FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA PRÁTICA: 01 OBJETIVOS: • Determinar o Brix de uma amostra açucarada pelo método aerométrico INTRODUÇÃO: Brix é a concentraçãode sólidos solúveis presentes numa amostra açucarada expressa em percentagem em peso; por definição, grau brix corresponde a uma relação entre a massa do soluto pela massa da solução. O brix de uma amostra pode ser determinado pelo método refratométrico ou pelo método aerométrico. Nossa prática se deterá ao aprendizado desse último. O areômetro (densímetro) é o aparelho mais simples usado para se medir o grau brix, sua escalas são bem variadas correspondendo a valores de 0 a 90o Brix. Salienta-se, no entanto, que as escalas mais utilizadas são as de 0 a 10oBrix, de 10 a 20oC e de 20 a 30oBrix. Esses aparelhos aferidos com uma solução padrão de sacarose a 20oC são muitas vezes conhecidos como sacarímetros ou brixômetro. MATERIAL: - Melaço; Caldo-de-cana ou Mostos açucarados - Diversos: Béquer de 50ml e 500ml; Bastão de vidro Proveta de 250 ml; Areômetro de 10 a 20o Brix e de 20 a 30o Brix Termômetro de 0 a 50oC Balança EQUIPES: Equipe A: Equipe B: Equipe C: Equipe D: Fazer diluição de 1 :2 para determinar o brix do melaço Fazer diluição de 1: 4 para determinar o brix do melaço Usar mostos açucarados Usar caldo de cana : Caso a temperatura da leitura seja inferior a 20oC. Imergir o areômetro no líquido em análise. Efetuar a leitura do brix na haste do areômetro. • • Calcular o brix real da amostra utilizando a fórmula Caso tiver sido realizada uma diluição. • Usar a solução 1+1 preparada para a determinação areométrica. Brix real = ( Brix lido ± fT) fd b) Determinação do pH pelo potenciômetro ou pHmetro • Antes da determinação do pH pelo potenciômetro.0. é necessário que o observador posicione sua vista exatamente .0 e 4. Obs. Filtrar caso haja uma grande concentração de sólidos em suspensão • • • Remover as espumas deixando o líquido transbordar um pouco. o mesmo deve ser aferido com soluções tampão de pH 7. Deixar a solução em repouso por alguns minutos (5 minutos) para eliminar as impurezas grosseiras.PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL: a) Determinação do Brix • • • • Pesar 100 g de melaço num Béquer e realizar a diluição recomendada.: Para a leitura correta. cobrindo a membrana. • Transferir 50ml da solução para um Béquer. subtrair o número encontrado na tabela do valor lido na haste. • • • Anotar o brix lido. Fazer a correção do brix observado para o brix a 20o C ( fT ) através de uma tabela correspondente. O procedimento inverso é feito quando a temperatura de leitura for superior a 20oC. Dissolver completamente. Obs. • Imergir o eletrodo na amostra. multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição correspondente ( fd ). Transferir a amostra (que poderá se também caldo de cana ou mostos açucarados) para uma proveta. no ponto de encontro entre a haste contendo a escala e o líquido examinado. Imergir o termômetro e efetuar a leitura. Obs:. Obs.: O pH em amostras de caldo de cana ou mostos pode ser determinado diretamente sem necessitar diluição. Na determinação do grau brix do melaço: (i) Qual o efeito da diluição ? (ii) Por que é necessário fazer a correção da temperatura? (iii) Como a temperatura pode influenciar essa determinação analítica? . Especificar as condições de trabalho e os resultados obtidos 2. Retirar o eletrodo e lavar com água destilada. Voltar o botão para a posição neutra.