Efecto de Los Inhibidores en La Cadena Respiratoria

EFECTO DE LOS INHIBIDORES EN LA CADENA RESPIRATORIAI. INTRODUCCIÓN Según se ha indicado, en las oxidaciones biológicas los hidrógenos sustraídos al sustrato son transferidos en forma gradual a través de aceptores que experimentan cambios reversibles en su estado redox. En la membrana interna de las mitocondrias estos aceptores están dispuestos ordenadamente según un gradiente de potencial de reducción creciente y asociados íntimamente a las enzimas que catalizan las transferencias. El conjunto recibe el nombre de cadena respiratoria o cadena de transporte de electrones. (Blanco 2001) Dos hidrógenos cedidos en una reacción redox representan la suma de dos protones (H+) y dos electrones (e-). Hidrógenos y electrones frecuentemente son denominados equivalentes de reducción. La cadena respiratoria comprende una serie de etapas. Durante todo el recorrido, los electrones fluyen naturalmente en el sentido que les fija el desnivel en el potencial de reducción de los aceptores. En este sistema, los electrones se deslizan desde A a B, a C, a D, y al oxígeno secuencialmente, impulsados por el potencial creciente. Todos los integrantes de la cadena de transporte de electrones se encuentran en la membrana interna de la mitocondria, constituyendo un sistema multienzimático altamente ordenado. Su inclusión en la membrana asegura la disposición espacial adecuada para un óptimo funcionamiento. (Blanco 2001) Al analizar el proceso de oxidación de un sustrato y la transferencia de electrones, uno podría preguntarse por qué el sustrato no entrega sus hidrógenos directamente al oxígeno o a otros aceptores con mayor potencial de reducción que el NAD por ejemplo ya que esas reacciones son termodinámicamente más favorables. Esto se explica si se recuerda que, en las condiciones existentes en la célula, toda reacción química transcurre gracias a la existencia de catalizadores. Sólo la presencia de enzimas específicas asegura el cumplimiento de las etapas y la liberación de energía en forma gradual y controlable. Los hidrógenos no pasan directamente de un sustrato dado al oxígeno o a cualquier otro aceptor si no existen enzimas que catalicen la transferencia. (Blanco 2001) Complejo I es la NADH-ubiquinona reductasa. No afectan. que se encuentra libre en el interior de la doble capa lipídica. monóxido de carbono (CO) . pues no reciben electrones. los restantes componentes de la cadena respiratoria se agrupan en cuatro complejos multimoleculares que ocupan todo el espesor de la membrana. y del citocromo c. Posee un grupo prostético FAD y tres centros Fe-S. recibe hidrógenos de sustratos oxidados por deshidrogenasas ligadas a esa coenzima. Cataliza la reducción de O2 a H2O.A excepción de la ubiquinona (CoQ). producto vegetal. cuyas moléculas están adosadas a la cara externa de la membrana interna. Estos complejos son designados con números romanos. Por intermedio de NAD. Contiene citocromos b566. El antibiótico antimicina A inhibe el transporte de electrones en el complejo III. El estado redox de los distintos componentes puede determinarse por espectrofotometría directamente en suspensiones de mitocondrias. Complejo IV es la Citocromo oxidasa. Actúan a nivel del complejo I (NADH-ubiquinona reductasa): rotenona. Estas sustancias impiden la llegada a la CoQ de hidrógenos procedentes de sustratos oxidados por deshidrogenasas ligadas a NAD. en cambio. Los estudios con distintos agentes bloqueantes del transporte de electrones apoyan el ordenamiento propuesto. Transfiere equivalentes de reducción desde succinato a