Universidad Católica Santa MariaFacultad de Ciencias Farmaceúticas, Bioquímicas y Biotecnológicas Arequipa Extracción y Purificacion de Flavonoides a partir de pétalos de Rosa Lenny Orana Sarmiento Sánchez Resumen Se realizó una extracción por Soxhlet de los pétalos de rosas rojas, primero se hace un desengrasado con éter que fue desechada, luego la extracción con etanol, la que se concentro y filtro, se hizo un reextracción con Acetato de Etilo por tres veces, se desecha la fase eterea y se conserva la fase acetica. Se agregó cloroformo para formar un precipitado, se filtra y a la fase precipitada se le resuspende en solucion etanolica. Procedemos a hacer las pruebas de identificación y determinación, como lo es la reacción de Shinoda y la reacción con el Tricloruro de Aluminio. Summary Extraction by Soxhlet of red rose petals you made, first degreasing with ether which was discarded is, after extraction with ethanol, which was concentrated and filter, made a reextraction with ethyl acetate three times, discarded the ether phase and the acetic phase is preserved. Chloroform was added to form a precipitate, is filtered and the precipitated phase was resuspended in ethanol solution. We proceed to make identification tests and determination, as is the reaction of Shinoda and reaction with aluminum trichloride. Introducción Los flavonoides lato sensu son pigmentos casi universales en los vegetales. Casi siempre hidrosolubles, son responsables de la coloración de las flores, frutos y a veces de las hojas. Asi ocurre con los flavonoides amarillos (chalconas, auronas, flavonoles amarillos), con los antocianósidos rojos, azules o violetas. Si no son directamente visibles, contribuyen a la coloración por su papel de copigmentos: asi ocurre con las En algunos casos.flavonas y flavonoles incoloros que copigmentan y protegen a los antocianósidos. asegurando asi la protección de los tejidos contra los efectos nocivos de las radiaciones ultravioletas. la zona de absorción de la molecula se situa en el ultravioleta próximo: la “coloración” se percibe únicamente por los insectos que se sienten asi eficazmente atraídos y guiados hacia el néctar y obligados por lo tanto a asegurar el transporte del polen que condiciona la supervivencia de la especie vegetal. Los flavonoides se encuentran también en la cutícula foliar y en las células epidérmicas de las hojas. . B y C. los atomos de carbono individuales son referidos por . con la estructura general C6 −C3 −C6 ' los cuales pueden formar o no un tercer anillo. se acumulan en las vacuolas y. según las especies. Los O-heterosidos de flavonoles dominan en los Helechos que.y C-heterósidos de flavonas y de derivados Ourónicos. corteza. Numerosos autores se han encargado de relacionar la distribución de estas moléculas con los distintos sistemas taxonómicos propuestos por los sistemáticos contemporáneos: en líneas generales no están en desacuerdo con las tendencias evolutivas establecidas para estos sitemas. los proantocianidoles son bastante constantes y se observa la presencia. Esto se refiere sobretodo a plantas de regiones aridas o semiáridas. Cuando los flavonoides se encuentran en la cuticula foliar. como se ha podido demostrar en algunos cereales). en función del órgano(leño. de los grupos hidroxilo. Los anillos son denominados A. hidrosolubles. la distribución de estos compuestos y de heterosidos de flavonas y flavonoles que los acompañan varía netamente. se concentran en la epidermis de las hojas o se reparten entre la epidermis y el mesofilo (aunque estos dos tejidos pueden acumular de manera especifica estructuras diferentes. las Equisetales por la proantocianidoles. se concentran en las células epidérmicas. según algunos autores. Estructura Química Quimicamente. las Psylotales y Selaginellales se caracterizan por la presencia de biflavonoides. mayoritariamente de O. En Pteridophytas no es mayor la variedad estructural de flavonoides. La diversidad estructural de flavonas es máxima en Angiospermas: así una treitena de tipos de flavonoides se han podido identificar en las Asteraceae. estas sustancias son de naturaleza fenólica y se caracterizan por poseer