Enzimas: generalidades, propiedades, clasificación. Coila P., FMVZ-UNA-Puno

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA LABORATORIO DE BIOQUIMICAEnzimología Generalidades Estructura Propiedades Terminología Nomenclatura Clasificación Cofactores  ©Pedro Coila Generalidades  Las rutas o vías metabólicas son un conjunto de reacciones enzimáticas implicadas en algún propósito: síntesis o degradación de una molécula, síntesis de ATP, etc.  Estas vías inician con una molécula específica y terminan con un producto.  Cada paso es catalizado por una enzima específica.  El metabolismo celular es la suma de las reacciones químicas que ocurren simultáneamente.  Cada reacción es catalizada por una enzima.  De modo que las enzimas intervienen en todo proceso que implique VIDA Historia  Desde finales del S XVIII y principios del S XIX, la digestión de la carne por las secreciones del estómago y la conversión del almidón a azúcar por la saliva y extractos de plantas, ya eran conocidos.  Sin embargo, el mecanismo por el cual esto ocurría no había sido identificados. Historia  Otro evento conocido desde tiempos inmemoriales era la fermentación alcohólica, resultado del crecimiento de levaduras y de su acción química sobre los azúcares. • En el S XIX, Louis Pasteur llegó a la conclusión que esta fermentación era catalizada por una fuerza vital contenida en las células de la levadura, llamadas fermentos, que se pensó solo funcionaban con organismos vivos. Escribió que "la fermentación del alcohol es un acto relacionado con la vida y la organización de las células de las levaduras, y no con la muerte y la putrefacción de las células". • Es decir: NO PODIA EXISTIR FERMENTACIÓN SIN VIDA Etimología 1878 – Fiedrich W. Khune (1837-1900) acuña el término enzima para referirse a sustancias catalizadoras cuya presencia se sospechaba en las levaduras. gr. ενζυμον = “en” y “zymee” = “en la levadura” • No sabían cuál era la naturaleza química de estas sustancias. • Por otro lado, la palabra “fermento” se refería a la actividad química producida por organismos vivientes. Historia 1897 – Edward. Buchner, en la U. Humboldt de Berlín, obtiene un extracto inerte de levaduras y encontró que el azúcar era fermentado inclusive cuando no había elementos vivos en las células de las levaduras. Con esto demostraron que la fermentación podía ser hecho sin vida y que las enzimas eran fermentos inertes. En 1907 recibió el PN de Química por sus investigaciones bioquímicas y descubrir la fermentación libre de Historia • Habiendo demostrado que las enzimas podían funcionar fuera de la célula viva, el próximo paso era determinar su naturaleza química. • Al respecto, en muchos de los trabajos iniaciales se evidenció que la actividad enzimática estaba asociada con proteínas, pero algunos científicos (como el Premio Nobel Richard Willstätter) argumentaban que las proteínas servían simplemente para el transporte de las verdaderas enzimas y que las proteínas per se no eran capaces de realizar catálisis. • En 1926 - James B. Summer aísla y purifica la ureasa (de frejol) y tras 20 años de esfuerzo, postuló que “todas las enzimas eran proteínas”. La comunidad científica dudó de su hallazgo. Historia • En 1930 - John H. Northrop y Wendell Stanley trabajando con enzimas digestivas (pepsina, tripsina y quimotripsina) confirman que las enzimas eran proteínas, estableciéndose definitivamente la naturaleza química de las enzimas. • Estos tres científicos recibieron el Premio Nobel de Química en 1946. Historia • Hasta la década de los 50´s, se tenían aisladas y cristalizadas 75 enzimas. • A la fecha, según la Base de Datos de Enzimas, disponible en: http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes que contiene las estructuras de enzimas depositadas en el Banco de Datos de Proteínas (PDB), al 5 de abril del 2009, se tienen 24,235 enzimas registradas. Definición ENZIMAS = CATALIZADORES ORGANICOS = BIOCATALIZADORES Las enzimas son proteínas globulares sintetizadas por los organismos vivos cuya función es aumentar la velocidad o celeridad de las reacciones químicas. Una excepción lo constituyen las ribozimas cuya naturaleza química es ácido nucleico y no proteína. USOS DE LAS ENZIMAS (APLICACIONES): -Biotecnología -Agricultura - Guerras químicas - Medicina - Metalurgia - Ingenierías - Industria químico farmacéutica - Industria alimentaria - etc. La enzima está conformada por 3 tipos de aminoácidos (AA) Sitio activo ¿Cómo actúan? Como cualquier otro catalizador, las enzimas actúan disminuyendo la barrera de Energía de Activación (Ea) por lo que un mayor número de moléculas alcanzan la energía de transición (el estado excitado). Por ejemplo, la descomposición del H2O2 a H2Oy O2 puede ocurrir: -Espontaneamente (sin catalizador) - Con catalizador inorgánico (platino) - Con biocatalizador (catalasa) Los valores de Ea son 18, 12 y 6 kcal/mol, lo que significa que el platino acelera la reacción 20000 veces y la catalasa 270000 veces. ¿Como lo hace?  