coenzima Q. los componentes de la cadena que participan en las instancias previas al sitio afectado aparecerán reducidos y los de etapas posteriores estarán oxidados. Cianuros (CN). probando así que éstos siguen otra vía. poderoso veneno de peces. Contiene FMN y varios centros Fe-S. la oxidación de succinato y otros sustratos que ceden hidrógenos a flavoproteínas con FAD. Complejo III es la Ubiquinona-citocromo c reductasa. Un recurso útil para establecer la secuencia de la cadena ha sido el uso de inhibidores que actúan en sitios específicos. Entrega los hidrógenos a ubiquinona. Como ejemplo se mencionarán algunos de los inhibidores más utilizados. y anestésicos como halotano. b562 y c1 y un centro Fe-S. Complejo II corresponde a la Succinato-ubiquinona reductasa. amital y otros barbitúricos. Transfiere electrones desde ubiquinona a citocromo c. Cuando se agrega a la preparación un inhibidor que bloquea la transferencia de electrones en un punto determinado. en la cual están incluidos los citocromos a y aa3 y dos iones Cu. 2 y 1 mL  Tubos de ensayo  Gradillas 3. MATERIALES 1. Material biológico:  Homogenizado hepático 2. sino que ha permitido conocer mejor el mecanismo de acción de algunos fármacos y venenos.5.1 M  Barbiturato de sodio 0. (Blanco 2001) El uso de inhibidores no sólo ha ayudado a deducir la secuencia de la cadena respiratoria.1 M 4. Reactivos:  Buffer fosfato de sodio 0.1 M(sustrato natural)  p-Fenilendiamina(sustrato artificial) .6 Diclorofenolindofenol 0.4  2.02%  Malonato 0. Material y equipo de laboratorio:  Juego de pipetas 10. II. El objetivo de la presente experiencia es demostrar el efecto de algunos inhibidores sobre el flujo de electrones a través de la cadena respiratoria ubicada en la mitocondria. Sustratos:  Succinato 0.1 M  Cianuro de sodio 0.1 M pH 7.y azidas (N3-) inhiben específicamente la citocromo-oxidasa o complejo IV y bloquean la etapa final de activación del oxígeno. 5 1.2 1.0 0.5 0.5 .0 --------0.5 3 1.0 0.5 3 1.0 ------0.1 M Barbiturato de sodio 0.1 M Malonato 0.1 M pH 7.02% Succinato 0.1 M p-Fenilendiamina Homogenizado hepático TUBOS DE VIDRIO 1 2.5 0.2 ------0.5 4 1.5 1.5 ----0.0 0.1 M pH 7.1 M Cianuro de sodio 0.2 0.1 M Barbiturato de sodio 0.5 0.5 0.2 --------2 1.5 5 1.2 ----0.0 ----0.0 0.6 Diclorofenolindofenol 0.4 Malonato 0.5 --2 1.5 --0.5 4 0.III.1 M Cianuro de sodio 0.4 2. B.0 0.5 ----0.0 1. SISTEMA DE SUCCINATO: TUBOS DE VIDRIO 1 Buffer fosfato de sodio 0.5 0.2 --0. PROCEDIMIENTO Se prepararon los siguientes sistemas.1 M Homogenizado hepático 1.5 --0.0 0.5 6 0. A. SISTEMA DE LA p-FENILENDIAMINA COMPONENTES(mL) Buffer fosfato de sodio 0.5 ------0.5 0.5 5 0.5 1.5 1.0 --0.5 COMPONENTES(mL)  Mezclamos el contenido de cada sistema de reacción (tubo).  Dejamos en reposo a temperatura ambiente. RESULTADOS: 1. Sistema de Succinato TUBO COLOR 1 Azul 2 Azul 3 Incoloro 4 Azul 5 Azul 6 Incoloro 2. Sistema de p-Fenilendiamina TUBO COLOR 1 Marrón claro 2 Marrón oscuro 3 Marrón oscuro 4 Marrón claro 5 Marrón oscuro .IV.  En el tubo ºN 3 al contener el 2. porque este capta los e.V. Succinato (sustrato) pero no tiene el homogenizado hepático (enzima. En el tubo ºN 6 el barbiturato inhibe a nivel de complejo II e impide que la Flavoproteina done sus electrones a la CoQ. En el tubo ºN 2 la cadena respiratoria contenida en el homogenizado hepático oxidada a la p-Fenilendiamina (marrón oscuro) a nivel del Cyt c a la vez que este se reduce. En el tubo ºN 5 la reacción no fue la esperada. luego este sigue transfiriendo los electronos por el resto de la cadena transportadora.cadena respiratoria) por lo que no se lleva a cabo ninguna reacción de reducción. Por lo que el 2.  