ImunologiaMétodo de Pesquisa e Diagnóstico Imunológico Assuntos: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA); radiology Imaging Associates (RIA); Western Blotting; Imunoprecipitação; Soroaglutinação; Imunoeletroforese; Imunofluorescência. 1 MÉTODOS PESQUISA SOROLÓGICOS DE DIAGNÓSTICO E Os métodos utilizam amostrar de fluidos biológicos de pacientes suspeitos para diagnóstico laboratorial. Dependendo da pesquisa que se faça, o método é classificado como Direto ou Indireto. O primeiro procura por antígeno (Ag) do agente infeccioso; o segundo, por anticorpo (Ac), responsáveis por combater a infeção. As forças de ligação que estão envolvidas nas reações sorológicas antígenoanticorpo são fracas e estabilizam a ligação para formação do complexo. São elas: pontes de hidrogênio; ligações iônicas; forças hidrofóbicas; forças de Van der Waals. Os fatores que interferem com a ligação para formação do complexo Ac-Ag são: Especificidade dos anticorpos; Afinidade dos anticorpos; Avides dos anticorpos; Concentração de anticorpos e antígenos; Classe dos anticorpos envolvidos; Pureza dos antígenos utilizados. 1.1.1.1Afinidade Afinidade é a força resultante de todas interações não-covalentes entre um único sítio de ligação do anticorpo e um único epítopo do antígeno. Sua intensidade depende do grau de complementariedade entre as duas moléculas. Assim, anticorpos de baixa afinidade ligam-se de maneira fraca e tendem a se dissociar mais facilmente, por outro lado, os que possuem alta afinidade, apresentam ligações mais forte e duradouras. 1.1.1.2Avidez Forças que resulta de interações múltipla entre uma molécula de anticorpo e um antígeno (com todos os seus epítopos). Quanto mais sítios de ligações possui um anticorpo para determinado antígeno, maior será a sua avidez. Exemplos: Fragmento de Fab < Ig monomérica < Ig dímero < Ig pentâmero. Em geral, quanto maior a avidez melhor seu efeito biológico final (ex.: reconhecimento de antígeno complexo na superfície de um patógeno). Observa-se também que a baixa afinidade apresentada por um anticorpo poderá ser compensada pela sua avidez. 1.1.1.3Concentração Quando as concentrações de antígeno e anticorpo são equivalentes, formam-se complexos de tamanho que permite a sua visualização; nestas concentrações encontra-se a zona de equivalência. Quando o plasma ou soro a ser analisado apresenta uma alta concentração de anticorpos, estes se associam aos antígenos, formando pequenos complexos, não visualizados por precipitação; nesta concentração de anticorpos ocorre o efeito de pró-zona. Quando o anticorpo está pouco concentrado em relação ao antígeno, também são formados pequenos complexos e ocorre o efeito denominado de pós-zona. Figura 01. Apresentação esquemática dos efeitos prozona, zona e pós zona. Em geral, outras variantes também devem ser considerara em razão de sua influência na ligação Ac-Ag: o pH do meio onde ocorre os choques de interação antígeno e anticorpo, quanto mais ácido, menos efetiva é a ligação; a temperatura torna as reações mais rápidas, mas deve ser considerara em razão da capacidade de desnaturação que pode provocar entre os envolvidos; e o tempo de reação, Especificidade= Negativos Encontraodos peloTeste NegativosTotais Portanto. a quantidade mínima de anticorpos (ou antígenos) detectável.1. Nestes ensaios. proteção contra diferentes cepas do vírus da gripe não contidas na vacina. mas que por apresentar estruturas antigenicamente análogas mimetiza o antígeno que evocou a resposta. Sensibilidade= Verdadeiro Encontrados peloTeste PositivosTotais A especificidade é a fração dos que obtiveram resposta negativa entre aqueles que não possuam a característica (doença).2. proteção alcançada com a vacinação contra um dado microorganismo e contra outro antigenicamente relacionado: vacina contra gripe. 1. com maiores chances de acertar quando. proteção contra M.4Reação Cruzada Termo empregado quando um anticorpo induzido especificamente para um antígeno A é capaz de reconhecer um antígeno B contra o qual este não foi especificamente gerado. Entretanto.2. enquanto outro teste com maior especificidade diz.1Título Quando os ensaios não são quantitativos. quando um resultado é negativo.quanto maior o tempo de exposição.2 Conceitos Básicos em Sorologia 1. isto é.1. a proporção de resultados negativos verdadeiros. a produção de anticorpos contra um determinado antígeno pode ser correlacionada às diluições dos soros utilizadas para a realização do teste.2Teste de Referência ou Padrão Ouro Teste já conhecido e utilizado para diagnóstico.2. A esta diluição dá-se o nome de título do anticorpo.1. um teste com alta sensibilidade diz com maiores chances de acertar quando afirma um resultado positivo.1. a proporção de resultados positivos verdadeiros. a reação cruzada pode ser interpretada como benéfica (ex. com o qual uma nova metodologia deve ser comparada durante sua padronização. em algumas situações. 1.3Sensibilidade e Especificidade A sensibilidade se refere a fração dos que obtiveram resultado positivo entre aqueles que possuam a doença. as partículas antigênicas são misturadas com diferentes diluições do soro do paciente e considera-se como resultado de produção de anticorpos a maior diluição em que ocorre a visualização (precipitação ou aglutinação) da reação antígeno-anticorpo. 1. BCG. . 1.1. É também utilizado para o limiar de detecção de um método.2. É importante ressaltar que a resposta imune adaptativa tem como característica primordial a especificidade. mais fortes são as ligações formadas e maior a probabilidade de positivar. isto é. O conceito de exatidão (ou acuidade) refere-se ao grau de concordância de uma medida com seu valor alvo. em contrapartida. Na base dessa analogia está a ideia de que.6Reprodutibilidade A reprodutibilidade de uma experiência científica é uma das condições que permitem incluir no processo de progresso do conhecimento científico as observações realizadas durante a experiência. assim como o objetivo de um atirador é atingir o centro do alvo.7Limiar de Reatividade (ou Cut Off) O limiar de referência ou cut off do teste é o ponde de corte para uma variável acima do qual uma característica passa a ser considerara positiva. 1.5Precisão e Exatidão Precisão indica o quanto as medidas repetidas estão próximas umas das outras. apresentar resultados semelhantes. 