Gartner, Leslie P. - Texto Atlas de Histologia, 2da Edición [1 Introducción a La Histología y Técnicas Histológicas Básicas]

-... , ji • , LE .G • ES   """ , ex o as e • I .------, . Segunda edición • • • • I LESllE P. GARTNER, Ph.D. JAMES lo HIATT, Ph. D. Associate Professor of Anatomy Department of Oral and Craniofacial Biological Sciences Baltimore Collage of Dental Surgery Dental School Associate Professor of Anatomy, Retired Department of Oral and Craniofacial Biological Sciences University of Maryland Baltimore, Maryland Traducción: Baltimore Collage of Dental Surgery Dental School University of Maryland Baltimore, Maryland Dr. Jorge Orizaga S. Revisión técnica: M. en e N. Teresa 1. Fortoul Van der Coes Dra. Patricia Bizarro N. M. en e Laura Colín B. BióL Irma E. López M. BióL Ivonne C. Sánchez C. Dr. Rodrigo Vázquez F. McGraw-Hill Interanlericana HEALTIiCARE GROUP MEXICO • AUCKLAND • BOGOTA • CARACAS • LISBOA · LONDRES • MADRID . MlLAN . MONTREAL • NUEVA DELHI • NUEVA YORK· SAN FRANCISCO SAN JUAN · SINGAPUR • SIDNEY • TORONTO NOTA La medicina es una ciencia en constante desarrollo. Conforme surjan nuevos conocimientos, se requerirán cambios de la terapéutica. El (los) autor(es) y los editores se han esforzado para que los cuadros de dosificación medicamentosa sean precisos y acordes con lo establecido en la fecha de publicación. Sin embargo, ante los posibles errores humanos y cambios en la medicina, ni los editores ni cualquier otra persona que haya participado en la preparación de la obra garantizan que la información contenida en ella sea precisa o completa, tampoco son responsables de errores u omisiones, ni de los resultados que con dicha información se obtengan. Convendría recurrir a otras fuentes de datos, por ejemplo, y de manera particular, habrá que consultar la hoja informativa que se adjunta con cada medicamento, para tener certeza de que la información de esta obra es precisa y no se han introducido cambios en la dosis recomendada o en las contraindicaciones para su administración. Esto es de particular importancia con respecto a fármacos nuevos o de uso no frecuente. También deberá consultarse a los laboratorios para recabar información sobre los valores normales. TEXTO ATLAS DE HISTOLOGIA Prohibida la reproducción total o parcial de esta obra, por cualquier medio, sin autorización escrita del editor. DEHECHOS HESEHVADOS © 2002, respecto a la segunda edición en español por, McGRAW-T-IILL INTERAMERICANA EDITORES, S.A. de C.V, A subsidieuy of The McGraw-Hill Companies. Cedro Núm. ,5 12, Col. Atlampa, Delegación Cuauhtémoc, 064.50 México, D.F. Miembro de la Cámara Nadonal de la Industria Editorial Mexicana, Reg. Núm. 736 ISBN: 970-10-3728-6 Translated from the second English edition 01" Color Textbook of Histology, by Leslie P. Gartner, James L. Hiatt Copyright © 2001, Pllblished by W.B. Sallnders Company A Harcourt Health Sciences Company The Curtis Center Independence Square vVest Philadelphia, Pennsylvania 19106 Al! rights reserved ISBN 0-7216-8806-3(Edición original) 1234.567890 hllpreso en RR DONNELLEY 09876.543102 Printed in Chile A mi esposa Roseann, mi hija jennifer, y mi madre Mary. L.P.G. A mis nietos N t l ~   n David, james Mallary, Hanna Elisabeth, Alexandm Renate y Eric james. J.L.H. Siempre es muy satisfactorio publicar una nueva edición de un libro, en especial de uno tan bien aceptado no sólo en su idioma original sino también en sus diversas traducciones. La histología, como tema, se encuentra en el cruce entre la anatomía macroscópica y la fisiología, y actúa como un elemento integral entre ellas. Conforme nuestros conoci- mientos en biología progresaron, se desarrollaron nuevas disciplinas, como las biologías celular y molecular, que ejercen un gran impacto en el cúmulo de conocimientos de la histología, que se expande para incorporar vastas cantidades de información recién descubierta. En la preparación de la edición actual buscamos a través de la múltiple información que inunda los campos de la biología celular y molecular, y revisamos la mayor parte de los capítulos del libro con el fin de reflejar conceptos actuales en estos campos, de manera específica en su apli- cación al estudio de la histología. Aún así, al mismo tiempo trabajamos para presentar el material en forma concisa, de modo que se ajuste al reducido tiempo curricular actual que la mayor parte de las escuelas de medicina y odontología asigna al estudio de la histología. También añadimos nuevo material ilustrativo en forma de dibujos a todo color y fotomicrografías , así como micro- grafías electrónicas de barrido y transmisión con objeto de continuar ayudando al estudiante a correlacionar la información que obtiene en las secciones didáctica y de laboratorio del curso. Otro cambio didáctico que observarán quienes utilizaron la edición anterior es la adición de un resumen corto al inicio de cada sección, que destaca de manera sucinta la información que se presenta en ese segmento del capítulo. Más aún, ajustamos el tamaño final Pre acio • • • del libro para que el estudiante lo manipule en forma más conveniente y cómoda. Como