Forzando la molécula a un estado intermediario que se parece al de transición pero de menor energía.  Puede reunir dos moléculas reactivas en la orientación adecuada, aumentando su reactividad  Orienta partes de la molécula de forma adecuada para alcanzar la transición. Enzyme Stabilizes Transition State Energy change Energy required (no catalysis) ST Energy decreases (under catalysis) S ES EST EP Reaction direction T = Transition state P What’s the difference? Terminología enzimática - Sitio activo.- Es el lugar de la enzima donde ocurre la reacción química del sustrato - Sustrato (S).- Es la molécula que se une al sitio activo en donde va a ser transformada en producto. - Complejo enzima sustrato (ES).- Unión temporal entre la E y el S, momento en el cual el S es convertido en producto. - Producto (P).- El resultado de la reacción enzimática. Enzima Sustrato Sitio activo Complejo ES El sitio activo (o centro catalítico) - Es una hendidura o bolsillo ubicado en la superficie de la proteína y representa aprox. el 5% de la superficie total. - En ella ocurren los fenómenos de fijación y conversión química del S. - Está constituido por 100 AA y tiene un diámetro de 25 A. - Tiene una topografía 3D específica y única. Fuerzas que mantienen el complejo ES 1. Interacciones no covalentes.- Son las principales fuerzas de unión entre la E y el S. -Interacciones electrostáticas -Puentes de hidrógeno -Contactos de Van der wals - Interacciones hidrofóbicas 2. Interacciones covalentes temporales .Entre las cadenas laterales de los AA y el S. Mecanismo concertado de catalisis Carboxipeptidasa A Sitio activo (270) Glu 3 4 (248) Tyr OH COO + H H O2 1 N Sustrato: Cadena peptídica C C O- N C COO Glu (72) C-terminal R +Arg 5 His (196) + Zn (145) His (69) Localización celular de las enzimas Las enzimas ejercen su función predominantemente en el interior celular. Mas aún lo hacen en determinado organelo de la célula. Na/K ATPasa Retículo endoplasma membrana Glucosa 6 fosfatasa Alfa manosidasa Complejo Golgi Catalasa Succinato deshidrogenasa.Citocromo oxidasa Mitocondria Peroxisom a Propiedades de las enzimas 1. Son extremadamente eficientes. 2. Poseen alto grado de especificidad por sus sustratos. Modelos que explican la especificidad enzimática - Modelo de la llave y la cerradura (de Fisher).- El sitio activo es rígido y perfectamente complementario al S = especificidad absoluta. Modelos que explican la especificidad enzimática - Modelo de la adaptación inducida (de Koshland).- El sitio activo es flexible y no complementario al S. La enzima es inducida a tomar la forma complementaria a medida que el S se fija = especificidad relativa. 3. No sufren modificación en el proceso de reacción. 4. No cambian la Keq de la reacción, simplemente aumentan la velocidad para alcanzar ese equilibrio. 5. Están sujetas a regulación o control 6. Están presentes en pequeñas cantidades (nano o micromolares) 7. Son proteínas globulares generalmente de alto PM, solubles Actúan en condiciones moderadas de presión y temperatura. Mecanismo de acción Para actuar la enzima debe unirse necesariamente al S. Fases: 1. Unión de la E con el S (formación del complejo ES) 2. Modificación del S (conversión en P). 