1. Laboratorialmente. Essa condição origina-se no princípio de que não se pode tirar conclusões senão de um evento bem descrito. provocado por pessoas distintas. isto é. Esquema representativo de como podemos relacionar os dois conceitos entre si numa afiguração representativa. Figura 02. a reação cruzada pode determinar um resultado falso positivo. . quanto mais próxima do valor verdadeiro correspondente. ou reprodutibilidade). de erros de julgamento ou de manipulações por parte dos cientistas.tuberculose e M.2. é usual fazer analogia entre o processo de medição e um exercício de tiro ao alvo.1. etc.).1. Essa condição permite se livrar de efeitos aleatórios que podem afetar os resultados. Em outras palavras. Ou seja. A figura 02 ilustra quatro resultados possíveis em um teste de tiro.2. 1. repetida diversas vezes. leprae. uma medida é precisa se. o objetivo da medição é determinar o valor verdadeiro do mensurando. Para compreender melhor os conceitos de exatidão e precisão. que aconteceu várias vezes.1. referese somente ao grau de dispersão da medida quando repetida sob as mesmas condições. mais exata é a medida. é o valor mínimo que se precisa alcançar para considerar um paciente positivo.2. O conceito precisão (ou fidedignidade. dependente de anticorpo. Na zona de transição estão os falsos negativos e os falsos positivos. C4 e C2. um hexâmero no qual estão ligadas as proteases C1r e C1s. Percebe-se o cut off como limiar entre a consideração de um indivíduo doente e outro saudável. Existem 3 vias de ativação: (1) Clássica. formando uma nova enzima. 2 O SISTEMA DO COMPLEMENTO O sistema do complemento consiste em proteínas séricas (inativas na circulação) e de superfície celular.1. o C2b. em C4a e C4b e C2a e C2b respectivamente. um maior (b) que permanece no local de ativação e um menor (a) que segue para a fase fluida. Após a ligação do anticorpo a um antígeno multivalente. o complexo antígeno-anticorpo-C1q promove a ativação enzimática dos dímeros C1r e C1s. A protease C1s cliva as moléculas subsequentes da cascata. De modo geral. visando à eliminação de agentes infecciosos. 2 e 3) ou CH3 (IgM) dessas imunoglobulinas interagem com C1q. sendo sintetizadas prioritariamente por células do fígado e macrófagos teciduais. A primeira ondulação é o estado de saudável e a segunda o doente.Figura 03. a C3 convertase (C4b2b). 2.1 VIAS DO SISTEMA COMPLEMENTO 2. As proteínas do sistema do complemento correspondem a aproximadamente 5% das globulinas do soro. O fragmento C4b liga-se à parede de patógenos ou à membrana celular e. os componentes clivados originam dois fragmentos. formando complexos com atividade proteolítica que amplificam a fagocitose e a resposta inflamatória. ambas independentes de anticorpo. Quando ativadas.1 Via clássica Os domínios CH2 (IgG1. Esse . interagem entre si. (2) Lectinas e (3) Alternativa. em seguida. . que cliva C5 (C5a e C5b). Vias de Ativação do Sistema do Complemento. as 3 vias levam a ativação do C3 e geração da C5 convertase. O C3b é instável em fase fluida e pode ser hidrolisado se permanecer solúvel. Lectinas e Alternativa. As vias de ativação do sistema do complemento compreendem a via Clássica. Assim.Mannose binding lectin) inicia a ativação do complemento por meio da ligação à manose presente na parede de algumas bactérias (ex. Escherichia coli. moléculas indispensáveis para a formação do complexo de ataque à membrana (MAC – “Membrane Attack Complex”). Candida albicans).1.complexo proteolítico cliva a molécula C3 (C3a e C3b). com subsequente incorporação e clivagem do fator B (Ba e Bb) pelo fator D. o C3b pode ligar-se à parede de patógenos e iniciar a ativação da via. O complexo formado é a C3 convertase (C3bBb) da via alternativa. O C3b formado pode ligar-se ao complexo C4bC2b. ambas independentes de anticorpo. 2.1. ocorre clivagem espontânea em baixas taxas de C3 em C3a e C3b.3 Via alternativa Fisiologicamente. dependente de anticorpo. Esse complexo cliva C3 (C3a e C3b) promovendo elevada produção de C3b. Por outro lado. formando a C5 convertase (C4bC2bC3b). . Figura 00. análogas ao C1r e C1s. a MASP2 cliva C4 (C4a e C4b) e C2 (C2a e C2b) e o restante da cascata é semelhante ao da via clássica. 2. clivando C5 (C5a e C5b) que atua na fase tardia do sistema (C5b-C9) (figura 00). que pode ligar-se à parede de patógenos ou ainda formar a C5 convertase (C3bBbC3b) da via alternativa. Essa proteína é estruturalmente semelhante ao C1q da via clássica e tem as proteases MASP1 e MASP2 acopladas à MBL. o qual é estabilizado pela properdina.2 Via das Lectinas A proteína ligadora de manose (MBL. respectivamente. Mesmo sendo ativadas por diferentes maneiras. finalmente.1. Formação comum das três vias do sistema do Sistema Complemento. lise celular. C7 e C8. há o recrutamento das proteínas C9. influxo de água e íons e. Em seguida.4 Complexo de ataque à membrana A formação do MAC é iniciada com o fragmento C5b ligando-se às moléculas subsequentes C6. que se polimerizam e formam o MAC. Figura 00.2. Estruturação com Complexo de Ataque a Membrana. promovendo a formação de poros na membrana celular. . Desse modo. é necessário que haja a regulação da ativação desses componentes.4 Citólise A lise de organismos estranhos ou de células-alvo é mediada pelo MAC.2. MCP e CR1 Membrana Inibem a formação da C3 convertase da via clássica deslocando C2b de C4b. (Inflamação – Resposta Imune Inata) 2. promovendo a desgranulação de mastócitos. que precisam ser eliminados.2. existe nas superfícies celulares ou no plasma de mamíferos uma série de proteínas reguladoras que desempenham essa função: Regulador Localização Função Doença relacionada Inibidor de C1 (C1 INH) Plasma Inibe a atividade proteolítica de C1r e C1s Angiodema hereditário DAF. recobrem a superfície de microrganismos para que os mesmos sejam mais facilmente fagocitados. A interação desses produtos com seus respectivos receptores C3aR e C5aR.2. a interação antígeno-anticorpo pode levar à formação de imunocomplexos.1 Opsonização e fagocitose O C3b. Hemoglubinúria Paroxistica Noturna . C3b e C4b ligam-se ao receptor CR1.2. 2. Em conjunto. Para isso. que liberam aminas vasoativas e leucotrienos no sítio infeccioso. C4b e o iC3b são opsoninas. 2.2 FUNÇÕES DO SISTEMA DO COMPLEMENTO Para que o sistema do complemento exerça suas funções efetoras no sistema imunológico. presentes em células endoteliais e granulócitos. ou seja.3 PROTEÍNAS REGULADORAS DO SISTEMA COMPLEMENTO Após a ativação do complemento e realização de suas funções efetoras. com consequente eliminação do patógeno ou célula alvo. é necessário que haja a interação das proteínas do complemento com seus respectivos receptores presentes em diversas células da resposta imune inata e adaptativa. 2. enquanto iC3b liga-se a CR3 e CR4. 