crescimento e reprodução. metilação. Pode sintetizar qualquer molécula orgânica a partir de íons inorgânicos e glicose. Sistema Lac A lactose. que contem os genes responsáveis pela síntese do triptofano (via biossintética) e que somente será reprimido quando a concentração de triptofano na célula for alta. Outros genes. fosforilação.000-10. Na bactéria E. Muitos de seus genes estão se expressando continuamente. é um b-galactosídio que pode ser utilizado pela bactéria E. que lhe confere seus atributos específicos. A enzima que quebra a lactose é a b-galactosidase (b-gal). então a transcrição do gene correspondente será reprimida por reguladores que bloqueiam a ação da RNA polimerase (Sistema Reprimível). conjuntos apropriados de genes serão acionados. um exemplo de Sistema Induzível é o operon lac. após sua quebra em glicose e galactose. coli contem toda informação genética necessária ao seu metabolismo.000 vezes). capazes de responderem a tais situações adversas e "desligará" outros. A presença ou não de uma atividade protéica num determinado momento pode ser regulada em diferentes níveis: • Transcrição: o gene poderá ou não ser transcrito e isto depende da habilidade da RNA polimerase acionar os promotores desejáveis no momento certo (vide Reconhecimento do promotor) Tradução: o mRNA poderá ou não ser traduzido em determinadas circunstâncias e a eficiência eficiência do processo também poderá ser controlada. Cristina M.1). na verdade. • • Em bactérias a atividade gênica é controlada. expressam-se diferentes conjuntos de genes para executar as tarefas específicas de cada fase do ciclo. Se uma determinada atividade for requerida pela célula a transcrição do gene correspondente será induzida (Sistema induzível). é regulada. Um exemplo de Sistema Reprimível é o operon triptofano. Dependendo da situação em que a célula se encontre. etc. lacY e lacA. sob o controle dos sítios P (promotor) e O (operador)(Figura 12. Bonato . O que é um operon? Um operon é um grupamento de genes adjacentes sob controle do mesmo promotor/operador. Figura 12.6-alolactose. A entrada da lactose na célula depende da ação de uma proteína transportadora transmembrana denominada b-galactosídio permease codificada pelo gene lac Y. 1. Quando um operon é induzido. Numa linhagem selvagem de E. O gene lac A codifica a enzima tiogalactosídeo transacetilase que.3). in vitro. assim que as células são transferidas para um meio contendo lactose como única fonte de carbono. Todavia. Tais grupamentos de genes são comuns em Bacteria e Archaea e ainda podem ser encontrados em alguns eucariotos. a atividade de b-galactosidade aumenta cerca de 1. Degradação e modificação da lactose pela enzima b-galactosidase. cuja transcrição é induzida em presença do indutor 1. a quantidade de b-galactosidase presente em células cultivadas na ausência de lactose é muito baixa (nível basal). coli.2). O operon lac é constituído pelos genes lacZ. Tal molécula é denominada RNA poligênico ou policistrônico. 2. Ao mesmo tempo é 146 Cristina M. tanto modifica como degrada a lactose que entra na célula. como mencionado acima. todos os genes que dele fazem parte são transcritos numa molécula única de mRNA.000 vezes (Figura 12. Operon Lac Qual a função de cada um destes genes? O gene lac Z.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 12. Como a fermentação da lactose ocorre normalmente na ausência desta enzima sua função fisiológica é desconhecida. Em geral os genes de um mesmo operon executam funções relacionadas. transfere grupos acetil da acetil-CoA para o grupo OH do C6 b-galactosídeos. / z+ y Não Lactose fermenta Cristina M. Inicialmente foram isolados mutantes de diversos tipos: • Mutantes com perda de função para os genes lacZ e lacY.enquanto a forma selvagem é designada z+ e y+./ z. para os genes lac Z. lacY e lacA) foram nomeados genes estruturais. F z .Tais observações permitem propor a existência de um controlador. mesmo que o indutor estivesse presente e que mapeavam na mesma posição da mutação i-. foi feita uma análise de diplóides parciais gerados por sexdução. por exemplo. os diplóides parciais (merozigotos) gerados. 1. fermentam a lactose e produzem quantidades normais das enzimas b-galactosidase. Em seguida.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS induzida a síntese de permease e acetilase. Estes mutantes são designados z. lac Y e lac A. Como decifrar este sistema? Mutantes Lac A utilização de mutantes com perda de função. as mutações z b) z+ e y+são dominantes sobre z . • Mutantes constitutivos. incapazes de utilizar lactose (Lac -). Diplóides parciais dos genes estruturais Genótipo Fenótipo Conclusão Complementação total: z e y pertencem a cistrons diferentes Não há complementação: mesmo cistron (y) F z .y+ incorporado ao fator F' é transferido para uma linhagem F .Fermenta lactose F z+ y . o que permitiu entender melhor o sistema. • Mutantes suprimidos. ou seja. Mostra ainda que este controlador. são do tipo selvagem. - e y - pertencem a genes diferentes. Assim. em cuja presença a expressão dos genes do operon é liberada. ou seja. Dois tipos de mutantes constitutivos foram isolados: i. desde que não haja glicose no meio.e oc. permease e acetilase (Tabela 12. Além disto. Experimentos com merozigotos haviam