Documentos de la SEQC 2009Sumario Procedimiento recomendado para la calibración de termómetros en el laboratorio clínico Comité Científico Comisión de Metrología Documento G. Fase 3. Versión 2 Preparado por: J. Batista Castellví 2 6 Criterios para la selección de un modelo de automatización del laboratorio Comité Científico Comisión de Instrumentación y Sistemas Analíticos Documento A. Fase 3. Versión 2 Preparado por: JL Bedini Chesa, S. Esteve Pablador, L. García Beltrán, JM Gasalla Herraiz, C. Macías Blanco, M. Martínez Casademont, JM Moreno Cebeira, V. Martínez Vázquez, B. Prieto García, G. Serrano Olmedo, J. Torres Nicolau Recomendaciones preanalíticas para la medición del equilibrio ácido-base y gases en sangre Comité Científico Comisión de Magnitudes Biológicas relacionadas con la Urgencia Médica Documento H. Fase 3. Versión 5 Preparado por: X. Navarro Segarra, JL Marín Soria, A. Buño Soto, R. Díaz García, A. Galán Ortega, P. Guevara Ramírez, E. Guillén Campuzano, M. Muñoz Pérez, P. Oliver Sáez, N. del Río Barcenilla 18 23 27 30 41 Técnicas para la preparación de semen en reproducción asistida Comité Científico Comisión de Seminología y Técnicas de Reproducción Asistida Documento C. Fase 3. Versión 4 Preparado por: I. Sánchez, C. Mar, JA Castilla, M. Marcos, I. Martín, A. Galán, MI Jiménez, JM Moreno, MG Serrano, I. García-Cobaleda, C. Aulesa, V. Lozano, C. Sánchez, J. de Montserrat Recomendaciones para la estimación de la incertidumbre de medida en el laboratorio clínico Comité Científico Comisión de Metrología Documento H. Fase 3. Versión 2 Preparado por: FJ Gella Tomás, F. Canalias Reverter, S. Izquierdo Álvarez, V. Martínez Vázquez, M. Sánchez Manrique Recomendaciones para el estudio de las gammapatías monoclonales Documento de consenso. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular (SEQC) y Asociación Española de Hematología y Hemoterapia (AEHH) Comité Científico Comisión de Proteínas (SEQC) y Grupo Español de Mieloma (AEHH) Documento I. Fase 3. Versión 3 Preparado por: C. Martínez-Brú, R. García Sanz, J. Martínez-López Recomendaciones para la calibración de material volumétrico en el laboratorio clínico Comité Científico Comisión de Metrología Documento E. Fase 3. Versión 2 Preparado por: R. Ruíz Morer Fotografía de portada: Núria Insa Domicilio Social SEQC: c/ Padilla, 323. Despacho 68, 08025 Barcelona. Tel. 934 462 670. Fax 934 462 672 correo-e:
[email protected]. http://www.seqc.es. Edita: Publicaciones Nacionales Técnicas y Extranjeras, S.A. Redacción: c/ Padilla, 323 08025 Barcelona. Tel. 934 462 820 Fax. 934 462 064 Impresión: Trajecte. Depósito legal: B-33169/09. ISSN: 2013-5750 Procedimiento recomendado para la calibración de termómetros en el laboratorio clínico Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular Comité Científico Comisión de Metrología1 Documento G. Fase 3. Versión 2 Preparado por: J. Batista Castellví ÍNDICE 0. Introducción 1. Objeto y campo de aplicación 2. Normas para consulta 3. Definiciones 4. Requisitos metrológicos: criterios de aceptación 5. Procedimiento 5.1 Patrones 5.2 Condiciones previas 5.3 Procedimiento de calibración 5.4 Cálculo del error sistemático y de la incertidumbre de medida 5.5 Frecuencia de calibración 6. Aplicaciones 7. Bibliografía Anexo 1. Cálculo de la incertidumbre Anexo 2. Ejemplo de resultados de calibración 2. NORMAS PARA CONSULTA ● Asociación Española de Normalización. Sistemas de gestión de la calidad. Requisitos. UNE-EN ISO 9001:2000. Madrid: AENOR; 2000. ● Asociación Española de Normalización. Laboratorios Clínicos. Requisitos particulares relativos a la calidad y la competencia. UNE-EN-ISO 15189 :2003. Madrid : AENOR ; 2003. ● Centro Español de Metrología. Vocabulario internacional de términos fundamentales y generales de metrología (VIM). Madrid: Ministerio de Obras Públicas, Transportes y Medio Ambiente; 1994. 3. DEFINICIONES 3.1 Calibración Conjunto de operaciones que establecen, en condiciones especificadas, la relación entre los valores de una magnitud indicados por un instrumento de medida o un sistema de medida, o los valores representados por una medida materializada o por un material de referencia, y los valores correspondientes de esa magnitud realizados por patrones (VIM). 0. INTRODUCCIÓN Los termómetros que se utilizan para mediciones de temperaturas que pudieran afectar, directa o indirectamente, la calidad de los resultados generados en el laboratorio, deberían estar apropiadamente calibrados. Según las normas para la gestión de la calidad ISO 15189 e ISO 9001, los laboratorios clínicos deben establecer una programación que controle y demuestre periódicamente que sus instrumentos de medida se encuentran calibrados y mantener documentos que describan los procedimientos de calibración y los criterios de aceptación, así como informes que contengan datos de las calibraciones efectuadas. 3.2. Error máximo permitido (de un instrumento de medida) Valor extremo de un error permitido por especificaciones, reglamentos, etc. para un instrumento de medida dado (VIM). 3.3. Error sistemático Media que resultaría de un número infinito de medidas del mismo mensurando realizadas bajo condiciones de repetibilidad menos un valor verdadero del mensurando (VIM). NOTA: Para obtener una estimación, se realiza un número finito de mediciones y se utiliza un valor convencionalmente verdadero del mensurando. 1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN Este documento describe un procedimiento para calibrar los termómetros de columna de líquido y los termómetros digitales por el método de comparación, en el intervalo de temperaturas comprendido entre 0 y 100 ºC. Aunque determinados termómetros permiten intervalos de medida mayores, no se considera útil ampliar el campo de aplicación de esta recomendación a otras temperaturas. 3.4. Escala (de un instrumento de medida) Conjunto ordenado de trazos con cualquier numeración asociada, que forma parte de un dispositivo indicador de un instrumento de medida (VIM). Composición de la Comisión J. Batista Castellví, F. Canalias Reverter, F. J. Gella Tomás, B. González de la Presa, R. Ruiz Morer, M. Sánchez Manrique (Presidente). 1 3.5. Exactitud de un instrumento de medida Aptitud de un instrumento de medida para dar respuestas próximas a un valor verdadero (VIM). 2 • Documentos de la SEQC 2009 Procedimiento recomendado para la calibración de termómetros en el laboratorio clínico 3.6. Imprecisión Coeficiente de variación de un conjunto de resultados obtenidos al medir repetidamente un mensurando con un mismo procedimiento de medida. laboratorio clínico. No obstante, determinadas circunstancias pueden exigir requisitos más o menos estrictos que los aquí recomendados. Categoría A EMP (ºC) 0,5 1,0 2,0 3.7. Incertidumbre de medida Parámetro, asociado al resultado de una medición, que caracteriza la dispersión de los valores que podrían razonablemente ser atribuidos al mensurando (VIM). B C 3.8. Intervalo de medida Módulo de la diferencia entre dos límites de un rango nominal (VIM). 3.9. Patrón Medida materializada, instrumento de medida, material de referencia o sistema de medida destinado a definir, conservar o reproducir una unidad o uno o varios valores de una magnitud para que sirvan de referencia (VIM). Para cada termómetro del laboratorio deben establecerse las medidas que con dicho instrumento se efectúan y asignarle como error máximo permitido el más estricto de las categorías de medida que se realizan con el mismo. El error máximo permitido se utilizará como criterio de aceptación de las calibraciones. 5. PROCEDIMIENTO 5.1 Patrones Para la calibración por el método de comparación debe utilizarse como patrón un termómetro de resolución adecuada y previamente calibrado con referencia a la Escala Internacional de Temperatura de 1990, EIT-90. Se recomienda usar un termómetro digital con sonda de resistencia de platino del tipo PT 100, acompañado de un certificado de calibración expedido por un laboratorio acreditado o un instituto nacional de metrología, debiendo constar en dicho certificado la trazabilidad a patrón de referencia, la incertidumbre expandida y el factor (o probabilidad) de cobertura que se ha utilizado en la cálculo de incertidumbre expandida. 3.10. Resolución La menor diferencia de indicación de un dispositivo visualizador que puede percibirse de forma significativa (VIM) 3.11. Trazabilidad Propiedad del resultado de una medición o de un patrón tal que pueda relacionarse con referencias determinadas, generalmente a patrones nacionales o internacionales, por medio de una cadena ininterrumpida de comparaciones teniendo todas las incertidumbres determinadas (VIM). 