2. A fagocitose ocorre quando há interação do fragmento opsonizante com seu respectivo receptor nos fagócitos mononucleares e neutrófilos.2 Estimulação inflamatória Os produtos de clivagem C3a e C5a atuam como anafilatoxinas.3 Remoção de imunocomplexos Nas respostas humorais. A ligação de C3b a esses imunocomplexos facilita a remoção dos mesmos pela ligação de C3b ao CR1 expresso em hemácias. Essas migram para o fígado ou baço carregando os imunocomplexos que são eliminados pelo sistema fagocitário mononuclear. estimula a quimiotaxia de leucócitos. esses eventos contribuem para o processo inflamatório com aumento da permeabilidade capilar e influxo de células. e da via alternativa deslocando Bb de C3b.2. impedindo o acoplamento do fator B. Evasão do sistema imune por Schistosoma. enquanto que antígenos ou anticorpos livres não irão.Fator I Plasma Induz a clivagem de C3b em iC3b tendo como cofatores MCP/CR1 - Fator H Plasma Inibe a formação da C3 convertase da via alternativa através de sua ligação a C3b.4 TESTE DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO Complexos antígeno/anticorpo podem também ser medidos por sua resposta em fixar o complemento. uma vez que o complexo antígeno/anticorpo irá “consumir” o complemento presente no meio. impossibilitando a formação do MAC Infecções por Neisserias CD59 Membrana Liga-se ao complexo C5b-C8 impedindo a ligação de C9 e consequente formação do MAC Infecções por Neisserias 2. . Neisseria gonorrheae e Haemophilus Proteína S Plasma Liga-se ao C7 impedindo que ele se insira na porção hidrofóbica da membrana. Este teste só irá funcionar com anticorpos que fixam complementos (IgG e IgM são os melhores). Testes para complexos antígeno/anticorpo que se baseiam no consumo do complemento são denominados Testes de Fixação de Complemento (TFC ou FC) e são usados para semi-quantificar reações antígeno/anticorpo. é confirmada com a ausência de hemólise (a). algum complemento será consumido e. Figura 00. O antígeno e o complemento são misturados ao soro teste para ser investigado para presença de anticorpos e é aguardada a formação de complexos antígeno/anticorpo. Se complexos antígeno/anticorpo são formados entre o antígeno e o anticorpo em questão. Pela simples medição da quantidade de lise de células vermelhas pelos complexos antígeno/anticorpo pela medição da liberação de hemoglobina no meio. Se nenhum complexo antígeno/anticorpo estiver presente no tubo. se complexos antígeno/anticorpo estiverem presentes eles irão fixar o complemento e consequentemente diminuir a quantidade de complemento no tubo. A presença de patógeno ou sua prévia exposição. é adicionada uma quantidade padrão de células vermelhas sanguíneas. previamente sensibilizadas com anticorpos anti-eritrócitos. No teste negativo o complemento e antígeno adicionados provocam a hemólise (b). nenhum complexo antígeno/anticorpo se formou entre o antígeno e o anticorpo em questão). Após se aguardar a fixação do complemento. Se todo o complemento ainda estivesse presente (i. se este ainda estivesse lá. A quantidade de células vermelhas sanguíneas cobertas por anticorpos é predeterminada para ser suficiente para usar todo o complemento inicialmente adicionado. pode-se quantificar indiretamente os complexos antígeno/anticorpo no tubo.O princípio do teste de fixação do complemento está ilustrado na figura 00.e. quando as células vermelhas cobertas com anticorpo são adicionadas nem todas elas irão lisar. indicada pelo anticorpo. Demonstração das fases do teste de fixação do complemento. Um tubo controle com antígeno e complemento também é preparado. nenhum complemento será fixado.. portanto. . Entretanto. todas as células vermelhas serão lisadas. Testes de fixação de complemento são mais comumente utilizados para pesquisa de anticorpos em uma amostra teste mas eles podem ser modificados para medição do antígeno. presente em indivíduos que apresentaram a infecção e se encontram curados. Sendo que a eficiência desse exame é limitada pela reação de anticorpos de longa duração. observando-se a máxima diluição onde ocorre reação positiva. quando é então realizada uma diluição seriada da amostra. Reagentes especificos conjugados a enzimas). para a analise (anticorpos e anti-anticorpos . Esse exame se baseia na detecção de anticorpos ou de antígenos específicos. Para esse tipo de ensaio são utilizados: Placas de ELISA. Micropipetas. através da reação anticorpo-antígeno. de duas formas as quais são realizadas a partir de amostras sorológicas do paciente: ELISA Direto: técnica utilizada para a detecção de antígeno presente na amostra analisada. 3 ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) O ELISA é uma técnica de Imunoensaio enzimático (EIA) heterogêneo. muito utilizada para diagnostico principalmente por causa de seu baixo custo e por detectar quantidades extremamente pequenas de antígeno ou anticorpos. basicamente.Pode ser um teste qualitativo ou semi-quantitativo. ELISA Indireto: técnica utilizada para a detecção de anticorpos presente na amostra analisada. Esse método diagnostico pode ser feito. realiza-se outra lavagem da placa. . utiliza-se como substrato o peróxido de hidrogênio e cromógenos). Substrato enzimatico.anticorpos para a patologia (uma placa sensibilizada) a ser analisada e seguem-se as seguintes etapas: Coloca-se o soro do paciente nos poços presentes na placa. Se existir presença de anticorpos. assim se formará um complexo: antígeno (ligado à placa) – anticorpo – anti-anticorpo conjugado. Nos casos em que o conjugado é uma enzima. sendo assim. Após esse processo é realizada uma lavagem da placa (essa lavagem é feita usando um tampão de lavagem). para retirar os antígenos não ligados. se existir complexo anticorpo (ligado à placa) – antígeno – anticorpo (conjugado) na placa então haverá produção de cor. adiciona-se um substrato para a enzima (no caso da enzima ser a peroxidase. Tampão de lavagem.2 ELISA INDIRETO O ELISA indireto é uma técnica utilizada para detecção de anticorpo. uma solução que interrompa a ação da enzima para que assim a solução não fique com uma coloração muito forte e atrapalhe a leitura do teste. O substrato adicionado. para retirar os anticorpos que não formaram o complexo. pega-se uma placa contendo . ou seja. que não formou o complexo citado acima. como a peroxidase). Adiciona-se depois um anti-anticorpo conjugado (por exemplo a uma enzima. pega-se uma placa contendo . Por fim adiciona-se uma solução de parada. esses se ligarão aos anticorpos presentes na placa formando um complexo: anticorpo (ligado à placa) – antígeno. 3. 