demonstrado que mutações nos genes estruturais afetavam apenas a estrutura da enzima correspondente. não produziriam b-galactosidase ativa. Os genes codificadores das enzimas (lacZ. mutantes que nunca sintetizavam as enzimas.1). mutantes que sintetizavam as enzimas mesmo na ausência do indutor. indicando que: a) houve complementação. Bonato 147 . o operon lac não é induzido enquanto a glicose não se esgotar.y+ / z+ y -. Mutantes estruturais Quando o operon lac z . portanto. de alguma forma detecta a presença de lactose ou do bgalactosídio alolactose.e y -. Tabela 12. ou seja. mutantes z -.y +/ z+ y.z+ y -. e também de mutantes controladores permitiu a elucidação do sistema. mas poderiam produzir permease e acetilase ativas.e y. se glicose e lactose estão presentes no meio.y+ Fermenta Lactose F z+ y. regulando a expressão concomitante destes genes. Assim. ou seja.4). Mutações no gene lac I podem redundar em expressão constitutiva (i -) ou suprimida (iS). a ser utilizado nas análises subsequentes.y+ ou F i+ z+ y .z+ y+/i+ z . se as bactérias crescerem em presença de glicerol como única fonte de carbono. permitiu o estabelecimento de um modelo de regulação do operon lac. O que são indutores gratuitos? São b-galactosídios capazes de induzirem o sistema sem. Mutações em O podem redundar em mutação constitutiva (oC). então. O outro tipo de mutação constitutiva mapeava entre o gene lac I e o lac Z e só tinha efeito sobre a expressão dos genes adjacentes. posicionando-se à montante de lac Z. Foi assim encontrado um sítio de ação em cis./ i . mesmo na ausência de indutor. Tais mutantes foram denominados oC (operator constitutive). Os mutantes i . Tais fatos poderiam significar que o gene lac I codificava um Repressor do sistema. pode-se analisar o efeito do indutor sob a síntese das enzimas independente da metabolização do b-galactosídio. Figura 12. no mesmo cromossomo. O indutor mais eficiente do sistema foi o isopropil tiogalactosídio (IPTG) que passou. controlando negativamente a expressão dos três genes (Figura 12.produzem as mesmas quantidades de enzimas (Z. verificou-se que a produção das enzimas só ocorria na presença de IPTG (Tabela 12. oC e iS Nos mutantes constitutivos a transcrição do operon lac nunca está "desligada".MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Mutantes i -. Y e A) que o selvagem induzido. O lócus foi nomeado lac I e a mutação i -. 4. Experimentos de conjugação entre linhagens Hfr e F -. Quando os merozigotos com duplas mutações (F i .z+ y+) foram analisados. permitiriam mapear esta nova mutação. uma região de controle que só é ativa na mesma molécula. portanto. serem substrato para a enzima b-galactosidase. regulando genes adjacentes.2). assim como a utilização de indutores gratuitos. que se mostrou independente do operon lac. Bonato . Como se testou a possibilidade de haver um repressor do sistema? Como foi possível distinguir entre os dois tipos de mutantes constitutivos? Elucidando o Sistema: Diplóides Parciais e Indutores Gratuitos A análise dos diplóides parciais envolvendo os genes estruturais e o regulador. Portanto: 148 Cristina M. todavia. Ação em trans Repressor funcional agindo no DNA plasmidial. Ação em cis. só ocorrerá expressão de b-gal quando houver indutor no meio. Tabela 12. A permease.y+ F i . Uma vez que no cromossomo o Operador não está mutado. O isolamento dos mutantes oC (Figura 12. Em mutantes iS o operon lac está sempre reprimido. b) a função repressora do produto de lac I era antagonizada pelo indutor IPTG. Não reconhece o Operador Repressor funcional e operador constitutivo no plasmídio. com ação em trans (atuava tanto no plasmídio como no cromossomo bacteriano).2. Tal comportamento sugeria que o repressor tinha perdido a capacidade de se ligar ao indutor mantendo.5.o+ z+ y+ / i + o+ z .MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS a) o alelo induzível i+ era dominante sobre o alelo constitutivo i -. em relação aos genes lac Z e lac Y. Dos resultados obtidos podia-se inferir que: a) lac I era um gene independente cujo produto. Repressor funcional e operador constitutivo funcional. b) o alelo induzível i+ tinha ação em trans. Ação em trans. a expressão de b-gal no diplóide parcial não é constitutiva mas.IPTG +IPTG i+ o+ z+ y+ i . No merozigoto iS/i+ a transcrição do operon lac encontra-se travada.IPTG + IPTG + + + + + + + + + + + + Repressor funcional Repressor não Não reconhece o Operador Repressor funcional e Operador constitutivo Super Repressor: não se liga ao indutor. a da permease é constitutiva. Repressor não-funcional. numa época em que ainda não se seqüênciava o DNA nem estava desenvolvida a técnica de footprinting que permitiu estabelecer exatamente qual era o fragmento do DNA ao qual se ligava o repressor.o+ z+ y+ i + oC z+ y+ i S o+ z+ y+ F i . Observações Cristina M. o mutante iS.y+ / i + o+ z+ y+ foi testado. todavia. Bonato 149 . apesar da mutação constituiva oC em F. Isto demonstrava que o Operador só agia em cis. valendo-lhes o Prêmio Nobel em 1965. terá expressão constitutiva porque está sob ação de oC. ou seja.y+ / i .y+ / i + o+ z+ y+ F i + oC z+ y+ / i + o+ z+ y+ + + + + + + + + + + + Permease . o operon lac desligado. o oC plasmidial não tem qualquer efeito sobre a expressão do gene z+ presente no