3.12. Valor convencionalmente verdadero (de una magnitud) Valor atribuido a una magnitud particular y aceptado, algunas veces por convenio, como teniendo una incertidumbre apropiada para un uso dado (VIM). NOTA: También es denominado “valor convencional”. 5.2 Condiciones previas La comparación de temperaturas se efectúa en un baño líquido de agua, glicerina o aceite mineral. El recipiente ha de tener las dimensiones adecuadas al tamaño de los termómetros utilizados, con un volumen de líquido de al menos 100 veces el volumen del termómetro a calibrar. El baño ha de ser de temperatura programable y estable, con agitación constante para garantizar la uniformidad en todo el baño. Los termómetros están diseñados para indicar temperaturas correctamente cuando el bulbo y la columna están totalmente inmersos en el medio a medir (1 cm de columna puede estar fuera del medio para poder efectuar la lectura). Cuando se va a utilizar un termómetro de inmersión parcial, éste debe ser sumergido en el baño de calibración a la misma profundidad de uso. 4. REQUISITOS METROLÓGICOS: CRITERIOS DE ACEPTACIÓN El error máximo de medida de temperatura permitido (EMP) en el laboratorio clínico depende sustancialmente del objeto de la medición. De forma general pueden establecerse las siguientes categorías: A. Mediciones de temperatura de incubación que pueden afectar al valor de la concentración catalítica de una enzima o la medición del pH en la sangre. B. Mediciones de temperatura de incubación de cultivos celulares. C. Otras mediciones de temperatura, por ejemplo, en áreas de almacenaje. Teniendo en cuenta el estado actual de la tecnología de los instrumentos para la medición de temperatura utilizables en los laboratorios clínicos, se recomiendan los requisitos para el error máximo permitido de las mediciones de temperatura que se muestran en la siguiente tabla. Estos valores deben considerarse como una aproximación razonable y aplicable a muchas situaciones del 5.3 Procedimiento de calibración a) Seleccionar la temperatura a la que se desee calibrar el termómetro. Para ello escoger la temperatura de uso o tres temperaturas que abarquen la escala del termómetro a calibrar. Se recomienda realizar la calibración a temperaturas crecientes. b) Sumergir el termómetro a calibrar y la sonda patrón. Colocarlos cerca pero con suficiente espacio entre ellos para asegurar la circulación del líquido. c) Esperar que la temperatura se estabilice y leer la indicación de temperatura en ambos termómetros, 5 veces, de forma alternativa y dejando unos 10 segundos entre lecturas. Anotar las indicaciones del patrón (tPi ) y las indicaciones del termómetro a calibrar (tXi). Documentos de la SEQC 2009 • 3 25 x Up2 f) La incertidumbre combinada expandida (Uc) para el intervalo de confianza de aproximadamente el 95% resulta de multiplicar la anterior por el factor de cobertura 2. b) Incertidumbre asociada a la resolución (ur): la resolución del termómetro patrón (rp) y la del termómetro a calibrar (rX) ocasionan errores aleatorios de redondeo. La incertidumbre expandida (generalmente para el 95% de confianza) con un valor del factor de cobertura empleado (habitualmente kp = 2) es: up = Up = Up kp 2 d) Otros componentes de la incertidumbre como por ejemplo el asociado a la deriva de las sondas y los termómetros.5.29 rx Incertidumbre asociada a la resolución del termómetro a calibrar c) La incertidumbre asociada a la calibración del termómetro patrón: Se calcula a partir de los datos que proporciona el certificado del termómetro patrón.084 x rp2 + 0. También deberían calibrarse siempre que exista alguna sospecha de funcionamiento incorrecto o después de haber sido sometidos a temperaturas inadecuadas u otra situación que se piense que puede comprometer su funcionamiento. la desviación típica es igual a la amplitud de la distribución dividida por la raíz cuadrada de 12.084 x rx2 + 0. Estas condiciones son aplicables a cada temperatura de calibración. Description and use of a precision thermometer for the clinical laboratory. en ese intervalo. superiores el error máximo permitido. Washington. BIBLIOGRAFÍA . a) Calcular la media (tP) y (tX). Procedimiento TH-004 para la calibración de termómetros de columna de líquido de inmersión total. La suma del valor absoluto de ES con la de Uc debe ser inferior o igual al error máximo permitido. En el anexo 1 se detalla el origen y significado de los términos de esta ecuación. El instrumento puede utilizarse restringiendo su intervalo de medida o variando el error máximo permitido en función de la escala de medida.084 x rx2 + 0. e) La incertidumbre combinada típica (uc) se calcula a partir de la suma de cuadrados de las incertidumbres de cada componente: uc = uc = sp2+ sx2 + urp2 + urx2 + up2 sp2+ sx2 + 0. APLICACIONES El proceso de calibración de los termómetros permite obtener evidencia objetiva de que. 2004. - National Institute of Standards and Technology (NIST).084 x rp2 + 0.29 rp 12 = 0. 6. esto es.Centro Español de Metrología. e) Evaluar los resultados. Madrid: Minis terio de Industria y Energía.084 x rp2 + 0. b) Calcular la desviación típica (sp) y (sx) c) Calcular el error sistemático (ES) ES = tP – tX d) Calcular la incertidumbre combinada expandida para una probabilidad de cobertura de aproximadamente el 95% (Uc) aplicando la siguiente ecuación: Uc = 2 x sp2+ sx2 + 0. Incertidumbre asociada a la resolución del termómetro patrón urp = rp / urx = rx / 12 = 0. tienen las siguientes fuentes de incertidumbre (u): a) Incertidumbre asociada a la dispersión de las lecturas sp y sx se calcula a partir de la desviación típica (s) de 5 medidas repetidas. En este tipo de distribución. así como la homogeneidad y estabilidad del baño. SRM 934. Esto no cuestiona todas las mediciones que se efectuaron con anterioridad con el mismo termómetro. no se cometen errores inadmisibles. 5. Es posible que se obtengan resultados insatisfactorios en alguno de los puntos de calibración. NIST special publication 260-113. El valor medio del termómetro patrón (tP) se ha de corregir por la desviación (si existe) indicada en el certificado. Uc = 2 x sp2+ sx2 + 0. cuando se utiliza el instrumento para efectuar mediciones de temperatura. Edición 0.25 x Up2 4 • Documentos de la SEQC 2009 . 7. sino tan sólo aquéllas cercanas al punto de calibración para el que se obtuvieron resultados anómalos.084 x rx2 + 0. La amplitud de la distribución de posibles errores es igual a la resolución y.25 x Up2 general es suficiente calibrar los termómetros una vez al año. En Anexo 1. pueden ser ignorados por su escasa relevancia en las aplicaciones habituales del laboratorio clínico.5 Frecuencia de calibración La frecuencia de calibración de un termómetro depende de las características del instrumento y del uso a que se somete. cualquier valor tiene las mismas probabilidades de producirse (distribución rectangular o uniforme).4 Cálculo del error sistemático y de la incertidumbre de medida Los cálculos descritos se realizan para cada una de las temperaturas de calibración. 1990. Cálculo de la incertidumbre Las medidas realizadas con el termómetro. 1 ● Incertidumbre asociada a la calibración del termómetro patrón up = 0.11 ºC sX = 0.0012 + 0.138 ºC sP = 0.001 ºC ● Características del termómetro a calibrar Termómetro de columna mercurio.Procedimiento recomendado para la calibración de termómetros en el laboratorio clínico Anexo 2.5 ºC Resultado conforme sP2 + sX2 + 0.25 x Up2 Uc = 2 x 0.020 ºC Resolución (rp): 0.29 x 0.020 / 2 • Incertidumbre combinada expandida Uc = 2 x Uc = 0. tP = 60.29 x 0.03162 + 0.084 x rp2 + 0.030+0.00117 ºC tX = 60.084 x rx2 + 0.29 rx = 0.0316 ºC ● Incertidumbre asociada a la resolución de los dos termómetros urp = 0.29 rp = 0.088 Cálculo del error sistemático (ES) ES = tP .12 + 0.138 .088 = 0.60.001172 + 0.1 ºC ● Incertidumbre asociada a la dispersión de las lecturas calculada a partir de la desviación típica de 5 medidas repetidas.020 2 Documentos de la SEQC 2009 • 5 . Ejemplo Calibración de un termómetro de columna de mercurio de categoría A.tX | ES | = 60.084 x 0.001 urx = 0.084 x 0.119 ºC |ES + Uc | < 0.25 x 0.030 ºC Error total en la medida del termómetro a calibrar |ES + Uc|= 0.110 = 0. a la temperatura de 60 ºC ● Características de la sonda de calibración Sonda de resistencia de platino PT100 Incertidumbre de calibración (Up): 0. de inmersión total Rango de medida: 0-100 ºC Resolución (rx): 0. 