Universidad de ColimaFacultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias Licenciatura en Biología Extracción y caracterización enzimática de amilasas de Aspergillus sp. Aislado de masa de maíz. Integrantes Eduardo Chávez Sahagùn. Eduardo Duarte Álvarez. Blanca I. Mendoza Macias. Adriana M. Montes Picaso. Joel F. Morfín Méndez. Marìa Daniela Muñiz Anguiano. dicho ión es necesario para llevar acabo la catálisis. polisacáridos y lípidos perdiendo así su función en condiciones extremas o a catalizar mas eficientemente en ciertas condiciones optimas . estos últimos son los organismos más importantes en su producción a nivel industrial.Tecomán. sino que además son absolutamente necesarias para la vida. si cuentan con un ión de calcio unido covalentemente a cada una de sus moléculas. (Vargas y Silver. actúan sobre los enlaces α-(1-4) y/o α (1-6). colima a 19 de junio del 2007 I INTRODUCCIÓN Las enzimas son proteínas con propiedades catalíticas. es más abundantemente en semillas de cereales y tubérculos. (Vargas A y Silver L. Si bien las amilasas no cuentan con coenzimas. Es el principal polisacárido de reserva de origen vegetal. pudiendo llegar a desnaturalizarse o degradase particulares a cada enzima. cortando cadenas de azucares en cadenas mas cortas. plantas. bacterias y hongos. en su forma nativa esta constituido por α-amilasa y amilopectina. (Castro. Una de las características fundamentales de los hongos es su alimentación misma que realizan por absorción: primero secretan hacia el medio exterior enzimas digestivas (exoenzimas) que degradan moléculas grandes tales como proteínas. Así mismo factores ambientales tales como el pH y la temperatura alteran la función de las enzimas. El almidón es un polisacárido constituido principalmente por largas cadenas de glucosa. 2002). La actividad óptima de las amilasas se lleva acabo a un pH de 4. 2004). Las enzimas al ser proteínas están formadas por aminoácidos. es decir que aceleran reacciones químicas. sin embargo algunas requieren de iones inorgánicos (cofactores) y/o de moléculas orgánicas derivadas de vitaminas (coenzimas) para poder cumplir con su función de catalizadoras. Las amilasas pueden ser producidas por una gran variedad de seres vivos que incluyen a animales. (Nelson y Cox. Las amilasas son enzimas que hidrolizan el almidón. et al). entre cuyas propiedades se encuentran su gran especificidad y la presencia de uno o más sitios activos.8 a 6.5. 2002). Las enzimas no solo se encuentran en todos los seres vivos. Cubas Agitadores Agitadores magnéticos Incubadora Bolsas para esterilizar Porta y cubre objetos Embudos 15 Cajas de Petri 1 Pliego de papel filtro 2 Platos calientes 1 Termómetro Parafilm 2 Matraces de 500 mL. . Papel filtro 1 Balanza analítica 1 Balanza granataria. con un gran arsenal enzimático. y con gran cantidad de especies saprobias. 4 2 2 2 1 2 5 2 Vasos de precipitado de 500 mL. 3 Espátulas 2 Probetas de 100 y 10 mL.en moléculas mas pequeñas fáciles de absorber a través de su pared celular y su membrana plasmática.1996) El género Aspergillus es uno de los grupos de hongos con mayor distribución y con mayor variedad de formas de alimentación que hay. algunas son de importancia industrial. aisladas de masa de maíz. Mims y Blackwell . algunas parásitas de vegetales. (Alexopoulos. (Mier y Toriello 2002) II OBJETIVO Extraer y caracterizar enzimáticamente