3. Após esse processo é realizada uma lavagem da placa (essa lavagem é feita usando um tampão de lavagem). forma um produto colorido.1 ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE O ELISA direto é uma técnica utilizada para a detecção de antígeno. ao se ligar à enzima do complexo. Solução de parada. esses se ligarão aos antígenos presentes na placa formando um complexo: antígeno (ligado à placa) – anticorpo.aderida na parte solida . O cromógeno e o substrato são adicionados. assim formar-se á um complexo: anticorpo (ligado à placa) – antígeno – anticorpo. Após um período de incubação. Adiciona-se um anticorpo (conjugado) para esse antígeno. Realiza-se outra lavagem. Se existir presença de antígenos. para se retirar o excesso de anti-anticorpo conjugado. para retirar os anticorpos não ligados.aderida na parte solida – antígenos para a patologia a ser analisada e seguem-se as seguintes etapas: Coloca-se o soro do paciente nos poços presentes na placa. sendo assim. A apresentação de cor indica a presença do anticorpo pesquisado.1 Elisa por Competição É uma técnica utilizada para procura de antígenos no sangue do paciente. uma solução que interrompa a ação da enzima para que assim a solução não fique com uma coloração muito forte e atrapalhe a leitura do teste. Realiza-se a lavagem para se retirar o excesso de antígenos não ligados aos sítios dos anticorpos. Observação: no diagnóstico sorológico de doenças infectocontagiosas. por ação do fator reumatoide. IgA ou IgE seja significativa.3. 3. menor é a quantidade de antígeno no soro. isto é. ou seja. caso contrário. quanto maior a intensidade da cor. Adiciona-se o cromógeno e o substrato. Os antígenos competirão pelos sítios de ligação dos anticorpos e aquele que estiver em maior concentração ligará mais. Adiciona-se o cromógeno e o substrato. Adiciona-se um antígeno específico marcando com uma enzima (conjugado) para o anticorpo pesquisado. ocorrerá reação com a produção de cor. e segue as seguintes etapas: Adiciona-se o soro do paciente e em seguida uma solução com antígeno marcado (conjugado). Caso o conjugado tenha se ligado ao anticorpo da placa.3 OUTRO MÉTODO: 3. Exemplos onde o seu uso é intenso: diagnóstico sorológico da Doença de Chagas e da SIDA/AIDS 3. A detecção de IgM por esta técnica pode levar a resultado falso-positivo. A imunoglobulina E formará um complexo o IgG-IgM e manterá a imunoglobulina M aderida no poço. não haverá o desenvolvimento de cor. dependendo da substancia conjugada ao anti-anticorpo utilizado para a realização do procedimento . Lava-se para a retirada do anticorpo não capturado pela igG. autoanticorpo que quase sempre é uma IgM anti-IgG. portanto.4 RESULTADOS Os resultados para o ELISA são analisados de diversas maneira. Por fim adiciona-se uma solução de parada.3. Lava-se novamente. utiliza uma placa com anticorpos específicos aderidos em sua superfície. 3.2 Elisa de Captura É uma técnica desenvolvida para verificar a presença de anticorpo IgM específico no soro do paciente. A intensidade da cor produzida é inversamente proporcional a concentração de antígeno no sangue do paciente. onde a detecção de anticorpos IgG. Prepara-se uma placa com poços contendo IgG monoclonal contra IgM e procede as etapas: Adicionar solução com o IgM para ser pesquisado. Este método se baseia basicamente na reação reversível antígeno anticorpo. Etapas Fixação do anticorpo no suporte sólido. que é justamente a concentração de antígeno que se pretende determinar. estes métodos também exigem que se faça uma curva padrão (usando concentrações conhecidas de At) e comparar estes valores com os encontrados nas amostras desconhecidas. Lavagem. isto é Ac. sendo obtida até mesmo a concentração do antígeno ou anticorpo da amostra. ao invés do antígeno marcado. 4 RADIOIMUNOENSAIO (RIA) Este método usa o antígeno marcado radioativamente e anticorpos para determinar a concentração de antígenos com uma precisão bastante elevada. A luz produzida é inversamente proporcional a concentração do antígeno não marcado. anticorpo marcado (radioimunoensaio de competição com o Ac marcado). . diminuiu. Figura 01. Adição de quantidade determinada de antígenos marcados. dentre outras formas). sendo bastante usada para a determinação da concentração de hormônios. Quadro demostrando a relação das equações de equilíbrio Quando se adiciona o antígeno não marcado (cuja concentração é desconhecida) a reação Ac + At* em equilíbrio com AcAt* será deslocada para a esquerda. Algumas variantes desta técnica podem usar. pois a concentração de um dos reagentes. Como podemos ver na figura 01 o antígeno marcado (At*) compete pelo anticorpo (Ac) com o antígeno não marcado (At) para formar o complexo AcAt (marcado ou não).(por exemplo no caso de uma enzima é utilizado a reação desta com um substrato. no caso de um radioisótopo é utilizada a emissão de radioatividade. fazendo com que a concentração de AcAt* também diminua (segundo a lei de equilíbrio de Le Chatelier). basicamente. duas maneiras: Qualitativa: sendo o resultado positivo ou negativo. Adição do soro teste. Como em outros métodos quantitativos. Assim sendo. Quantitativa: feita com utilização de equipamentos de leitura como Espectrofotômetro ou uma Leitora de Microplacas por Absorbância. sendo o procedimento experimental bastante semelhante. isolando-se o complexo AcAt (marcado ou não) e medindose a radiaoatividade deste complexo (com isso somente detectando AcAt*) será possível determinar At. A leitura do resultado pode ser realizada de. As amostras são resfriadas ou aquecidas rapidamente. As proteínas são então transferidas do gel para uma membrana (tipicamente de nitrocelulose). os pesquisadores podem examinar a quantidade de proteína em uma dada amostra e comparar os níveis entre diversos grupos. O nome Western blot. Também há uma técnica chamada Northern blot. ou as soluções padrão. onde são usados como sonda anticorpos específicos à proteína. As amostras são fervidas de um a cinco minutos em uma solução tampão. com sítio de ligação diferente do sítio do anticorpo de fase sólida. O anticorpo marcado não-ligado é removido por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.1. Após a incubação. desenovelando-a completamente. Como um resultado. com quantidade desconhecida de antígeno.1 MÉTODO DE EXECUÇÃO DO WESTERN BLOTTING 5. 