0. No es objeto de este documento la revisión exhaustiva de todas y cada una de las posibles soluciones existentes en el mercado. mejorar. Bibliografía 0. Gestión de muestras especiales una vez dentro del proceso analítico 4.2. proporcionándole información fiable y útil para el correcto diagnóstico de las enfermedades. C Macías Blanco. S Esteve Poblador. recursos humanos y técnicos. M Martínez Casademont. Trazabilidad Fase Analítica 4. nos basaremos en la información proporcionada por el fabricante. Recuperación de muestras ya procesadas 5.1. Será de utilidad crear un guión en el que se incluyan todos estos aspectos. Versión 2 Preparado por: JL Bedini Chesa. La automatización ha permitido hacer más con menos y los nuevos descubrimientos científicos han creado. fundamentalmente. V Martínez Vázquez. nuevas necesidades y procedimientos que han repercutido en un aumento de la demanda de servicios al laboratorio clínico. 2. Identificación de la muestra 3. Conclusiones 7. L García Beltrán.4. Fase Postanalítica 5. para el seguimiento evolutivo de las mismas y para el control de la eficacia de la terapéutica aplicada. Tipos de contenedores 3. Control de la integridad de las muestras 4.6.2.Criterios para la selección de un modelo de automatización del laboratorio Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular Comité Científico Comisión de Instrumentación y Sistemas Analíticos Documento A. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN Este documento recoge una serie de aspectos a considerar para la selección de un modelo de automatización. Por otro lado.5.1. Fase 3. Trazabilidad de las muestras 5. si es posible. En este complejo escenario.5. Recursos humanos necesarios para la gestión y manteni miento del sistema de automatización en la fase ana lítica 5. Pero también será imprescindible considerar las características de cada laboratorio: los puntos fuertes a conservar y.7. que permitirán agrupar la actividad de varias especialidades del laboratorio clínico. Gestión de los módulos del sistema automatizado 4. en adecuar la tecnología necesaria para el estudio de fluidos y tejidos del cuerpo humano. Control de la calibración y controles de calidad 4. INTRODUCCIÓN Los avances tecnológicos desarrollados en los últimos años pueden condicionar la aparición e implantación de nuevos sistemas organizativos.3. de manera que compartan espacio físico. los aspectos que claramente precisan una mejora o un replanteamiento y aquellas innovaciones que deseamos implementar. Identificación de los pacientes: hospitalizados y ambulatorios 3. Configuración 3. 1. 3. A la hora de seleccionar un modelo de automatización se estudiará la fiabilidad y la practicabilidad de las soluciones disponibles. a su vez.1. la practicabilidad es un índice de información sobre las prestaciones del modelo de interés bajo las condiciones particulares del laboratorio donde se implanta.5. los profesionales de los laboratorios no pueden además olvidar su misión.3. sino el aportar unas 6 • Documentos de la SEQC 2009 .4. para que podamos ir reflejando una a una las soluciones que nos aporta cada modelo de automatización y las impresiones que nos suscitan en caso de que podamos valorar diferentes opciones aplicadas en otros laboratorios que compartan nuestras características básicas. J Torres Nicolau ÍNDICE Introducción Objeto y campo de aplicación Modelos de automatización Fase preanalítica 3. Acceso a la información generada sobre la muestra a tiempo real y validación técnica de resultados 4. Capacidad de almacenamiento 5. Conexión de los autoanalizadores con el sistema de in formación del laboratorio 6. Versatilidad de la automatización en la fase analítica 4.3. G Serrano Olmedo.8. 1. Las constantes mejoras en la instrumentación han conducido a un incremento notable de la capacidad productiva del laboratorio clínico. 4. los cuales se ven sometidos a la presión de los usuarios para la puesta a punto de nuevos procedimientos diagnósticos.4. Gestión de prioridades 4. JM Gasalla Herraiz. La fiabilidad nos habla de la capacidad que tiene un sistema para mantener una adecuada calidad analítica (veracidad e incertidumbre) a lo largo del tiempo.2. en la experiencia de otros usuarios y en las publicaciones de evaluaciones de cada modelo. Indicación de caducidad o días de conservación 5. B Prieto García. JM Moreno Cebeira. Archivo de muestras. Para conocer las prestaciones del sistema. con el fin de servir de apoyo a la clínica. que consistirá. El gran número de muestras que procesaban estos centros.UU y Canadá. Algunas de estas work-cells. de manera que se crean áreas.1. sobre todo en los sistemas de primera generación. Pueden agrupar más de un equipo. y el Hospital Clínico de Barcelona (España). Documentos de la SEQC 2009 • 7 . • Bioquímica básica. • Representa un ahorro considerable en el número de tubos. atendiendo a criterios tecnológicos o de tipo de muestra. escasa capacidad para aumentar la actividad del laboratorio mediante la adquisición de nuevas cuotas de mercado. la evolución de la tecnología ligada a los laboratorios ha planteado propuestas más flexibles. Y como ventajas: • Permite la gestión integral de la muestra.Criterios para la selección de un modelo de automatización del laboratorio recomendaciones que faciliten establecer cuál sería el modelo más adecuado para un laboratorio concreto. • Menores limitaciones arquitectónicas. de la capacidad de entendimiento entre los fabricantes de sistemas de transporte y los de instrumentos analíticos. • No es totalmente adecuado para la gestión integral de la urgencia. hasta el momento. • Determinaciones en sangre total. existen pocos laboratorios que hayan adoptado este modelo de automatización global. Sasaki responsable del primer laboratorio que se creó bajo esta concepción. preparación de alícuotas y sistemas de carga (racks) de los distintos analizadores. para atender: • Área de preanalítica. M. la mayoría de ellos totalmente cerrados. el nuevo Hospital Pompidou de París (Francia). • Los sistemas modulares integrados. por lo que en ocasiones puede requerirse un circuito diferenciado. el laboratorio central obtiene beneficios cuando lleva acoplada toda la gestión del proceso preanalítico. suero. poseen su propio sistema de transporte mecánico de muestras entre los diferentes módulos incorporados o están constituidas por un solo instrumento modular. de tipo modular. con clasificación. • Resolución de problemas de la fase preanalítíca. Regensburg (Alemania). Helsinki (Finlandia). que permiten a los laboratorios adaptarse mejor a futuros cambios importantes. • Coagulación básica. personal y actividades asistenciales pertenecientes a diferentes servicios y especialidades de laboratorio. • Permite una mejor gestión de la urgencia. poca repercusión real. al tener que limitarse al panel desarrollado por el fabricante. • Diferencias notables entre los modelos organizativos europeos y los de EEUU y Japón. de las propias work-cells. fundamentalmente en EE. • En la mayoría de los Sistemas Sanitarios Europeos. • Necesidad de un espacio adecuado. 2. sistema de transporte de muestras propio e incluso sistemas de preparación y teñido automático de extensiones de sangre. físicamente independientes. en 1984. • En los sistemas separados. • Permite la mayor optimización de recursos humanos. MODELOS DE AUTOMATIZACIÓN El concepto de organización de laboratorio unificado (core lab) ha variado en los últimos años como consecuencia del progreso tecnológico. 