dos anillos aromáticos bencénicos unidos por un ouente de tres atomos de carbono. Localización Los heterósidos de flavonoides. En el caso de las flores. la construcción de un filograna bastante coherente entre grupos que han conservado gran cantidad de caracteres ancestrales y otros mas evolucionados. parcial o total. Esto permite incluso. generalmente provistas de estructuras secretoras.Distribución y localización Distribución La presencia de flavonoides en las Algas no se ha demostrado hasta el momento. elaboran asimismo chalconas o proantocianidoles. en este caso. sobre todo en el caso de las Dicotiledoneas. en Cycadales y Coniferales (a excepción de Pinaceae) de biflavonides. En Gymnospermas. ausentes en Gnetales. Aunque son frecuentes en Bryophytas (Musgos y Hepáticas). se trata casi siempre de geninas libres cuya lipofilia se incrementa por la metilación. hojas). se trata de flavonoides stricto sensu. distribuidos en todos los pigmentos amarillos de las plantas a pesar de los carotenoides . isoprenilacion. lo que resulta en la extensión de la hidroxilacion. Varios subgrupos de flavonoides son clasificados de acuerdo con la sustitución del anillo C. el cual utiliza números ordinarios para los anillos A y C y números primos para el anillo B. la que incorpora precursores de las rutas del shiquimato y la acetato-malonato (4.2). produciendo Oglicosidos y C-glicosidos.3). Flavonas y flavonoles Presentes en vegetales y son los flavonoides mas comunes. En esta clasificación son de suma importancia el estado de oxidación del anillo heterocíclico y la posición del anillo B(2.un sistema numérico. aunque también se presentan con relativa frecuencia como agliconas libres (1. Posteriores modificaciones ocurren en varios estados. metilación. Los flavonoides naturales suelen presentar al menos tres hidroxilos fenólicos y se encuentran generalmente combinados con azucares en forma de glucosidos. dimerización y glicosilacion.5). Los tipos de flavonoides están relacionados por una ruta biosintetica común. Antocianinas Siempre se encuentran como glicósidos.extraidos de la corteza de los frutos cítricos. solubles en disolventes orgánicos apolares. con acetona o alcohol (etanol.). Propiedades físico-químicas. etc. celulosa. son compuestos que existen en muy pequeñas cantidades por eso son los flavonoides menos conocidos. La separación y purificación de los diferentes flavonoides se funda en las técnicas cromatográficas habituales (sobre poliamida. Se puede seguidamente realizar una evaporizacicon al vacio y. . se disuelven en disoluciones de hidróxidos alcalinos. la CLAR constituye en estos últimos años el método de elección en el arsenal de las técnicas de aislamiento de heterosidos flavonicos (fases reversas C8 o C18 con disolventes se tipo agua -o acetonitrilo. en caso de fracaso. después de la clorofila. o THF. Las geninas son. cuando el medio contenga solo agua. extracción Solubilidades y extracción Aunque por regla general. proceder a una serie de extracciones liquido-liquido con disolventes no miscibles con el agua: con éter de petróleo que elimina clorofila y lípidos. hesperósido). los heterósidos mas polares. con acetato de etilo que arrastra la mayoría de los heterósidos. cuando contienen al menos un grupo fenólico libre. son el grupo mas importante de pigmentos en las plantas visibles al ojo humano y proporcionan el color malva.+ metanol + acido acético). gel de Sephadex. normalmente en caliente. las manzanas y la uva constituyen hasta aproximadamente 30% de su masa seca. metanol) a los que se adiciona agua(20 a 50% según que la droga sea fresca o seca). la rosa. en su mayoría. Los heterosidos pueden extraerse. los heterósidos son hidrosolubles y solubles en alcoholes.Flavanonas y flavanonoles Son incoloros o solo ligeramente amarillos. rosa. como la fresa. seguidamente habrá que separar las ceras y grasas que se extraen simultáneamente (se puede lavar en principio con hexano pero la selectividad de este disolvente no es absoluta). violeta y azulado a numerosas flores y frutos. Al igual que para la mayoría de metabolitos secundarios de los vegetales. con dietileter que extrae las geninas libres. Los