En el tubo ºN 2 contiene 2.6 diclorofenolindofenol acepta los e.liberados por la Flavoproteina reducida (fp H2) cadena.    En el tubo ºN 4 el Malonato agregado actúa a nivel del complejo II inhibiendo a la succinato deshidrogenasa evitando la reducción del 2. Succinato (sustrato) y homogenizado hepático (enzima.6 diclorofenolindofenol (indicador). DISCUSIÓN Sistema de Succinato  El tubo ºN 1 contiene 2.reduciéndose.6 diclorofenolindofenol.  En el tubo ºN 3 el Malonato actúa a nivel de complejo II inhibiéndolo.6 diclorofenolindofenol (indicador) pero a diferencia del tubo Nº 1 no tiene Succinato (sustrato) pero si tiene el homogenizado hepático (enzima-cadena respiratoria) por lo que no se reduce el indicador. pero la pFenilendiamina dona sus e.cadena respiratoria) se produce la reducción de el indicador. . Sistema de p-Fenilendiamina   El tubo ºN 1 contiene solo p-Fenilendiamina (sustrato indicador) por lo que no hay reacción redox.6 diclorofenolindofenol (indicador).al Cyt c oxidándose (marrón oscuro). a nivel de complejo I y II. Lubert.de las flavinas a la CoQ. Para que exista una reacción redox. donados por la p-Fenilendiamina. en el sistema debe haber un elemento que ceda electrones y otro que los acepte: 5. El agente reductor: Es aquel elemento químico que suministra electrones de su estructura química al medio. BIBLIOGRAFIA Blanco. .  En el tubo ºN 5 el Barbiturato de sodio inhibe la transferencia de e.A. impidiendo que esta siga oxidándose. aumentando su estado de oxidación. 5ta edición. Señalar los componentes de un sistema de oxido-reducción biológica. QUÍMICA BIOLOGICA. pero la p-Fenilendiamina dona sus e. 8ta edición. Editorial El Ateneo. 2002. En el tubo ºN 4 el Cianuro de sodio actúa a nivel de complejo IV. El cianuro de sodio inhibe la cadena respiratoria a nivel de complejo IV. 2001. Antonio. reducido. VI. se dice que cuando un elemento químico capta electrones del medio se convierte en un elemento reducido. El agente oxidante: Es el elemento químico que tiende a captar esos electrones. quedando con un estado de oxidación inferior al que tenía. El Barbiturato de sodio impide la transferencia de e. BIOQUÍMICA. 6. y la relación que guarda con su precursor queda establecida mediante lo que se llama un par redox. CONCLUSIONES    El Malonato inhibe la cadena respiratoria a nivel de complejo II. Análogamente. Cuando un elemento químico reductor cede electrones al medio se convierte en un elemento oxidado. e igualmente forma un par redox con su precursor reducido. es decir. Editorial Reverte S.al Cyt c oxidándose (marrón oscuro). CUESTIONARIO 1. Stryer. es decir. manteniendo su color claro. impidiendo que reciba los electrones del Cyt c. oxidándose. Los tres componentes de la cadena respiratoria son:    Tres grandes complejos proteicos con moléculas transportadoras y sus correspondientes. Los inhibidores del transporte de electrones más comúnmente usados pueden reunirse en tres grupos principales según el sitio de la cadena respiratoria donde actúan: a. como el amobarbital. Sobre la NADH-deshidrogenasa. Una pequeña proteína llamada citocromo c que es periférica y se ubica en el espacio intermembrana. El succinato: Ingresa a nivel del complejo II. Piericidina A (antibiótico). Señalar los componentes de la cadena respiratoria. La P – Fenilendiamina: Ingresa a nivel del complejo IV. De ejemplos de inhibidores de la cadena respiratoria. b. enzimas 3. c. Los inhibidores reciben este nombre porque su principal función es el inhibir el transporte de electrones en la cadena de la respiración. 