BiotecnologiaESPECTROFOTOMETRIA 1. INTRODUÇÃO Quando se incide um feixe de luz branca denominada policromática sobre um prisma, observa-se sua separação em diferentes cores, correspondentes a determinados comprimentos de onda (Figura 1). FIGURA 1 – Espectro eletromagnético. Na realidade, a porção do espectro eletromagnético compreendida entre 380 e 780 nm excita a retina humana. Esta região denominada “visível” é utilizada com freqüência na determinação de inúmeras substâncias que formam soluções coloridas. De modo mais amplo, a espectrofotometria é um processo de medida que, basicamente, emprega as propriedades dos átomos e moléculas de absorver e/ou emitir energia eletromagnética em uma das regiões do espectro eletromagnético indicado na Tabela I. TABELA I – Características do Espectro Eletormagnético Raios Gama Raios X Ultravioleta Visível Infravermelho Microond a Ondas de Rádio Angstrom (Å) 1 10 1800 3800 7800 - - Nanômetro(n m) - - 180 380 780 - - Micra (µ) - - - - 0.7 400 - - - - - - 0.04 25 Centímetro (cm) Os números indicam o limite inferior dos comprimentos de onda de cada radiação Apesar de serem usadas diferentes unidades para medidas de comprimentos de onda, a mais comum nas regiões ultravioleta e visível é o nanômetro (1 nm = 10 -7 cm = 10-9 m); na região do infravermelho usa-se o micrômetro (1 µm = 10 -6 m = 10-4 cm) e o número de onda (cm-1). As regiões de maior interesse para as análises químicas são as compreendidas entre 200-380 nm (ultravioleta), 380-780 nm (visível) e 2-16 µ (infravermelho). Apesar do mecanismo de absorção de energia ser diferente nas regiões do ultravioleta e do infravermelho, o processo fundamental que ocorre é a absorção de certa quantidade de energia. A energia necessária para a transição de um estado de menor energia para outro de maior energia é diretamente relacionada à freqüência da radiação eletromagnética que causa a transição. A energia absorvida é dada pela expressão: 1 /10 ONDAS LUMINOSAS As Ondas luminosas apresentam diferentes comprimentos. um filtro de vidro. que podem ser longos ou curtos. A freqüência e o comprimento de onda são relacionados por: v = c/ onde c = velocidade da luz (2. freqüência e comprimento de onda são dadas pelas seguintes expressões: E = Nhv = Nhc/ onde N = número de Avogadro. por exemplo. As relações básicas entre energia (caloria/mol). de redes de difração. ainda. Na realidade.624 10-27 erg seg-1). 2. Ao se incidir.Biotecnologia E = hv onde h = constante de Planck (6. porque transmite uma faixa muito ampla do comprimento de onda. o vermelho.998 1010 cm seg-1) = comprimento de onda em cm. luz formada por um único comprimento de onda. isto é. conforme mostrado na Figura 2. Se for 2 /10 . E = energia absorvida (erg). um monocromador. mesmo o do tipo composto. Para isto. O comprimento de onda longa apresenta maior distância entre dois máximos consecutivos do que a curta. esta refletirá somente o comprimento de onda não absorvido. A distância entre um pico e outro consecutivo constitui o comprimento de onda característico deste feixe luminoso. O problema na análise química consiste em buscar meios para se obter luz monocromática. o fundamento teórico do fenômeno é totalmente diferente dos correspondentes aos prismas. não é. O comprimento de uma onda longa apresenta maior distância entre dois máximos consecutivos. É comum o emprego de filtros de cores diferentes para separar determinados comprimentos de onda. FIGURA 2 – Comprimento de Onda (a) longa e (b) curta. transmitindo faixa de comprimentos de onda muito estreita. Os chamados filtros de interferência são aqueles de pequena faixa de emissão. rigorosamente. constituído pela associação de dois ou mais filtros de corte e que transmite uma faixa definida do espectro. é possível utilizar-se de certos artifícios como o emprego de prismas capazes de separar as diferentes cores do espectro e. ou seja.É conhecido que uma onda luminosa apresenta pontos de picos máximo e mínimo. cps). Porém. um feixe luminoso sobre uma superfície opaca vermelha. v = freqüência da luz incidente (ciclos por segundo. Logo. Usa-se transmitância percentual (% T) para evitar operações com números decimais. Uma expressão mais conveniente para a intensidade de absorção é obtida pela lei de Lambert-Beer que estabelece relação entre transmitância. chama-se transmitância e o valor máximo que pode emergir é 100%. porém são as soluções coloridas que absorvem os demais comprimentos de onda. T = I / I0 Se determinada solução não absorve energia. no caso de se empregar superfícies coloridas no exemplo. como na Figura 4.Biotecnologia utilizada uma superfície de cor azul. conseqüentemente. respectivamente. conclui-se que uma solução que absorva energia terá transmitância menor que 1. como indicado na Figura 3. T = 1. o raio luminoso será absorvido em proporção direta à concentração apresentada pela solução vermelha. T=100 %. 