azucares libres permanecen en la fase acuosa junto con. Los flavonoides lipófilos de los tejidos superficiales de hojas (o de frondes) se pueden extraer directamente con disolventes de polaridad media (diclorometano). muchos de ellos poseen una escasa hidrosolubilidad (rutósido.Sus glicósidos son bien conocidos –hesperidina y naringina. España o Italia. durante un tiempo. se habla de “factores vitamínicos P” o. Inhibición de la aldosa reductasa. Numerosos flavonoides –hipolaetina. Inhibición de la elastasa. cirsiriol. han podido mostrar una cierta eficacia clínica. lo que permite conservar la integridad de la sustancia fundamental de la pared vascular. En animal. la actividad celular de estas moléculas y los sitemas implicados en la respuesta inmunitaria y en la inflamación. Este interés de los flavonoides en controvertido: así. etc. Esta propiedad le ha valido. es decir.son potentes inhibidores de la 5-lipooxigenasa y por tanto de la producción de los leucotrienos mediadores de la inflamación y de las manifestaciones alérgicas. Ademas algunas moléculas de estos grupos. Muchos trabajos experimentales se esfuerzan asimismo en demostrar. interesa sobre todo la interaccion de los flavonoides con radicales y sus posibles consecuencias en términos preventivos. a estod productos naturales y a sus derivados que los diccionarios especializados incluyen bajo la denominación general de “vasculoprotectores y venotonicos” se les denomina “venotropos”. tienden a no utilizarse: en la actualidad. de “factores P”. entre otras y pro parte. su actividad antiagregante plaquetaria.de amplia prescripción. en el terreno de patologías ciculatorias menores. ser capaces de disminuir la permeabilidad de los capilares sanguíneos y aumentar su resistencia.. se atribuye a su valor terapéutico. por las flavonas y sobre todo por los proantocianidoles. el nombre de “vitamina P”. de frecuente recomendación farmacéutica y de una importante automedicación. Inhibición de la hialuronidasa. ambiguos. la FDA (Food & Drug Administration)no les reconoce ninguna actividad.de la que se sabe que se encuentra implicada en la patogenia de la catarata Inhibición in vitro de la protein-kinasa sobre todo por la luteolina. además la lectura de tratados clásicos de farmacología no permite durar sobre la escasa importancia que. Otras propiedades de los flavonoides. al menos en posologías elevadas. . por regla general. Inhibición no especifica de la catecol-O-metiltranferasa.Propiedades biológicas La principal actividad atribuida a los flavonoides es la de ser “venoactivos”. a menudo presentados como antiinflamatorios –lo que es compatible con lo que se conoce como sus interacciones (in vitro) con los polinucleares y los trombocitos o también con el metabolismo del acido araquidónico. Estos términos. Al no ser vitaminas (una carencia en flavonoides no ocasiona ningún síndrome especial). Inhibición de la fosfodiesterasa del AMPc que explicaría. pueden reducir la sintomatología de una hipovitaminosis C esperimental. No obstante los flavonoides y las preparaciones a base de flavonoides son objeto –en Francia y en muchos países como Alemania. Actualmente. mejor aun. lo que aumenta la cantidad de catecolaminas disponibles y provoca por tanto un aumento de la resistencia vascular. in vitro. Por regla general los flavonoides son in vitro inhibidores enzimáticos: Inhibición de la histidina descarboxilasa por el quercetol o la naringenina. los flavonoides pueden ser antialérgicos. no poseen indicación en ausencia de sintomatología funcional. no se realizan siempre de acuerdo con las normas actualmente en vigor para este tipo de pruebas. algunos flavonoles son. antibacterianos. Las variaciones de actividad en función de las características estructurales no permiten ninguna generalización. a contrario. En general las especialidades que se disponen en la actualidad en el mercado poseen las indicaciones o propuestas de empleo siguiente: Tratamiento de síntomas relacionados con la insuficiencia venolinfática (pesadez y dolores de pierna) Tratamiento de los signos funcionales debidos a la crisis hemorroidal. mutagenicos. diuréticos. Los flavonoides se utilizan