• • • Fazer leitura do pH. DISCUSSÃO 1. Azul de metileno: Dissolver 1g de azul de metileno em água destilada e completar para 1000ml. O volume de solução padrão de sacarose gasto na titulação de 10 ml do Licor de Fehling pode ser relacionado com o valor da concentração de açúcares redutores por intermédio de um cálculo estequiométrico. termômetro. soluções de HCl (1:1).75g de sacarose em Béquer numa balança analítica. Tela de amianto. tripé de ferro. banho-maria com controle de temperatura. pois quando neutralizada esta se deteriora rapidamente. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL • • • • • • • Pesar 4.639g sulfato de cobre (CuSO4. por conta de sua composição (sacarose) que é bastante favorável ao crescimento de microrganismos. Adicionar 10 ml de ácido clorídrico (1:1). balança de precisão. bureta de Mohr (50ml). azul de metileno a 1%. frascos de Erlenmeyer de 250ml (3). Completar a solução para 1000ml. * Solução A: Dissolver 34. MATERIAL E REAGENTES • • Sacarose p. Diluir a amostra com 75 ml de água destilada. Quando as soluções forem devidamente preparadas deve-se gastar cerca de 10ml de solução padrão de sacarose para titular 10ml de licor de Fehling. bico de Bunsen. proveta de 50ml. soluções de NaOH (1N). funil. Deixar a solução em repouso durante 24 horas para completar a inversão da sacarose. Obs.a. balão volumétrico de 1000ml. Bequer. Adicionar 2 a 3 gotas do indicador fenolftaleína a 1%. Neutralizar cuidadosamente com hidróxido de sódio (1N) agitando constantemente.5H2O) em água diluir para 500ml Solução B: Dissolver 173g de sal de Rochelle (tartarato de sódio e potássio) e 50g de NaOH em água. diluir para 500ml e deixar em repouso dois dias. pérolas de vidro. garra. solução de fenolftaleína a 1%.PRÁTICA: 02 OBJETIVOS: • Determinar o fator do licor de Fehling pelo método de Eynon-Lane INTRODUÇÃO: A partir de uma solução padrão de sacarose de concentração conhecida é possível por titulação avaliar o fator de uma solução mista de Fehling-Soxlet (5ml de solução A e 5ml de solução B) conhecida como Licor de Fehling..056. O resultado experimental obtido equivale ao fator do Licor de Fehling e será mais correto quanto mais se aproxime de 0.: É conveniente que a solução ao ser armazenada seja mantida ácida. pipetas volumétricas de 5ml (2) e 10ml (1). Para que a solução seja . bastão de vidro. Soluções de Fehling A e B*. Repetir (mais duas vezes).05g de redutores F = Fator do Licor de Fehling . Colocar 2 a 3 gotas da solução de azul de metileno a 1% e esperar 20 segundos.armazenada durante muito tempo. MÉTODO DE EYNON-LANE • • • • • • • • • • Adicionar 20 ml da solução A e 20ml da solução B (Licor de Fehling) em um frasco de Erlenmeyer e agitar bastante. menor do que o volume gasto na primeira titulação e anotar os volumes gastos (V2 e V3). deve-se adicionar ácido benzóico à solução de açúcar invertido. Titular com a solução açucarada da bureta. Determinar a média V dos volumes gastos nas duas titulações. acrescentando a frio um volume da solução a ser analisada. logo: 1000ml (volume total da solução) →5 g de redutores 10ml (volume gasto na titulação) → F F = 0. até obter uma coloração ligeiramente avermelhada. Obs.20ml. Juntar algumas pérolas de vidro. temos 10ml do Licor de Fehling deverão ser gastos 10 ml da solução padrão na titulação. Aquecer até ebulição durante 2 minutos. Obs.: A diferença entre as titulações não deve ser maior que 0. Transferir 10 ml do licor de Fehling para um frasco de Erlenmeyer de 250ml e adicionar 50ml de água. CÁLCULO ESTEQUIOMÉTRICO H2O C12H22O11 → 2C6H12O6 342g → 2 x 180g 4. Anotar o volume da solução consumida na titulação (V1). caso contrário deve-se refazer a titulação.: Deve-se acrescentar a solução A sobre a solução B.75g → X X = 5 g de redutores Observa-se experimentalmente que utilizando 5ml da solução A e 5ml da solução B. São constituídos por complexos de glicose e frutose com