5 WESTERN BLOTTING (IMMUNOBLOTTING) Um Western blot. que serve para a detecção de RNA. uma quantidade fixa de anticorpo é imobilizada em um suporte. amostras podem ser tomadas. deixando-a coberta por uma carga negativa. uma técnica para detecção de DNA desenvolvida anteriormente por Edwin Southern. O SDS então cerca a proteína. para que uma quantidade consistente de proteína possa ser retirada de cada amostra diferente. O resultante é a mistura homogênea dos componentes da célula. tanto de um tecido biológico quanto de uma cultura de células. e pode ser usado da forma que está ou sujeita a centrifugação em uma série de passos para se isolar as frações do material citosóico e nuclear. 5. Medida da radioatividade da fase sólida. Elas são homogenizadas por sonicação (quebra das células por ondas sonoras de alta freqüência) ou por força mecânica.. A partir da resposta obtida. a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva. contendo corante. e o enxofre impede a formação de pontes de dissulfeto na proteína. A solução teste.1 Preparação do Tecido Tipicamente. Essa técnica usa eletroforese em gel para separar as proteínas desnaturadas por massa. um composto sulfuroso e um detergente conhecido como dodecil sulfato de sódio (SDS). é um método em biologia molecular e bioquímica para detectar proteínas em um homogenato (células bem trituradas) ou um extrato de um tecido biológico. Radioimunoensaio de captura No radioimunoensaio de captura. A ebulição e o detergente desnaturam a proteína. . é um trocadilho do nome Southern blot. com concentrações conhecidas do antígeno são adicionadas. remove-se o antígeno não-ligado e adicionam-se anticorpos marcados específicos para o antígeno. Na amostra preparada é então quantificada. As proteínas são então separadas por massa em "bandas" dentro de cada canaleta. Ambas as variedades de membranas são escolhidas por suas propriedades de ligar proteínas não especificamente (isto é. Também é possível usar um gel 2-D que separa as proteínas de uma única amostra em duas dimensões e as proteínas são separadas na primeira dimensão de acordo com o ponto isoelétrico (pH no qual elas têm uma carga total igual a zero).1. elas são movidas do gel para uma membrana de nitrocelulose ou de PVDF. Esquema ilustrativo da transferência de proteínas do gel para uma membrada. peso molecular das proteínas de interesse e tampões disponíveis. e na segunda de acordo com seus pesos moleculares. Figura. uma mistura disponível comercialmente de proteínas de pesos moleculares conhecidos. As membranas de nitrocelulose são mais baratas que as de PVDF. ou ladder.1. as proteínas são expostas a uma fina camada para detecção (figura).5. e uma corrente elétrica é aplicada entre grandes placas de cada lado. então as proteínas carregadas se movem do gel para a membrana enquanto mantém a mesma disposição que continham no gel. liga todas as proteínas igualmente bem). .2 Eletroforese em Gel As proteínas da amostra são separadas de acordo com o peso molecular usando-se a eletroforese em gel. A ligação das proteínas à membrana é baseada tanto em interações hidrofóbicas quanto em interações de cargas entre a membrana e as proteínas. Desde que as proteínas caminham apenas em uma direção ao longo do gel. os géis de poliacrilamida são os mais comuns.3 Transferência A fim de fazer as proteínas acessíveis à detecção do anticorpo. Uma canaleta é reservada para um "marcador". Géis têm várias formulações dependendo do laboratório. porém são mais frágeis e não suportam bem a repetidas amostragens. Como resultado desse processo de "borramento" (blotting em Inglês). as amostras são carregadas lado-a-lado em "valas" feitas no gel. 5. A membrana é colocada facea-face com o gel. providenciando um sinal intensificado.1.1. Um filme fotográfico é colocado contra a membrana. 5.é usada em conjunção com um agente quimioluminescente. Ele geralmente é ligado a biotina ou a uma enzima reveladora. Normalmente uma parte da resposta imune é colhida e usada como ferramenta de detecção específica e sensível que se liga à proteína diretamente . Também podem ser incubadas em diferentes temperaturas. com temperaturas mais altas sendo associadas com mais ligações.1Anticorpo Primário Anticorpos são gerados quando uma espécie hospedeira ou uma cultura de células imunes são expostos à proteína de interesse (ou a uma parte dela). e exposta à luz da reação é criada a imagem dos anticorpos ligados ao blot. Mais comumente.5.4 Bloqueio Desde que a membrana foi escolhida por sua habilidade de ligar proteínas. a qual leva a uma mudança de cor ou sinal fotométrico. e às vezes com BSA ou leite em pó.5 e 5 microgramas/mL) é encubada com a membrana sobre leve agitação. . com uma pequena quantidade de detergente como Tween 20 ou carbono coloidal.5 Detecção Durante o processo de detecção testa-se a membrana com anticorpos da proteína de interesse. 5. passos precisam ser feitos para impedir as interações não específicas entre a membrana e o anticorpo usado para a detecção da proteína alvo.1.por isso anticorpo primário. como por exemplo fosfatase alcalina. Este é conhecido como anticorpo secundário. e se liga eles com uma enzima reveladora.tipicamente albumina de soro bovino (BSA) ou leite seco desnatado. Depois de bloqueada a membrana. Tipicamente. uma peroxidase . uma solução diluída do anticorpo primário (geralmente entre 0. direcionado a porções espécies-específicas do anticorpo primário. O bloqueio da ligação não específica é alcançado pondo-se a membrana em uma solução diluída de uma proteína .ligada secundariamente . a enzima pode ser provida com uma molécula substrato que será convertida pela enzima a um produto colorido de reação que será visível na membrana. Esse passo confere a vantagem de que vários anticorpos secundários se ligarão a um anticorpo primário. tanto específicas à proteína alvo (o sinal) e não específicas (o ruído).2Anticorpo Secundário Depois de se enxaguar a membrana para remover o anticorpo primário não ligado. 5.5. A solução de anticorpos e a membrana podem ser seladas e incubadas juntas de 30 minutos a uma noite.5. a solução é composta de uma solução salina tamponada. Como os procedimentos ELISPOT e ELISA. ela é exposta a outro anticorpo.1. e a reação produz fluorescência proporcionalmente à quantidade de proteína. A imagem é analisada por densitometria.Uma terceira alternativa é usar um marcador radioativo acoplada ao anticorpo secundário. O método radioativo promove a ionização e subsequente autoradiografia para visualização da interação antígeno-anticorpo. Entre todos os interferentes que observamos. À medida que o antígeno se difunde no gel ele reage com o anticorpo e quando o ponto de equivalência é atingido é formado um anel de precipitação. prata. a qual avalia a quantidade de proteína colorida e quantifica os resultados em termos de intensidade óptica. o que mais interfere na formação do precipitado são as concentrações de antígeno e anticorpo. conforme é ilustrado na figura 00. Sua principal característica é que um de dos componentes do complexo encontra-se na forma insolúvel em suspensão. dois métodos de detecção de antígenos são comumente usados: radioativo e imunoenzimática.3Visualização As proteínas no western blot são detectadas diretamente por uso de corantes orgânicos.1. 