en la primera edición, trabajamos para que este libro sea legible y proporcione la información de manera tan eficiente como sea posible al presentar muchos de los esquemas en forma didáctica. Gran parte de la información se resume en cuadros para promover la adquisición de los conocimientos. Con frecuencia el texto se interrumpe por insertos resumidos que no sólo organizan aspectos importantes de la histología funcional sino que también ponen en alerta al lector respecto a su relevancia. Los términos importantes se presentan en negritas tanto para dirigir la atención a ellos como para permitir que el estu- diante que se prepara para exámenes los revise con rapidez. Por último, en la totalidad del texto el lector encontrará correlaciones clínicas que se insertan en recuadros e ilustran la importancia de la histología para los estudiantes de las profesiones de la salud. Creemos que estas características ayudarán a resaltar el dogma importante de la histología de los días modernos: que la estructura y la función se relacionan de manera estrecha. Aunque hicimos todo lo posible por presentar una descripción completa y precisa del tema, reconocemos que en cualquier labor de esta magnitud hay omisiones y errores. Por consiguiente, continuamos alentando y acogiendo con mucho gusto las sugerencias, los consejos y las críticas que facilitarán mejorar este texto. LESLIE P. GARTNER JAMES L. HIATT • IX   ~ r a Deseamos agradecer a las personas siguient es la ayuda y apoyo que nos proporcionaron en la preparación de este libro. En la University of Maryland, gracias en especial al doctor William A. F alkler, Jr., por la revisión del capítulo referent e al sistema linfoide; al doctor Norman F. Capra por revisar la sección de huso muscular, y a la sefiorita J ennifer P. Bassiur, estudiante de odontología del tercer afio, por sus sugerencias que contribuyeron a mej orar la presentación de est e material. Agradecemos verdaderamente al doctor James C. Hus- ton y en especial al doctor Paul May por proporcionarnos una extensa lista de sugerencias para mejorar los materiales de texto e ilustrativos. También deseamos agradecer a los doctores Robert A. Bloodgood, Fadhil Al-Lami y Nicholas A. Chiaia sus valiosos comentarios dirigidos a sus respectivos campos de experiencia. ecimientos • • • Como la histología es un t ema visual, es imprescindi- ble contar con ilustraciones gráficas excelentes. Por esta razón estamos en deuda con Todd Smith por su atención cuidadosa a los detalles al revisar las ilustraciones de la primera edición y crear nuevas figuras. También agrade- cemos a nuestros múltiples colegas de todo el mundo y a sus respectivos editores que nos permitieron genero- samente tomar prestados materiales ilustrativos de sus publicaciones . Por último, damos las gracias al equipo de proyectos de W.B. Saunders por toda su ayuda, en particular a WiUiam R. Schmitt, Editor en Jefe, Textos Médicos; Carol Robins, Supervisora de Correctores; EUen ZanoUe, Disefiadora; Natalie Ware, Jefa de Producción; Peg Shaw, Ilustrador Especialista y, sobre todo, a nuestra Editora de Desarrollo, Deborah Thorp. • XI 1 Introducción a la histología y técnicas histológicas básicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 Citoplasma.......................... 11 3 Núcleo ............................ . 49 4 Matriz extracelular ..... . ........ .... . 69 5 Epitelio y glándulas . ...... .. ... ... .... 83 6 Tejido conectivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 7 Cartílago y hueso • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 127 8 Músculo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153 9 Tejido nervioso. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179 1 O Sangre y hemopoyesis ................ 213 1 1 Sistema circulatorio .................. 243 12 Sistema linfoide (inmunitario) .. . ...... 263 Conteni o • • • 1 3 Sistema endocrino ................... 289 1 4 Sistema tegumentario .......... . ..... 311 1 5 Sistema respiratorio ................. 329 16 Sistema digestivo: cavidad bucal ....... 351 1 7 Sistema digestivo: conducto alimentario . . 363 1 8 Sistema digestivo: glándulas ........... 393 19 Sistema urinario .. ........ . ......... 415 2 O Sistema reproductor femenino ... .. .... 439 2 1 Sistema reproductor masculino . .... .... 463 2 2 Sentidos especiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 485 Indice alfabético ................ .... 