3. se forem usados dois tubos de vidro contendo soluções coloridas e se incidir um feixe de luz. observa-se que não ocorre absorção do raio luminoso correspondente à luz transmitida (I). vermelha e azul. TRANSMITÂNCIA E ABSORBÂNCIA A relação existente entre a luz emergente ou transmitida (I) e a luz incidente (I 0). Se a solução azul do tubo for substituída por outra de cor vermelha. A relação é: log10 (I0/I) = kcb = A 3 /10 . Assim. quando I = I0. somente a luz azul será refletida e as demais cores absorvidas. Analogamente. o fenômeno ocorrido nas superfícies coloridas transparentes se repete. ficando retidas todas as demais. Se interpor um filtro de cor azul entre o caminho da luz incidente (I 0) e o tubo contendo solução azul. Portanto. FIGURA 4 – Absorção da Luz por filtros. I e I 0 têm o mesmo valor e. FIGURA 3 – Absorção da luz por soluções coloridas. se observará que atravessam a superfície colorida e transparente as cores vermelha e azul. espessura da amostra e concentração das espécies que absorvem. O mesmo é observado para outras superfícies opacas coloridas. porém transparentes à luz. A intensidade de uma banda de absorção em um espectro no ultravioleta e no visível é usualmente expressa como a absortividade molar no máximo de absorção max ou log max. A absorbância é proporcional à concentração de soluto e ao comprimento da espessura da solução pelo raio luminoso.Biotecnologia onde: k = constante característica do soluto. em centímetro. a expressão acima torna-se: A=cb O termo é conhecido como absortividade molar. Se a concentração de soluto. em centímetro. Como a maioria das medidas fotométricas é realizada com espessura constante da solução. usa-se a equação: A = abc onde a = absortividade.10-abc onde 4 /10 . variando-se somente a concentração. c. A relação que existe entre quantidade de luz absorvida e concentração do soluto é denominada absorbância ou densidade óptica (DO). b = caminha óptico através da amostra. for definida em g/l (grama por litro). na literatura mais antiga. Na Figura 5 está indicado o que ocorre ao incidir um raio luminoso sobre uma solução. que se relaciona com absortividade molar por = aM M = peso molecular do soluto. Quando a concentração (c) é expressa em mol/l e o comprimento do caminho óptico. FIGURA 5 – Transmissão e absorção da luz por uma solução. b = comprimento do caminho óptico através da amostra. A expressão mais freqüente da Lei de Beer é I =I0. Quando não se conhece o material que absorve. é comum mencionar a Lei de Lambert-Beer como a Lei de Beer. pode-se exprimir a intensidade de absorção como: E1% = A/cb onde c = concentração em grama por 100 ml. definição que corresponde ao enunciado da Lei de Beer. c = concentração do soluto. A = absorbância. aparecendo na literatura mais antiga como coeficiente de extinção molar. c pode ser substituído pela absorbância (A). conforme apresentado anteriormente. de maneira que é possível utilizar tais valores para construir as curvas de calibração ou analíticas. b = comprimento ou espessura da solução atravessada pela radiação. logaritmo da transmitância versus concentração ou absorbância versus concentração. fornece uma reta perfeita. Os valores de absorbância medidos na maioria dos fotocolorímetros são fracionários e de difícil leitura com exatidão. pode-se substituir ambos os termos na expressão por K. Assim: 2-log% T = K. A Lei de Beer também pode expressar-se da seguinte forma: I/I0 = 10-abc Aplicando-se logaritmo: log (I/I0) = -abc lgo (I0/I) = abc log (100/%T) = abc log 100 / log %T = abc 2-log % T = abc Como (a) é constante e se conhece a espessura (b) do tubo ou cubeta pelo a qual atravessa o raio luminoso. mas a relação entre esta e a concentração é logarítmica. o produto K. A análise fotométrica fundamenta-se na Lei de Lambert-Beer ou simplesmente de Beer.c Como a absorbância é proporcional à concentração de soluto e ao caminho óptico. e pode servir de curva de calibração para a 5 /10 . entende-se que um valor em porcentagem de transmitância lido na escala do fotocolorímetro pode ser facilmente transformado em absorbância. condição que não se cumpre nas curvas feitas com o % T. em papel milimetrado. Uma relação linear em qualquer um dos gráficos indica que a substância em solução obedece à Lei