cromossomo.) permitiu definir claramente a existência do operador com ação em cis. Aliás. mesmo em presença do indutor. Expressão do operon lac em haplóides e diplóides parciais na presença e ausência do indutor (IPTG) Genótipo B-gal . Quando o merozigoto F i + oC z. regulava negativamente a expressão de lac Z e lac Y.o+ z+ yF i + oC z. A descoberta deste sistema de regulação da expressão gênica foi feita por Jacob & Monod. Tal idéia foi confirmada quando se isolou um outro tipo de mutante. nem o próprio repressor havia sido isolado (Isolando o Repressor). indicando que iS é dominante sobre i+.o+ z. portanto. Ação em trans Figura 12. F i + o+ z+ y+ / iS o+z+ y+ F i . O repressor lac é uma proteína tetramérica. a qual é reconhecida pelo Repressor. Ação em trans Super Repressor: não se liga ao indutor. liga-se a ele. liga-se ao DNA. alolactose).MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS no plasmídio. Estão indicadas mutações identificadas neste sítio e que tornam o operador constitutivo. onde se liga a RNA polimerase. A ação do repressor é antagonizada pelo indutor (IPTG. Na ausência do indutor. Controle Negativo: O Repressor em Ação O gene regulador lac I codifica uma proteína repressora que impede a transcrição do operon lac ao nível do DNA. Os genes do operon lac só serão liberados para transcrição quando o indutor ligar-se ao repressor . de sorte que cada vez que se liga a uma das moléculas.operon ligado (Figura 12. Seqüência de DNA do Operador. Enquanto proteína alostérica. alostérica. 5. o que diminui significativamente sua afinidade pelo sítio operador no DNA Alguns nucleotídeos do operador sobrepõem-se aos do promotor. "desligando" o operon 150 Cristina M. a RNA polimerase não pode atuar .operon desligado (Figura 12. Assim. o repressor volta a conformação anterior e liga-se ao DNA. sua conformação é alterada e sua habilidade de reagir com a outra molécula é afetada.o+ z+ y+ / iS o+ z+ y+ Super Repressor: não se liga ao indutor. Bonato . 7). quando o repressor está ocupando sua posição no operador. 6). Quando a concentração do indutor diminui dentro da célula. que reconhece uma seqüência específica do DNA denominada operador. Na presença de indutor. Ação em cis. possui sítios para ligação tanto com o DNA como com o indutor. impossibilita a ação da RNA polimerase. 7. A ligação do complexo facilita a ligação da RNA polimerase. Bonato 151 . Operon Lac Ligado. gerando as enzimas bgalactosidase.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 12. Cristina M. Na presença do Indutor. o promotor é liberado para ligação da RNA polimerase. 8). Quando o tetrâmero repressor liga-se ao sítio Operador. Controle Positivo: CAP-cAMP em Ação Quando a bactéria E. Figura 12. coli é cultivada em presença de glicose + lactose. também denominada CAP (catabolite activator proteina). permease e acetilase. característico de células crescendo com suprimento adequado de glicose. simultaneamente os galactosídios induzem o sistema ligando-se ao repressor. A repressão do operon lac pela glicose é denominada repressão pelo catabólito e é o resultado dos baixos níveis de cAMP intracelular. Em conseqüência. O complexo cAMP/CAP. 6. na forma de um dímero tem afinidade por uma região do promotor. o tetrâmero repressor é inativado. Operon Lac Desligado. Como agem as moléculas de cAMP? cAMP interage com a proteína CRP (cAMP receptor protein). a expressão do operon lac permanece inibida até que a lactose seja exaurida. à montante da região onde a RNA polimerase se liga. os níveis de cAMP aumentam e. O sítio operador livre não bloqueia mais a ação da RNA polimerase. Quando o nível de glicose cai.O operon lac é transcrito e o mRNA poligênico traduzido. aumentando em 50 vezes sua atividade (Figura 12. parasitas celulares. simplesmente. O Fago Lambda: Lise ou Lisogenia? Os vírus são estruturas muito especiais e simples constituídas. podem ser encontrados vírus de DNA fita simples e vírus de RNA fita dupla. Sem ele a transcrição é bastante ineficiente porque o promotor Lac é um promotor fraco. a qual será transmitida às novas gerações de partículas virais. O Operon Lac é um modelo tanto de controle positivo como negativo. Já o complexo cAMP/CAP é imprescindível para a ocorrência da transcrição. basicamente. Mesmo em presença do indutor. a concentração de cAMP diminui dentro da célula. Em alguns vírus a quantidade de informação disponível é suficiente para codificar de 3 a 10 tipos de proteínas enquanto em outros são codificadas de 100 a 200 tipos. portanto. Vírus que infectam bactérias são denominados bacteriófagos ou. Em geral as células apresentam sítios receptores específicos para determinados vírus de sorte que a interação célula-vírus é específica. Isto porque a seqüência do promotor difere um pouco do consenso. Em conseqüência. de uma molécula de ácido nucléico envolvida por uma capa protetora. dificultanto o reconhecimento pelo fator sigma 70 (s70). A informação genética dos vírus pode estar contida em moléculas de DNA ou de RNA Nunca DNA e RNA coexistem em uma mesma partícula viral. ou seja. A glicose inibe a atividade da Adenilato Ciclase. até que a concentração de glicose decaia. Aos vírus que infectam as células vegetais ou animais referimo-nos. Uma célula que permite infeção por um determinado vírus é denominada célula hospedeira. 