La fitoquímica en lasinteracciones bióticas Biol. Yolanda M. García Rodríguez Laboratorio de Ecología Química, CIEco UNAM Interacciones bióticas y abióticas En los cultivos, la incidencia de plagas y patógenos se ha explicado principalmente en términos de variación ambiental, variación genética y recientemente variación química natural de las plantas. Fitoquímica Los perfiles químicos pueden mantenerse en una población a pesar de la variación ambiental, debido a que algunos compuestos secundarios tienen control genético. HO O OH OH O N N N O OH Fitoquímica La investigación de perfiles químicos en las poblaciones naturales contribuye a explicar su resistencia natural a la herbivoría y en poblaciones cultivadas genera información para el manejo agronómico de plagas. La fitoquímica se estudia con diferentes tipos de cromatografía. Cromatografía Método físico para separar, cuantificar, aislar e identificar los componentes de una mezcla. Cromatografía Adsorción: El soluto se adsorbe en la superficie de la fase estacionaria sólida. Absorción, partición o reparto: El soluto se reparte entre la fase estacionaria líquida y la fase móvil por diferencia de solubilidad. Cromatografía en columna Las compuestos de la mezcla se separan debido a su afinidad con la fase estacionaria y con la fase móvil. Cromatografía en TLC F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 Revelado de luz UV (ʎ=254nm) de las fracciones obtenidas por cromatografía en columna, del extracto hexánico de T. lucida. Cromatografía en columna Intercambio Iónico Los aniones o cationes se separan en base a una columna rellena con un intercambiador de iones (resina con carga) Exclusión Molecular, filtración o permeación en gel No existen interacciones entre la fase estacionaria y el soluto, se separa por tamaño de partícula. Cromatografía HPLC Similar a la cromatografía en columna, con columna 5-25 cm y partícula entre 3- 10m. Cromatografía HPLC Gran presión en el flujo de la fase móvil (6000 psi). HPLC High Pressure Liquid, High Performance Liquid. Fase reversa la mas usada Separación de compuestos NO volátiles y termolábiles: aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos…es la mas usada. Cromatografía de gases GC Los compuestos se distribuyen en una fase móvil gaseosa, interaccionan con la fase estacionaria por cambios de temperatura. Cromatografía de gases Los compuestos son separados en base a su volatibilidad: los compuestos deben ser volátiles y térmicamente estables (10-20 %) Sin embargo derivatizar los compuestos se pueden colector aire jet H2 columna Cromatografía de gases Análisis rápido, requiere poca muestra (0.5ml) Monitoreo ambiental, investigación de nuevos compuestos con actividad biológica, cuantificación de sustancias prohibidas y metabolitos en sangre. Volatilidad Tipos de cromatografía Cromatografía de gases (GC) Cromatografía Líquida (HPLC) Polaridad Grupos de compuestos Análisis de datos Análisis de datos Análisis de datos Área, Estándar interno PK RT Caryophyllene 1 3.68 Area 47085 2 3.85 84407 3 3.96 32655 4 5 4.19 4.23 34829 44564 6 4.45 31479 mg Library/ID 0.021597 4 3-Penten-2-ol Bicyclo[3.1.1]heptane, 6,60.038716 dimethyl-2-methylene-, 6 (1S)0.014978 5 Benzene, 1-ethyl-3-methyl0.015975 Benzene, 1-methyl-4-(17 methylethyl)0.020441 Limonene 0.014439 1-Pentanol, 51 cyclopropylidene0.207980 Benzene, 1-methoxy-4-(2- Análisis de datos Estándar externo 40000000 35000000 30000000 f(x) = 8445541.51x + 372769.13 R² = 1 25000000 área 20000000 15000000 forbol-12-miristato 13-acetato por HPLC 10000000 5000000 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 (mg/ml) 4.5 Concentración CULTIVOS Persea americana var. Hass Persea americana var. drymifolia Solanum lycopersicon Variación fitoquímica en aguacate (Persea americana) y su relación con herbívoros. Lippia graveolens Jatropha curcas Mikania micrantha Variación fitoquímica de la defensa indirecta inducida por herbívoros. Tagetes lucida Cosmos bipinnatus Causas y efectos de la variación fitoquímica. Eupatorium glabratum Tithonia tubiformis Oenothera rosea MALEZAS Prospección de compuestos útiles para el ser humano. Volátiles foliares de P. americana var Hass 36 compuestos con nueve grupos funcionales ácidos grasos 5 triterpenos 2 fenilpropanoides 6 furanos 7 esteres 8 triterpenos 3 sesquiterpenos 9 alcanos 1 monoterpenos 4 25.2% 20.8% 14.4% 11.6% 5.6% 5.3% 3.5% 2.8% 2.0% Persea americana var Hass Se puede caracterizar quimiotipos