las amilasas aisladas de Aspergillus sp. animales y humanos. III MATERIALES Y MÉTODOS a) Materiales 1) Material de laboratorio 28 Vasos de precipitado de 40 mL. L) Dextrosa Monohidratada (J. PM: 136.V) Peptona de caseína (BECTON DICKISON DE MÉXICO S.A DE C.T BARRER S.1 Cámara de flujo laminar. S DE R. DE C. DE C.V) Ácido clorhídrico (ANAL Y TAKA DE MÉXICO S.V) Agar nutritivo (BECTON DICKISON DE MÉXICO S. DE C. 99.A.L.A DE C. DE C. PM 36.A.V.A.V MONTERREY N. 1 Mechero de Bunsen 2 asas bacteriológicas 2 agujas de disección Algodón Gasas Cinta Autoclave Papel extraza 1potenciometro 1 piceta 2) Reactivos Extracto de levadura (BECTON DICKNSON DE MÉXICO S.V) Cloruro de sodio (QUÍMICA DINÁMICA S.V.V XALOSTOC.09 g/mol.46 g/mol) Acetato de sodio (FERMONT.08 g/mol) Glicerina (HYCEL DE MÉXICO SA.5%) Alcohol al 70% Agua Tween 80 3) Material Biológico Masa de maíz Almidón soluble Salvado de trigo b) Métodos 1) Preparación de soluciones . PM: 92. MÉXICO) Fécula de maíz (UNILEVER DE MEXICO. DE C.A DE C. 5 g de NaCl.)/100 Masa de Agar .)/100 Masa de extracto de levadura =3.75 g de extracto de levadura.5%) (250 mL.agar = 5 g En un matraz Erlenmeyer se agregaron 250 mL de agua junto con 3.75 g -Peptóna de Caseína al 2% p/v % p/v = masa del soluto/v solución * 100 Masa del soluto= (2%) (250 mL.-Agua con glicerina al 10% v/v %v/v = v soluto/ v solución * 100 v soluto = 10 mL *100/ 100 v soluto = 10 mL.)/100 Masa de dextrosa = 5 g -NaCl al 5% p/v % p/v = masa del soluto/v solución * 100 Masa del soluto= (5%) (250 mL.5 g -Agar-agar al 2% p/v % p/v = masa del soluto/v solución * 100 Masa del soluto= (2%) (250 mL. de glicerina y 90 mL. lo cual se agito en un plato caliente.)/100 Masa de peptóna = 5 g -Dextrosa al 2% p/v % p/v = masa del soluto/v solución * 100 Masa del soluto= (2%) (250 mL. 5 g de dextrosa 5 g de agar – agar y 12. 5 g de peptona de caseína.)/100 Masa de NaCl = 12. -Medio YPD Extracto de levadura 15% p/v % p/v = masa del soluto/v solución * 100 Masa del soluto= (1. En un matraz Erlenmeyer se colocaron 10 mL. . de agua. 025 moles m= (PM) (n) m= (0.5 mL En un matraz Erlenmeyer se mezclaron 0.125 g -Acetato de sodio (CH3COONa) 0.1M n= (M) ((Lslon) n = (0.25 L) n= 0.se mezcló con un agitador magnético.05% p/v % P/V= masa del soluto/v solución * 100 Masa del soluto= (0.)/100 Masa de almidón =0. se disolvió usando un agitador magnético -Fécula de Maíz Se agregaron 60 g de fécula de maíz (maizena) en 500 mL de agua. -Tween 80 al 0.)/100 Masa de NaCl =6 g En un vaso de precipitado se agregaron 600 ml de agua junto con 6 g de NaCl.05 g de CH3COONa .5 mL de Tween 80 con 500 mL de de agua.1% v/v % v/v= volumen de soluto / v solución * 100 Volumen soluto= (0.)/100 Volumen de Tween 80 = 0.025 moles) (82 g/mol) m = 2.1 M) (. -NaCl al 1% p/v % p/v = masa del soluto/v solución * 100 Masa del soluto= (1%) (600 mL.1%) (500 mL. Posteriormente se esterilizó en la autoclave. posteriormente se esterilizó en la autoclave y se vertió en 10 cajas de Petri. -Solución de almidón tamponada: Almidón 0. de mezcló utilizando un agitador magnético.05%) (250 mL. 19g de NaCl En un matraz Erlenmeyer se colocó 250 mL de agua estéril.05 de CH3COONa y 0. b) Medio de cultivo YPD A cinco cajas de Petri esterilizadas se les agrego 20mL de YPD. 2. de agua con glicerina al 10% v/v.19 g NaCl. fijándolo con cinta adhesiva) dentro de una caja de Petri a la cual se agregó 20 mL. por ultimo se coloco una pequeña muestra de masa de maíz. Caro.15M)(. 