aminoácidos e/ou derivados.ARI . mas contudo não são convertidas em álcool ou seja. reduz-se ficando descorada.: Para hidrolizar a sacarose pode-se usar ácido clorídrico ou a enzima invertase. Essa determinação baseia-se na redução do íon cúprico em cuproso pelo grupo redutor do açúcar e também na redução do indicador utilizado (azul de metileno). Esse método é adequado para avaliar os açúcares existentes em caldo-de-cana ou em melaço. Definições Técnicas Açúcares Redutores Simples (ARS) correspondem à concentração de glicose e frutose existentes na matéria-prima na forma redutora.PRÁTICA: 03 OBJETIVOS: • Determinar açúcares Redutores pelo método de Eynon-Lane INTRODUÇÃO: Os açúcares redutores de uma amostra açucarada podem ser determinados pelo método volumétrico da dupla redução de Eynon-Lane. que na ausência de Cu++ livre. Açúcares Redutores Fermentescíveis (ARF) presentes numa amostra correspondem aos redutores totais menos os redutores infermentescíveis. não fermentam. logo pode-se clarificar a amostra para facilitar a titulação. Açúcares Redutores Totais (ART) correspondem ao teor de glicose e frutose existente na amostra. mais aqueles que são originados da hidrólise da sacarose .é titulada pela solução açucarada. Neste último as impurezas podem interferir no ponto de virada do indicador. ART = ARS + S Obs. H2O SACAROSE →GLICOSE + FRUTOSE H+ Açúcares Redutores Infermentescíveis (ARI) são substâncias de caráter redutor. ARF = ART . A redução é constatada pela formação de óxido cuproso (coloração vermelho-tijolo) quando se faz reagir o licor de Fehling com os açúcares redutores da amostra. A mistura de soluções de Fehling-Soxlet conhecida como licor de Fehling . Tela de amianto. garra. tripé de ferro. bico de Bunsen. diluir para 500ml e deixar em repouso dois dias. • Colocar esta solução na bureta e titular o Licor de Fehling. pipetas volumétricas de 5ml (2) e 10ml (1). banho-maria com controle de temperatura. soluções de NaOH (1N). b) ART • • Pesar quantitativamente 2g de melaço em Béquer numa balança analítica Transferir a amostra para uma balão de fundo chato diluindo com 50 ml de água destilada. • Deixar esfriar e transferir a amostra para um balão volumétrico de 500ml. soluções de HCl (1:1). Completar o volume. Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 500ml usando água destilada. bastão de vidro. solução de fenolftaleína a 1%.5H2O) em água diluir para 500ml Solução B: Dissolver 173g de sal de Rochelle (tartarato de sódio e potássio) e 50g de NaOH em água. * Solução A: Dissolver 34.639g sulfato de cobre (CuSO4. termômetro. c) ARI . funil. • Completar a solução para 500ml. • Levar a um banho-maria à temperatura de 68-70oC (temperatura interna) por 15 minutos. balão de fundo chato 250ml. pérolas de vidro. Azul de metileno: Dissolver 1g de azul de metileno em água destilada e completar para 1000ml. balão volumétrico de 500ml. • Adicionar 10 ml de ácido clorídrico (1:1) ou 5ml de HCl concentrado. frascos de Erlenmeyer de 250ml (6). Tratamento das amostras açucaradas a) ARS • • • Pesar quantitativamente 4g de melaço em Béquer numa balança analítica.MATERIAL E REAGENTES • • Melaço. bureta de Mohr (50ml). Soluções de Fehling A e B*. Colocar esta solução na bureta e titular o Licor de Fehling. proveta de 50ml.: O termômetro deverá também ser lavado para dentro do balão volumétrico. Bequer. balança de precisão. • Neutralizar cuidadosamente com hidróxido de sódio (1N) agitando constantemente. azul de metileno a 1%. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1. Obs. • Adicionar 2 a 3 gotas do indicador fenolftaleína a 1%. Homogeneizar suavemente.3g de (NH4)2SO4. Aquecer até ebulição durante 2 minutos. Dissolver a amostra em 200ml de água. Adicionar 5g de levedura prensada (fermento) dissolvida em 50ml de água. Transferir os sobrenadante para balão volumétrico de 500ml. caso contrário deve-se refazer a titulação. Método de Eynon-Lane • • • • • • • • • • Adicionar 20 ml da solução A e 20ml da solução B (Licor de Fehling) em um frasco de Erlenmeyer e agitar bastante. Filtrar à vácuo ou centrifugar. Usar essa solução para titular 4ml de Licor de Fehling (2ml de A + 2ml deB).20ml. Determinar a média V dos volumes gastos nas duas titulações. Colocar 2 a 3 gotas da solução de azul de metileno a 1% e esperar 20 segundos. Anotar os volumes gastos (V2 e V3). Titular com a solução açucarada da bureta. até obter uma coloração ligeiramente avermelhada. menor do que o volume gasto na primeira titulação e anotar os volumes gastos (V2 e V3). Cálculos: a) ARS 4 g de melaço → 500ml M → V (média dos volumes gastos) M (massa de melaço) → 0. Juntar algumas pérolas de vidro.• • • • • • • • • • • • Pesar 50. Transferir 10 ml do licor de Fehling para um frasco de Erlenmeyer de 250ml e adicionar 50ml de água.0g de melaço. Fazer aferição do balão. Adicionar à solução 0. Deixar fermentar a 30oC durante no mínimo 36 horas.3g de KH2PO4 e 0. 3. Repetir (mais duas vezes). 2. acrescentando a frio um volume da solução a ser analisada. Obs. Anotar o volume da solução consumida na titulação (V1). Obs.05 (fator do licor de Fehling) 100 → ARS 625 ARS (%) = V . Lavar 2 vezes o sedimento com água.: A diferença entre as titulações não deve ser maior que 0.: Deve-se acrescentar a solução A sobre a solução B. b) ART 2 g de melaço → 500ml M → V (média dos volumes gastos) Vx 2 V M = = 500 250 M (massa de melaço) → 0. Comparar os resultados obtidos com o padrão utilizado para o melaço.02 (fator do licor de Fehling) 100 → ARI 200 ARI (%) = V DISCUSSÃO • • • • Especificar as condições de trabalho e os resultados obtidos.05 (fator do licor de Fehling) 100 → ART 1250 ART (%) = V c) ARI 50 g de melaço → 500ml M → V (média dos volumes gastos) M (massa de melaço) → 0. Conclusão. Calcular o percentual de Açucares redutores fermentescíveis (ARF) e o percentual provenientes da inversão da sacarose (S). . Amostras . Quando esse processo é uma fermentação de melaço ou caldo-de-cana para produção de etanol os agentes responsáveis que fornecem melhores rendimentos são as leveduras. nosso objetivo é criar condições favoráveis ao microrganismo agente da fermentação e desfavoráveis aos contaminantes. Por outro lado.PRÁTICA: 04 OBJETIVO: • Realizar um processo fermentativo em batelada para produzir etanol INTRODUÇÃO: A produção de etanol a partir do processo fermentativo tem sido explorado a partir do melaço. O mosto produzido por melaço ou caldo-de-cana pode ser empregado na propagação do Inóculo ou na fermentação para obtenção de álcool etílico. Todo o processo é acompanhado por análises químicas e microbiológicas. pois o pH nem sempre permite acompanhar o processo. b) variação da temperatura. oxigênio e pH devem se adequados ao desenvolvimento do mesmo. Mosto é a denominação que se dá a matéria-prima (melaço. A matéria prima se transforma em mosto após a correção do Brix. denomina-se Inóculo. Os controles químicos mais importantes são: a) variação da concentração do substrato. A elaboração desse produto de em quantidade e condições economicamente viáveis é a finalidade dessa prática. Em muitas destilarias o preparo do inóculo é realizado a partir de fermento prensado para panificação (50g/L) e assim a fase de propagação pode ser eliminada. Assim. O inóculo na prática pode ser preparado a partir de uma cultura “estoque” mantida num tubo de ensaio por propagação sucessivas em