sobre todo en el terreno capilar-venoso: solos o asociados.casi nunca ha sido correctamente establecida. hepatoprotectores (isobutrina. no eximen de una terapéutica etiológica y patogénica. Propuesto en transtornos ligados a la circulación retiniana y/o coroidiana. tratamiento de apoyo de transtornos funcionales de la fragilidad capilar. hipocolesterolemiantes. La mayoría de los flavonoides son. es decir. sobre los mismos modelos. Mejoría de los transtornos de fragilidad capilar a nivel de la piel (petequias). antimutagenicos. antiespaspodicos sobre ileon de cobaya estimulado por diversos agonistas (flavonoides de tomillo y de otras Lamiaceae). Unicamente un pequeño numero de moléculas puras o de extractos estandarizados ha podido demostrar una eficacia sintomática moderada a pesar de la subjetividad de los síntomas y de la importancia del efecto placebo en el principal tipo de patología involucrada. . citotóxicos. a forfitiori. etc. hipidulina. Tratamiento del linfoedema de miembro superios consecuente al tratamiento radioquirurgico del cáncer de mama. después de su exploración clínica o paraclinica. antivirales in vitro. Utilización de Flavonoides en Terapeutica Pese a los resultados parciales proporcionados por test bioquímicos o por estudios de farmacología animal. poseer efectos anti-iniciadores y/o antipromotores o incluso ser citostáticos. la realidad de la eficacia clínica de la mayoría de los flavonoides – y. Un pequeño numero de flavonoides son anticancerígenos e inhibidores del crecimiento de células tumorales in vitro: pueden interaccionar con los enzimas del metabolismo xenobiotico. son constituyentes habituales de vasculoprotectores y venotonicos y de tópicos utilizados en flobologia. Tratamiento de metrorragias debidas a la contracepción por microprogestagenos y de metrorragias debidas a la utilización de dispositivos intrauterinos. de la de las drogas que los contienen. Los expertos se ponen de acuerdo para subrayar que los venotropos carecn de interés demostrado en la prevención de transtornos tróficos en pacientes que poseen varices en los miembros inferiores y en la cicatrización de ulceras de las piernas. flavanolignanos). in vitro. Los ensayos en el hombre –que no son normalmente mas que meras “observaciones”-. En la insuficiencia venosa. por el grado de copigmentacion y por cambios en el pH de los petalos. La mayoría de los flavonoides protegen a las células de los daños ocasionados por la luz UV y también están involucradas en la defensa de la planta en otras situaciones de estrés. La muestra se desengrasa inicialmente con éter de petróleo ó n-hexano. y el marco se extrae con etanol puro o del 70%. lo cual ocurre debido a la oxidación ade flavonas. rojos. temperatura y radicación lumínica. e influenciado por factores ambientales como disponibilidad de nutrientes. sus petalos cambian de color. 1979). como heridas o ataque de patógenos (Grotewold. alcaloides. Entre una de las manifestaciones de estos fenómenos bioquímicos se puede mencionar el ennegrecimiento de los petalos de la rosa roja. Métodos Experimentales de extracción Los flavonoides en general se extraen de muestras secas y molidas.) Las Antocianinas son los pigmentos mas importantes responsables del color rojo de las rosas. por 3 ciclos para el desengrasado y luego continuamos la extracción con Etanol por 5 ciclos. Se pesaron 5g de pétalos de rosas. dependiendo de la copigmentacion que se presente. Este cambio de color puede disminuir el valor estético de la flor y puede ser utilizado como parámetro de senecencia. Estos pigmentos pueden causar que los petalos se observen rosados. . La pigmentación de los tejidos vegetales también se afecta por el pH y la temperatura (Jungmin et al. La modificación del color puede ser causada por cambios bioquímicos de los pigmentos. violeta o azules. antocianinas y otros fenoles (Halevy y Mayak. taninnos y polisacáridos. 2006). Este último es recomendado para garantizar la extracción de los más polares. Cada una de estas tres fracciones se puede analizar por cromatografía en capa fina (CCF) y HPLC en fase reversa. los medianamente polares en la fase acetato de etilo y los más polares en el nbutanol. El extracto obtenido se evapora con calentamiento no superior a los 50°C y se le hacen particiones sucesivas con éter etílico. 