8. O complexo CAPcAMP é um ativador do Operon Lac. Todavia. de um modo geral.Logo. O repressor codificado pelo gene lac I mantem o sistema trancado (controle negativo). um promotor pelo qual a RNA polimerase tem baixa afinidade. Tanto células de eucariotos como de procariotos podem ser infectadas por vírus. até que ele seja induzido por um bgalactosídio. 152 Cristina M. não ativando eficientemente o fator de transcrição CAP. A molécula de ácido nucléico contem a informação genética do vírus. Na maioria das vezes o DNA é fita dupla e o RNA é fita simples. pois propicia a ligação da RNA polimerase (controle positivo). Daí a necessidade de ajuda. fagos. a qual sintetiza cAMP a partir de ATP. Sempre que glicose e lactose estiverem presentes no meio o operon lac não será induzido. se o sítio de ligação do complexo cAMP/CAP estiver alterado. A partícula viral infecciosa é denominada vírion e consiste de ácido nucléico protegido por uma capa protéica. como vírus vegetais e vírus animais. a lactose só age como indutor na ausência de glicose. Bonato . São. Para se reproduzirem precisam infectar uma célula.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 12. a transcrição ocorrerá em níveis baixíssimos. ~6000 nucleotídeos (2nm). O envelope é constituído da bicamada lipídica e proteínas específicas da membrana plasmática da célula infectada. originando a partícula madura. 9). denominada capsídeo. que contem. Bonato 153 . como no do HIV. que infecta E.000 moléculas idênticas de proteínas arranjadas helicoidalmente em torno da molécula central de RNA fita simples. Figura 12. via interações RNA-proteína (Figura 12.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS A capa protetora viral é constituída principalmente de proteínas A capa protetora. em torno do ácido nucléico. Em alguns casos. Figura 12. é apenas levemente superior ao volume ocupado pelo próprio ácido nucléico. Em alguns exemplos conhecidos. coli. No TMV. A estrutura é estabilizada pela adição da cauda e fibras. O capsídeo é construído como uma concha vazia e só então o ácido nucléico (DNA dupla fita) é inserido. moléculas de carboidratos e lipídeos também fazem parte do capsídeo. Figura 12. constituída de uma pequena variedade de proteínas.10). vírus do mosaico de tabaco. as proteínas são arranjadas em volta do RNA. 11. Este é o caso do vírus vegetal TMV. No capsídeo do bacteriófago l está empacotada uma molécula de DNA dupla fita de ~ 50Kb codificando cerca de 50 proteínas. Durante a montagem do capsídeo. O DNA é inserido na cabeça vazia. o empacotamento é posterior à construção do capsídeo ao qual se conecta uma cauda com fibras terminais que são utilizadas no processo de reconhecimento e infeção do hospedeiro (Figura 12. que se expande durante o processo. Assim. com centenas de cópias idênticas arranjadas em estrutura regular. Na maioria das vezes. o capsídeo é envolvido por uma membrana (vírus de envelope). o volume interno do capsídeo. o capsídeo tem um único tipo de proteína. Vírus animal com envelope. Em alguns vírus muito simples. condensando-se conforme vai entrando. 11). condensando-o. contem mais de um tipo de cadeia polipeptídica e apresentam um capsídeo com simetria icosaédrica (poliedro de 20 faces). que é um vírus de RNA. 9. Cristina M. um vírus animal de RNA. O bacteriófago Lambda (l). 10. helicoidal. é específica para cada tipo de partícula viral. o capsídeo é um filamento de ~2. A aquisição do envelope ocorre via um processo de brotamento ao nível da membrana plasmática (Figura 12. responsável pelo transporte de maltose. Ao infectar a bactéria E. sem lisar a célula (via lisogênica). à esquerda. Os genes que codificam proteínas com funções relacionadas estão todos agrupados permitindo que sejam controlados por um número reduzido de promotores e proteínas reguladoras. as fibras terminais da cauda interagem com uma proteína de membrana da E. tornando-se linear. Antes de ser empacotado dentro do capsídeo o DNA do fago é cortado no sítio cos. O bacteriófago l é um exemplo marcante desta correlação (Figura 12. respectivamente. codificada pelo gene lamB. criando-se uma cascata na qual grupos de genes são ligados ou desligados no momento exato. Esta interação inicia um processo pouco compreendido. Mapa genético do fago l na forma circular intracelular.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Controle Temporal na Expressão dos Genes Virais Ao infectar a célula hospedeira o vírus injeta uma molécula de ácido nucléico dentro da célula livrando-se da capa protetora. 12). uma vez que apresenta terminais 3' e 5' complementares (terminais coesivos) que são covalentemente ligados pela ligase do hospedeiro. de genes emvolvidos na integração do genoma do vírus ao genoma do hospedeiro (lisogenia) ou a transcrição. Todavia. 