Universidad Santo Tomás2012 ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA PARA MUESTRAS DE ADN. Luis A. Colihuinca Llancapan. Resumen La electroforesis consiste en la separación de moléculas a través de una matriz. La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. Para el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis. Palabras claves: ADN, Bacteriófago Lambda, Red Gel, Gel Agarosa. TBE. Introducción La electroforesis es un proceso que se utiliza para separar macromoléculas en una solución. La electroforesis en gel de agarosa es el método más común y más utilizado. Una molécula de DNA cortada con enzimas de restricción genera diferentes fragmentos. Estos pueden ser separados en base a su tamaño utilizando un gel de electroforesis en agarosa. Existen algunos otros tipos de electroforesis en gel de agarosa, pero la electroforesis horizontal es el más utilizado para separar moléculas de ADN en agarosa. Cuando el ADN es sometido a un campo eléctrico y atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta. Hay dos fuerzas de acción opuesta que determinan la velocidad de la partícula. Primero, la fuerza eléctrica atrae en DNA hacia el electrodo y la intensidad de la atracción es directamente proporcional a la carga. Diagnóstico Molecular Segundo, la fuerza de rozamiento se opone a la migración y su intensidad depende del tamaño y la forma de la partícula. La tinción más conveniente y más comúnmente usada para visualizar ADN en geles de agarosa es la molécula fluorescente bromuro de etidio, ésta molécula plana se intercala en el ADN doble hebra entre las bases nitrogenadas apiladas a través de fuerzas de van der Waals. En la actualidad hay nuevas moléculas intercalantes fluorescentes que no tienen estos potenciales efectos tóxicos para el ser humano, entre ellos: SYBR Safe, SYBR Gold, Red Gel, Green Gel. En nuestro práctico utilizaremos Red Gel el cual además de no ser mutagénico ni citotóxico es amigable con el medio ambiente. Las enzimas (ó endonucleasas) de restricción son unas proteínas con Página 1 Universidad Santo Tomás 2012 acción catalítica que tienen la propiedad de reconocer secuencias cortas, de unos cuatro ó seis pares de bases en el ADN de doble hebra, y cortar en todos los puntos donde se encuentre dicha secuencia. Este lugar de corte se denomina diana de restricción. Cada enzima de restricción tiene una diana particular en el ADN. En la actualidad hay una amplísima cantidad de enzimas de restricción y los usos destinados son varios. Materiales y Métodos Muestra: Se utilizó muestras de ADN genómico y ADN del fago lambda. - Micropipetas de 0,1-20ul, de 20-200ul y 200-1000ul. - Puntas de micropipetas estériles. - Tubos eppendorf. -Cámara de electroforesis horizontal -Peines para las bandejas -Bandeja para la preparación del gel -Fuente de poder -1 matraz de Erlenmeyer de 100ml estéril. -Guantes de látex -Guantes para calor Reactivos. - Bromuro de etidio -Agarosa grado molecular -TAE 1 X -Red gel - BSA - EcoRI - Baffer de carga. - Buffer de reacción enzimática. -Agua Destilada Procedimiento: Reacción de digestión del fago lambda y ADN genómico con la enzima EcoRI. 1. Se realizó los cálculos de las cantidades que se requerían en cada caso. 2. Se marcó 3 tubos eppendorf con los números 1 (control), 2 (ADN fago lambda) y 3 (ADN genómico) 3. Se agregó al tubo 1, usado como control, 1 µgr (2ul) de ADN del Fago, 2 µl de buffer de reacción 10X y 15,8ul de agua destilada. 4. Al tubo 2 se agrego, 1 µgr (2ul) de ADN del fago lambda, 2 µl de buffer de reacción 10X, 0,2ul de BSA y 15,3ul de agua destilada. 5. Al tubo 3 se agrego, 0,6 µgr (5ul) de ADN genómico, 2 µl de buffer de reacción 10X, 0,2ul de BSA, 0,5ul de enzima y 12,3ul de agua destilada. 6. Nota 1: Se agrego 0,5ul de enzima EcoRI a los tubos 2 y 3 y se mezclo con la pipeta de 4 a 5 veces. Cuidando que al agregar la enzima no quedara en las paredes del ependorf. Nota 2: El tubo 1 no lleva enzima EcoRI y se usa como control ADN Fago. 7. Se incubo los eppendorf en baño termoregulador a 37ºC por 1 hora. 8. Finalmente se procedió a correr el ADN digerido mediante una electroforesis de gel de agarosa al 1%. Preparación gel de agarosa al 1% 1. Realizar un gel de agarosa a una concentración de 1%. Para la cámara de electroforesis pequeña pesar 0.2 gr. de agarosa para 20 ml de buffer de corrida. 2. Poner los 20 ml de buffer de corrida en un matraz y agregar los 0.2 gr de agarosa. Diagnóstico Molecular Página 2 Universidad Santo Tomás 2012 3. Disolver la agarosa por agitación suave y posterior incubación a 100ºC en microondas por unos segundos. 4. Se sacó el matraz del microondas con mucho cuidado y se agito suavemente. La agarosa debe estar totalmente disuelta y verse una solución transparente, de no ser así se debe volver a incubar unos segundos más. (Paso peligroso, máxima precaución). 