2. Como ventajas de este sistema se pueden considerar: • Menor inversión inicial. Sobre todo en cuanto a trazabilidad. • Dificultades en la comunicación entre el Sistema Informático de Laboratorio (SIL) y el sistema de gestión de la cadena de transporte. en los que se conectaban diferentes analizadores a un sistema automatizado de transporte de muestras. • Escasa incidencia de la cadena de transporte sobre las prestaciones reales de los instrumentos. • Mayor flexibilidad en la elección de los instrumentos analíticos. estos planteamientos han tenido. Sobre todo en cuanto a trazabilidad. custodia. • Hematimetría. sin un desarrollo informático especialmente dedicado a tal fin. en la Kochi Medical School de Japón. Laboratorio totalmente automatizado Muchos de los desarrollos en el campo de la automatización total pueden atribuirse al Dr. • Permite la conexión de distintos sistemas de inmunoanálisis con lo que se puede conseguir un panel muy completo. inmunoanálisis homogéneos y heterogéneos. No permiten la consolidación del inmunoanálisis. En Europa. al igual que los que se sustentan sobre un solo equipo modular. son totalmente cerrados. Como inconvenientes: • No permite la gestión integral de la muestra. Desde entonces. • No necesita grandes instalaciones. seguridad biológica y gestión de la fase postanalítica. o se transporta el tubo manualmente. o no hay un ahorro significativo en el número de alícuotas. una tecnología que en aquellos momentos parecía definitivamente consolidada y el problema que se había planteado por la escasez de personal técnico. tanto de tecnología como de estructura organizativa de trabajo. alrededor de 140 laboratorios japoneses han seguido este esquema. 2. plasma. de un analizador a otro. custodia y gestión de la fase postanalítica. Fuera de Japón. al tener unidos a la cadena los sistemas que comparten la misma muestra. • Dificultad de gestionar y organizar. Quizás la escasa implantación de esta modalidad se deba a una serie de factores que es necesario tener en cuenta: • Necesidad de una fuerte inversión inicial.2. o de equipos situados en otras áreas del laboratorio. Han sido pioneros en la puesta en marcha de sistemas totalmente automatizados los hospitales de Leuven (Holanda). centrifugación. permitían plantear esquemas organizativos rígidos y poco flexibles. • Escasa flexibilidad y modularidad. orina o líquidos biológicos. Laboratorio automatizado modular En los últimos años. En este modelo la instrumentación se agrupa en “islas” o módulos de automatización (work-cells). desde una única y nueva estructura organizativa. • Permite la preparación de muestras para ser procesadas en equipos off-line de la cadena. • Dependencia para la conexión de nueva tecnología. En cualquiera de los dos casos. en algunas ocasiones diseñados por los propios laboratorios. Pueden distinguirse dos modelos claramente diferenciados de core lab: el laboratorio totalmente automatizado y el laboratorio automatizado modular. frasco 24 horas). Si esto no es posible o el receptor de especímenes y el extractor no son la misma persona. 30’. citrato. pasaporte. tamaño tubo + color tapón). 3. Es recomendable considerar la capacidad de compresión de los códigos en función de las necesidades y la calidad de los lectores de los diferentes equipos disponibles en el laboratorio. Algunos sistemas preanalíticos pueden diferenciar las muestras de un paciente con el mismo código de barras por: la forma-tamaño del tubo. aunque en estos especímenes de menor frecuencia no parece recomendable su automatización. Carbonato. FASE PREANALÍTICA La fase preanalítica es el conjunto de operaciones que se realizan desde que se recibe la petición hasta que se inicia la fase analítica. con lectores específicos. analítico y postanalítico.En los siguientes apartados se revisará cada una de las tres fases que comprende la tarea de un laboratorio clínico. vendrá limitado principalmente por la 8 • Documentos de la SEQC 2009 .).1 Tipos de códigos de barras que soporta el sistema Ante la multitud de formatos de código de barras disponibles.) Aditivo (seco con o sin gel. Es aconsejable la estandarización del tubo según los diferentes especímenes (suero. frente al 25% de la fase analítica (Godolphin 1990). Este proceso debería realizarse en Admisión de Pacientes en el mismo momento del ingreso o de la extracción. banda magnética o microchip. También es en dicha fase donde se producen el máximo número de errores. destaponado y posterior retaponado. sangre total. información…). se debe considerar la posibilidad de manejar otros tipos de contenedores distintos al tubo (vasos. centrifugación. cultivos. prefijo alfanumérico) Número de petición (numérico) Prioridad de la muestra (banda de color o sufijo) Destino de distribución Fecha y hora de extracción Momento de la extracción (basal. Algunas ventajas de automatizar la preanalítica son: • Mayor bioseguridad: al no existir manipulación de la muestra • Trazabilidad del proceso • Liberación de personal a tareas más productivas • Estandarización de procesos: menos errores • Mejor gestión de la muestra: menos tubos por extracción Por todo ello. etc. Sería deseable que este proceso se realizara de manera inseparable (espacio y tiempo) del etiquetado de los contenedores para realizar la extracción.etc. el color del tapón. etc.) Identificación del contenedor: Tipo de contenedor (tubo primario.) 3.1 Identificación de los pacientes: hospitalizados y ambulatorios Es deseable la identificación de los pacientes con la tarjeta sanitaria. diámetro y tipo de tapón del tubo en los procesos de lectura del sistema de identificación. etc. heparina. Si esta carece de fotografía.3. microtubo. orina. etc. 3.3. será necesario el DNI. valle o pico. La mayor parte de los sistemas presentes en el mercado ofrecen la posibilidad de identificar al paciente mediante un brazalete. Es imprescindible valorar tanto la calidad del papel empleado para generar la etiqueta autoadhesiva identificativa como la de la impresión del código de barras.) Conservante (HCl. Algunos sistemas soportan códigos de barra bidimensionales. Tamaño/Volumen (tubo largo. con la resultante pérdida de información (Melanson 2007). Esta fase requiere más del 57 % del tiempo necesario para dar respuesta a la demanda de una petición analítica.2 Información de las etiquetas con el código de barras Las etiquetas con el código de barras deben contener idealmente la siguiente información: Identificación del paciente: Nombre Identificador unívoco del paciente (número de historia clínica. sería deseable que el procedimiento de identificación positiva se realizara en cada fase. el rack en el que se introducen al sistema o soluciones mixtas (Ej. según los trabajos consultados (Bonini 2002) y donde hay más riesgo en la manipulación de los especímenes.2 Tipos de contenedores Según las necesidades del Laboratorio. CIP. En el caso de la utilización de radiofrecuencia es necesario prevenir la retirada manual de los tubos de los contenedores. y 2) identificación por radiofrecuencia combinado con código de barras. En todo paciente la identificación es imprescindible.3 Identificación de la muestra Existen principalmente dos opciones para la identificación de los especímenes: 1) código de barras. conviene seleccionar el que presente mejores características para cada laboratorio (versatilidad. de manera que sea nítida y robusta al rayado. etc. entre el 32 y 75%. De este modo se garantizaría la trazabilidad paciente-petición-espécimen 3. 3.). En el caso de que solamente se manejen tubos. tanto en el momento de la extracción como durante los procesos preanalítico. a fin de establecer los puntos donde repercute de manera especial la automatización del mismo. Los principales aspectos a tener en cuenta son: 3. longitud. fondos redondos o cónicos. NSS…) Sexo Fecha de nacimiento Identificación de la muestra: Centro de procedencia (Ej. el posible uso simultáneo de tubos de diferentes características (medida. basado en código de barras. con conexiones WIFI soportadas por programas informáticos instalados en PDAs o Tablets PC. portaobjetos. etc. EDTA. permitiendo una cantidad de información muy superior.). para así solventar posibles incidencias que requieran localizar al paciente. Los códigos de barras son leídos repetidamente y se debe mantener la calidad durante todo el proceso. el que admita la generación de un dígito de control (permite chequear la aparición de errores durante la impresión/interpretación del mismo) y el que pueda ser leído por todos los equipos relacionados del laboratorio. así como el momento de la extracción en tiempo real. Estos sistemas permiten introducir los datos identificativos del extractor (mediante un código personal). etc. en estos últimos años se ha planteado la necesidad de automatización de dicha fase. tubo corto. goma.. revoluciones y tiempo) y.1 Soportes (racks) para los diferentes especímenes Existen en la actualidad una amplia variedad de soportes para los diferentes especímenes. hay especímenes como gases en sangre. pero el sistema deberá poder gestionar eficientemente los diferentes tipos de soportes utilizados. como para tubos secundarios (alícuotas) su identificación deberá mantener la misma información que la etiqueta del tubo primario. Si se decide su inclusión dentro de la cadena de automatización. tubos para precipitación o pretratamiento de muestras. la existencia de sensor de nivel del módulo de alicuotado y la presencia de detector de coágulos. de modo que se utilizara el mismo sistema que en el laboratorio. se deberían tener en cuenta las siguientes consideraciones: ● Prioridad de la muestra: Si incluye muestras urgentes habrá que adaptar la puesta en marcha automática de la centrífuga por tiempo máximo de espera o por la llegada de alguna muestra de alta prioridad. reconocimiento de imagen del tamaño y forma del tubo. cambiando el destino de distribución. Es posible definir unos parámetros de centrifugación que nos permitan centrifugar conjuntamente muestras para la obtención de suero. pero no todos están adaptados para cualquier tipo de tapón (rosca.3. Esta característica puede condicionar el tipo o tipos de tubo o contenedor a utilizar. aunque el soporte para cinco tubos o 3. Una vez identificados los requerimientos de los especímenes.). 