154 Cristina M. O genoma do l possui cerca de 50. coli. Bonato . de genes envolvidos na montagem de partículas virais (lise). Dependendo do equilíbrio momentâneo entre as proteínas reguladoras. codificam proteínas reguladoras que controlam a expressão posterior de outros genes. produzidas imediatamente após a infecção. • Figura 12. A tradução dos mRNAs virais leva à produção de enzimas e proteínas estruturais envolvidas no ciclo de desenvolvimento do fago. à direita. Assim que penetra no hospedeiro. Os promotores/operadores PLOL e PROR controlam a transcrição à esquerda e à direita. duplicando-se juntamente com o cromossomo do hospedeiro. No caso do bacteriófago l. o fago l pode seguir dois caminhos: Seu genoma replica-se vegetativamente originado novas partículas fágicas e lisando a célula hospedeira (via lítica). a expressão dos genes virais é rigidamente controlada ao nível de transcrição. o DNA do l se circulariza. 12. A molécula invasora será utilizada como molde para a síntese de mRNAs virais e também para a síntese de novos genomas virais. desencadeia-se a transcrição. Algumas moléculas de mRNAs virais. Inicialmente são transcritos os genes reguladores. Seu genoma integra-se ao genoma do hospedeiro e aí permanece silencioso por longo tempo. no qual o DNA linear do fago é injetado na célula hospedeira.000 pb. coli. Freqüentemente observa-se uma correlação entre a ordem temporal de expressão dos genes e a ordem espacial de organização dos genes nos cromossomos. O DNA é injetado na célula. Bonato 155 . O ácido nucléico do fago replica e recombina. Este tipo de interação fagohospedeiro é denominada lisogenia e as células hospedeiras são denominadas lisogênicas. Esta forma de perpetuação do genoma do fago não implica nem na morte da célula nem na liberação de partículas virais. A célula hospedeira é lisada. levando a uma produção massiva do genoma do fago. Via Lisogênica de Desenvolvimento Na via lisogênica de desenvolvimento o fago integra-se ao cromossomo da célula hospedeira. Inicia-se a transcrição dos genes virais. Cristina M. A seguir são transcritos os genes que codificam enzimas envolvidas na síntese. 13 Infecção fágica da bactéria E. 13). Dezenas de partículas virais são liberadas (Figura 12. Fagos capazes de estabelecerem este tipo de interação com a célula hospedeira são denominados fagos temperados (Figura 12. Posteriormente são ativados genes que codificam os componentes protéicos que participam da estrutura e montagem da partícula viral. Figura 12. sem lise celular. A seqüência de eventos no ciclo lítico pode ser resumida em: • • • • • • • • • O fago é adsorvido ao receptor presente na superfície da bactéria. O genoma viral integrado e inativo é denominado profago. uma vez que a maioria dos genes virais estarão reprimidos. Os mRNAs são traduzidos pela maquinaria do hospedeiro.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Via Lítica de Desenvolvimento Na via lítica de desenvolvimento há multiplicação das partículas virais com morte da célula hospedeira. recombinação e modificação do DNA. O bacteriófago l é um exemplo de fago que apresenta tanto a via lítica como a lisogênica. como parte integrante do cromossomo hospedeiro. Quando o DNA do l está integrado ao cromossomo bacteriano a replicação autônoma do cromossomo do fago fica reprimida e o fago só se duplica a cada divisão celular da bactéria. coli. Os capsídeos são montados e o DNA é empacotado com posterior adesão da haste e fibras. O cromossomo bacteriano é degradado. Os primeiros genes a serem transcritos são os genes reguladores. 14). Após integração. Na fase precoce imediata de transcrição os promotores PL e PR controlam. a expressão de genes N (à esquerda) e cro (à direita). ou seja. Isto implica que fitas complementares são utilizadas como molde pela RNA polimerase. A opção entre as vias lítica e lisogênica de desenvolvimento é governada por proteínas codificadas tanto pelo genoma do fago como da bactéria e. a partir dos promotores PL (Left. diferentes conjuntos de genes serão transcritos a partir do genoma viral. também. Os primeiros genes transcritos codificam proteínas reguladoras que controlarão os passos posteriores de desenvolvimento. Na condição de profago não provocará qualquer dano à célula hospedeira. 14. Fagos temperados como o bacteriófago l podem optar pelo ciclo lítico ou lisogênico. a expressão gênica do fago ficará quase que completamente reprimida. podemos distinguir três grupos de genes no fago l: precoce imediato. PR e PRM. 156 Cristina M. direita). Uma vez que um ou outro padrão de transcrição tenha se estabelecido. Dependendo do estado escolhido. Bonato . lítico ou lisogênico. precoce posterior e tardio. pelas condições de infecção. Ciclo lisogênico. transcritos em sentidos opostos. se uma bactéria lisogênica for infectada por um fago de mesmo tipo ele não poderá se multiplicar. Bactérias lisogênicas são imunes à infecção por outras partículas virais do mesmo tipo. Entre os dois promotores encontra-se o gene cl e seu promotor PRM (Figura 12. ele é mantido estavelmente. respectivamente. 15). esquerda) e PR ( Right. Transcrição Precoce De acordo com sua ordem de expressão.