511 .. VII . ./ ucclon a Intro técnicas Histología es la rama de la anatomía que estudia los tejidos de animales y plantas. Sin embargo, este libro de texto sólo describe los tejidos animales, de manera específica los humanos. En su aspecto más amplio, la palabra histología se emplea como sinónimo de anatomía microscópica, ya que su materia no sólo incluye la estructura microscópica de los tejidos sino también la de la célula, órganos y sistemas. Es necesario comprender que el cuerpo está compuesto de células, matriz intercelular y una sustancia líquida, el líquido extracelular (líquido tisular ), que impregna estos componentes. El líquido extracelular, que deriva del plasma sanguíneo, transporta nutrientes, oxígeno y moléculas de señalamiento a las células del cuerpo. Por el contrario, las moléculas de señalamiento, los product os de desecho y el dióxido de carbono que liberan las células del organismo llegan a la sangre y los vasos linfáticos a través del líquido extracelular. Este último y también gran parte de la matriz intercelular no se observan en preparaciones histológicas de rutina; empero, es necesario que el estudiante de histología reconozca su presencia invisible. El obj eto de la histología ya no aborda simplemente la estructura del cuerpo, sino también su funcionamiento. En realidad, la histología guarda una relación directa con otras di sciplinas y es esencial para comprenderlas. Por esta razón, este libro de texto entrelaza la biología celular, bioquímica, fisi ología y, según sea apropiado, la patología. Los estudiantes reconocerán la importancia de este obj etivo en cuanto se remitan al texto más adelante en su carrera. Un excelente ejemplo de esta relación se advertirá cuando el lector conozca la histología del riñón y observe su intrincada estructura (has ta el nivel molecular ), en la que reside la capacidad de este órgano para realizar su función. Las alteraciones de la estructura renal dan lugar a un gran número de trastornos que ponen en peligro la vi da. . El resto de este capítulo analiza 10$ métodos que aplican los histólogos para estudiar la anatomía microscópica del cuerpo. a ist o o """ía isto ó icas >- ./ . aSlcas • • • MICROSCOPIA DE LUZ Preparación de los tejidos Los pasos necesarios para la preparación de tejidos para microscopia de luz incluyen a) fijación, b) deshidratación y aclaramiento, c) inclusión, d) corte y e) montaje y tinción de los cortes. Se han desarrollado diversas técnicas para preparar los tejidos con el fin de estudiarlos, de tal manera que semejen cuanto más su estado natural en vivo. Las etapas incluidas son fijación, deshidratación y aclaramiento, inclusión en un medio estable, sección en cortes delgados para poderlos observar mediante transiluminación, montaje en una superficie para facilitar su manipulación y tinción para diferenciar los diversos componentes tisulares y celu- lares. Fijación La fijación se refi ere al tratamiento del tejido con sustancias químicas que no sólo retardan las alteraciones tisul ares subsecuentes a la muerte (o después de su remo- ción del organismo) sino que también conservan su confi - guración normal. Los agentes para fijación usados más a menudo en microscopia de luz son formalina amortiguada y fijador de Bouin. Estas dos sustancias permiten el entrecruzamiento de las proteínas y por tanto conservan una imagen del tejido similar al vivo. Deshidratación y aclaramiento Debido a que una gran parte del tejido está constituida por agua, se aplica una serie gradual de baños de alcohol iniciando con alcohol al 50% y alcanzando de manera 1 2 ••• Introducción a la histología y técnicas histológicas básicas paulatina el alcohol al 100% para eliminar el agua (deshi- dratación). A continuación, el tejido se trata con xileno, una sustancia química que es miscible con parafina fundida. Este proceso se conoce como aclaramiento, ya que el tejido se torna transparente en xileno. Inclusión Con objeto de distinguir entre sí las células superpuestas en un tejido y la matriz extracelular, el histólogo debe incluir los tejidos en un medio apropiado y a continuación seccionarlos en cortes delgados . Para la microscopia de luz, el medio habitual de inclusión es la parafina. Se coloca el tejido en un recipiente adecuado con parafina fundida hasta que se inflltra por completo. Una vez que se impregna el tejido con parafina, se coloca en un receptáculo pequeño, recubierto con parafina fundida y se deja endurecer para formar un bloque de parafina que incluya al tejido. Sección Una vez que se rebajan los bloques de tejido para eliminar el material de inclusión redundante, se montan para seccionarlos. Esta labor se lleva a cabo mediante un micrótomo, un aparato equipado con una hoja y un brazo que desciende en el bloque de tejido en incrementos específicos iguales. Para la microscopia de luz, el grosor de cada corte fluctúa entre 5 y 10 pm. También es posible efectuar los cortes en especímenes congelados, sea en nitrógeno líquido o en un portamuestras para congelación rápida en un crióstato. Estos cortes se montan con un medio para montaj e de congelación rápida y se seccionan a temperaturas inferiores a cero mediante una hoja de acero enfriada con anterioridad. Los cortes se colocan en portaobjetos de vidrio previamente enfriados, se permite que alcancen la t emperatura ambiente y se tiñen después con colorantes específicos (o se tratan para estudios histoquímicos o inmunocitoquímicos ). Montaje y tinción Los cortes de parafina se montan (colocan) en portaobjetos de vidrio y a continuación se tiñen mediante colorantes hidroso/ubles que permiten diferenciar los diversos componentes celulares. Los cortes para microscopia de luz convencional, sec- cionados mediante hojas de acero inoxidable, se montan en portaobjetos de vidrio recubi ertos con un