2) Aislamiento del hongo Se aisló el hongo apartir de masa de maíz mediante los siguientes métodos: a) Cámara húmeda El método de cámara húmeda se lleva acabo con la colocación de un caballete (sobre un triangulo de cristal se coloca un porta objetos. Piñeros). 2. este proceso se realizó en una cámara de flujo laminar .Se incubaron durante 7 días a 28 °C (Castro.0375 moles m= (PM) (n) m= (0. los cuales ya habían sido previamente esterilizados durante 15 min. La preparación antes descrita se incubó durante 5 días a 28 °C.15M) n= (M) (Lslon) n = (0.-NaCl (0.453 g/mol) m = 2. Navas. se disolvieron y mezclaron usando agitador magnético. se coloco una pequeña muestra de masa de maíz a cada caja de petri. 3) Identificación del hongo . una vez gelificado este. a 15 libras de presión.25L) n= 0.0375moles) (58.125 g de almidón. el proceso se repitió . Una vez obtenido el crecimiento del hongo fue observado en el microscopio. para ello tuvimos que separar el cubre y el portaobjetos. así mismos se sembraron otras 5 cajas con esporas de otra sepa de Aspergillus aislada por otro equipo.Se realizó por medio de un cultivo monospórico (la finalidad de este fue para que el crecimiento del hongo fuera en las paredes del cubre y portaobjetos para una fácil observación en el microscopio). Piñeros). Luego se filtro la mezcla utilizando un embudo y papel filtro. (Castro. Una vez realizado lo anteriormente descrito. se tomaron 70 mL. Se tomaron 100g del salvado de trigo y se colocaron en un vaso de precipitado con 295 militros de solución de cloruro de sodio. Una vez identificado en hongo. con una aguja de disección estéril se tomo un muestra de nuestro hongo y fue inoculado por los cuatro lados del trozo de YPD. cada una de las bolsas fue inoculada con las esporas de ambas sepas respectivamente e incubadas por 7 días a 28°C (Castro. el cual consistió en poner un trozo de YPD portaobjetos que esta fijado al caballete y encima sobre el se colocó un cubreobjetos. 4) Expresión de las amilasas Se esterilizaron dos bolsas con 395 g salvado de trigo en la autoclave por 15 min. Navas. cada vez que se tomaba muestra del hongo se esterilizaba la aguja de disección. Caro. Piñeros).1%. para mayor obtención de esporas. una vez enfriado el salvado. Después del crecimiento las esporas obtenidas de cada sepa fueron suspendidas por separado en tween 80 al 0. descritas en manuales. dichas preparaciones se incubaron a 28 °C durante 3 días. libros y artículos. a los cuales se les añadió unas gotas de hidróxido de sodio para el aclaración de las estructuras morfológicas. Del filtrado y se repartió en 14 fracciones de 5 mL. posteriormente la mezcla fue agitada durante 24 hrs. 5) Extracción de la enzima Las enzimas fueron extraídas del salvado de trigo mediante la utilización de una solución de cloruro de sodio. después fueron observadas en el microscopio y se hicieron las comparaciones con imágenes y características del Aspergillus sp. a 8° C. se resembró en 5 cajas de YPD. a 121°C. Caro. Navas. aplicando entonces a las muestras extraídas lugol y comparando la coloración obtenida con muestras de solución de fécula y de almidón sin extracto enzimático y coloreadas con lugol. En primer lugar se sabe que la amilosa. debido a la acción de las amilasas. IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se