5. Se deja enfriar la agarosa hasta aproximadamente 50 ºC y se agrega 2 µl de Red Gel concentrado 10.000X. 6. Se mezcló hasta que estuvo bien homogenizado. 7. Mientras se enfría la agarosa, se preparó el molde para verter la solución. Se sellan con “masking tape” los extremos abiertos del molde y se coloca el peine. 8. Se añadió la agarosa suavemente y con mucho cuidado al molde y se espero a que solidificará. Preparación de muestras de ADN para cargar al gel. En un trozo de parafilm se coloco 3 gotas de 5ul de buffer de carga separadamente. Se tomo con una punta nueva 10ul de la muestras de ADN (ADN genómico, ADN control y ADN Fago lambda) y se deposito sobre una de las gotas de buffer de carga. Se mezclo con la misma punta y se depositaron 14ul en el gel de agarosa. Se repitió lo mismo con las otras dos muestras. Tapar conectar la cámara a la fuente de poder. Imagen 1. Cámara de electroforesis con las muestras corriendo. 1. Se tapó la cámara con cuidado y se conecto los cables (rojo con rojo y negro con negro). El electrodo negro debe ir al lado donde se cargan las muestras. 2. los cables se conectaron a la fuente de poder con ésta APAGADA. 3. Se ajusta la fuente de poder a 80 volts. 4. Luego se encendió la fuente de poder. Visualización del gel de agarosa 1. Se colocó el gel en el transiluminador y se observó las bandas que se ven por la excitación de la sonda intercalante Red Gel. 2. Finalmente se fotografió el gel. Resultados Los resultados obtenidos al final del laboratorio, se pudo visualizar y fotografiar el gel y se pudo observar de la siguiente manera en la cámara del transilumonador. Diagnóstico Molecular Página 3 Universidad Santo Tomás 2012 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 En la imagen 2. Se observan Bandas borrosas extendidas (pocillos 4, 6 y 8). Esto podría indicar que el ADN estaba contaminado por la presencia de algunos inhibidores que interfieren en la actividad de la enzima EcoRI sobre los sitios de restricción. Se observan escasas diferencias en la intensidad de las bandas, esto en relación con la concentración de ADN. Nuestro gel tuvimos que teñirlo con bromuro de etidio tras la electroforesis debido a que sin él, las bandas no se observaban fácilmente. Por lo tanto para aumentar la diferencia en intensidad de las bandas, se incluyó el bromuro de etidio en el gel. La movilidad de las moléculas de ADN durante la electroforesis también se puede ver influenciada por la concentración del gel de agarosa, ya que a menor concentración de agarosa la electroforesis presenta una mayor migración de las moléculas. La presencia de bandas de tamaño molecular similar puede haberse debido a que la muestra de ADN no se hubo digerido bien, independiente del tiempo de incubación. Esto podría haberse debido a la presencia de contaminantes presente en la alícuota de ADN que inhiben el proceso de digestión enzimático por las enzimas de restricciones. Tales contaminantes podrían ser removidos mediante otra precipitación con etanol o filtración. Una variable a considerar es el tiempo de electroforesis, ya que se puede requerir menor voltaje y aumentar el Página 4 Imagen 2. Gel de Agarosa con las muestras de ADN corridas. Orden de las muestras cargadas. 1- Control 2- ADN genómico 3- ADN fago. 4- ADN genómico 5- ADN fago 6- ADN genómico 7- ADN fago 8- ADN genómico 9- ADN fago 10- ADN genómico 11- ADN fago Discusión En el gel de electroforesis el ADN genómico digerido con EcoRI, se observa como un chorreado, ya que EcoRI tiene cientos de sitios de restricción en el ADN genómico y por lo tanto da origen a cientos de fragmentos de distintos pesos moleculares. Es por eso que se observan chorreados debido a los cientos de fragmentos uno tras otros que avanzan durante una electroforesis en agarosa. Diagnóstico Molecular Universidad Santo Tomás 2012 tiempo de la electroforesis, y a la vez verificar que la concentración de agarosa en el gel es la adecuada para la obtención de los resultados deseados. Bibliografía Luque, J. y Herráez, A. (2003) Texto ilustrado de biologia Molecular e Ingeniería Genética: conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud. Harcourt. Pág. 137. BioRad. Manual de instrucciones de la cámara mini sub cell para electroforesis en geles de agarosa. Rev A -Facultad de Medicina UNAM, Departamento de Bioquímica. Bioquímica y Biología Molecular. Objetivos del curso y manual de prácticas de laboratorio. Mc Graw-Hill Interamericana Editores, México, 2005. - - Dr. Álvaro Vidal. Q.F. Ricardo Valera Sánchez. Manual de Procedimientos de Electroforesis para Proteínas y ADN. División de Biología Molecular Centro Nacional de Salud Pública Instituto Nacional de Salud, LimaPerú, Año 2003 Diagnóstico Molecular Página 5 Universidad Santo Tomás 2012 Diagnóstico Molecular Página 6