adhesivo. Debido a que muchos constituyentes de los tejidos tienen casi las mismas densidades óptimas, deben teñirse para la microscopia de luz. La tinción para microscopia de luz se llevó a cabo principalmente con colorantes hidrosolubles. En consecuencia, primero es necesario eliminar la parafina del corte, después de lo cual se re hidrata y tií'ie el tejido. Una vez teñido, se deshidrata el corte de nueva cuenta de tal manera que pueda fijarse de modo permanente el cubreobjetos con un medio adecuado para montaje. El cubreobjetos no sólo protege el tejido de algún daño sino que también se requiere para observar el corte con el microscopio. Aunque existen varios tipos de colorantes para observar los múltiples componentes de células y tejidos, pueden agruparse en tres clases: • Colorantes que diferencian los componentes ácidos y básicos de la célula • Colorantes especializados que distinguen los compo- nentes fibrosos de la matriz extracelular • Sales metálicas que se precipitan en los tejidos y forman depósitos de metales en ellos Los colorantes empleados con más frecuencia en his- tología son hematoxilina y eosina (H y E). La hema- toxilina es una base que tiñe de manera preferencial los componentes ácidos de la célula de un color azuloso. Puesto que casi todos los componentes ácidos son ácido desoxirribonucleico (DNA) y ácido ribonucleico (RNA), el núcl eo y las regiones del citoplasma ricas en ribosoma se tiñen de color azul oscuro; estos elementos se denominan basofílicos. La eosina es un ácido que tiñe los componentes básicos de la célula de color rosado. Debido a que muchos constituyentes del citoplasma ti enen un pH básico, las regiones del citoplasma se tiñen de color rosa; se dice que estos elementos son acidófllos. También se usan muchos otros colorantes en la preparación de especímenes para estudio histológico (cuadro 1-1). Las moléculas de algunos colorantes, como el azul de toluidina, se polimerizan entre sí cuando se exponen a concentraciones altas de polianiones en el tejido. Estos agregados son de un color diferente al de sus moléculas individuales. Por ejemplo, el azul de toluidina tiñe de azul los tejidos, excepto los que son ricos en palian iones (p. ej ., matriz de cartílago y gránulos de células cebadas), que se tiñen de color púrpura. Se dice que un t ejido o un componente celular que se tiñe de color púrpura es metacromático y que el azul de toluidina muestra • metacromaSIa. Microscopia de luz Los microscopios compuestos están constituidos por una disposición especifica de lentes que permiten una gran amplificación y una buena resolución de los tejidos observados. En el microscopio de luz actual se utiliza una disposición específica de grupos de lentes que amplifican una imagen (fi g. 1-1). Como resultado del uso de más de una lente simple, este instrumento se conoce como un microscopio compuesto. La fuente de luz es una bombilla eléctrica con un filamento de tungsteno cuya luz se reúne en un haz enfocado por la lente condensadora. El haz de luz se localiza abajo y se enfoca en el espéci- men. La luz que pasa a través de este último penetra en una de las lentes del obj etivo; estas lentes están asentadas en Cuadro 1-1. Colorantes y reacciones histológicas comunes Reactivo Hematoxilina Eosina Tri crómica de Masson Colorante de orceína para fibras elásticas Colorante Weigert para fibras elásticas Tinciones argénticas Hematoxilina férrica Acido peryódico de Schiff Colorantes de Wright )' Giemsa Resultado A;:;ul : núcleo; regiones ácidas del citoplasma; matri z de cartílago Rosa: regiones básicas del citoplasma; fibras de colá- gena A;:;ul oscuro: núcleo; rojo: músculo, queratina, cito- plasma A;:;ul claro: mucinógeno, colágena Pardo: fibras elásticas A;:;ul: fibras elásticas Negro.· fibras reticulares Negro: estriaciones de músculo, núcleos, eritro- citos Magenta: moléculas ricas en glucógeno)' carbohi- dratos Se utiliza para tinciones diferenciales de células hemáticas Rosa: eritrocitos, gránulos de eosinófilos PÚr¡Jtl m: núcleos de leuco- citos, gránulos basófilos A;:;ul: citoplasma de mono- citos)' linfocitos una torreta movible localizada justo arriba del espécimen. Por lo general se dispone de cuatro lentes objetivos en una torreta, que proporcionan amplifi caciones baja, media, alta y con aceite. En la mayor parte de los microscopios las tres primeras lentes suelen amplificar, cuatro, 10 y 40 veces, respectivamente, y se utilizan sin aceite; la lente para aceite amplifica la imagen 100 veces. La imagen de las lentes del obj etivo se reúne y las lentes del ocular la amplifican de manera adicional. Es- tas lentes aumentan la imagen en un factor de 10 - para amplificaciones totales de 40, 100, 400 Y 1 000 y enfocan la imagen resultante en la retina del ojo. El enfocamiento de la imagen se realiza mediant e perillas indentadas que mueven las lentes del obj etivo hacia arriba y abajo sobre el espécimen. La perilla de enfoque amplio las mueve en incrementos mayores que la perilla Introducción a la histología y técnicas histológicas básicas ••• 3 de enfoque fino. Resulta de interés que la imagen que se proyecta