de Beer. lançando-se a transmitância versus concentração em papel semilogarítmico ou ainda. resultando a expressão: 2-log % T = A Por esta expressão.Biotecnologia I = intensidade da luz transmitida. expresso em centímetro. nas condições da análise. c = concentração do soluto. Os valores de absorbância plotados em papel milimetrado. I0 = intensidade da luz incidente. de modo que para plotar seu valor deve utilizar-se papel semilogarítmico. a = constante de absorção do soluto ou absortividade que depende do comprimento de onda. A = log 1/T = abc ou A = 2-log % T A relação indicada pelos gráficos de Beer. quando a Lei de Beer é obedecida. Isto pode ser evitado. pode ser apresentada de várias formas. lendo-se a porcentagem de transmitância na escala 0-100% e transformando este valor em absorbância mediante tabelas de conversão ou pela expressão A = 2 – log % T. que relaciona a absorbância ou a transmitância da energia radiante monocromática de uma solução com a espessura da camada absorvente (b) e a concentração (c). A leitura da % T é muito mais simples. em papel milimetrado comum.699. A relação entre concentração e absorbância é linear. Por exemplo: 20% de transmitância corresponde a uma absorbância de 0. Não obstante. e situar-se numa região em que a mesma não varie acentuadamente com o comprimento de onda. a maioria dos equipamentos dispõe de programas e expressa os resultados da determinação analítica. em proporção à concentração deste. de prismas. Muitos fotocolorímetros utilizam o sistema de célula fotoelétrica dupla o qual anula as desigualdades da voltagem que podem produzir-se no meio do trabalho. o raio luminoso B será absorvido no soluto da solução colorida. 4. instrumentos eletrônicos destinados a permitir o cálculo de concentrações apresentadas por diferentes soluções coloridas. FIGURA 6 . A leitura em % T tem a vantagem de se obter valores numa escala entre 0 e 100. que se correspondem permitindo ler porcentagem da transmitância e/ou a absorbância. FOTOCOLORÍMETROS As explicações anteriores apontam para uma melhor compreensão dos fundamentos do uso dos fotocolorímetros. o comprimento de onda escolhido para a determinação deverá corresponder ao comprimento de onda de absorbância máxima ou de transmitância mínima. O anodo capta os elétrons emitidos e o passo seguinte é medido em um galvanômetro. 4. Este fato que não acontece na escala correspondente à absorbância que. Os fotocolorímetros são capazes de medir a quantidade de luz transmitida quando um raio luminoso incide numa solução colorida de concentração conhecida ou desconhecida. próprias para cada modelo de aparelho.Transmissão da radiação luminosa. Estes instrumentos utilizam luz monocromática (Lei de Beer) e se valem para selecionar o comprimento de onda adequado.1 ESCALAS DE LEITURA Existem fotocolorímetros que apresentam duas escalas. tornando mais fáceis as leituras. conforme apresentado na Figura 6. segundo a sensibilidade do instrumento. Concentração de soluto elevada produzirá uma diferença do potencial. células fotoelétricas e galvanômetros destinados a medir o fluxo da corrente elétrica. Haverá uma diferença apreciável no fluxo de corrente elétrica medida no galvanômetro.Biotecnologia determinação da concentração de soluções de mesma natureza. redes de difração ou filtros. dependendo da referência. Atualmente. A relação absorbância-concentração permite o cálculo da concentração de uma solução desconhecida pelo fator de calibração (f) determinado pela absorbância de uma solução padrão (Ap) de concentração (Cp). 6 /10 . O fator é determinado pela expressão: f Cp Ap Cx Ax Estabelecido o espectro de absorção. o raio luminoso A não encontrará obstáculo no seu caminho em direção à célula A. dividido em 100 partes iguais. plásticas ou quartzo. Estes valores são observados numa escala que permite medida em transmitância ou absorbância.Utilizam tubos de vidro ou cubetas de vidro. Esta luz se transforma em energia elétrica mediante o emprego de células fotoelétricas ou de células fotovoltáticas capazes de ceder elétrons em forma proporcional à intensidade do feixe luminoso. 100 representa o ponto zero do aparelho. pois. se recorre ao uso de curvas de calibração. Cx = ? (concentração da solução problema). A leitura da absorbância encontra-se invertida à da % T. Entretanto.502 (absorbância medida da solução padrão).2. Com os valores obtidos no fotocolorímetro. 