Doseamento de Antibióticos _ Controle de Qualidade microbiológico

UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA E BIOLOGIADoseamento Microbiológico de Antibióticos Profª. ANA FLÁVIA OLIVEIRA SANTOS  Cepas ATCC (American Type Culture Collection). . não quantificáveis por métodos físico-  1929 – Penicilina (Fleming).  Procedimentos gerais  Padrão USP.Dosagem Microbiológica de Antibióticos  Substâncias químicos.  1948 – Farmacopéia Britânica.  1955 – United States Pharmacopea (USP).  Padrão USP.20μg 22.Dosagem Microbiológica de Antibióticos  Avaliação comparativa.  Cepas ATCC (American Type Culture Collection).5 μg 13.11 mm P4 .5μg 17 mm P1 . frente a um padrão biológico de referência.11 mm Placa com os padrões de Ciprofloxacina e o microrganismo-teste Staphylococcus aureus ATCC 25923.2. . P2 .10μg 19.22 mm P3 .  Métodos microbiológicos para determinação da potência dos antibióticos são indicados para substâncias ou preparações. .  A atividade (potência) de antibióticos pode ser demonstrada sob condições adequadas através de seu efeito inibitório sobre o crescimento microbiano. em que o seu teor não poder ser determinado por métodos físicoquímicos.Doseamento microbiológico de antibióticos  A quantificação microbiológica de substâncias ativas demanda sempre no emprego de uma avaliação comparativa frente a um padrão biológico de referência.  Uma redução na atividade antimicrobiana pode revelar alterações sutis não demonstráveis por métodos químicos. em meio de cultura específico e condições adequadas.Métodos biológicos para determinação de Potência de Antibióticos Difusão em ágar Ensaio de difusão em ágar ou cilindro em placas (este método fundamenta-se na determinação da potência do antibiótico em estudo. Método Turbidimétrico Método turbidimétrico (considera a relação entre a proporção de crescimento da população microbiana no meio líquido e a concentração da substância ensaiada. através de halos de inibição do crescimento do microrganismo sensível a este antibiótico. sendo mais empregado no doseamento de vitaminas e aminoácidos). com relação a potência do seu padrão internacional de referência. . Emprega meio de cultura sólido inoculado. O crescimento do microrganismo ocorre respeitando. Relaciona o tamanho da zona de exibição (fatores de crescimento) ou inibição (antibiótico) de crescimento com a dose da substância ensaiada. em sistema mono ou bicamadas.Difusão em Agar É fundamentalmente um método físico. gerando contraste e resultando a chamada zona de inibição de crescimento. e as placas são então incubadas. porém. no qual um microrganismo é usado como Revelador. distribuído em placas. em área restrita. através do qual a substância teste se difunde. A solução teste é aplicada sobre a superfície do meio. áreas onde tenha ocorrido a difusão do antibiótico. . Ocasional deficiência de contato do cilindro com a superfície do ágar provocando o aparecimento de halos deformados. Métodos dependentes da concentração da solução teste.Solução teste nas placas Semeadas Cilindros ou furos no gel. Desvantagens do método de cilindro em placa Não formação de halos nítidos. Métodos dependentes da quantidade testada em cada unidade de suporte. . Disco de papel ou métodos nos quais a solução amostra é transferida na forma de micro gotas. Densidade de semeadura. Uniformidade do ágar. Condição do microrganismo teste. . Espessura do gel e tamanho do halo são inversamente proporcionais. Espessura. Tempo de aplicação da solução-teste. Composição do meio. Condições de incubação. se na forma vegetativa ou esporulada. ou ser padronizado. Fatores que afetam o tamanho do halo de inibição de crescimento Escolha do microrganismo e sua sensibilidade. sendo importante a sua uniformidade. Volume da solução teste no cilindro ou disco deve ser grande suficiente para ser considerado constante.Fatores que influenciam a Dosagem microbiológica pH. Temperatura de incubação. Potência da solução-teste. 