5. 6. a quimioluminescência é o método imunoenzimático de eleição em Western Blot. Normalmente. vários métodos com coloração de prata e partículas coloidais como ouro. pois a coloração da reação apresenta baixo contraste. de forma natural nas células ou adsorvido artificialmente. O tipo de coloração a ser utilizado deve ser compatível com a membrana usada para a transferência de proteínas. com a sucessiva quantificação. além de conferirem resultados rápidos. cobre. diferentemente do método radioativo. peroxidase ou fosfatase alcalina ligados aos anticorpos são usados com inúmeros substratos solúveis que produzem produtos coloridos insolúveis. Esta florescência é detectada por um filme fotográfico ou câmeras especiais que capturam uma imagem digitalizada do Western blot. somando-se a isto. Após a adição do anticorpo primário e anticorpo secundário. As desvantagens do método compreendem na dificuldade de obtenção de fotografias com qualidade.1 IMUNODIFUSÃO Na imunodifusão radial o anticorpo é incorporado no gel de ágar quando este for derramado e diluições diferentes do antígeno são aplicadas nos poços perfurados no ágar. A importância deste método de detecção está em franco desuso. A quimioluminescência preconiza a incubação de um substrato fluorescente que ao ser exposto a uma enzima reveladora associada ao anticorpo secundário gera uma coloração. marcadores fluorescentes. por apresentar um alto custo e riscos à saúde. Esses métodos são de simples execução e não requerem equipamentos sofisticados. por exemplo. Atualmente. . marcando uma proteína capaz de se ligar ao anticorpo como a proteína A de Staphylococcus com um isótopo radioativo de iodo. 6 IMUNOPRECIPITAÇÃO A técnica consiste na indução da precipitação de compostos através da formação do complexo antígeno-anticorpo. o fato de não produzir resultados quantitativos (necessita do densiômetro).5. ferro ou Indian. Em orifícios feitos na agarose. O anticorpo específico é incorporado à agarose que recobre uma lâmina de vidro. são adicionadas diferentes concentrações do antígeno.1. da ordem de mg/mL. Em um orifício é adicionado antígeno e em outro soro. 6. Este teste é comumente usado em laboratório clínico para a determinação dos níveis de imunoglobulina em amostras de pacientes.1 Radial Simples O teste de imunodifusão radial simples permite determinar a concentração de uma amostra de antígeno.1. que . A lâmina é incubada por 24/48 horas. Se aparecerem no teste mais de um anel. Figura 00. Isso pode ser devido à misturada de antígenos ou de anticorpos. b) ser de baixa sensibilidade e. Esquema ilustrativo do efeito de difusão e formação do complexo antígenoanticorpo. este é um teste quantitativo. A baixo está um gráfico que se pode fazer para a quantificação.O diâmetro do anel é proporcional ao log da concentração do antígeno. uma vez que a quantidade de anticorpo é constante. ao correr diferentes concentrações de um antígeno padrão pode-se gerar uma curva padrão a partir da qual se pode quantificar a quantidade de um antígeno em uma amostra desconhecida. c) requer o uso de extratos antigênicos em concentração elevada. Por essa razão. 6. ocorreram mais de uma reação antígeno/anticorpo. Observa-se o halo de precipitação em volta dos orifícios. As principais desvantagens da imunodifusão radial são: a) Método semiquantitativo. Durante a incubação ocorre a difusão do anticorpo e do antígeno na agarose. A lâmina é incubada por 24/48 horas.2 Radial Dupla Em uma camada de agarose que recobre uma lâmina de vidro são feitos orifícios. com a formação de complexos antígeno-anticorpo insolúveis. Portanto. uma mistura complexa de antígenos é aplicada em um poço perfurado em um gel de ágar e os antígenos são submetidos à eletroforese. Este teste é usado para a análise qualitativa de misturas complexas de antígenos. Este teste é comumente usado para a análise de componentes no soro de um paciente. As soluções sofrem difusão e formam complexos Ac-Ag na zona de equivalência.2 IMUNOELETROFORESE Em imunoeletroforese. um sulco é feito no gel e os anticorpos são adicionados. de forma que os antígenos são separados de acordo com suas cargas. aplicação dos anticorpos e formação de complexos na zona de equivalência. separação de acordo com a carga. levando a formação da linha de precipitação. À medida que os anticorpos se difundem no ágar são produzidas linhas de precipitina na zona de equivalência quando ocorre uma reação antígeno/anticorpo. Figura 00.precipitam e formam linhas entre os orifícios. A formação da linha de precipitação indica a presença de anticorpos específicos figura 00. O soro é colocado no poço e anticorpos para soro total é colocado no sulco. 6. conforme ilustrado na Figura 00. . Este teste pode também ser usado para avaliar a pureza das proteínas de soro isoladas. Através da comparação com o soro normal. O arco de precipitação fica mais evidente após lavagem e utilização de corante. Após a eletroforese. A figura demonstra as etapas da imunoeletroforese: aplicação do antígeno. Figura 00. é possível determinar se há deficiências em um ou mais componentes do soro ou se há uma superabundância de algum dos componentes do soro (espessura da linha). embora uma medida grosseira da quantidade (espessura da linha) pode ser obtida. devem ser classificadas pela imunofixação. combina as técnicas de eltroforese e imunoprecipitação. chamados de flocos. aplicou-se o anti-soro para cada uma das imunoglobulinas num gel diferente. 