en la retina está invertida de derecha a izquierda y al revés. La calidad de una imagen no sólo depende de la capa- cidad de una lente para amplificar sino también de su resolución -la capacidad de la lente para mostrar que dos obj etos distintos están separados por una distancia. La calidad de una lente depende de qué tan cerca se aproxima su resolución al límite teórico de 0.2.5 pm, una restricción determinada por la longitud de onda de la luz visible. Existen varios tipos de microscopios de luz, que se diferencian por el tipo de luz que utilizan como fuente luminosa y la forma en que la emplean. Sin embargo, la mayoría de los estudiantes de histología deben reconocer sólo las imágenes obtenidas de los microscopios de luz compuest o, electrónico de transmisión y electrónico de barrido; en consecuencia, no se comentan aquí los otros tipos de microscopios. Técnicas de imágenes digitales En las técnicas de imágenes digitales se emplea una computadora para capturar y manipular imágenes histológicas. El advenimiento de la computadora proporcionó un medio para capturar imágenes en forma digital, sin utilizar una película. Aunque este método de captura de imágenes aún no puede competir con la t ecnología fílmica, tiene muchas ventajas que la constituyen en una herramienta valiosa, por ejemplo: • Observación inmediata de la imagen adquirida • Modificación digital de la imagen • Capacidad para realzar la imagen mediante el uso de programas de computadora disponibles en el comer- . ClO Además, debido a que estas imágenes se guardan en un formato digital, es posible archivar cientos de ellas en un solo disco CD-ROM Y su recuperación es casi instantánea. Por último, su forma digital hace posible la transmisión electrónica de estas imágenes mediante correo electrónico o su distribución a través de Internet. Interpretación de cortes microscópicos Una de las habilidades más difíciles, fru strantes y demoradas en histología es la de aprender a interpretar un corte bidimensional como si fuera tridimensional. Si se imagina una manguera para el jardín, como en la figura 1-2, y a continuación se practican cortes delgados, se torna obvio que el objeto tridimensional no necesariamente se distingue de cualquiera otra de las representaciones bidimensionales. Sin embargo, observando todos los cortes extraídos de la manguera arrollada, es posible reconstruir mentalmente la imagen tridimensional. 4 ••• Introducción a la histología y técnicas histológicas básicas Lámpara Imagen en el ojo • , ' , ' , ' , , ;:;----Lente condensador Lente de proyección Imagen en la pantalla de • Cátodo ------ Anodo Ventana para observación Espécimen Imagen en la pantalla de observación Pantalla de televisión Microscopio de luz Microscopio electrónico de transmisión Microscopio electrónico de barrido Fig. 1-1. Comparación de los microscopios de luz, electrónico de transmisión y electrónico de barrido. Procedimientos avanzados de observación Histoquimica La histoquímica es un método de tinción de tejidos que proporciona información sobre la presencia y localización de macromoléculas intracelulares y extra celulares. Es posible localizar los constituyentes químicos especí- ficos de tejidos y células por los métodos de histoquímica y citoquímica. Estos métodos aprovechan la actividad enzimática, re actividad química y otros fenómenos fisico- químicos relacionados con el elemento en cuestión. Las reacciones de interés se tornan evidentes mediante la formación de un precipitado insoluble que toma cierto color. Con frecuencia, la histoquímica se efectúa en tejidos congelados y puede aplicarse tanto en la microscopia de luz como en la electrónica. En una reacción histoquímica se utiliza el reactivo ácido peryódico de Schiff (PAS), que forma un precipitado de color magenta con moléculas ricas en glucógeno y carbohidratos. Para asegurar que la reacción sea específica del glucógeno, los cortes consecutivos se tratan con ami- lasa. Por consiguiente, los cortes no tratados con amilasa muestran un depósito magenta, en tanto que en los cortes tratados no se observa tinción en la misma región. Aunque es posible localizar enzimas mediante proce- dimientos histoquímicos, se observa el producto de la reacción enzimática y no la enzima en sí misma. El reactivo está diseñado de tal manera que el producto se precipita en el sitio de la reacción y se reconoce como un depósito metálico o de color. Inmunocitoquímica En la inmunocitoquímica se utilizan anticuerpos marcados con fluoresceína y antianticuerpos para identificar una localización intracelular y extra celular de las macromoléculas más precisa de la que es posible con la histoquímica. Aunque los procedimientos histoquímicos permiten ubicar relativamente bien ciertas enzimas y macro moléculas en células y tejidos, es posible obtener una localización más exacta con la inmunocitoquímica. Este procedimiento exige desarrollar un anticuerpo contra la macromolécula particular a localizar y marcar el anticuerpo con un colo- rante fluorescente (fluoresceína o rodamina). Existen dos métodos de marcado con anticuerpo: directo e indirecto. En el método