tiño una muestra de solución de fécula de maíz y una muestra con solución de almidón tamponada con lugol. Al interactuar la amilasa con el almidón. sin embargo a las muestras a las que si se les aplico el extracto enzimático se observo que conforme pasaba el tiempo las muestras incubadas adquirían una coloración mas clara progresivamente.30. como consecuencia hay menos lugol interactuando con la parte interna del espiral que forme cada cadena.5 10. . pH 5) y 10 mL de fécula de maíz comercial respectivamente (así que tenemos siete fracciones de cada cepa con solución taponada y otras siete con solución de fécula de maíz comercial). extrayendo al termino de cada periodo una fracción incubada con almidón y otra con fécula de cada cepa respectivamente. Houtman Y Atalla Almidón soluble . Navas. 90 y 120 minutos. al aplicar lugol el yodo contenido en este interactúa con la parte interna del espiral de la amilosa provocando una coloración púrpura oscura.5% p/v. obteniendo así un total de 28 fracciones de extracto enzimático (14 de cada cepa) (Castro. a cada uno de los cuales se les aplicaron 10 mL de solución taponada de almidón (almidón 0. causando que sea apreciable una coloración más tenue. corta las cadenas del mismo en segmentos más cortos. 6) Actividad enzimática: Cada uno de los grupos de extractos enzimáticos fueron divididos en dos grupos de siete fracciones (cada fracción contenía 5 mL). Piñeros). componente del almidón en solución acuosa adquiere una estructura en forma de espiral. Posteriormente fueron incubadas a 37 °C durante: 1. (Xiaochun . 1996).por separado para ambas sepas aisladas. Caro.60. en la muestra de solución de fécula de maíz se observó una coloración púrpura obscura y en la solución tamponada una coloración café claro. España. . Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano. Bogotá.100. aislado en semillas de lentejas. T (2002) Bioquímica. pp. Perú. . sabemos que sigue actuando continuamente la amilasa. Navas C. Toriello C. México.Alexopoulos C. H.. 29 . Atalla R. VI BIBLIOGRAFÍA . . 5ta edición. México. (2002) Selección y evaluación del genero Bacillus productoras de amilasa en cultivo sumergido. 1era edición. 4a edition. 28 -Nelson D. Mims C. mismas que pueden ser extraídas y observada su actividad in-vitro..196222.Castro C. (1996) The complex of amylase and iodine. 101. Houtman C.. Blackwell M. University of Wisconsin. y M. así mismo al observarse la disminución de la coloración.J.L. Piñeros Y.Roskosk R. Chemical Engineering Department.Xiaochun Y. Editorial Reverte. pp. Ulloa M. One Gifford Pinchot Dr. Forest Products Laboratory. V CONCLUSIÓN Los hongos del genero Aspergillus son capaces de producir amilasas. (2002) Hongos microscópicos saprobios y parásitos: métodos de laboratorio. . Universidad Nacional de San Marcos. 4ª edición. SA. -Mier T. pp. Colombia. Cox (2004) Lehninger principios de bioquímica. (1996). pp. Barcelona pp. Silver L.Observado el proceso anteriormente mencionado significa que hay actividad amilolitica con el almidón. Editorial UAM-Xochimilco. . Editorial omega.Apaza V. INC. Obtención de amilasas fúngicas a partir de Aspergillus sp. Editorial MCGraw-Hill interamericana. 190-215. Canadá. (2001) Bioquímica.W. Caro O.. Madison. Editorial John Wiley y Sons.M.Stryer B.
Report "Extracción y caracterización enzimática de amilasas de Aspergillus sp. Aislado de masa de maíz"