6. Utilizou-se a eletroforese para a separação do soro em cada gel e.1 Exame de VDRL (Venereal Diseases Research Laboratory) A sífilis é uma doença infecciosa humana produzida por uma espiroqueta. As proteínas não precipitadas são lavadas e o imunoprecipitado é a seguir corado. Figura 00. Imunofixação do soro humano. derivam de uma única linhagem de células plasmáticas que podem produzir altas concentrações de um único anticorpo monoclonal que aparece como uma linha estreita na eletroforese (ex. 6. Este método tem grande aplicação na identifição de proteinas M presentes em pequenas quantidades. cadeia leve Kappa e Lambda) é colocado sobre as frações separadas (figura 00). IgM. amiloidose. que são difíceis de detectar por outros métodos. macroglobulinemia de Waldestrom.4 FLOCULAÇÃO O processo consiste na formação de agregados de partículas finais em suspensão num líquido. No sistema floculado não há a formação de um "bolo" (adensamento de material ao fundo do recipiente) dado que todos os flocos estão na suspensão. anti-soro (contra IgA. A imunofixação.: mieloma múltiplo.3 IMUNOFIXAÇÃO Quando paraproteínas (globulinas anormais na amostra biológica) são detectadas na eletroforese de soro. As imunoglobulinas monoclonais. IgG. Ela é primeiramente uma doença transmitida sexualmente. que substitui a técnica de imunoeletroforese por ser mais sensível e rápida. A presença de proteína M é caracterizada na imunofixação pela presença de uma banda bem definida associada com uma classe de cadeia pesada (IgM. Outras possíveis viam de transmissão é a transfusão de sangue infectado. gamopatia monoclonal de significado indeterminado). o Treponema pallidum. IgG ou IgA) e banda de mesma mobilidade que reage com cadeia kappa ou lambda.4. e a perinatal (sífilis . também chamadas de Proteínas M. Após a separação das proteínas séricas por eletroforese.6. urina ou líquor. em seguida. hoje praticamente eliminada através de triagem sorológica de rotina. indicando um teste positivo para a presença de anticorpos. como o VDRL. plasma ou líquido cefalorraquidiano (LCR) que contenham anticorpos (reaginas). 6. Quando a suspensão antigênica do VDRL é misturada com o soro. frente a uma quantidade constante de antígeno. isto é. fungos. Figura 00. revestem as partículas virais. bactérias.5. mas consistindo em um antígeno não treponêmico.congênita) transmitida in útero. Após um período de incubação. colesterol e cardiolipina possui semelhança imunológica com antígenos de Treponema pallidum. aglutinarem certos tipos de hemácias. e treponêmicos. usados como testes confirmatórios para os soros reativos nos testes de triagem. se presentes na amostra. as partículas de antígeno floculam e o resultado da reação é observado ao microscópio. . Hemácias. a máxima diluição em que ocorre a aglutinação. Os testes para detectar anticorpos específicos são realizados empregando-se diluições em série do anticorpo. Os testes sorológicos para sífilis são classificados como não-treponêmicos.1. espontaneamente. pelos treponemas procedentes da mãe infectada para o feto em desenvolvimento.1 Teste de Aglutinação Direto Na reação de aglutinação direta procura-se por partículas antigênicas insolúveis em sua forma íntegra ou fragmentada. usados mais comumente para a triagem. Demonstração de dois testes VDRL reais com resultados positivos (a esquerda) e negativos (a direita). a aglutinação se completa e o resultado é geralmente expresso como o título do anti-soro. A ausência de floculação indica resultado negativo (figura 00). protozoários podem ser aglutinados diretamente por anticorpo.1Teste de Inibição de Hemaglutinação Direta A inibição da hemaglutinação direta é baseada na capacidade que certos antígenos virais têm de.5.5 IMUNOAGLUTINAÇÃO 6. Os anticorpos. 6. resultando na inibição da aglutinação. A combinação de lecitina. pois há uma série de antígenos que pode ser ligada à sua superfície para fornecer um sistema indicador sensível na detecção de anticorpos. acarreta a presença de anticorpos heterófilos no soro de muitos animais. O teste detecta anticorpos das classes IgG e IgM e. O princípio do teste baseia-se na competição. o que facilita a ligação de muitos antígenos e.Estes testes não distinguem entre IgG e IgM.1Teste de Hemaglutinação passiva A verificação de Boyden. por meio de ligações químicas covalentes. devida ao contato direto com os antígenos solúveis.5. Este método é usado para detectar anticorpos contra o vírus da rubéola. embora os anticorpos IgM sejam 750 vezes mais eficientes na aglutinação que os IgG. a aplicação dos testes de aglutinação passiva é muito variada e utilizada para procura de anticorpos. por adsorção via agentes químicos. Hemácias possuem uma superfície complexa. O teste em placa utiliza pequenas quantidades de reagentes e é considerado positivo quando se verifica a formação de tapete cobrindo o fundo da cavidade da placa em “V”. haptenos ou anticorpos que competem com a substância homóloga com que a hemácia foi sensibilizada.) podem ser sensibilizadas por adsorção passiva. 6. enquanto antígenos protéicos requerem pré-tratamento com ácido tânico ou cloreto de cromo. como ácido tânico. de que proteínas podiam ser adsorvidas a hemácias tratadas com ácido tânico e que essas células podiam ser aglutinadas por anticorpos específicos possibilitou o emprego dos métodos de aglutinação para a detecção de anticorpos contra várias substâncias. O título da amostra testada será a máxima diluição em que ainda se observa a formação do tapete. “sepharose”. Tais anticorpos devem ser removidos antes da execução do teste.2. bentonita. os testes em placa permitem que a determinação do ponto final da reação seja feita diretamente.2 Teste de Aglutinação Passiva ou Indireta Para o teste de aglutinação passiva. cloreto de cromo ou por conjugação do antígeno.5. 6. Devido à grande diversidade de antígenos que podem se ligar às células ou partículas. Hemácias estão entre os melhores suportes de antígenos para os testes de aglutinação. freqüentemente.2Teste de Inibição de Hemaglutinação Passiva O teste de inibição de hemaglutinação passiva é sensível e específico na detecção de pequenas quantidades de antígenos solúveis. Antígenos polissacarídeos prontamente aderem a hemácias. 6. em 1951. Além disso.2. sarampo. e negativo quando as hemácias sedimentam formando um “botão” compacto. leveduras. as hemácias e as partículas inertes (látex. fornecendo reagentes estáveis. pelos sítios de combinação do anticorpo. etc. a quantidade de antígeno necessária para se obter a máxima reatividade com IgM é muito maior do que a necessária para a máxima reatividade com IgG.5. influenza e certos enterovírus. O . entre o antígeno fixado à hemácia e o antígeno solúvel ou o hapteno. em doenças reumáticas. Portanto o soro do paciente não poderá estar inativado. . em processo agudos ou crônicos. 