directo (fig. 1-3) se marca el anticuerpo contra la macromolécula con un colorante fluorescente. A continuación se permite que reaccione el anticuerpo con la macromolécula y puede Fig. 1-2. La histología exige la reconstruc- ción mental de imágenes bidimensionales en una sólida tridimensional a partir de la cual se cortaron. En este diagrama se seccionó un tubo curvo en varios planos para ilustrar la relación entre una serie de cortes bidimen- sionales y la estructura tridimensional. Corte transversal Corte oblicuo c: I t c ) I I e ) observarse el complejo resultante con un microscopio de fluorescencia (fig. 1-4). En el método indirecto (fig. 1-3) se prepara un anti- cuerpo marcado con fluorescencia contra el anticuerpo primario específico para la macromolécula de interés . Una vez que reacciona el anticuerpo primario con el antígeno, se lava la preparación para eliminar el anticuerpo primario no unido; en seguida se añade el anticuerpo marcado y reacciona con el complejo antígeno-anticuerpo origi- nal, con lo cual se forma un complejo secundario visi- ble con microscopia de fluorescencia (fig. 1-5). El método Anticuerpo fluoresceinado Antígeno Introducción a la histología y técnicas histológicas básicas ••• 5 I :;\ c ) :CC I e :> Diagrama que muestra los diferentes aspectos de cortes a través de un tubo curvo en diferentes niveles e e ) Corte longitudinal - - - - - - - - -- ' e ) indirecto es más sensible que el directo porque se unen múltiples antianticuerpos marcados con el anticuerpo pri- mario, cuya observación es más fácil. Además, el método indirecto no requiere marcar el anticuerpo primario, que muchas veces sólo se encuentra disponible en cantidades limitadas . La inmunocitoquímica puede utilizarse con especíme- nes para microscopia electrónica si se marca el anticuerpo con ferritina, una molécula densa en electrones, en lugar de un colorante fluorescente. El marcado con ferritina puede aplicarse en los métodos directo e indirecto. Antianticuerpo fluoresceinado adicionado r- r "" Anticuerpo Antígeno r Fig. 1-3. Métodos de inmunohi stoquímica directo e indirecto. l;;quie-rda. Se marca un anticuerpo contra el antígeno con un colorante fluorescente y se obselva con un microscopio de Auorescencia. La fluorescencia se identificó sólo en donde se locali zaba el anticuerpo. Derecha. Se preparan anticuerpos marcados con fluo- rescencia contra un anticuerpo que reacciona con un antígeno particular. Cuando se obser- van mediante microscopia de fluorescencia, la región que fluoresce representa el sitio del anticuerpo. __ ___ de te jido   . . +-- - --Lavado Directo Indirecto 6 ••• Introducción a la histología y técnicas histológicas básicas Fig. 1-4. Ejemplo de inmunocitoquímica directa. Se tifíeron inmuno- lógicamente neuronas cultivadas de un ganglio cervical superior de rata con anticuerpo marcado con fluorescencia específico para el receptor de insulina. Las áreas brillantes corresponden a los sitios en los que se unió el anticuerpo a receptores de insulina. El patrón de tinción indica que los receptores están localizados en todo el citoplasma del soma y las prolongaciones pero no en el núcleo. (Tomado de James S, Patel, N, Thomas P, Burnstock G: Immunocytochemical localisation of insulin receptors on rat superior cervical ganglion neurons in dissociated cell culture. J Anat 182:95-100, 1993.) Autorradiografía La a u torra diogra fía es un método en el que se incorporan isótopos radiactivos en macromoléculas, que a continuación se observan con el uso de una película de emulsión superpuesta. La autorradiografía (radioautografía) es un método particularmente útil para localizar e investigar una secuen- cia temporal específica de fenómenos. El método exige incorporar un isótopo radiactivo casi siempre tritio (3H) en el compuesto estudiado (fig. 1-6). Un ejemplo es el empleo de un aminoácido tritiado para observar la síntesis y agrupamiento de proteínas. Después de inyectar el compuesto radio marcado en un animal se obtienen especímenes de tejido a intervalos de tiempo seleccionados. Se procesa el tejido en la forma usual y se coloca en un portaobjetos de vidrio; sin embargo, en lugar de sellar el tejido con un cubreobjetos, se aplica sobre él una capa delgada de emulsión fotográfica. Se coloca el tejido en una caja oscura durante unos cuantos días o semanas, durante los cuales las partículas emitidas del isótopo radiactivo exponen la emulsión sobre los sitios celulares en los que se localiza el isótopo. Se revela y fija la emulsión mediante técnicas fotográficas y se dejan pequeños gránulos de plata sobre las porciones expuestas de la emulsión. A continuación se sella el espécimen con un cubreobjetos y se observa con un microscopio de luz. Los gránulos de plata se hallan sobre las regiones del espécimen que incorporó el compuesto radiactivo. Se usa una autorradiografía para vigilar el tiempo de incorporación de prolina tritiada en la membrana basal subyacente a células endodérmicas del saco vitelino (fig. 1-6). Se ha empleado una adaptación del método de auto- radiografía de la microscopia electrónica para demostrar que la