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 12. Os genes reguladores estão todos agrupados numa região específica do cromossomo sob o comando dos promotores PL. As recombinases codificadas pelo fago são responsáveis pela integração do genoma do fago ao cromossomo bacteriano. coli por milhares de gerações celulares. O fago lintegrado poderá permanecer latente no genoma hospedeiro de E. seu DNA se circulariza e começa a ser transcrito via RNA polimerase do hospedeiro. Quando o fago l infecta a célula bacteriana. assim como os sítios nut. xis. Também nesta fase são transcritos genes necessários à replicação do fago (O e P) e à integração do fago no cromossomo hospedeiro (att. enquanto o antiterminador N permite que se avance para a fase precoce posterior de transcrição. ligado aos sítios nut. os quais controlam a expressão do gene cl. 16. Inicia-se. a partir dos promotores P L e PR. tL1 e tR1 estão indicados. Os sinais de terminação da transcrição. com a transcrição dos genes reguladores cll e clll. 15. propiciando a lisogenia. Os sítios terminadores tL1 e tR1 são ignorados pela RNA polimerase quando a enzima interage com o antiterminador N. b e g) assim como de outro antiterminador codificando a proteína Q (Figura 12. PL e PR. Bonato 157 . capazes de ativar a transcrição do gene cl. Transcrição dos genes reguladores cll e clll na fase precoce posterior assim como do antitermindor Q. A proteína Q também é um regulador positivo que age como um antiterminador dos genes de transcrição tardios envolvidos na síntese de proteínas da cabeça. A fita “superior” é transcrita para a esquerda e a “inferior” para a direita. Figura 12. N utilization) e interage com a RNA polimerase impedindo que ela reconheça os sítios usuais de terminação. O gene N. Quando ligada. capaz de ligar-se às regiões P R/OR e PL/OL. cauda e lise. regulado pelo promotor PL. O fato do fago l utilizar antiterminadores para assegurar a transcrição em estágios subsequentes permite que os mesmos promotores iniciais. a. locais de reconhecimento da proteína antiterminadora N. Como é tomada a decisão? Competição Cro X Cl No bacteriófago l os reguladores Cro e Cl e a enzima RNA polimerase competem pela mesma região do DNA. O fago l apresenta duas unidades de transcrição precoce imediatas. sejam utilizados para transcrever quer os genes da via lítica quer os genes da via lisogênica. O fato da RNA polimerase ignorar os sítios de terminação permite que a transcrição avance. Nesta fase inicial o gene cl não é transcrito. assim. Por esta razão Cl é denominado repressor do l e é responsável pela manutenção do estado lisogênico. int. O gene cl. o antiterminador Q permite que se avance para fase tardia da cascata lítica desde que as condições sejam propícias. Os genes N e cro codificam funções precoces imediatas e estão separados dos genes precoces posteriores por seus terminadores. Assim. As proteínas Cll e a Clll são reguladores positivos. tL1 e tR1. codifica a proteína reguladora Cl. 16).MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 12. codifica uma proteína antiterminadora que se liga às seqüências nut (do inglês. Cristina M. bloqueia a transcrição de todos os genes do fago ao mesmo tempo que ativa a transcrição de seu próprio gene à partir do promotor P RM. a fase precoce posterior. tanto à direita como à esquerda. possui maior afinidade por OR1 enquanto Cro possui maior afinidade por OR3. aparentemente. ex. Estes sítios são semelhantes. A proteína Cro também se liga às mesmas regiões PR/OR e PL/OL. competindo com Cl. OR2 e OR3. codifica a proteína reguladora Cro. Por esta razão a proteína Cro é considerada um anti-repressor de l. Estabelecimento do ciclo lítico. Quando Cro se instala na região reguladora a transcrição do gene cl fica reprimida. O arranjo espacial de operadores e promotores que se sobrepõem. Os sinais transduzidos pela bactéria modularão a atividade do regulador positivo de transcrição. é crucial na opção lise/lisogenia (figuras 12. respectivamente. Cl. respectivamente e facilitanto a do gene cl a partir de PRM (do inglês. Bonato . regulando a expressão de operons à esquerda e à direita. Repressor Maintenance) Figura 12. Na ausência de Cl. 17 e 12. p. Figura 12. 18. permite esta competição. 17. a opção por um tipo de desenvolvimento ou outro do fago dependerá. As proteínas Cro e Cl apresentam afinidades diferentes por eles. elemento chave neste processo. estão sobrepostos aos sítios operadores OR e OL. a transcrição dos genes cl e cro é mutuamente exclusiva. a proteína Cll. O operador OR é constituído de três sítios discretos de reconhecimento: OR1. Cl liga-se a OR1/OR2 e OL1/OL2. regulado pelo promotor PR. 18).MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS O gene cro. Os promotores PR e PRM à direita e PL à esquerda.. as proteínas tardias são sintetizadas e Cro acaba ocupando os operadores OR3/OR2 e OL3/OL2. Circuito autógeno na manutenção da lisogenia. 158 Cristina M. pelos quais tem alta afinidade. mas não idênticos. das condições apresentadas pela célula hospedeira. Como este sistema é regulado? O que determina que Cl ligue-se a seus sítios operadores antes de Cro ou vice-versa? Muitos dos mecanismos que controlam este sistema já foram esclarecidos e. A própria organização dos genes no cromossomo do fago. pelos quais tem alta afinidade. Logo. em última instância. impedindo a transcrição dos genes cro e N. a transcrição do gene int e a transcrição inicial do gene cl (Figura 12. O circuito lisogênico é mantido pela proteína Cl.