EXTRACCIÓN ADN PLASMÍDICORef. ADNPLASMIDO (25 extracciones) 1. OBJETIVO DEL EXPERIMENTO El objetivo de este experimento es introducir los principios de la extracción de ADN plasmídico a partir de células bacterianas. Los estudiantes aprenderán la estructura y función de los plásmidos de ADN. 2. INTRODUCCION Los plásmidos son fragmentos extracromosómicos de ácidos nucléicos (ADN o ARN) que aparecen en el citoplasma de algunos procariotas. Son de tamaño variable, aunque menor que el cromosoma principal. Cada bacteria puede tener uno o varios a la vez. Los plásmidos tienen una conformación variable que puede ser lineal, circular o con estructura superenrrollada (supercoiled DNA). Los plásmidos son herramientas muy útiles en ingeniería genética para la transformación génica y la manipulación genética de procariotas y eucariotas. Cada tipo de plásmido presenta un control de su replicación diferente. Son muy útiles para sintetizar en grandes cantidades proteínas de interés.De forma natural los ADN plasmídicos existe como molécula superenrrollada (Forma I). otro grupo con genes de fertilidad. esta estructura en la célula es causada por la acción de unos enzimas llamados girasas y esto tiene importantes consecuencias biológicas. mediante un procedimiento conocido como transformación. Los plásmidos se pueden clasificar siguiendo distintos criterios. este ADN superenrrollado está doblado en sí y tiene una estructura más condensada y enredada que el mismo ADN cuando está relajado. Posteriormente se transforma un tipo de bacteria con el plásmido modificado y se seleccionan las bacterias transformadas que produzcan las sustancias deseadas. genes de producción de sustancias tóxicas para otras bacterias o genes que codifican enzimas útiles para degradar sustancias químicas. Uno de estos criterios es el tipo de genes que portan. El proceso de transformación comienza con la selección de un plásmido adecuado. El tipo de genes que portan los plásmidos es variado. esto se debe a que el ADN en Forma I no es tan estable como las formas circulares o relajadas. . el que porta genes de virulencia o el grupo que porta genes de resistencia. Estas bacterias se cultivan en sistemas de tipo biorreactores para su crecimiento en grandes cantidades. tratándose generalmente de genes que aportan ventajas adaptativas a la bacteria que los porta: genes de resistencia a antibióticos. En este proceso se eligen plásmidos con características que permitan seleccionar las bacterias transformadas en un medio de cultivo como por ejemplo plásmidos con genes de resistencia a antibióticos o con genes de enzimas que sinteticen compuestos coloreados. la molécula pasa a una forma relajada llamada ADN circular (Forma II). El ADN plasmídico superenrrollado purificado con el tiempo y lentamente desarrolla nicks y se convierte en Forma II. El ADN purificado debe ser un círculo cerrado covalentemente y estar en forma de estructura superenrrollada. Las 2 cadenas del ADN circular no están cerradas covalentemente y se mantienen unidas por puentes de hidrógeno entre las bases. Aunque los plásmidos no pueden sintetizar una envoltura proteica y se transfieren con dificultad de una célula a otra se ha hipotetizado que podrían ser los precursores de los primeros virus. en el que se introducen los genes que se quieren expresar con protocolos específicos que usan enzimas de restricción y DNA ligasa. Si uno o más fosfatos unidos al esqueleto del ADN superenrrollado son eliminados o rotos (nicks). existiendo plásmidos cuya replicación está acoplada con la replicación del cromosoma bacteriano y otros cuya replicación no está relacionada con la del cromosoma. Así se define el grupo de plásmidos con genes de degradación de sustancias. Los plásmidos empleados en ingeniería genética se llaman vectores. como la insulina o los antibióticos. 3. Además este plásmido confiere resistencia al antibiótico ampicilina ya que contiene el gen que codifica para la lactamasa que inactiva la ampicilina. Sistema de electroforesis básico (aparatos y reactivos). COMPONENTES Pellets bacterianos que contiene el 25 unidades plásmido pGAL DANAGENE Plasmid Mini Kit 25 extracciones Componentes necesarios y NO suministrados Microcentrifuga. El plásmido pGAL contiene el gen de E. Sistema de detección de ácidos nucleicos. Microtubos y micropipetas.En este experimento el plásmido pGAL de 6751 pares de bases que ha sido modificado por ingeniería genética será aislado a partir de células bacterianas que se suministran con el kit. esto se debe a que cuando la galactosidasa rompe el X-GAL se produce un producto azul.coli que codifica para la galactosidasa que en presencia del galactósido artificial X-GAL producirá colonias de color azul . esta propiedad permitirá distinguir en una placa de cultivo que células bacterianas tienen el plásmido pGAL. . Etanol 100%. 2. Los contaminantes son eliminados con un tampón de lavado y el ADN plasmídico es eluido con un tampón de elución. 2. Si no se disponen de un sistema básico de electroforesis. PRÁCTICA Esta práctica. contactar con el departamento técnico de DanaGen-BioTed bioted@arrakis. el ADN plasmídico se une a las membranas de sílica de unas columnas presentes en el kit. que permite aislar el plásmido pGAL de células bacterianas. 3.4. Plásmido pGAL. Plásmido pGAL. 5. se lleva a cabo con el kit comercial DANAGENE Plasmid Mini Kit. 1. 4. SBRY Green. Tinción realizada con nuestro sistema NO TÓXICO DANABLUE . etc) se le puede suministrar nuestro DANABLUE o GELSAFE (necesita un transiluminador UV). Seguir las instrucciones de trabajo incluidas en el kit. En presencia de sales caotrópicas. Plásmido pGAL. RESULTADOS M 1 2 3 4 M: Marcador peso molecular. 1. Plásmido pGAL. Este kit permite la extracción del ADN plasmídico utilizando un método denominado de lisis alcalina y tratamiento con RNAsa que permiten la obtención de un lisado celular claro con mínima cantidad de ADN y ARN contaminante.es que le podrá suministrar todos los materiales necesarios para llevar a cabo la electroforesis de los resultados de la extracción de ADN plasmídico. Si no se dispone de un sistema de visualización del ADN propio (Bromuro de etidio.