3. sin conexión a ningún analizador. 3. alicuotado.). hemograma).3.Criterios para la selección de un modelo de automatización del laboratorio Condiciones de conservación (luz. de modo que sea posible su trazabilidad al paciente. volverá a analizar los nuevos requerimientos y los enviará a su nuevo destino. 3.4.3.3 Información de las etiquetas secundarias y alícuotas Tanto si se generan etiquetas secundarias para placas de cultivo. concentradores de orina. podremos distinguir dos configuraciones de automatización posibles de la fase preanalítica: el clasificador-alicuotador individualizado. etc.4. Holman 2002): • Si se opta por el laboratorio totalmente automatizado.3 Centrifugación selectiva de especímenes La centrifugación suele ser una fase crítica dentro de la automatización preanalítica. en el caso de disponer de una única centrífuga. Para ello el sistema debería obtener información sobre el contenedor del espécimen (mediante prefijos o sufijos en el código de barras. ya que puede convertirse en un auténtico “cuello de botella” para el sistema. En los casos en que el destino sea un pretratamiento. deberían ser dirigidos a bandejas de clasificación para: pretratamiento. centrifugación. se pueden establecer sistemas de trabajo por lotes (completado de posiciones) o por definición de tiempo de espera máximo. Aunque la progresiva automatización de todos los especímenes mejoran la calidad y la eficiencia del laboratorio (Dadoun 2002). orinas o sueros). su origen (muestras centrifugadas en puestos remotos de extracción o extraídas in situ). diferenciando el espécimen por indicadores indirectos (color del tapón o anillos de color). temperatura.) unidos a uno o varios analizadores. El tipo de soporte dependerá principalmente de cada analizador. la automatización será en todas las fases (preanalítica. existen múltiples alternativas como las etiquetas preimpresas (no personalizadas) que indican el tipo de muestra o etiquetas preimpresas sin ninguna otra información. etc. etc. Destaponado/retaponado del tubo primario La mayoría de los sistemas automáticos poseen unidades de destaponado. o muestras con condiciones críticas de oscuridad o temperatura. El retaponado suele hacerse con tapones de plástico o taponado térmico con tapas metálicas. color del tapón. preferentes o no prioritarias) y cuál será su próximo destino (destaponado. prioridad (muestras urgentes. predilución. ser capaz de adaptarla a los requerimiento específicos del lote de especímenes a tratar (4 ºC para PTH. etc.5 Etiquetado automático de los contenedores primarios y secundarios El sistema debería ser capaz de etiquetar automáticamente los contenedores estándar (tubos primarios y secundarios para alícuotas) minimizando así los errores de pre o postetiquetado manual. banco de sangre.4.4 Gestión de la identificación de muestras en extracciones realizadas fuera del laboratorio La opción ideal sería que el sistema pudiera generar las etiquetas personalizadas y específicas de contenedor en cualquier punto de extracción. En todos los casos sería recomendable poder identificar el centro donde se realizó la extracción. 3.) y los que no lo precisen (Ej.4. 3.4 Configuración El diseño en la automatización de la fase preanalítica dependerá del modelo general de automatización escogido (ver apdo. o varios módulos (destaponado.). precipitación. analítica y postanalítica). 3. etc. seroteca. 3. Si la infraestructura no lo permite. • Si el modelo es el laboratorio automatizado modular. Alicuotado En el alicuotado automático se valorará la utilización de pipeta desechable para cada muestra.) Fecha de caducidad 3. destaponado. etc. que pueden no ser fácilmente automatizados. procesamiento directo.5. una vez realizado éste. Documentos de la SEQC 2009 • 9 .). “rack” es uno de los más extendidos.4.2 Clasificación y pretratamiento de los especímenes El sistema debería identificar (clasificar) los especímenes que requieran pretratamiento (centrifugación. si bien ya existen algunas iniciativas en la línea de automatizar la carga de muestras para el estudio ácido-base y gasometría. ● Condiciones de centrifugación: El sistema debería poder identificar por la información del contenedor qué características de centrifugación requiere (temperatura máxima. etc. etc. 2 Modelos de automatización) y cada laboratorio deberá estudiar cuál se adecua más a sus necesidades (Reynolds 2002. quedando reservado éste a los contenedores no estándar (placas de cultivo. 37 ºC para crioglobulinas. y condiciones de tiempo y RPM según se trate de plasma para test de coagulación.4. Si sólo se incluyen muestras de prioridad normal. centrífuga. puestos de trabajo o instrumento encargado del siguiente proceso. plasma para coagulación y orinas. 1 Versatilidad de la automatización en la fase analítica Un sistema automatizado no debe suponer una limitación en cuanto a incluir analizadores de diferentes casas comerciales. la suma de los volúmenes requeridos para las determinaciones solicitadas y un volumen para repeticiones. Sería recomendable que. si se dispone de analizadores “reflejos” que permitan alternar los mantenimientos • Frecuencia de las calibraciones y de los controles • Tiempos de respuesta pactados: habrá que tener en cuenta si el laboratorio recibe muestras para su análisis en una sola tanda o si las va recibiendo “en goteo” y si realiza peticiones urgentes • Problemas técnicos frecuentes: filtros atascados. alicuotado y redireccionamiento a los diversos destinos). destaponado.4. especímenes duplicados.). 3. desajuste de agujas. 4. para poder tomar acciones sobre las muestras con incidencias antes de haberlas destaponado. comenzando por el momento de la extracción / recogida de muestra. Se registrarán todos los tiempos de manipulaciones intermedias (centrifugación. Puntos fundamentales a incluir en este “plan ideal” serían los siguientes: El sistema debería ser capaz de procesar las alícuotas en condiciones adecuadas para evitar la concentración (taponado inmediato). hormonas en pacientes procedentes de consulta de endocrinología). fotodegradación (procesamiento tras paneles de metacrilato oscurecido). reimpresión de etiquetas no legibles. marcadores tumorales en pacientes oncológicos. Con este objetivo es útil realizar un esquema del flujo de trabajo actual respecto a esta fase. en la evaluación de un sistema de automatización debemos plantearnos una reflexión previa acerca de las características de nuestra fase analítica actual para que la automatización se adecue a las características y posibilidades de nuestro laboratorio. por optimización de tiempos. ambas compatibles con la conexión de diferentes analizadores a la misma: 10 • Documentos de la SEQC 2009 . 4. las muestras con condiciones críticas de oscuridad o temperatura pueden no ser fácilmente automatizadas. diseñásemos un guión de las características que debería cumplir un sistema automatizado en cuanto a la fase analítica. el sistema debería ser capaz de taparlas una vez generadas. no debería realizarse antes del chequeo de llegada. asimismo.1.2 Registro de tiempos preanalíticos Todo sistema preanalítico debería mantener un registro (Rynning 2007) de los tiempos en los que se realizan todas y cada una de las acciones sobre cada espécimen. Será posible la consulta en cualquier momento del estado de la petición y cada uno de sus especímenes y alícuotas. cuánta inversión de tiempo supone. Este esquema debe incluir: • El tiempo de la jornada laboral que se dedica a la fase analítica diaria y semanalmente (por ejemplo habrá que tener en cuenta turnos de tarde y turnos de fin de semana. fallo de fotómetro.5. 