foliares: comunes,perfiles químicos que abundan en la zona; y raros a los que se desvían del promedio. Correlación de quimiotipos raros con incidencia de barrenador de las ramas y quimiotipos comunes con incidencia de mosquita blanca y araña roja (Espinosa-García, 2001) Volátiles foliares de P. americana var Hass Los componentes mayoritarios de quimiotipos comunes y raros son: estragol, -cariofileno y eugenol, en los quimiotipos comunes constituyen el 26% y en los raros más del 70 % de su composición. Los compuestos que separan los grupos de quimiotipos son pcimeno, camfeno, óxido de cariofileno, limoneno, -mirceno, -terpineol, -cis-ocimeno, farneseno compuestos que han sido reportados con actividad contra herbívoros generalistas. Persea americana La susceptibilidad de P. americana var. drymifolia a la incidencia del agallero Trioza ancepsesta relacionada con grupos de compuestos secundarios foliares, según trabajos realizados en bancos de germoplasma. (Torres-Gurrola et al., Solanum lycopersicum Comparar la respuesta inducida por herbivoría en plantas ¿Cómo ha alterado la domesticación a la emisión constitutiva e inducida de volátiles? Bautista-Lozada A. 2014. Tesis de Doctorado. UMSNH. Solanum lycopersicum n= 40 plantas por variedad Cámara de vidrio Headspa ce estático Fibra SPME Cromatógrafo de Gases-Masas Perfil constitutivo Solanum lycopersicum Concentración Media Estandarizada 1.2 Compuestos volátiles: (y-μ)/σ 1) hexanal 1.0 2) 3-hexanol 0.8 3) α-pineno 0.6 0.4 478.26±18.76 pg/hr 1,241.76±71.25 pg/hr 4) β-mirceno 5) o-cimeno 6) (+)-4-careno 840.25±45.84 pg/hr 7) α-felandreno 0.2 8) α-terpineno 0.0 9) p-cimeno -0.2 -0.4 1,203.14±63.07 pg/hr 825.77±30.27 pg/hr 2,560.29±118.54 pg/hr 10) β-felandreno 11) limoneno 12) nonanal -0.6 FAUAS 2 FAUAS 4 FAUAS 6 Río Grande Río Fuego Castlemart CULTIVADAS SILVESTRES 13) decanal Zea mays Jatropha curcas Incorporar la variación fitoquímica y genética de Jatropha curcas a programas de manejo integrado de plagas y enfermedades. Se probó la toxicidad de los ésteres de forbol contra Phytium ultimun y Phytophthora capsici, hongos patógenas en plantaciones de Jatropha curcas y Phoma herbarum, Fusarium moniliformedos hongos generalistas, que atacan diferentes cultivos. Mayo-Hermenegildo 2014. Tesis Licenciatura. UMSNH. H. de Absorbancia (mAU) Jatropha curcas Arranque 10 min 40 min 55 min 70 min Detector Columna A B 60% 50% 25% 0% 40% 50% 75% 100% C 100% Longitud de onda variable Eclipse XDDC18 (4.6mm x 156mm x 5mm Agilent Technologies) forbol-12-miristato 13acetato Tiempo de Retención (min) Cuantificación de EF con estándar externo por HPLC Absorbancia (mAU) Jatropha curcas Arranque 10 min 40 min 55 min 70 min Detector Columna Tiempo de Retención (min) Cuantificación de EF en la muestra de J. curcas por HPLC A B 60% 50% 25% 0% 40% 50% 75% 100% C 100% Longitud de onda variable Eclipse XDDC18 (4.6mm x 156mm x 5mm Agilent Technologies) Jatropha curcas Los ésteres de forbol tienen actividad fungiestatica in vitro en hongos generalistas y dos especies de hongos fitopatógenas de J. curcas. La inhibición del crecimiento micelial aumentar la concentración. es mayor al El efecto fungistático de los ésteres de forbol se observa a partir de 0.250 mg/mL, mayor a la reportada en otros Tagetes lucida • Propiedad antifúngica de compuestos volátiles de tres plantas medicinales (Nurite, Santa María y Toronjil) sobre hongos patógenos de fresa. Fulgencio-Negrete, R. Tesis de Maestría. UMSNH. Efecto antifúngico de Tagetes lucida Botrytis cinerea F1 F2 F6 F1 F2 F6 F7 F3 F7 F3 F4 Tecto 60 Tecto 60 F5 Etanol F4 F5 Etanol Colletotrichum acutatum Cuantificación de compuestos activos de Tagetes lucida Concentración (% de área) Compuesto Tiempo de retención (min) Ext. Hex. F1 F2 Mirceno 8.22 2.1 5.9 2.2 o-cimeno 9.76 1.3 2.9 β-Linalol 11.19 2.3 Estragol 14.13 Acetato de geraniol Metil eugenol F4 F5 F6 F7 IK 0.8 0.8 NP 0.6 NP 992 1.4 0.5 0.5 NP NP NP 1048 NP 2.0 2.8 2.8 1.6 2.0 NP 1101 29.4 69.6 32.0 27.5 27.5 4.1 10.4 NP 1206 18.95 0.9 1.0 0.9 1.0 1.0 NP NP NP 1383 19.67 64.0 10.2 60.3 67.5 67.5 94.4 86.9 NP 1414 NP=no presente; IK= Índice Kovats. F3 Composición de la Fracción 5 de Tagetes lucida Tagetes lucida Los copuestos mayoritarios del extracto hexánico de T. lucida son metil-eugenol y el estragol. La fracción F5 contiene 94.4% de metil-eugenol, por lo que se le atribuye ser el responsable de la actividad fungicida. Ecología Química CIEco, UNAM ¡¡Gracias !!