4. É aconselhável nos fotocolorímetros ler % T e transformar este valor em absorbância por cálculo. com mais freqüência. Onde se lê 100 % de transmitância.2. onde a Lei de Beer é obedecida. constrói-se a curva de calibração plotandose as leituras de transmitância ou de absorbância na ordenada e as concentrações na abscissa. Para obter-se uma curva padrão prepara-se solução da substância problema numa faixa de concentração próxima do valor esperado. considerado normal.2 Utilizando-se curvas de calibração Quando se trabalha com soluções padrão se faz uso da relação entre concentrações e absorbâncias. determina-se a concentração da solução problema (Cx): Ax = 0.Biotecnologia dependendo do valor fracionário. A curva traçada em papel milimetrado comum com as leituras expressas em absorbância é linear desde que a Lei de Beer seja obedecida. será necessário ler a absorbância de uma solução padrão de concentração conhecida e a absorbância da solução problema. Para obtê-la. logo.301 20 C x 12mg / l 0.502 4. ao se fazer a leitura em um fotocolorímetro. pode-se determinar a concentração de uma solução desconhecida desde que se conheça sua absorbância. 7 /10 . encontra-se zero de absorbância. Cp = 20 mg/l (concentração da solução padrão). ficará como incógnita conhecer sua concentração. Sempre que o procedimento experimental for idêntico ao utilizado para confeccionar uma curva. de concentração conhecida. nem sempre tais soluções podem se manter estáveis e sua preparação diária demanda grande perda de tempo. É por isso que. embora muitos autores aconselhem o emprego de solução padrão. Considerando-se que a absorbância é diretamente proporcional à concentração do soluto.2 DETERMINAÇÃO DE CONCENTRAÇÕES 4. pode-se escrever que: Ax C p Cx A x Cx Cc Ap Ap Substituindo-se os valores numéricos. Com os dados experimentais indicados no exemplo a seguir. mediante o uso de tabela de conversão ou pelo uso de programa adequado. na prática. para se calcular a concentração da solução desconhecida. tem-se: Cx 0. é de difícil medida principalmente nas extremidades de escala. Numa faixa limitada de concentração. o valor obtido corresponderá à absorbância.301 (absorbância medida da solução problema).1 Por comparação com solução padrão Cada técnica requer sua própria curva de calibração ou analítica. que facilitam e simplificam enormemente o trabalho no laboratório. Ap = 0. que consiste em relacionar as absorbâncias ou transmitâncias na ordenada e os respectivos comprimentos de onda na abscissa. referem-se aos comprimentos da onda central das bandas espectrais limitadas pelo monocromador. A quantidade de energia radiante absorvida é proporcional à concentração do material absorvente na solução. O primeiro apresenta absorbâncias em 430 nm. ESPECTRO DE ABSORÇÃO Para avaliar a região espectral correta.3 Condições para Construção de Curvas de Calibração As condições de trabalho para elaboração da curva com soluções padrão devem ser mantidas em relação à solução problema. 5. Ocasionalmente. pode-se efetuar a medida em comprimento de onda diferente daquele em que há o máximo de absorção (ou mínimo de transmitância) para obter linearização. recomenda-se a medição em 640 nm. que não deve ser escolhido para as medidas. Assim. aumento da faixa de trabalho ou eliminação de interferências. Os métodos colorimétricos e espectrofotométricos talvez sejam os mais freqüentemente usados e importantes na análise quantitativa.Biotecnologia 4. por exemplo.2. Eles se baseiam na absorção da luz visível ou outra energia radiante pela solução. a variação do comprimento de onda nos limites da região do espectro eletromagnético considerado. a solução problema deverá ser diluída a 1/10. que apresenta maior sensibilidade e praticamente sem influência do ‘’branco’’. Pela Figura 7 observam-se dois picos. Anotam-se os valores das leituras. por exemplo. A curva deverá ser traçada numa faixa de concentração da substância que siga a Lei de Beer. onde a linha pontilhada corresponde ao branco. é possível determinar-se quantitativamente a substância absorvente presente. como a do visível. Por este fato. Se a curva for construída com diluição de 1/10. utilizar a faixa do espectro na qual a energia radiante seja absorvida ao máximo a fim de se obter maior grau de sensibilidade. e usando papel milimetrado plotar na ordenada a absorbância e as concentrações na abscissa. Se para construir a curva foi utilizado papel de filtro faixa azul com período de espera de 15 minutos e temperatura de 37C. valores situados abaixo daqueles normais. dentro do normal e acima do normal. O espectro de absorção de uma substância é representado pelo gráfico obtido lançando-se na ordenada a transmitância ou a absorbância da solução. pela medida da absorção da luz. 8 /10 . do elemento ou substância pesquisada. e na abscissa. Os comprimentos de onda relacionados neste gráfico. FIGURA 7 – Espectro de Absorção. submeter a solução-problema a condições idênticas. conforme indicado na Figura 7. também denominada ‘’espectro de absorção’’. deve-se elaborar a curva de absorbância espectral. A curva deverá compreender faixas úteis. De preferência. ou outra energia radiante. ou seja. por que o branco apresenta grande absorbância neste comprimento. entre 380 e 780 nm. A absorção na região do UV e do visível depende da estrutura eletrônica da molécula. é conhecida também como luz negra. ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO ULTRAVIOLETA A radiação eletromagnética de comprimento de onda mais curto que a luz visível e mais longo que os raios X é chamada de luz ou radiação ultravioleta (UV). dispersão do sistema e da abertura da fenda de saída do monocromador. 6. aos sistemas conjugados. ambos aparelhos. essencialmente. utilizam lâmpadas de mercúrio ou tubos de descarga de hidrogênio ou também lâmpadas de filamento de tungstênio. na maior parte. caracterizando a largura efetiva da banda espectral que depende. Os espectrofotômetros e fotocolorímetros diferem entre si quanto a maior ou menor sensibilidade e faixa de trabalho. que significa. são particularmente prejudiciais para a vida por serem fortemente absorvidos pela atmosfera e pela camada de ozônio da Terra. quantitativas (bandas espectrais largas determinam faixas de absorção mais homogêneas para as medições). prismas ou redes de difração. Na realidade estes aparelhos são absorciômetros. Para a separação dos diferentes comprimentos de onda. prismas ou redes de difração. 8. Nos fotocolorímetros são usados filtros. DIFERENÇAS ENTRE ESPECTROFOTÔMETRO E FOTOCOLORÍMETRO Os espectrofotômetros são equipamentos de composição avançada que utilizam prismas ou redes de difração na seleção da região desejada do espectro eletromagnético. A absorção de energia é quantizada e conduz à passagem de elétrons de orbitais do estado fundamental para orbitais de maior energia em um estado excitado. visível (VIS) e infravermelho (IV). Na prática. um elétron de um estado energético de alta energia retorna para um estado energético de menor energia. pois medem energia radiante absorvida. exclusivamente. a espectrometria no UV é limitada. que são mais baratos e. afastado (300-200 nm) e no vácuo (200-4 nm). 7. Esta luz. às vezes. A luz UV é geralmente dividida em regiões denominadas de ultravioleta próximo (400300 nm). invisível para o olho humano. e para ajuste de valores nominais dos comprimentos de onda indicados no espectrofotômetro. de um comprimento de onda determinado. Os espectrofotômetros são empregados na faixa compreendida entre 200 e 1000 nm. c) ausência de reações indesejáveis entre moléculas do soluto e moléculas do solvente.Biotecnologia Esta banda poderá abranger uma faixa de ondas com diferenças de 5 a 50 nm. b) meio homogêneo. Estes últimos comprimentos de ondas. Os fotocolorímetros ou fotômetros são aparelhos de construção simples que utilizam filtros compostos para selecionar porções do espectro a serem utilizadas. ou seja de igual índice de refração em todas direções. DESVIOS DA LEI DE BEER As condições que devem ser respeitadas para cumprimento da lei de Beer são: a) luz monocromática. 9 /10 . Os fotocolorímetros em geral trabalham na zona do visível (380-780nm). A luz UV é produzida em alguns processos que geram transição da luz visível em átomos. os espectrofotômetros utilizam. Para muitas das estruturas eletrônicas esta absorção ocorre em uma porção pouco acessível do ultravioleta. Muitos deles fazem medições nas porções do espectro correspondentes ao ultravioleta (UV). Quanto à fonte luminosa. O espectro de absorção é útil para comparações qualitativas (bandas de pequena largura permitem a caracterização de faixas estreitas de absorção ao longo da região espectral). no qual. A região UV do espectro foi descoberta em 1801 por John Ritter no transcurso de experiências fotoelétricas. Os efeitos biológicos da luz UV inclui bronzeamentos e queimaduras pelo sol. Por esses motivos. entretanto.Biotecnologia A seletividade da absorção no UV é uma vantagem. Exposição excessiva tem sido ligado ao desenvolvimento de câncer na pele e catarata. 10 /10 . A região ultravioleta afastada tem a capacidade de destruir certas classes de bactérias. uma vez que se pode reconhecer grupos característicos em moléculas de complexidade bastante variável. é usada para esterilizar alguns gêneros alimentícios e equipamentos médicos.