GD2 BIOLOGIA MOLECULAR – CURSO FARMÁCIA E BIOMEDICINADEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA PROFESSORA RAFAELA FERREIRA GD2 - Tradução e modificações pós-traducionais; Controle da expressão gênica em procariotos e eucariotos; Clonagem gênica, expressão e purificação de proteínas recombinantes 1. Através de um desenho esquemático, indique os principais elementos de um tRNA e de que forma o tRNA está ligado ao aminoácido. 2. O que é seqüência de Shine-Delgarno e qual a sua importância? 3. Explique o que é fenômeno de oscilação no pareamento códon –anticódon. Quais são as consequências deste processo em termos do número de tRNAs que são necessários para a tradução? E para as consequências de mutações? 4. Descreva (ou esquematize) o alongamento em procariotos no processo de tradução, indicando os fatores de alongamentos e o sítios de ligações. 5. Quais as diferenças entre o processo de iniciação da tradução em procariotos e eucariotos? 6. Baseando-se na lista de códons e amino ácidos abaixo, quais das seguintes afirmações são corretas? AGU = serina AGC = serina AAG = lisina AAA = lisina AUG = metionina AUA = isoleucina a) O código genético é degenerado b) A alteração de um único nucleotídeo no DNA que dirige a síntese destes códons poderia levar à substituição de uma isoleucina por uma lisina no polipeptídeo. c) A alteração de um único nucleotídeo no DNA que dirige a síntese destes códons necessariamente levaria à substituição de um aminoácido no polipeptídeo codificado. 7. Compare a precisão de (a) replicação do DNA, (b) síntese de RNA e (c) síntese de proteínas. Quais os mecanismos utilizados para assegurar a fidelidade de cada um desses processos? 8. Nos procariotos, a ausência de compartimentalização do genoma permite que os processos de transcrição e tradução sejam acoplados. Em eucariotos, esses processos estão temporal e espacialmente isolados. Quais as consequências dessa diferença entre procariotos e eucariotos? Qual a importância do fator sigma para a atividade da enzima RNA polimerase? Como a existência de diversos fatores sigma contribui para a regulação da transcrição? 11. a. Qual a função dos complexos SAGA e SWI/SNF? 13. Explique o que é o código de histonas. b. e. Explique como esta técnica pode ser empregada no desenvolvimento de terapias . implicam em diferenças de regulação da expressão gênica entre esses organismos. g. que tipo de alterações ocorrem na cromatina e. b. Explique esta afirmativa comparando a regulação em procariotos e eucariotos. c. acetilação Adição de âncoras lipídicas Degradação 10. 12. de diversos genes que codificam proteínas que participam de uma mesma via metabólica). Diz-se que em eucariotos o estado basal de transcrição é restritivo. c. Explique como esta técnica pode ser empregada na validação de alvos terapêuticos c. Quatro regiões contidas na sequência líder do óperon triptofano (sequência localizada entre o promotor e as sequências codificadoras de proteínas) são importantes para o mecanismo de atenuação. Cite mecanismos permitem a regulação conjunta de genes relacionados (por exemplo. Como a concentração de glicose influi na transcrição gênica para o óperon lac (e de modo geral. h. como presença de cromatina e de membrana nuclear. Descreva o mecanismo de RNAi desde a introdução de um dsRNA longo (RNA longo de dupla fita) até a degradação de um mRNA específico. para diversos óperons relacionados ao metabolismo de carboidratos)? d. f. Explique o papel de cada uma dessas regiões para a regulação deste óperon. Os óperons lac e triptofano são regulados de acordo com a concentração de lactose e de triptofano. d. a. Em ambos óperons a ligação de uma proteína repressora ao promotor é regulada por moléculas sinalizadoras. No entanto. c. descrevendo o processo que ocorre em altas e em baixas concentrações de triptofano. b. de modo geral. enquanto no outro é desfavorecida. A técnica de RNAi apresenta diversas aplicações na área terapêutica. Em eucariotos não há organização em óperons. Algumas diferenças entre eucariotos e procariotos. qual a sua importância para a regulação da expressão gênica. a. De modo geral. Justifique essa diferença considerando as proteínas codificadas por cada óperon. d.9. em um caso esta ligação é favorecida. Explique a importância de cada uma das seguintes modificações pós-traducionais: Enovelamento Formação de ligações dissulfeto Clivagem da cadeia polipeptídica Glicosilação Fosforilação Metilação. quais as vantagens de organização de genes em óperons? b. a. em que IIIc é incorporado. A Figura D representa os resultados após RNAi para SET2 (siSETD2) e para uma sequência silenciadora de uma proteína não relacionada (siCycB. A maior parte de nossos genes podem sofrer splicing alternativo. Esse processo pode ser regulado de diversas maneiras. Por que esta conclusão não pode ser obtida apenas a partir dos resultados indicados em A e B? 15. é possível concluir que há relação de causa e efeito entre a metilação de H3K36 e o splicing alternativo? Justifique.14. Como o DNA pode ser amplificado? b. b. No processo de clonagem é necessário amplificar o DNA de interesse e inseri-lo em um vetor. foi alterada em ambos tipos celulares a concentração da enzima SET2. Após estes experimentos foi verificada a razão entre os mRNAs que continham o exon IIIb e as que continham o exon IIIc em cada caso. Os resultados após superexpressão de SET2 estão representados na Figura C. Observa-se que estes tipos celulares diferem quanto ao padrão de metilação das histonas H3. Experimentos controle indicaram a eficiência das alterações das concentrações de SET2 e da alteração na taxa de metilação esperada para cada caso. tendo como controle o gene EGFP. que constitui um controle neste experimento). indicada em vermelho nas figuras) ocorre incorporação do exon IIIb. O gene FGFR2 é um exemplo. a redução da concentração da mesma através de RNAi. responsável pela metilação de H3K36. Nas células mesenquimais. a. Em células epiteliais de próstata (PNT2. Foram realizados dois experimentos: a superexpressão dessa proteína. inclusive por modificações em histonas. Para investigar se existe relação de causa e efeito entre estas duas observações. Qual o papel das enzimas de restrição neste processo? . indicada em preto nas figuras) o exon IIIc é incorporado (Figura A). A partir dos resultados obtidos em C e D. a. observa-se uma proporção muito maior de histonas H3 metiladas na lisina 36 (K36me3) do que nas células PNT2 (Figura B). enquanto em células tronco mesenquimais (hMSC. 20. Como verificar se o vetor de incorporado por uma bactéria contem o gene de interesse? . Explique porque é importante que um vetor contenha uma região com múltiplos sítios de reconhecimento para enzimas de restrição. Os plasmídeos são vetores muito úteis. a. Uma etapa importante da clonagem de um gene em uma bactéria é verificar se o vetor recombinante (contendo o gene de interesse) foi inserido no microorganismo. 17. Se um plasmídeo com um gene de interesse clonado fosse amplificado biologicamente por inserção em uma bactéria. Como o sucesso da inserção do vetor pode ser verificado? b. Como é possível resolver este problema? 18. Explique como a presença de íntrons em genes eucarióticos complica a geração dos produtos protéicos que eles codificam quando a expressão é feita em bactérias. quais características o plasmídeo deveria ter para se multiplicar na bactéria e ser possível selecionar aquelas que contêm o plasmídeo? 19. Cite uma limitação desses vetores e um vetor que não possua a mesma limitação.16. mas nem sempre são adequados.