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS impedindo a transcrição de cl. ativando a transcrição do gene que codifica a integrase. respectivamente. Ao ligar-se a estes promotores permite uma atuação mais eficiente da RNA polimerase. Figura 12. A partir deste momento a transcrição do gene cl ocorrerá via promotor PRM e não necessitará mais de Cll. A tradução dos primeiros mensageiros cl produz os monômeros de Cl que se unem formando dímeros (repressor) com alta afinidade pelo sítio OR1. Logo. 19. O fator de transcrição Cll ativa a transcrição a partir de dois promotores no DNA do fago: PI e PRE (de Repressor Establishment). Cristina M. o dímero permitirá que a RNA polimerase ligue-se ao sítio promotor à esquerda. um transcrito antisense de cro. Cll também agirá sobre o promotor P I. sendo imediatamente preenchido. enquanto o gene cl produz o repressor do l. Uma vez instalado no sítio OR2. Bonato 159 . que pode hibridizar com o mRNA de cro inibindo sua tradução. Assim que o dímero liga-se ao sítio OR1. Este fenômero é chamado cooperatividade. A transcrição de cl a partir do promotor PRE utiliza como molde a fita oposta à utilizada na transcrição do gene cro produzindo. A expressão inicial do gene cl depende da ação da proteína reguladora Cll que ao ligar-se ao promotor P RE permite o reconhecimento deste promotor pela RNA polimerase que transcreverá o gene cl à esquerda.11). Cll cria as condições ideais para que se instale a via lisogênica de desenvolvimento. O Regulador Positivo Cll A opção entre lise e lisogenia depende dos níveis relativos de atividade das proteínas reguladoras CII e Cro. O produto do gene int é uma recombinase (integrase) envolvida na inserção do fago no cromossomo bacteriano. uma vez que o repressor Cl exercerá controle positivo sôbre a transcrição de seu próprio gene (Figura 2. Os promotores PI e PRE controlam. O 5' terminal do mRNA transcrito a partir de PRE é o antisense de cro. PRM. conseqüentemente. 19). o sítio OR2 torna-se muito mais atrativo a outro dímero repressor. um RNA antisense de Cll. Em compensação. não haverá síntese do repressor Cl dirigida pelo promotor PRE. Assim. consequentemente. Mutações que tornam inativos os produtos dos genes cl. Por outro lado. a transcrição do gene cro e dos genes subsequentes estará reprimida (controle negativo). vão afetar as concentrações relativas de Cro e Cl. Perda de sua função estabiliza Cll e a super produção da protease acelera a degradação de Cll (Kihara et al. o circuito autógeno onde o gene cl é continuamente transcrito. Por outro lado. Recentemente foi demonstrado que a ação de Cll também pode ser controlada pelo RNA oop. liga-se ao sítio OR3 impedindo a transcrição a partir do promotor PRM. em relação ao promotor PL. coli.. Concentrações elevadas do RNA oop tornam o processo de lisogeinização do hospedeiro ineficiente. assim. que reside na margem periplasmática da membrana plasmática de E. Cll é Degradada por uma Protease Bacteriana Uma vez que Cll controla a transcrição de cl. Portanto. A modulação transmembrana permitiria acoplar os rumos do desenvolvimento do fago às condições do meio ambiente. Ao mesmo tempo. estará livre e a transcrição dos 160 Cristina M. Isto diminuirá os níveis de atividade de Cll e. sintetizadas pelo genoma do profago ligar-se-ão imediatamente aos operadores OL e OR do novo invasor impedindo sua duplicação e a entrada no ciclo lítico. sintetizada pelo gene hflB (do inglês high frequency of lysogeny) também denominado ftsH. a partir do promotor PRE. do cromossomo de E. Bonato . PR e. Resumindo. uma vez que a protease HflB está ausente. A proteína Cro. coli. é provável que um sensor de membrana capte os sinais nutricionais repassando-os para a protease via complexo HflKC que modula a atividade de HflB/FtsH. Desta forma. HflB tem afinidade por HflKC(HflA) formando um complexo hetero oligomérico in vivo. cll ou clll determinam o desenvolvimento lítico do fago enquanto mutação no gene hflB/ftsH aumenta a lisogenia. Quando a célula hospedeira está crecendo em um meio rico. Desta forma a lisogenia é mantida estavelmente através de gerações. em células que se encontram em um meio carente há uma tendência à lisogenia. a proteólise intracelular de Cll poderia ser controlada por eventos que ocorrem na superfície da célula.MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Instala-se. resta saber quem controla a atividade da Cll. codificada no genoma do fago. A ação da protease HflB é modulada pelo complexo HflKC (HflA). É a síntese continuada do repressor que explica o fenômero da imunidade à infecção por outro fago de mesmo tipo. uma vez que estas atividades. Mutantes hflB/ftsH apresentam alta freqüência de lisogenia. na ausência de seu competidor. a RNA polimerase fica impedida de ligar-se ao promotor da direita. consequentemente. como os sítios OR1 e OR2 estão preenchidos com a molécula repressora. a ação da protease HflB sobre Cll pode ser controlada pela proteína Clll. A proteína Cll é extremamente instável "in vivo" porque é degradada pela protease HflB/FtsH. para que o fago faça a opção pelo ciclo lítico. o promotor PR à direita. HflB é uma proteína transmembrana com atividade de protease dependente de ATP. Fenômeno semelhante ocorre à esquerda. a atividade da Clll deve estar baixa e a proteína HflB/FtsH ativa. Se um outro fago l infectar uma bactéria lisogênica. em última instância. o desencadeamento da via lisogênica depende da relação entre as atividades dos genes cll e clll do fago e dos genes hflB/ftsH e hflA do hospedeiro. o desenvolvimento lítico é privilegiado formando-se inúmeras partículas fágicas. 