3. Liberación del P . Mecanismo de acción E + S E S E +P Modificaciones de componentes de la reacción enzimática Modificaciones de los componentes de la reacción enzimática S Concentration P E ES Tiempo de reacción Nomenclatura Nombre común (no sistemática, tradicional o trivial) - Hasta antes de 1965 el nombre no guardaba ninguna relación con la reacción que catalizaba, ni con el S. Ejemplos: pepsina, tripsina, quimotripsina, - Luego se nombran a las enzimas con el nombre del S sobre el cual actuaba, con el sufijo “asa” Ejemplos: ureasa, maltasa, amilasa, arginasa, catalasa - En algunos casos se incluye el tipo de reacción que catalizaba la enzima Ejemplos: lactato deshidrogenasa, piruvato descarboxilasa, glucosa oxidasa Nomenclatura Nombre sistemático --- 1965 UIB – a través de la Comisión de Enzimas (EC) establece reglas para nombrar a las enzimas: - Toda enzima debe tener un número de clasificación de 4 dígitos y un nombre sistemático. Ejemplo: 2.7.3.2. ATP: creatina kinasa, Ejemplos: N. Sistemático N. Común N. Sistemático N. Común N. Sistemático N. Común EC 1.1.1.1. Etanol: NAD oxidorreductasa Alcohol deshidrogenasa EC 1.1.11.6. H2O2: oxidorreductasa Catalasa EC 2.7.1.1. ATP: D-hexosa fostotransferasa Hexoquinasa Clasificación Clase 1: Oxidorreductasas Catalizan reacciones de oxidorreducción (redox) de diversos tipos. Ared + Box Aox + Bred Nomenclat. Alternat. • Deshidrogenasas • Oxidasas • Peroxidasas • Oxigenasas • Hidroxilasas • Reductasas A : es el agente reductor o dador electrónico; en el curso de la reacción se oxida (pierde electrones) B : es el agente oxidante o aceptor electrónico; en el curso de la reacción se reduce (gana electrones) Ejemplo: EC 1.1.3.4 Glucosa : O2 oxidorreductasa Dador Aceptor Nombre común: Glucosa oxidasa En las reacciones redox, siempre tienen que estar presentes el aceptor y el dador electrónico a la vez. Clase 2: Transferasas Catalizan reacciones de transferencia de agrupaciones atómicas de una molécula donadora a otra aceptora. A-X + B A : molécula dadora o donadora B : molécula aceptora X : grupo transferido Ejemplo: A + B-X Sub-clases de transferasas 2.1.-.- Grupos monocarbonados 2.2.-.- Grupos aldehido o ceto 2.3.-.- Aciltransferasas 2.4.-.- Glicosiltransferasas 2.5.-.- Alquil- o Ariltransferasas 2.6.-.- Grupos nitrogenados 2.7.-.- Grupos fosfato 2.8.-.- Grupos sulfato EC 2.7.1.1. ATP: D-Hexosa fosfotransferasa Dador Aceptor Grupo transferido Nombre común: Hexokinasa Clase 3: Hidrolasas Catalizan reacciones hidrolíticas (ruptura de enlaces químicos) con participación del agua. A-B + H2O A-OH + B-H Es difícil la utilización de nombres sistemáticos en las hidrolasas. Muchas de ellas conservan el nombre primitivo: tripsina, pepsina, papaína, etc. Ejemplo: EC 3.4.21.4. (trupsina) Sub-clases de hidrolasas 3.1.-.- Esterasas 3.2.-.- Glucosidasas 3.3.-.- Eter hidrolasas 3.4.-.- Peptidasas 3.5.-.- Acil anhidro hidrolasas Etc. Clase 4: Liasas Catalizan reacciones de adición o remoción de grupos a enlaces C=C (ruptura o formación de dobles enlaces. Catalizan la ruptura de enlaces por medios distintos a la hidrólisis. Ejemplo: Algunas liasas EC 4.1.1.1. Piruvato descarboxilasa - Descarboxilasas - Aldolasas - Anhidrasa carbónica - Adenilato ciclasa Clase 5: Isomerasas Catalizan reacciones que implican cualquier tipo de isomerización, tales como, racemizaciones, epimerizaciones e isomerizaciones cistrans. Es decir, modificación interna de una molécula (sin agregarle ni quitarle grupo o átomo alguno). Algunas isomerasas - Epimerasas - Racemasas - Mutasas - Isomerasas Ejemplo: EC 5.3.1.1. Triosa fosfato isomerasa Clase 6: Ligasas Catalizan reacciones de unión (o condensación) de dos moléculas (formación de enlaces) acoplado a la hidrólisis del ATP o de otro compuesto de alta energía. A + B + ATP O bien A-B + ADP + Pi C + D + ATP Ejemplo: C-D + AMP + PPi Algunas iigasas EC 6.5.1.3. RNA ligasa -Sintetasas - Carboxilasas - Tiokinasas http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes Clasificación de Enzimas (E.C.) El número de enzimas al 14-Abril del 2009, según el Banco de Datos de Enzimas, son: E.C.1.-.-.- Oxidoreductasas. E.C.2.-.-.- Transferasas. E.C.3.-.-.- Hidrolasas. E.C.4.-.-.- Liasas. E.C.5.-.-.- Isomerasas. E.C.6.-.-.- Ligasas. [4,207] [7,350] [9,183] [1,752] [1,011] [732] Cofactores enzimáticos •Son sustancias no proteicas que requieren muchas enzimas para que puedan catalizar eficientemente. Su presencia es indispensable (ingresan con los alimentos) •Generalmente, se sitúan en el sitio activo de la enzima, en donde se fija de manera específica (en forma covalente o no). •Entonces, los cofactores actúan modificando la estructura 3D de la enzima, la del sustrato o ambas e incrementando al máximo la interacción de estos Terminología Parte proteica Parte no proteica Tipos de cofactores Holoenzima Apoenzima Cofactor Tipos: 1. Inorgânicos (iones) 2. Orgánica - Coenzimas - Grupos prostéticos 1. Cofactores inorganicos Son las sustancias iónicas (cationes o aniones) de los metales. Por esta razón son nutrientes esenciales para el organismo. Se unen mediante enlaces de coordinación con las cadenas laterales de ciertos AA del sitio activo. 