Fenol-cloroformoFenol-cloroformo (abreviado PC o PCIA, ver reactivos abajo) es una extracción líquido-líquido en la técnica bioquímica . Es ampliamente utilizado en biología molecular para el aislamiento de ADN , ARN y proteínas . Volúmenes iguales de un fenol: cloroformo y se mezcla una muestra acuosa se mezclan, formando una mezcla bifásica . Este método puede tardar más de unsistema basado en columnas , como la purificación a base de sílice, pero tiene una mayor pureza [ cita requerida ] y la ventaja de una alta recuperación de ARN: una columna de ARN es normalmente adecuado para la purificación de corta duración (<200 nucleótidosARN) especies, como siRNA , miRNA , gRNA y tRNA . Métodos de columna también cizallamiento fragmentos grandes de ADN, que puede o no puede ser un problema en función de las aplicaciones posteriores. Fue ideado originalmente por Piotr Chomczynski y Sacchi Nicoletta y publicada en 1987 (referido como tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo). [1] [2] El reactivo utilizado específicamente para la extracción de RNA se vende por Sigma-Aldrich por el TRI nombre Reactivo, por Invitrogen bajo el nombre TRIzol , por Bioline como Trisure y por Tel-Test como STAT-60. Cómofunciona Este método se basa en la separación de fases por centrifugación de una mezcla de la muestra acuosa y una solución que contiene agua saturada con fenol , cloroformo y una solución caotrópico desnaturalizante ( tiocianato de guanidinio ), resultando en una fase superior acuosa y una fase inferior orgánica (principalmente fenol). Ácido nucleico (ARN, ADN) de las particiones en la fase acuosa, mientras que las particiones de proteínas en fase orgánica. En una última etapa, el ARN se recuperó de la fase acuosa mediante precipitación con 2-propanol o etanol . ADN se encuentra en la fase acuosa en ausencia de tiocianato de guanidinio y por lo tanto la técnica se puede utilizar para la purificación de ADN solo. Tiocianato de guanidinio desnaturaliza las proteínas, incluyendo las RNasas, y separa rRNA de proteínas ribosomales, mientras fenol , isopropanol y agua son disolventes con una mala solubilidad. En presencia de cloroformo o BCP ( bromocloropropano ), estos disolventes separar completamente en dos fases que son reconocidos por su color: una fase clara, acuosa superior (que contiene los ácidos nucleicos) y una fase de rosa brillante inferior (que contiene las proteínas disueltas en fenol y los lípidos se disolvió en cloroformo).Otros productos químicos desnaturalizantes tales como 2-mercaptoetanol y sarcosina también se pueden usar. La desventaja principal es que el fenol y cloroformo son ambos materiales peligrosos e inconveniente, y la extracción es a menudo laborioso, por lo que en los últimos años muchas compañías ahora ofrecen formas alternativas para aislar el ADN. además de su acción de lisis. Tiocianato de guanidinio se utiliza también para lisar las células y las partículas de virus en el ARN y las extracciones de ADN. o como un tamponada con Tris 50% fenol. Cloroformo: Cloroformo se estabiliza con pequeñas cantidades de amileno o etanol . Para la purificación del ADN. cloroformo al 48%. [1] Nota: Este compuesto también puede ser reconocida como tiocianato de guanidina. El fenol es. de modo que pueden ser estudiadas de manera segura. el pH es generalmente cerca de 7. Tiocianato de guanidina se puede usar para desactivar un virus . Tiocianato de guanidinio (GITC) es un compuesto químico utilizado como un desnaturalizante de proteínas en general. algo soluble en agua. Estas enzimas de otro modo dañar el extracto. tal como un tampón Tris-solución 50% de fenol. el pH se mantiene a alrededor de pH 4.Reactivos Fenol: El fenol usado para bioquímica es en una solución saturada de agua con tampón de Tris . momento en el que todos los ácidos nucleicos se encuentran en la fase acuosa. ser unagente caotrópico . Alcohol isoamílico: alcohol isoamílico puede reducir la formación de espuma y asegurar la desactivación de RNasas. naturalmente. Algunas soluciones de cloroformo venir como pre-cloroformo hizo un 96%. 4% de mezcla de alcohol isoamílico que se puede mezclar con un volumen igual de fenol para obtener la solución 25:24:1. 