3. muestras cortas.4. ya que es preferible. falta de algún espécimen. 3. En casos de muestras de escaso volumen el sistema debería consultar con el responsable la prioridad de preparación de alícuotas. 4.5. que la aspiración y dispensación individual para cada alícuota. presencia de coágulos o calidad inadecuada de la muestra) el sistema debería iniciar acciones automáticas de corrección (ejemplo: rechazo de muestra duplicada o no solicitada).1VOLUMEN DE LAS ALÍCUOTAS El sistema debe adaptar el volumen de cada alícuota a los requerimientos del destino y al número de pruebas a realizar en cada petición. con este diseño de lo que tenemos actualmente y lo que queremos implementar.1 Comprobación de entrada de tubos y otros recipientes al sistema preanalítico El sistema debe confirmar de manera positiva la entrada de cada uno de los especímenes de la petición al sistema. y finalizando en el momento de su llegada al analizador.5. termodegradación (los soportes de tubos primarios y alícuotas deberían estar refrigerados) y/o contaminación del espécimen (puntas desechables). El retaponado suele hacerse con tapones de plástico o taponado térmico con tapas metálicas. FASE ANALÍTICA Al igual que en cualquier otra fase. en la adaptación del software propio del sistema de automatización a la gestión que nosotros queremos realizar del mismo o en la inversión de tiempo que supone el mantenimiento y chequeo del propio sistema. debería al menos confirmarse por el usuario o poder seleccionar individualmente las alícuotas prioritarias (serología en muestra prediálisis de un paciente oncológico) 3. Una vez hemos caracterizado el trabajo que realizamos rutinariamente en la fase analítica habrá que plantearse cuáles son los puntos débiles que hemos encontrado y cómo esperamos mejorarlos y.5 Trazabilidad 3.5. si se diese el caso) • Una valoración de la carga de la fase analítica a lo largo de la jornada laboral: ¿tenemos picos de trabajo o es continuo? • Incremento del volumen de muestras o del panel de determinaciones que se espera a corto y medio plazo • Mantenimiento de los analizadores: a qué hora y/o día se realizan.Es importante valorar la modalidad de pipeteo. Se tendrá en cuenta un volumen muerto (específico del analizador). o por un módulo independiente de taponado. petición duplicada. ya sea por el propio alicuotador. En función de las incidencias detectadas (falta de petición.1 Posibilidad de conectar los analizadores elegidos a una cadena Existen dos formas diferentes de entrada de muestras a una cadena. sobra algún espécimen. dejando traza de todos y cada uno de los procesos realizados sobre ellos. petición con datos incompletos. El proceso de destaponamiento automatizado (en aquellos sistemas que lo posean).4. y no el laboratorio a ella. Esto que podría establecerse de manera genérica (por ej.3 PrEPArACIÓN DE ALÍCUOTAS EN CONDICIONES ÓPTIMAS DE CONSErvACIÓN DE LA MUESTrA 3. etcétera.2 RETAPONADO DE ALÍCUOTAS Si es necesaria la preparación de alícuotas. etc.5. qué cualidades y calidades deseamos preservar. o avisar al operador para la toma de decisiones (ejemplo: recentrifugación. la aspiración de gran volumen de muestra en la pipeta y posterior dispensación en varias alícuotas (Holman 2002). Aún así. líquidos biológicos. es importante conocer si nuestro sistema dispone de un mecanismo de recuperación de muestras en esta fase. 4.10 Taponado/destaponado de tubos Lo ideal sería trabajar con tubos tapados para una mejor conservación de la muestra. si registra esta recuperación. 4. sería deseable disponer de un sistema de aviso respecto a la integridad de las mismas. Para ello. Existen sistemas en los que la muestra circulante es introducida en el analizador mediante un brazo robotizado. Para ello. 4. aunque actualmente existen modulares que pueden integrar varias metodologías. no sería necesario acceder a las muestras una vez introducidas en el proceso analítico. Por ello.1. no obstante. aquellas áreas que emplean el mismo tipo de muestra pueden considerarse “integrables” en un modelo de automatización común con la ventaja de poder reducir el volumen de muestra que se necesitará extraer al paciente. En cualquier caso. de modo que podrá contemplarse la posibilidad de un modelo de laboratorio de 24 horas. conocer si el sistema de automatización permitirá reducir el número y/o el volumen de muestras o especímenes requeridos. A su vez. haya terminado o no su análisis.1. ya sea por su escaso volumen o por otras causas (pediátricas. lo que supone un “secuestro” temporal de la muestra. Será necesario plantear la posibilidad de compaginar distintas versiones de analizadores. son múltiples las situaciones en las que es necesario recuperar una muestra. quedará supeditada a la garantía que ofrezca el sistema en lo que se refiere a ausencia de contaminaciones cruzadas y habrá en todo caso que evaluar cómo afecta la integración al tiempo de respuesta establecido como óptimo para cada área.…). 4. Es necesario valorar la solución que el sistema ofrece para las muestras especiales.6 Capacidad de ampliación y facilidad de renovación Se deberá prever el posible aumento de la carga de trabajo.…). En algunos casos la solución pasa por que el sistema haga una alícuota y deje liberado el tubo primario. así como el tiempo de cola en cada analizador.8 Accesibilidad a las muestras durante la fase analítica En un sistema totalmente automatizado. inmunoquímica. se tendrá en cuenta cómo influye su integración en la fluidez de la fase analítica de una muestra. se tendrá en cuenta si se trabaja Documentos de la SEQC 2009 • 11 . Además. En el caso de laboratorios en los que es frecuente el manejo de volúmenes escasos (hospitales pediátricos. o bien. Habitualmente las áreas se agrupan por metodologías (fotometría. la valoración del tiempo de puesta en marcha quedará matizada en función de los requerimientos de parada del propio sistema (averías. 4. …).1.1.9 Manejo de diferentes tipos de contenedores y/o muestras Un requisito importante de un sistema de automatización es la posibilidad de gestionar conjuntamente diferentes tipos de muestras y/o especímenes. así como el espacio necesario para el almacenamiento de las muestras una vez procesadas. semanal y mensual). 4.2 Tiempo necesario para empezar a emitir resultados desde el encendido del sistema (tiempo de respuesta) Es conveniente establecer el tiempo que requiere el sistema para su puesta en funcionamiento. será importante conocer el panel de pruebas. Esto dependerá de las características de los equipos y del laboratorio. 4. lo que significa estimar un tiempo mínimo y un tiempo máximo en función de la organización del trabajo. unidades de quemados.1.5 Capacidad de incorporar nuevas técnicas con la misma instrumentación Se valorará la disponibilidad de canales abiertos. Por ejemplo. Si no es posible.) hay que considerar si el sistema de automatización puede gestionar este tipo de muestras conjuntamente con el resto de las muestras o si necesitarán una gestión específica: pasarlas a otro tipo de contenedor. aunque tiene la ventaja de reducir las colas de espera que se generan en aquellos sistemas que aspiran el volumen teórico necesario cuando el tubo llega al analizador.1. etc. y por tanto.7 Integración de diferentes áreas del laboratorio Se debe tener en cuenta qué áreas sería interesante integrar en la automatización.1.3 Posibilidad de carga de reactivos durante el funcionamiento del sistema En función del volumen de muestras que procesemos quizás no sea suficiente con una carga de reactivos al comienzo de la jornada. se tendrá en cuenta la existencia de especímenes potencialmente no transportables en cadena y el impacto que genera su entrada manual en cada una de las alternativas antes mencionadas. Sin embargo. la posibilidad de añadir otros analizadores u otros módulos a los ya disponibles. 