4. (inhibidores de sitio III):  Antimicina. Rotenona (insecticida). H2S. Monóxido de carbono.2. bloqueando la transferencia de electrones entre la flavina y la ubiquinona. (Inhibidores del sitio I):    Barbitúricos. Un componente no proteico: UBIQUINONA (Q) que están embebidos en la membrana. Actúan sobre el Hemo a3 de la citocromooxidasa impidiendo su interacción con el oxígeno (inhibidores de sitio IV):    Cianuro. Actúa bloqueando la transferencia de electrones entre el citocromo b y el citocromo c1. . pero adosado laxamente a la membrana interna. De ejemplos de sustratos y el nivel al que ingresan en la cadena respiratoria. Estos agentes causan tasas de respiración máxima pero el transporte de electrones no genera ATP. pero la fosforilación oxidativa a nivel de sustrato es exergónica. la fosforilación oxidativa aparece luego de la cadena de transporte de electrones. Se le llama así para distinguirla de otras rutas que producen ATP con menor rendimiento. La fosforilación oxidativa es una ruta metabólica que utiliza energía liberada por la oxidación de nutrientes para producir adenosín trifosfato (ATP). La fosforilación oxidativa es endergónica. que se asocian con protones en el exterior de la mitocondria.4-dinitrofenol (DNP). debido a que los protones translocados no regresan a la matriz mitocondrial a través de la ATP sintasa. De ejemplos de desacopladores de la fosforilación oxidativa. Es la síntesis de ATP (o de otro nucleótido trifosfatado) por transferencia de un grupo fosforilo y una molécula fosforilada de ADP (o de otro nucleótido difosfatado) en la que no participa la ATP-sintasa. Una clase importante de antimetabolitos son los agentes desacopladores ejemplificados por el 2. y que se disocian del protón en el interior de la mitocondria. Los agentes desacoplantes actúan como ácidos lipofílicos débiles. 8. La fosforilación oxidativa a nivel de sustrato no utiliza la ATP sintasa. .5. llamadas "a nivel de sustrato". que pasan a través de la membrana unidos a un protón. Las dos producen ATP. Establezca diferencias y semejanzas entre fosforilación oxidativa en la cadena respiratoria y la fosforilación a nivel de sustrato. debido a la fosforilación del ADP. Que entiende por fosforilación a nivel de sustrato. Por ejemplo la fosfoglicerato quinasa y la piruvato quinasa catalizan la fosforilación a nivel de sustrato en la glicolisis. 7. Una fosforilación a nivel de sustrato es la formación de un nuevo enlace de fosfato de alta energía en la que NO PARTICIPA EL OXIGENO. 6. La fosforilación oxidativa es apoyada por una fuerza protón motriz generado por los complejos de la cadena de transporte de electrones. por el contrario las fosforilación oxidativa si la utiliza. La fosforilacion oxidativa a nivel de sustrato aparece en la glicolisis. Que entiende por fosforilación oxidativa. La fosforilación oxidativa se da en aerobiosis. Graficar en una cadena de oxido-reducción biológica la vía de entrada del 2. la fosforilación oxidativa a nivel de sustrato puede darse en anaerobiosis (glicolisis). La p-Fenilendiamina participa como sustrato además de ser indicador. reduciendo a la forma marrón claro. 10. . La velocidad de transferencia de electrones puede entonces medirse siguiendo la perdida de color del pigmento.6 Diclorofenolindofenol y la p-Fenilendiamina. en la cadena de electrones acepta electrones liberados por el Cyt c reducida. Interpretar el cambio del estado incoloro ha coloreado del p-Fenilendiamina. 9. La p-Fenilendiamina es un sustrato indicador artificial que en estado oxidado presenta un color marrón oscuro.