volumes crescentes de mosto. Neste caso o microrganismo deverá se adaptar a mostos com concentração gradativamente crescente e as condições de temperatura. Os controles microbiológico incluem exame do inóculo nas diversas fases e do mosto em fermentação. d) desprendimento gasoso. subproduto da indústria do açúcar ou diretamente do caldo-de-cana por ação de leveduras. acidez e adição de nutrientes (se necessário). c) variação da acidez total. Neste caso a esterilização se faz necessária. pé de cuba ou pé de fermentação um volume de células de concentração suficiente de microrganismo capaz de garantir um processo biotecnológico em rendimento satisfatório. para fornecer um elevado teor de álcool. caldo-de-cana ou outros) devidamente preparada para ser fermentada. Quando o mosto é destinado ao Inóculo deverá ser preparado com uma concentração de sólidos solúveis baixa (Brix ≤ 11) para favorecer o crescimento do microrganismo. pH. Já o mosto destinado à fabricação de etanol deverá conter um grau brix maior (18 –22oBrix). e) aumento da concentração do produto da reação. • Pesar os nutrientes: (NH4)H2PO4 . Obs. MgSO4... • Calcular a proporção entre a água e o melaço... Procedimento experimental Equipe A: preparar 200ml de mosto com 5oBrix Equipe B: preparar 1500 ml de mosto com 8oBrix Equipe C: preparar 7500ml de mosto com 11oBrix • Fazer os cálculos da diluição do melaço até o brix desejado de acordo com o esquema recomendado por Cobenze B M A B-M M-A Onde: B = Brix do melaço A = Brix do diluente M = Brix do Mosto (desejado) M ..Cultura de Saccharomyces cerevisiae em forma de fermento prensado ou liofilizada Material e reagentes: • • Balanças. densímetros com escalas de 0 a 10o Brix e de 10 a 20o Brix.... potenciômetro.... • Ajustar o pH para 4 .... • Pesar e dissolver o melaço na água.... espátulas....A = massa do melaço B .. • Confirmar o brix pelo uso de um areômetro.. • Inocular o fermento e incubar . bastão de vidro (3).... (NH4)2HPO4.5 com H2SO4..5g/L de mosto • Dissolver os nutrientes para suplementar o mosto... H2SO4 concentrado.. • Com o auxílio da fórmula Vmosto = Vmelaço + Vágua + Vnutrientes • Calcular o volume de melaço desejado..: Consultar a tabela para obter a densidade do melaço em função do brix. • Distribuir em frascos de Erlenmeyer ou balões esterilizados. termômetro.. balões de fundo chato de 1 ou 2litros (3) e de 6 litros (3)..... Melaço.. 0. Béqueres de 250ml (3) e 500ml (3). 1g/L de mosto MgSO4 .....M = massa do diluente • Fazer conversão do resultado obtido de massa para volume usando para isso a densidade do melaço e da água..... preparar 20 L de mosto com 18oBrix (usar dorna B). H2SO4 concentrado. Equipe B: Cultura pura de Schizocaccharomyces. espátulas. b) variação da temperatura. preparar 30L de mosto com 18o Brix (usar dorna A). subproduto da indústria do açúcar ou diretamente do caldo-de-cana por ação de leveduras. termômetro. Equipe C: CCultura em forma de fermento prensado ou liofilizada. MgSO4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL • Preparar 20-30 litros de mosto de acordo com a metodologia da prática anterior (usar o esquema recomendado por Cobenze). . ou penicilina. (NH4)H2PO4. Os controles microbiológico incluem exame do inóculo nas diversas fases e do mosto em fermentação. AMOSTRAS Equipe A: Cultura pura de Saccharomyces cerevisiae. densímetro de 10 a 20o Brix. c) variação da acidez total. • Inocular o fermento separando uma alíquota para avaliar a viabilidade celular (prática subsequente). Béquer 500ml. Todo o processo é acompanhado por análises químicas e microbiológicas. e) aumento da concentração do produto da reação. Os controles químicos mais importantes são: a) variação