4.4 Capacidad de incorporar instrumentación de diversa procedencia Punto clave a tener en cuenta en el caso de aquellos laboratorios que elijan diferentes casas comerciales para la misma o para diferentes áreas analíticas del laboratorio.Criterios para la selección de un modelo de automatización del laboratorio • Si el tubo o la alícuota se introduce directamente en la cadena. mantenimientos programados y preventivos.1. así como para efectuar la carga de reactivos. asimismo. hay que conocer el tiempo necesario para la realización de los mantenimientos programados (diario. por lo que habrá que considerar cuál es el tiempo máximo que se consumiría en ese caso. Este puede ser un punto limitante. así como distintos tipos de contenedores. por tanto las pruebas problemáticas y las que no es posible realizar. Es interesante. etiquetado especial. sino también en las conexiones informáticas de los diferentes sistemas y en la transmisión bidireccional de la información entre cada analizador y el sistema informático. En este punto una cuestión a valorar es el sistema utilizado para la aspiración de la muestra en cada analizador integrado. una integración parcial. para incorporar técnicas de otras casas comerciales. etc. 4. pueden sacarse las muestras de la cadena temporalmente. al menos hasta el fin de esta fase. orinas. si para la carga de nuevos reactivos es necesario que el sistema se pare.1. Habrá que considerar si se desea una integración total de los sistemas mediante conexión a un mismo proceso automatizado. • Si existe un brazo robótico que introduce las muestras en la cadena. y la mejora que supone respecto a mantenerlas como áreas independientes. A la hora de valorar la opción más adecuada para un laboratorio concreto. y cómo afecta al proceso de análisis una vez se reincorpora la muestra al sistema. La valoración de estas y otras ventajas. turbidimetría. se disminuye el tiempo de circulación de las muestras. por el posible conflicto que podría crearse no sólo en la instalación del sistema automatizado. hospitalizados. dependiendo si se trata de un laboratorio que sólo trabaja la rutina. las condiciones de almacenamiento de las mismas durante el proceso analítico y la facilidad de su localización (organización manual. pero si esta previsto realizar alícuotas. 4. es muy importante conocer si el sistema está totalmente libre de posibles contaminaciones. 4. puntas desechables. Puede gestionarse previamente desde la fase preanalítica. 4. Algunos analizadores disponen de un sistema de “rerun” automático cuando la muestra todavía está en el equipo.4. Por tanto el sistema de automatización tendrá que ser capaz de gestionar prioridades en base a las necesidades y podrá hacerlo con diferentes sistemas que tendremos que valorar según los requerimientos: gestión preanalítica totalmente automatizada (mediante racks predefinidos como prioritarios o mediante etiquetas de color) o por gestión del software analítico (comunicación directa con el SIL). o incluso del diagnóstico del paciente. Otro punto es la necesidad de retapar los tubos una vez procesados y en este caso habrá que tener de nuevo en cuenta si se trata de contenedores primarios o alícuotas. En este caso habrá que valorar la posible pérdida de eficacia en la carga de muestras. lipemia e ictericia • Detección del nivel de muestra • Volumen muerto requerido Y todo ello debe estar informatizado de manera que se disponga de estos datos durante la validación de resultados. Esta gestión también será diferente si la secuencia de recepción de muestras es un goteo continuo o picos de recepción a determinadas horas. la mejor solución será utilizar puntas desechables. diluciones. ésta debe incluir un mecanismo de valoración de la integridad de la muestra que incorpore: • Detección de fibrina • Detección y cuantificación (índices numéricos) de interferencias por hemólisis. 12 • Documentos de la SEQC 2009 . aunque también hay sistemas informáticos que gestionan la recuperación de las muestras una vez han salido del analizador. así como establecer qué pruebas se desea informar con un tiempo de respuesta mínimo.2 Priorización de determinaciones si el volumen de la muestras es insuficiente En primer lugar.2. o si integra la urgencia (24 horas de trabajo continuado).3 Control de la integridad de las muestras Si se persigue una verdadera automatización total de la fase analítica. 4.2. 4. Priorización de la entrada de muestras para prevenir contaminaciones En caso de integrar diferentes áreas del laboratorio en el sistema de automatización. 4.con el tubo primario o con alícuotas. si se integran diferentes áreas de laboratorio. En cada caso habrá que conocer la estabilidad de las muestras. repeticiones o comprobaciones.3 Influencia de la integración de la urgencia en los tiempos de respuesta Primero se debe definir el tiempo de respuesta deseado para las urgencias. puede ser necesario definir rutas diferentes de entrada de los tubos a los analizadores en función de las peticiones.1 Priorización de muestras según procedencia Es importante priorizar las muestras en función de su procedencia. 4. puede darse el caso de que el laboratorio tenga 4. Otro tipo de gestión sería informatizada mediante la comunicación con el SIL. Es más.4 Gestión de muestras especiales una vez dentro del proceso analítico Es importante conocer qué ocurre con los tubos con múltiples rutas. diluciones y/o comprobaciones Durante la fase analítica será necesario realizar nuevas determinaciones de una muestra en proceso o ya analizada. en caso de resultar insuficiente.5 Eficacia en cuanto a gestión de pruebas reflejas. Si están integradas en el mismo laboratorio la rutina y la urgencia. será preciso conocer la capacidad que tiene de mantener un volumen predefinido de reserva en el analizador o el tiempo máximo estimado que debe permanecer una muestra en la zona de descarga antes de ser retirada del sistema. disponiendo de estas muestras en racks o bandejas específicas y tener una zona reservada para su carga.2. Es además importante tener en cuenta que si se ajustan mucho las prestaciones del sistema al volumen de muestras en un momento dado. una variación del mismo puede significar que el sistema no lo asuma eficazmente. y sería valioso un sistema que permita reconocer ese volumen mínimo de modo que. Si se integra la urgencia habrá que conocer cómo se gestionan estas muestras y cómo afecta esto al tiempo de respuesta tanto de las muestras urgentes como de las no urgentes. Para ello. se valorará el utilizar distintos equipos. ya que no es lo mismo una muestra urgente con un tiempo de respuesta (emisión de resultados) máximo de una hora que de tres horas. 4.2. Además. que gestionar distintos tipos de urgencias: de UCI.2. tubos duplicados (no será necesario procesarlos) y tubos sin identificar. o equipos con rotor para las muestras prioritarias. será necesario conocer el volumen requerido para la realización de cada prueba. la muestra sea gestionada con base en un algoritmo preestablecido según servicios de procedencia y diagnósticos. se considerará una para muestras potencialmente contaminantes. En el primer caso se valorará que el sistema pueda destapar tubos que hayan sido centrifugados previamente por el sistema o externamente. FIV. Si no se van a realizar alícuotas en todo el proceso. que priorice la realización de determinadas pruebas. en cuyo caso no será necesaria la priorización de determinadas muestras (ej: serología). en cuyo caso habrá que tener en cuenta si todas las muestras que se cargan en nuestro sistema se registran previamente de modo adecuado en el SIL. etcétera. informatizada o robotizada).1. para realizar pruebas reflejas. Se podrán utilizar alícuotas diferentes para cada analizador o bien.2 Gestión de prioridades Los requerimientos en la gestión de prioridades serán más o menos estrictos.11 Posibilidad de asumir un aumento en el panel de pruebas y/o en el número de peticiones La versatilidad del sistema de automatización debe verse también reflejada en la posibilidad de aumentar el número de determinaciones a realizar ya que es raro el laboratorio que no aumenta su oferta a medio plazo. • Registro por fechas. Por tanto. criterios para su aceptación (basados en diagnóstico. etc. sencillo y global que indique el estado de la muestra en cada momento. de lotes y caducidades de controles y calibradores. etc. • Acceso a los resultados en tiempo real. temperatura) en el compartimento de reactivos antes de utilizarlos y una vez abiertos • La capacidad de almacenaje que tiene el analizador • Caducidades de los reactivos (una vez reconstituidos y/o una vez abiertos). etcétera. así como el tiempo necesario para obtener un resultado urgente. Resultados anómalos Se deben establecer «límites de alarma» en el instrumento que obligan a una acción inmediata de comprobación o de aviso al facultativo responsable. de todos los mantenimientos. diluciones. Se deben considerar los siguientes aspectos: • Posibilidad de crear. para la trazabilidad de la misma y de los resultados que se obtengan. controles y calibraciones. de alarmas de los equipos o de resultados del control de calidad.Criterios para la selección de un modelo de automatización del laboratorio 4. y conocer la hora exacta a la que han sido generados.6 Acceso a la información generada sobre la muestra a tiempo real y validación técnica de resultados Una vez que la muestra está dentro del sistema de automatización es muy importante. exportación y valoración de datos. • Control de la absorbancia de los blancos de reacción. 