2008). acetato de etilo y nbutanol.Pigmentos involucrados en la Rosa Roja (Rosa Gallica sp. se somete a una extracción con éter por Soxhlet.. Los flavonoides apolares quedan en la fase etérea. Compuestos como las antocianinas y los fenoles son sintetizados con base a información genética y estadio de desarrollo de la planta. La copigmentacion es la interaccion de antocianinas con flavonoides y otros compuestos como metales. Cuando algunas flores inician el proceso de senescencia. Reaccion con el FeCl3 5% Utilizar una solución acuosa de rutina. . carmelita o rojo. cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo. Intensos en todos los casos. por tres veces cada una con 20ml. Reacción de Shinoda o Cianidina Caracteriza compuestos de estructura benzopirona.se diluye con 1ml de HCl concentrado y un pedacito de cinta de Magnesio°. Filtrar el precipitado. El extracto etanolico es evaporado a sequedad y suspendido en agua destilada hirviendo a 100ml con agitación. El ensayo se considera positivo. se añade 1ml de alcohol amílico. añadirle gotas del reactivo de FeCl3 5%. se mezclan fases y se deja reposar hasta que se separen. a partir de la adicion del HCl concentrado. Si la alícuota del extracto se encuentra en agua. Despues de la reacción se espera 5minutos. y el residuo re disolverlo en Etanol para las pruebas de identificación. La suspensión acuosa es filtrada por papel y el filtrado se lleva a una re extracción con Acetato de Etilo. La fase Acética contiene los flavonoides los cuales precipitan al agregarle Cloroformo. Observar a la luz UV con y sin vapores de amoniaco en un cromatograma. naranja. Si la alícuota del extracto se encuentra en alcohol –como es el caso. se procede de la misma manera. este ultimo reduce al flavonoide lo cual se reconoce por la coloracion rosada.A. la forma predominante es la del ion flavilio. especificamente compuestos con orto-difenoles. 1964 Catedra de Farmacognosia y medicina Tradicional. 2. Las diferentes especies vegetales estudiadas. España CLAUDIA KUKLISKI. 2000. Biochemistry of phenolic compounds. Métodos de investigación de fitoquimica HARBONE J. el extracto de Rosas en contacto con el acido clorhidrico con las Cintas de Magnesio metalico se genera hidrogeno. pp. Investigacion Fitoquimica. Metodo en el Estudio de Productos Naturales. 3.B. Editorial Acribia S. primera impresión 2003 DOMINGUEZ XORGE. A un pH 7 se produce la base quinoidal. La muestra problema de flavonoides. 2012 LOCK.A. Bibliografía BRUNETON JEAN. Farmacognosia. cuando esta es sometida a pH basico o alcalino. como: los petalos de rosas.5 y seguido se forma la chalcona. cercano a los estandares empleado en UV.Resultados y discusiones Discusión de resultados Las antocianinas son mas estables en un medio acido que en un medio neutron o alcalino. En medio acido a pH 1. S. el cual da el color rojo. lleva a la formacion de coloraciones variadas en presencia de FeCl3. el cual da una coloracion azul debido a cambios conformacionales y a la estabilizacion de los electrons de Valencia del cation flavilio y la resonancia del anillo aromatico B3 . esto es a pH 4. 1994. produciendose la pseudobase carbinol. 2da Edicion ZARAGOZA. En el caso de la reaccion de Shinoda. En la reaccion de coloracion con FeCl3. Farmacognosia. O. utilizados hoy en las industrias con fines terapeuticos. Conclusiones 1. Fondo Editorial PUCP. Mediante los metodos de extraccion y las reaccion de identificacion. Lima. Esto se debe a que la naturaleza polifenólica de los flavonoides. guia de practicasFarmacognosia. las rosas presentan heterosido flanonico antocianina. etc. las dos formas son incoloras. presenta una relacion de flujo determinado. presentan diferentes tipos de flavonoids.114-130 . la muestra de extracto de Rosas cambio a una coloracion roja rosada. el ion flavilio es susceptible al ataque nucleofilio por parte del agua. que en este caso por presentar antocianinas produce una coloracion roja rosada. alimentarios. Ediciones Omega. en especial las drogas de estas.