prolina tritiada aparece primero en el citosol de las células endodérmicas, se desplaza a continuación al retículo endoplásmico rugoso, después al aparato de Golgi, Fig. 1-5. Inmunocitoquímica indirecta. Se prepararon anticuerpos fluorescentes contra anticuerpos primarios contra colágena de tipo IV para demostrar la presencia de una lámina basal continua en la interfaz entre acumulaciones de células malignas y el tejido conectivo circundante. (Tomado de Kopf-Maier P, Schroter-Kermani C: Distribution 01' type VII collage in xenografted human carcinomas. Cell Tissue Res 272:395-405, 1993. Copyright Springer-Verlag. ) a continuación hacia vesículas y por último a la matriz extracelular (fig. 1-7). De esta forma se demostró visual- mente la secuencia de fenómenos que tiene lugar en la síntesis de colágena de tipo IV -la proteína principal en la lámina densa de la lámina basal. MICROSCOPIA ELECTRONICA El uso de electrones como fuente de luz en la microscopia electrónica permite lograr una amplificación y resolución mucho mayores que las obtenidas con la microscopia de luz. En los microscopios de luz, las lentes ópticas enfocan luz visible (un haz de fotones ). En los microscopios elec- trónicos, los electromagnetos tienen la función de enfocar un rayo de electrones. Debido a que la longitud de onda de un rayo de electrones es mucho más corta que la de la luz visible, los microscopios electrónicos son en teoría capaces de obtener la resolución de dos objetos separados por 0.005 nm. Sin embargo, en la práctica la resolución del microscopio electrónico de transmisión (MET) es alrededor de 0.2 nm, aún más de 1 000 veces mayor que la resolución del microscopio de luz compuesto. La res olución del microscopio electrónico de barrido (MEB) se aproxima a 10 nm, considerablemente menor respecto de los instrumentos de transmisión. Más aún, los microscopios electrónicos modernos pueden amplificar un objeto hasta 150 000 veces; esta amplificación es lo bastante potente para observar macromoléculas individuales como DNA y miosina. Microscopia electrónica de transmisión En la microscopia electrónica de transmisión se utilizan cortes mucho más delgados, en comparación con 105 de la microscopia de luz, para teñir 105 tejidos y se requieren técnicas de precipitado de metales pesados en lugar de colorantes hidrosolubles. La preparación de especímenes de tejido para micros- copia electrónica de transmisión incluye las mismas etapas básicas que las de la microscopia de luz. Se han desarrollado fijadores especiales para la microscopia de luz de transmi- sión, ya que el poder de resolución mayor del microscopio electrónico requiere enlaces cruzados de proteínas más finos y específicos. Estos fijadores, por ejemplo soluciones amortiguadas de glutaraldehído, paraformaldehído, tetróxido de osmio y permanganato de potasio, no sólo preservan los detalles estructurales finos sino que también actúan como colorantes electrodensos, que per- miten observar el tejido con el haz de electrones. Puesto que estos fijadores penetran en tejidos frescos, incluso en los que se emplean para la microscopia de luz, se infiltran piezas relativamente pequeñas de tejidos en grandes volúmenes de fijadores. Los bloques de tejido para microscopia electrónica de transmisión no suelen ser mayores de 1 mm 3 Se han creado medios de inclusión adecuados, como la resina epóxica, de tal modo que pue- Introducción a la histología y técnicas histológicas básicas ••• 7 • . " • • • • • .. 4 ~ \   " • • • . >. • • .. .. 2min. • • • • • 10min . • • • 20min • • • 8hr • • • Fig. 1-6. Autorradiografla. Examen con microscopia de luz de la incor- poración de prolina tritiada en la membrana basal en función del tiempo transcurrido desde la inyección de la prolina. En las fotomicrografías a a e, los gránulos de plata (puntos negros ) se localizan principalmente en las células endodérmicas; sin embargo, después de ocho horas (el), los gránul os de plata también se hallan en la membrana basal. La presen- cia de gránulos de plata indi ca la localización de la prolina tritiada. (Tomado de Mazariegos MR, Leblon cr, van der Rest M: Radioautographic tracing of :3H -proline in endodennal cell s of the parietal yolk sac as an indicator of the biogenesis of basement membrane components. Am J Anat 179:79-93, 1987. Copyright © 1987. Reprinted by permission of Wiley-Li ss , lnc, a subsidiary of John Wiley & Sons, lnc. ) den cortarse los tejidos incluidos en plástico en cortes extremadamente delgados (ultradelgados ) (25 a 100 nm) que no absorben el haz de electrones. Los haces de electrones se generan en una cámara de vacío mediante calentamiento de un filamento de tungsteno, el cátodo. A continuación se atraen los electrones al ánodo de carga positiva, una placa metálica en forma de rosquilla con un agujero central. Con una carga diferencial de alrededor de 60 000 voltios colocada entre el cátodo y el ánodo, los electrones que pasan a través del agujero en el ánodo tienen una alta energía cinética. • 8 ••• Introducción a la histología y técnicas histológicas básicas Fig. 1-7. Autorradiografía. En esta foto micrografía