2% de alcohol isoamílico solución (a veces llamado "25:24:1"). como fenol oxidado daños a los ácidos nucleicos. aunque se usa más comúnmente en la extracción de ADN y ARN. ya que la exposición de cloroformo puro a la luz ultravioleta y oxígeno produce fosgenogas. como el virus de la gripe que causó el 1918 " gripe española ". La mayoría de las soluciones también tienen un antioxidante. Esta aplicación es de suponer que la base de su actividad desnaturalización. Un método comúnmente usado es tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo extracción . No es estrictamente necesario el uso de fenol o cloroformo si la extracción de ARN de transferencia . [CH 6 N 3] +. cloroformo al 50%. que retiene el ARN en la fase acuosa preferentemente. Para la purificación del ARN. donde la función. y da una interfaz difusa. Esto es porque guanidinio es el ácido conjugado de guanidina y se llama el catión de guanidinio . y el alcohol isoamílico reduce la formación de espuma. la cual se agudiza por la presencia de cloroformo. es evitar que la actividad de las enzimas RNasa y DNasa mediante la desnaturalización de las enzimas ellos. una célula tendrá que sintetizar protectores de estrés). Considerando que los compuestos caotrópicos tales como etanol interferir con no. fuerzas de van der Waals . y desnaturaliza . también pueden desestabilizar el enlace de hidrógeno. [1] Caotrópicos sales que se disocian en solución ejercer efectos caotrópicos a través de diferentes mecanismos. Esto es también directamente aplicable a la región hidrófoba en bicapas lipídicas . y los efectos hidrófobos . entonces la integridad de membrana se verá comprometida. lo que la desnaturalización de la proteína. que aumentan la polaridad química del disolvente . por lo que las sales. Esta solubiliza la región hidrófoba en la solución. si una concentración crítica de un soluto chaotropgnfgnfic se alcanza (en la región hidrofóbica de la bicapa). puesto que estos métodos utilizan sondas que se unen a sus conjugados. macromoléculas tales como proteínas y ácidos nucleicos (por ejemplo ADN y ARN ). se deduce que un aumento de solutos caotrópicos en un sistema biológico desnaturalizarán macromoléculas. El enlace de hidrógeno es más fuerte en medios no polares. Solutos caotrópicos disminuir la red efecto hidrófobo de regiones hidrófobas a causa de un desorden de las moléculas de agua adyacentes a la proteína. por lo tanto. que no debería ocurrir si los protocolos adecuados se siguen. reducir la actividad enzimática e inducir estrés en una célula (es decir. Mecanísticamente . las sales pueden tener propiedades caotrópicas por blindaje cargos y prevenir la estabilización de puentes de sal. Adicionalmente. Solutos caotrópicos aumentar laentropía del sistema al interferir con las interacciones mediadas por intramoleculares no covalentes tales como fuerzas de enlaces de hidrógeno . y la célula se lisan . y sólo si la enzima se las arregla para renaturalizar.covalentesfuerzas intramoleculares como se indicó anteriormente. Estructura macromolecular y la función es dependiente del efecto neto de estas fuerzas (véase el plegamiento de la proteína ). la enciclopedia libre Saltar a navegación . Una posible excepción podría ser cuando se trabaja con temperaturas extremófilos porque algunas enzimas de estos organismos puede permanecer estable bajo circunstancias extraordinarias Agente caotrópico De Wikipedia. Plegamiento de proteínas terciaria es dependiente de las fuerzas hidrófobas de aminoácidos en toda la secuencia de la proteína.Northern o un ADN para el análisis de Southern blot porque la electroforesis en gel seguido de la transferencia a una membrana se separa el ARN / ADN de las proteínas. búsqueda Un agente caotrópico es una sustancia que altera la estructura de. los péptidos que conseguir a través del proceso generalmente no importa a menos que un péptido es una RNasa o DNasa. Esto puede resultar en ión-dipolo interacciones entre las sales y especies de enlaces de hidrógeno que son más favorables que las normales de enlaces de hidrógeno . [2] .esto es porque hay moléculas de agua insuficientes para efectivamente solvato los iones.