2. Cofactores orgánicos: Pueden ser A. COENZIMAS Se unen a la enzima en forma transitoria, generalmente durante la catálisis. Una misma coenzima puede actuar en numerosas reacciones enzimáticas. Los componentes esenciales de muchas coenzimas son la vitaminas (la mayoría del Complejo B) B. GRUPOS PROSTETICOS Están unidos permanentemente a la enzima mediante enlaces covalentes. A diferencia de las coenzimas, los GP son más grandes. Ejemplo: el grupo heme de la catalasa Vitaminas y sus formas coenzimáticas Vitamina Tiamina (B1) Riboflabina (B2) Piridoxina (B6) Niacina Forma coenzimática Tiamina pirofosfato (TPP) FAD y FMN Piridoxal fosfato NAD y NADP Reacción Descarboxilación, transferencia de grupo fosfato Redox Transferencia de grupos amino Redox Ac. Pantoténico Biotina Ac. Fólico CoA Biocitina THF Transferencia de grupos acilo Carboxilación Transferencia de grupos de un C Vit B12 Desoxiadenosil cobalamina, metilcobalamina Isomerizaciones Vit C Hidroxilación Isoenzimas o isozimas Son familias de enzimas que catalizan la misma reacción química pero con propiedades cinéticas y físico-químicas diferentes. Difieren en su estructura primaria (en algunos AA) y, por tanto, en los valores de sus puntos isoeléctricos (pI), por lo que su presencia de estas formas múltiples puede detectarse y separarse mediante electroforesis. Pueden estar presentes en una misma especie e incluso en una misma célula. La isoenzima más conocida es la lactato deshidrogenasa (LDH), presente en todos los tejidos. Es un tetrámero con dos clases de subunidades (H y M) de 35 kd cada una. Ambas subunidades difieren significativamente en el contenido de sus AA y están codificados por genes diferentes. Presenta 5 isoenzimas y todas catalizan la misma reacción. Las 5 formas isoenzimáticas son: La isoenzima H4 predomina en el corazón (heart) y la M4 en el músculo esquelético (muscle). Las otras 3 isozimas se encuentran presentes en los distintos tejidos. Si bien todos catalizan la misma reacción, difieren significativamente en sus valores Km respecto a sus sustratos, así como en sus valores de Vmáx. El siguiente esquema muestra el contenido relativo de la LDH en los tejidos humanos. Zimógenos o proenzimas  Son precursores inactivos de ciertas enzimas, las que más tarde en respuesta a una señal bioquímica, se convierten en activas por hidrólisis de enlaces peptídicos.  La mayoría de enzimas digestivas pertenecen a este grupo. P. ej. pepsina, tripsina y quimotripsina, que se sintetizan como pepsinógeno, tripsinógeno y quimotripsinógeno, respectivamente. Cuando son vertidas al TGI se convierten en sus formas activas mediante escisión hidrolítica de uno o más enlaces del  Son inactivos porque el sitio activo no está disponible para el sustrato ya sea por que se encuentra “sellado” por un segmento peptídico o porque los residuos de fijación y catálisis no tienen la alineación apropiada.  El rompimiento de uno o más enlaces produce nuevas interacciones de los grupos R lo que produce una nueva conformación de la proteína.  Se sintetizan en forma inactiva con la finalidad de proteger a la célula (u órgano) que lo produce. Si se sintetizaría en su forma activa sería autodestructivo ya que hidrolizaría a cualquier proteína celular.  De hecho, una de las causas de pancreatitis (a veces mortal) es la liberación prematura de enzimas activas. Activación de zimógenos (cascada de reacciones) Complejos enzimáticos  Son agrupaciones de enzimas físicamente unidas unas con otras y que se encuentran relacionadas con una vía metabólica, de tal forma que los intermediarios (sustratos) pasan de un sitio activo a otro sin abandonar el sistema.  Cada subunidad (enzima) posee una conformación que le permite unirse a las restantes por medio de enlaces débiles (no covalentes), pudiendo disociarse ésta. COMPLEJO DE LA PDHasa Enzimas multifuncionales (multienzimas)  Son proteínas que catalizan reacciones sucesivas de una vía metabólica, que como consecuencia de la evolución, se han unido en una sola cadena polipetídica, de tal forma que esta cadena contiene varios sitios activos.  De este modo, los intermediarios (sustratos) no abandonan el sistema.  A diferencia de los complejos, éstos no pueden disociarse ya que todo el sistema está unido covalentemente formando una proteína multienzimática.