electrónica de una célula endodérmica de saco vitelino son obvios gránulos de plata (similares a los de la figura 1-6), que representan la presencia de prolina tritiada recubriendo el re tículo endoplásmico rugoso (rER), el aparato de e olgi (e ) y grúnul os secretorios (Se). La colágena de tipo IV, que es ri ca en prolina, se sintetiza en células endodérmicas y se libera a la membrana basal. La prolina tritiada se concentra más en organelos que participan en la síntesis de proteína. (Tomado de Mazariegos MH, Leblon CP, van de Hest M: Hadioau- tographic trac:ing of 3H-proline in endodennal cells of the pariental yolk sac as an indicator of the biogenesis of basement membrane components. Am J Anat 179:79-93, 1987. Copyright © 1987. Heprinted by permission of Wiley- Liss, II1 C, a subsidiary of John Wiley & Sons, 1ne.) Fig. 1-8. Citoquímica y grabado por congelación (crio- fractura). Héplica del marcado por criofractura de una célula acinar pancreáti ca de rata. Se localizaron residuos de N-acetil-d-galactosamina mediante el complejo de lectina y oro de Helix poma.tia. que aparecen como puntos negros en la imagen. El núcleo (Nu) semeja una depresión, el retículo endoplásmico rugoso (rER) asume la forma de líneas paralelas y los gránulos secretorios (e ) parece n elevaciones o depresiones pequeñas. Las elevaciones (e ) representan la mitad de la cara E y las depresiones (ast eriscos) la cara P de la membrana del gránulo secretorio. (Tomado de Kan F\VK, Bendayan M: Topographical and planar distribution of Helix pomatia lec: tin-binding glycoconj ugates in secretory granules and plasma membrane of pancreatic acinar cells of the rat: Demonstration of me mbrane heterogeneity. Am ] Anat 185:165- 176, 1989. Copyright © 1989. Reproducida con autori zación de Wiley-Li ss, Inc, a subsidia,y of John Wiley & Sons , 1nc.) Se enfoca el haz de electrones en el espécimen mediante electro magnetos, que son análogos a las lentes condensa- doras de un microscopio de luz (fig. 1-1). Debido a que el tejido está teñido con metales pesados que se precipitan de manera preferencial en membranas lípidas, los electrones pierden parte de su energía cinética a medida que inter- actúan con el tejido. Cuanto más pesado sea el metal que encuentra un electrón, menos energía retendrá el electrón. Los electrones que salen del espécimen se someten a los campos electromagnéticos de varios electro magnetos adicionales, que enfocan el haz en una placa fluorescent e. A medida que los electrones chocan con la placa fluorescente, se convierte su energía cinética en puntos de luz, cuya intensidad es una función directa de la energía cinética del electrón. Es posible llevar a cabo un registro permanente de la imagen resultante sustituyendo la placa fluorescente con una película sensible a electrones y produciendo un negativo a partir del cual pueden imprimirse una fotomi - crografía en blanco y negro. Microscopia electrónica de barrido La microscopia electrónica de barrido proporciona una imagen tridimensional del espécimen. A diferencia de la microscopia electrónica de transmi- sión, la de barrido se usa para observar la superficie de un espécimen sólido. Con esta técnica es posible ver una imagen tridimensional del objeto. Por lo general, el objeto que se observa se prepara en una forma especial que permite depositar en la superficie del espécimen una capa delgada de un metal pesado, como oro o paladio. Introducción a la histología y técnicas histológicas básicas ___ 9 A medida que el haz de electrones explora la superficie del objeto, se reflejan algunos (electrones retrodispersos ) :' se expulsan otros (electrones secundarios) desde la capa de metal pesado. Los electrones retrodispersos y secundarios son capturados por detectores de electrones y se interpretan, comparan y muestran en un monitor como una imagen tridimensional (fi g. 1-1). Es posible represen- tar una imagen permanente fotografiándola o digitalizándola para guardarla en una computadora. Técnica de fractura por congelación (criofractura) La estructura macromolecular de las superficies inter- nas de la membrana se revela mediante el método de fractura por congelación o criofractura (fig. 1-8). Los especímenes congelados con rapidez que se trataron mediante criopreservadores no forman cristales de hielo durant e el proceso de congelación; en consecuencia, el tejido no sufre un daíio mecánico. A medida que choca en el espécimen congelado una hoja de corte sumamente fría, fractura a lo largo de planos de segmentación, que son regiones de menor unión molecular; en las células la fractura ocurre con frecuencia entre las hojas interna y externa de la membrana. La cara de la fractura se recubre en un ángulo mediante platino y carbón evaporados; con ello se forman acumula- ciones de platino en un lado de una proyección pero no en el lado opuesto cerca de la proyección, generando así una réplica de la superficie. A continuación se digiere el tejido )' se examina la réplica mediante microscopia electrónica de transmisión. Este método permite mostrar las proteínas trans membranales de membranas celulares (fig. 1-8) . •