7. O teste é efetuado com uma gota de antígeno e uma gota de amostra de soro sobre esta superfície. O teste pode ser empregado na pesquisa de antígenos ou de anticorpos. Este método é mais sensível e menos específico que a hemaglutinação passiva para a detecção de fator reumatóide. pois recorre à formação de complexos antígeno-anticorpo. A presença destes grupos indica que no soro testado possui anticorpos. Quando misturadas. ocorrendo doenças autoimunes. irá ocorrer a formação de grumos ou floculação pelos complexo antígeno-anticorpo. etc. o indivíduo já fora exposto ao agente patógeno. contudo. o que se observa no lugar de grumos ou flocos é hemólise eritrócitos sensibilizados. A técnica se divide em duas formas: direta (rápida) e indireta (lenta). podendo ser um suporte específico para o teste ou uma lâmina simples. Sua realização é efetuada em superfície de vidro.5. etc.1 Soroaglutinação Direta (Rápida) A técnica de soroaglutinação rápida é o teste sorológico mais simples e comumente utilizado.2. haverá a exposição dos determinantes de IgG que reagem com o fator reumatóide. produzindo partículas visíveis aos olhos desarmados. O teste pode ser visualizado a olho nu com de uma lente sob incidência de luz.grau de inibição relaciona-se com a quantidade do antígeno presente na amostra e. o soro que se deseja verificar e a suspensão de hemácias sensibilizada. Também é empregada na pesquisa da proteína C que aparece no soro de pacientes na fase aguda de várias infecções. em doenças infecciosas. O fator reumatóide deve ser um autoanticorpo à porção Fc de IgG agregada ou alterada. também com a afinidade pelos sítios de combinação do anticorpo. portanto. 6.1. como estafilocócica ou estreptocócica. febre reumática. A aplicação mais comum é na detecção do fator reumatóide.2 Soroaglutinação Indireta (Lenta) A técnica indireta (lenta) também forma complexos antígeno-anticorpo. funcionando como sistema indicador da reação antígeno-anticorpo. os anticorpos formação complexos que romperão com a membrana celular dos eritrócitos e liberarão hemoglobinas que tornarão a reação visível.3Teste de Aglutinação do Látex Partículas de látex são esferas de poliestireno que podem ser utilizadas como suportes na adsorção de proteína solúvel e antígenos polissacarídicos. 7 SOROAGLUTINAÇÃO O teste de soroaglutinação fundamenta-se na imunofloculação. seleciona-se células vermelhas de mamíferos para serem sensibilizadas com o antígeno que se deseja pesquisar.1. Para tanto. 7. que é anticorpo da classe IgM pentamérico dirigido contra IgG. Caso existam anticorpos específicos (aglutininas) no soro. resultando em aglutinação. Adsorvendo IgG passivamente ás partículas do látex. degenerativas. o citomegalovírus.2 e 3. o conjugado reage com o anticorpo específico para o antígeno (figura 00).2. a preparação é incubada com um conjugado de antiimunoglobulina produzida em outra espécie de animal. O anticorpo não ligado é removido por lavagens e o preparado é observado em microscópio de fluorescência. Após lavagens. Legionnella sp. por isso. Após a lavagem. O soro do paciente é diluído.1.1. .2.1.1. os da parainfluenza 1.1Para a Pesquisa de Antígenos Consiste na incubação da célula ou tecido em que se quer pesquisar o antígeno com o anticorpo específico obtido em animal conhecido ou monoclonal. 8. Treponema pallidum. Escherichia coli. o da varicela-zoster e o adenovírus. levando a formação de um imunocomplexo. com os do herpes simples tipo 1 e 2. a preparação é incubada com o conjugado fluorescente e. se houver anticorpo no soro. o teste de imunofluorescência indireta tem sido empregado para amplificar o sinal e aumentar a sensibilidade. Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno. estreptococos ß-hemolítico do grupo A e vários vírus. 8. Pode ser empregado na pesquisa de antígenos ou de anticorpos. O teste tem sido utilizado para a pesquisa de Chlamydia trachomatis. 8. os da influenza tipo A e B. formando um imunocomplexo estável.2 Teste de Imunofluorescência Indireta A sensibilidade dos testes de imunofluorescência é limitada ao nível de fluorescência detectável pelo olho humano.2Para a Pesquisa de Anticorpos Antígenos padronizados são fixados a lâminas de vidro.8 IMUNOFLUORESCÊNCIA O teste de imunofluorescência é um dos mais utilizados no diagnóstico de laboratório para a pesquisa de anticorpos e cada vez mais com anticorpos monoclonais para a pesquisa de microrganismos e seus componentes em espécimes clínicas. O conjugado se fixa ao antígeno. colocado sobre o antígeno e incubado para permitir a formação do complexo antígeno-anticorpo. 8.1 Teste de Imunofluorescência Direta O teste de imunofluorescência direta é empregado na pesquisa e na localização de antígenos em células ou tecidos através de um anticorpo específico marcado com fluorocromo (conjugado). Este teste está direcionado para a pesquisa de antígenos na amorestra. onde os imunocomplexos encontrarão anticorpos que os prenderão e permitirão serem revelados através do depósito do corante coloidal (figura 00). e outros são imunológicos como para o teste de gravidez. O sistema é realizado em uma matriz constituída de membrana de nitrocelulose ou de náilon coberta por acetato transparente para facilitar a visualização do teste. A amostra aplicada se liga ao conjugado colorido. Posteriormente a fase líquida passa pela linha de captura. formando o complexo antígeno e anticorpo. O antígeno ou o anticorpo é fixado na membrana na forma de linhas ou pontos e o restante da membrana é bloqueado com proteína inerte como nos testes imunoenzimáticos (ELISA). Esquema representativo do teste imunicromatográfico. Um dos métodos imunológicos desses testes emprega corante insolúvel. como a determinação da glicemia (glicosímetros). . Utiliza-se um antígeno fixo para formação do complexo antígeno-anticorpo com o soro do paciente. São testes de triagem. usam métodos enzimáticos químicos. Figura 00. emprega-se um anticorpo anti-imunoglobulina com marcar para detectar a presença. que percorrem por migração cromatografia a matriz de teste. como ouro coloidal (róseo) ou prata coloidal (azul marinho) como revelador da interação antígenoanticorpo. e consequentemente elevado custo. Alguns deles. Teste de imunofluorescência indireto para pesquisa de anticorpos. portanto de elevada sensibilidade. Para detecção de antígenos podem ser utilizados anticorpos fixados na linha de captura e como conjugado um segundo anticorpo conjugado ao corante. Após. 9 IMUNOCROMATOGRAFIA Os testes dispensam o uso de reagente adicional ou equipamentos.Figura 00. O controle deve sempre ser levado em consideração para a observância da qualidade.Para assegurar a qualidade dos reagentes e a realização adequada do procedimento. como nos testes imunoenzimáticos (figura 00). esses testes rápidos utilizam controles internos. Figura 00. . Teste imunocromatográfico.
Report "Estudo ~ Métodos de pesquisa e Dianósticos Imunológicos"