da concentração do substrato. • Adicionar o antibiótico (tetracilina ou penicilina) se necessário. • Acompanhar a fermentação de acordo com o quadro a ser fornecido na prática. preparar 20L de mosto com 18o Brix (usar dorna C). microscópio. Assim. bastão de vidro. pois o pH nem sempre permite acompanhar o processo.PRÁTICA: 05 OBJETIVO: • • Realizar um processo fermentativo em batelada para produzir etanol Comparar resultados INTRODUÇÃO: A produção de etanol a partir do processo fermentativo tem sido explorado a partir do melaço. fermentador (dorna). Melaço. lâminas. potenciômetro. tetraciclina. d) desprendimento gasoso. nosso objetivo é criar condições favoráveis ao microrganismo agente da fermentação e desfavoráveis aos contaminantes. MATERIAL E REAGENTES • • Balanças. provetas 250ml. câmara de Neubauer. A elaboração desse produto de em quantidade e condições economicamente viáveis é a finalidade dessa prática. 1. caldeira. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL • • • • • • Colocar água até o nível marcado na cuba (15ml). termômetro. . “Sikes”e “Proof spirit”. EBULIOMETRIA MATERIAL • Tubos de ensaio. AMOSTRAS • • • Mosto em fermentação. condensador. o volume de álcool contido em 100 volumes do líquido alcoólico. tubo específico). Esvaziar a caldeira e resfriá-la. Itália e outro países latinos o teor alcoólico é avaliado por volumetria. Na ebuliometria a amostra é destilada diretamente num ebuliômetro e o teor alcoólico é determinado pelo uso de uma escala (régua) que compara a variação da temperatura de ebulição com o teor alcoólico da mistura. França. Mosto fermentado. A alcoometria ponderal é usada na Alemanha.. Na densimetria o alcoólico geralmente é avaliada por um dos dois processos. Vários alcoômetros são destinados a avaliação do teor alcoólico dentre eles podemos citar o de Gay Lussac. Aquecer o aparelho. em peso ou em volume. Cartier. ebuliômetro (lamparina. fixando o zero com a tempertarua de ebulição da água.Austria.• Guardar na geladeira alíquotas de 50ml retiradas durante o processo fermentativo para determinação do teor alcoólico. 8. o resultado obtido exprime o peso de álcool contido em 100 partes de peso da mistura e no segundo. Nossa prática se deterá a utilização do alcoômetro de Gay Lussac. enquanto que no Brasil. Adaptar o termômetro. anidro nas misturas de álcool e água. régua. Graduar a régua que acompanha o ebuliômetro. No primeiro caso. Leite de leveduras. Russia e paízes nordicos. Fazer leitura quando a temperatura ficar estável. A riqueza alcoólica pode ser avaliada por densimetria ou por ebuliometria. PRÁTICA: 07 OBJETIVO: • Determinação do teor alcoólico INTRODUÇÃO: A alcoometria tem por objetivo determinar o teor de álcool puro. • • • • • • Remover o termômetro da caldeira. Colocar a amostra na cubeta até o 2o traço (50ml). . Após estabilizar fazer a leitura da temperatura. mas caso ocorra. Obs.: Após cada análise lavar a caldeira com água para evitar incrustação. Conectar o termômetro e encher o condensador com água. Acender a lamparina. deve-se ferver durante 5 minutos com uma solução a 20% de hidróxido de sódio. Localizar na régua o teor alcoólico da amostra. 3 Determinação analítica do produto (i) Teor alcoólico 3. CONCLUSÃO .1. pH (ii) Açúcar redutor simples (iii) Açúcares redutores totais (iv) Açúcares redutores infermentescíveis 2. RESULTADOS DE DISCUSSÃO 4.2. MATERIAIS E MÉTODOS 2. INTRODUÇÃO 2.MODELO DE RELATÓRIO DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA Equipe: Nome dos alunos participantes: Fermentador: 1. Condições da Fe rmentação (i) Microrganismo (ii) Inóculo (iii) Mosto (iv) Fermentador (Dorna) 2. Determinações analíticas no melaço (i) Brix.