1997). as moléculas repressoras Cl. MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS genes tardios, envolvidos no ciclo lítico, será ativada pela proteína antiterminadora Q. Conforme aumenta a concentração da proteína Cro ela ocupará os sítios OR2 e OR1 do operador, pelos quais tem baixa afinidade, impedindo a transcrição a partir de P R e PL. Todavia, neste momento, já existe quantidade suficiente do antiterminador Q para dirigir a transcrição dos genes tardios. Indução do Profago A indução do profago depende da degradação do repressor Cl. Como romper o circuito autógeno, que mantem a produção de Cl? Quando uma população de bactérias lisogênicas é exposta brevemente a um agente que provoque danos ao DNA, como por exemplo a radiação ultra-violeta (UV), o repressor do l é inativado por ação da proteína RecA da bactéria, que estimula a clivagem autocatalítica do repressor Cl (Voet & Voet,1995) O repressor CI é um dímero constituído de dois monômeros idênticos (Figura 12. 20). Cada monômero possui dois domínios distintos. O domínio N-terminal está envolvido na ligação ao sítio operador no DNA. O domínio C-terminal está envolvido na associação dos monômeros para formar o dímero ativo. É o dímero que tem alta afinidade pelo DNA. A ação da protease sôbre o repressor é digerir a conexão entre os dois domínios do monômero. Como a afinidade dos domínios N-terminais pelo DNA é controlada pela dimerização dos domínios C-terminais, a clivagem resulta na dissociação do repressor do DNA. Consequentemente, a transcrição de cI diminui e a de cro aumenta; o genoma do fago é excisado do cromossomo bacteriano; instala-se o ciclo lítico de desenvolvimento. Este processo é denominado indução do profago e corresponde a uma resposta dramática da célula à alterações transitórias no meio ambiente (Figura 12. 21). Figura 19. 20. O monômero do repressor é um polipeptídeo de 27.000 daltons com domínios distintos. Os domínios C-terminais associam-se formando dímeros e os domínios N-terminais ligam-se ao sítio operador do DNA. O domínio N-terminal contem 5 segmentos de a-hélice. As a-hélices 2 e 3 ligam DNA. Cristina M. Bonato 161 MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Figura 12. 21. No processo de indução do profago, a RecA estimula a autoproteólise dos monômeros de Cl separando os dois domínios. Conclusões A decisão lise-lisogenia, depende, de quem ocupará primeiro as regiões PL/OL e PR/OR: Cl ou Cro. A RNA polimerase, o repressor Cl e a proteína Cro, competem pelas mesmas regiões de controle de forma mutuamente exclusiva e cooperativa. A instalação de Cl ou Cro depende de suas concentrações relativas, as quais são afetadas pelas atividades de Cll, Clll, HflB e HflA. A presença de múltiplos operadores e a ligação cooperativa do repressor Cl são fundamentais na mudança de estado do l, frente as condições do hospedeiro. Guia de estudos Defina: fago l; virion; capsídeo; profago; fago temperado; lisogenia; infecção lítica; antiterminador; operador; mRNA antisense; cooperatividade; nut . Quantas vezes o genoma do l é maior que o do TMV? Como vírus animais podem adquirir seu envelope? Quais são as proteínas reguladoras codificadas pelo fago l? Como os genes estão organizados no cromossomo do l? Porque bactérias lisogênicas são imunes à infecção por outras partículas virais de mesmo tipo? Que genes do l são imediatamente transcritos após a infecção? A partir de que promotores? 162 Cristina M. Bonato MOLDES MÓDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTEÍNAS Quais as conseqüências de uma mutação, com perda de função, no gene cro? Quais as conseqüências de uma mutação, com perda de função, no gene cl ? Porque as transcrições de cro e cl são mutuamente exclusivas? Qual a vantagem de utilizar antiterminadores? Se um fago l mutado no gene clll, com perda de função, infectar uma célula mutada no gene hflB, também com perda de função, que tipo de desenvolvimento mais provavelmente acontecerá, lítico ou lisogênico? Porque? Porque a transcrição do gene cl a partir do promotor PRE inibe a tradução dos mRNA cro? Qual a conseqüência de uma mutação no gene recA da bactéria hospedeira lisogênica? Explique o circuito autógeno de manutenção da lisogenia. Qual a função do RNA oop? Como explicar a transcrição dos genes tardios depois de Cro ligar-se a PR/OR e PL/OL? REFERÊNCIAS Leitura Básica Alberts, B.; Bray, D.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K. & Watson, J., 1997 – Biologia Molecular da Célula – Tradução Arnaldo Zaha, 3a edição, Editora Artes Médicas, Porto Alegre–RS Azevedo, J. L., 1998 –Genética de Microrganismos – Editora da Universidade Federal de Goiânia, Goiânia–GO Birge, E. A., 1994 – Bacterial and Bacteriophage – 5d edition – Spring–Verlag New York Inc. Bonato, M.C.M., 1998 – Assimetrias e Destinos – Texto didático. Griffiths et al., 1996 - An Introduction to Genetic Analysis - Freeman and Company, 6th ed. New York, NY. Hartl, D.L. & Jones, E.W., 1998 - Genetics. Principles and Analysis, 4th ed, Jones and Bartlett Plub., USA. Hausmann, R., 1997 - História da Biologia Molecular – Trad. Celma E. Lynch de Araújo Hausmann – Sociedade Brasileira de Genética (SBG) – Ribeirão Preto – SP. 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