2mL. a fim de que a difusão inicie ao mesmo tempo. Os solventes. Cuidados dizem respeito a randomização das placas na distribuição de soluções-padrão e de amostras. preparação da amostra e faixas de concentração devem seguir orientação da monografia específica. dentro do menor tempo possível para transferência das soluções. . diluentes.Considerações para o ensaio por Difusão em Agar Cada placa de 10 cm de diâmetro comporta até 6 cilindros ou igualmente 6 furos. No caso dos cilindros a colocação pode ser manual com auxílio de pinça ou através de dispensadores que simultaneamente colocam todos os cilindros por placa. Aplicar soluções nos cilindros (ou outro dispositivo) por meio de pipeta que libere volume uniforme da ordem de 0. com variação máxima de 0. Medir o diâmetro das zonas de inibição do crescimento e calcular a potência da substância a partir dos resultados. % A/P = Antilog [2 + F/E x log (rd)] Onde: F = ( A total – P total) /3 E = [ (Total A3 – Total A1) + ( Total P3 – Total P1)] / 4 Rd = razão das doses ou % A/P= 102 (Rd F/E) .Considerações para o ensaio por Difusão em Agar Incubar as placas na temperatura indicada.5ºC durante o período de 16 a 18horas. 3 32 a 35 32 a 35 . de incubação mL/100 das placas ºC ml Base 21 Superfície 4 0. Antibiótico Microrganismo Meios de cultura).7468) Micrococcus luteus (ATCC .5 32 a 35 36 a 38 Bacitracina Bacitracina 2 2 1 1 21 21 4 4 0.9341) Micrococcus flavus resistente à neomicina (ATCC 14452) Micrococcus luteus (ATCC .9341) 11 Ampicílina Anfomicina Micrococcus luteus (ATCC .10240) 11 2 11 1 21 21 4 4 0. Base Superfície 11 Volume (mL) de meio a ser Volume de aplicado nas Temperatura inóculo camadas.5 32 a 35 Amoxilina Micrococcus luteus (ATCC.5 0.Farmacopéia Brasileira Meio de cultura a ser usado (conforme 3.3 0. 20 e 40 l/mL Temperatura de incubação: 35-37 °C Tempo de incubação: 18 horas .2 mL Concentração inicial: 1000 l/mL Concentrações finais: 10.Condições para o ensaio de Cefalexina Produto em análise: Cefalexina.0 Meios de cultura – Camada base .Ágar Muller Hinton Camada semeada . Forma farmacêutica: Drágeas Método empregado: Difusão em ágar Microrganismo teste: Micrococcus luteus Solução diluente: Tampão fosfato de potássio pH 6.Ágar Muller Hinton Volume do inóculo: 0. Considerações para o ensaio por Turbidimetria Empregar para cada antibiótico o microrganismo e caldo nutritivo indicado pela Farmacopéia. Determinar experimentalmente o volume de inóculo a ser adicionado a 100mL de Caldo a partir da quantidade sugerida. além do meio de cultura líquido e microrganismo teste. e após incubação da mistura procede-se a leitura da resposta... O princípio do método é simples. O meio inoculado deve ser preparado e utilizado imediatamente. A substância teste é adicionada a suspensão do organismo teste presente em meio nutriente. .Método Turbidimétrico Caracteriza-se por séries de tubos contendo concentrações muito próximas do antibiótico. Pelo menos 18 tubos são usados para o ensaio. . calcular a potência da amostra e seus limites de confiança.5mL de solução de formaldeído. Tomando a preocupação de assegurar temperatura uniforme e tempo de incubação idêntico para todos os tubos. a 12% em cada tudo. A partir dos resultados.Três tubos para cada concentração do padrão e da amostra. à temperatura adequada. de 3 a 4 horas. Determinar a absorvância para cada tubo em fotocolorímetro apropriado. Incubar em banho maria. interromper a multiplicação dos microrganismos pela adição de 0. Após o período de incubação.Considerações para o ensaio por Turbidimetria Distribuir em tubos idênticos. no comprimento de onda de 530 nm. volumes igual de cada uma das soluções amostra e padrão. Dosagem Microbiológica de Antibióticos Difusão em Ágar  Método físico  Microrganismo revelador  Zona de Inibição de crescimento  Método Turbidimétrico  Inibição de crescimento  Solução uniforme do antibiótico  Caldo . Rev. T. 2005. v. J. 2001. E. Cezaretto. Lachman.L. São Paulo... S. São João da Boa Vista. farm. Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos e correlatos. Ohara. E. São Paulo. L. Teoria e prática na indústria farmacêutica. Doseamento microbiológico do norfloxacino... 2000..12. T. p. Schapoval. São paulo: atheneu. 1988. lisboa: fundação calustre gulberman. Pinto. H. P. M. método da difusão em ágar (cilindro em placas). V.2. M. d. J. T. C. Kanig. de . Lieberman.161-65.. Controle da qualidade microbiológica medicamentos. Ciênc. Kaneko. 1990. E.Referências Farmacopéia brasileira 4ª ed.A. Fröehlich..