4. materiales. número de lote. comentarios a determinadas pruebas para muestras hemolizadas. etc. 4. Se deberá conocer el número de determinaciones a la hora en condiciones de rutina. El personal técnico normalmente dispone de un procedimiento que le indica las comprobaciones o acciones que debe realizar (repeticiones. • Registro por fechas. por fechas. resultados de pacientes. Por ejemplo. generación de nuevas pruebas. habrá que tener en cuenta: • Si la calibración es automática con frecuencia preestablecida o manual a demanda • El tiempo requerido para la calibración: preparación de material.…). instrumentos. Los técnicos encargados de la validación técnica deben conocer los «límites de alarma» y la actuación consecuente. El resultado de una prueba puede contener errores importantes debidos a problemas en cualquiera de los elementos que intervienen en la realización de la misma (muestras. alarmas. análisis de los calibradores. El autoanalizador debe ser capaz de realizar de forma automática algunas acciones (repeticiones. cada determinado número de muestras. • Posibilidad de generar textos predeterminados según algorit mos adaptados a perfiles de resultados concretos. En la velocidad de procesamiento influirá qué constituyentes han sido solicitados. Los sistemas analíticos automatizados deben de tener la capacidad de realizar estos procesos de una forma rápida y eficaz.) en función de determinados criterios basados normalmente en valores o rangos de resultados. Será necesario adaptar o modificar las prioridades de análisis según la carga de trabajo en un determinado analizador para evitar “cuellos de botella”. • La edición de unidades de calibración • Programación de los controles de calidad según algoritmos disponibles (cada cierto tiempo. habrá que tener en cuenta: • Si requieren reconstitución previa (liofilizados) o están listos para el uso • Las necesidades de conservación (humedad. coeficiente de variación biológico intraindividual.5. que es la velocidad de procesamiento.2 Velocidad de procesamiento De todo lo expuesto hasta ahora se deduce que habrá un parámetro que englobará todas las especificaciones mencionadas. Esto es lo que se suele denominar validación técnica para distinguirla de la validación facultativa. anulación de pruebas) tras la orden emitida por el sistema informático del laboratorio.1 Reactivos Es importante para la versatilidad del sistema de automatización la posibilidad de cargar reactivos sin necesidad de parar el sistema. modificar o anular datos de una muestra durante el análisis.5 Gestión de los módulos del sistema automatizado 4. • Capacidad de almacenar. para lo que será importante conocer la capacidad de entrada de muestras en los distintos equipos.…). facilitando toda la información necesaria para una correcta realización de la validación técnica. calibradores. reactivos. controles. avisos. ya sea manual o informatizada mediante algoritmos. volumen disponible en los analizadores de modo individual y en conjunto.7 Control de la calibración y controles de calidad En cuanto a la calidad del análisis es fundamental la gestión de las calibraciones y de los controles de calidad. si es necesario como en el caso de controles y calibradores en forma de gráficos (de evolución por ejemplo) y ofrecer la posibilidad de imprimirlos en papel cuantas veces sean necesarias. lipémicas o ictéricas. Aunque en general esta capacidad está ligada y depende de los analizadores y no de los sistemas de automatización. personal. gráficas Levey-Jennings. En un sistema automatizado se debe tener información en tiempo real de los reactivos disponibles en cada uno de los analizadores que estén integrados y esta información incluirá: caducidad. para valorar el impacto de gasto de recursos que supone la carga de reactivos. la posibilidad de gestionar los datos generados por la muestra durante el análisis a tiempo real y que exista un sistema intuitivo. Documentos de la SEQC 2009 • 13 . fecha de calibración. • La posibilidad de visualizar la curva de calibración final y las acumuladas. teniendo en cuenta una situación de carga máxima del sistema. incidencias y averías. Con esta información se nos debe facilitar la posibilidad de realizar una validación técnica de resultados.5. y disponer de un sistema de avisos para aquellos resultados no normales o no esperados.). valores de referencia. calibraciones. 4. controles de calidad programados. Tras la validación técnica de los resultados el autoanalizador debe de permitir visualizarlos de forma clara. cambios de reactivos. 4. Indicación de caducidad o días de conservación Temperatura ambiente: Todas las muestras que se vayan a analizar inmediatamente o sangre total para obtener suero o plasma Refrigeración (4 – 6 ºC): Suero. Archivo temporal de muestras/especímenes. y una continua para la actualización. o destruidos.1 Personas necesarias para el funcionamiento del sistema y cualificación necesaria Será necesario conocer los horarios de todo el personal. las muestras son almacenadas por periodos de tiempo variables con el fin de realizar comprobaciones y ofrecer al clínico la posibilidad de solicitar nuevas pruebas a la vista de los resultados. especialmente para aquellas muestras que necesitan ampliar algún parámetro. Los tubos con pruebas pendientes vuelven a la fase preanalítica. Así. dado que en estos sistemas automatizados pueden utilizarse varios analizadores que realicen las mismas determinaciones y una muestra puede tener que ser analizada en varios aparatos. En cuanto a la temperatura de conservación. plasma y muestras para análisis bacteriológico que no se vayan a analizar antes de 4 horas Congelación a -20 ºC: Suero o plasma que se vaya a almacenar a largo plazo En ocasiones se precisa la utilización de conservantes 4.8 Recursos humanos necesarios para la gestión y mantenimiento del sistema de automatización en la fase analítica La automatización de la fase analítica suele conllevar una reorganización de recursos humanos definiendo nuevas tareas y responsabilidades. hay que tener en cuenta: Los autoanalizadores deben llevar incorporado un sistema que permita la dilución automática postanálisis con posibilidad de diversas diluciones para la repetición de las muestras. Otras veces las muestras se guardan con fines científicos o legales. FASE POSTANALÍTICA 5. Existen funciones de búsqueda de muestras o grupos de muestras con determinados criterios. será importante establecer si las muestras tienen que ser mantenidas refrigeradas (4 ºC) o congeladas (-20 ºC. evitando interrupciones en la rutina y asegurando una rápida disponibilidad de los resultados. El tiempo y las condiciones del archivo de muestras deben adaptarse al reflejado para cada una de las magnitudes analíticas en la cartera de servicios. Debería haber una formación inicial para la puesta en marcha del sistema. 14 • Documentos de la SEQC 2009 . 5.1 Recuperación de muestras ya procesadas El sistema automático debe ofrecer la posibilidad de cargar muestras a posteriori.4 Servicio técnico especializado para la resolución de incidencias Al igual que cada analizador tendrá establecido un servicio técnico de apoyo para la resolución de incidencias.Por otra parte. Capacidad de repetición de parámetros de modo automático tras la orden emitida durante el proceso de validación. o – 80 ºC) en función de los parámetros a analizar. Archivo indefinido de muestras/especímenes. Estos deben quedar claramente establecidos y se tendrán en cuenta para la gestión del sistema.2 Archivo de muestras Una vez terminado su procesamiento. Los tubos finalizados son almacenados automática o manualmente. 4. el sistema de automatización debe tener su propio servicio (on-line y/o presencial) para solventar cualquier problema o fallo que pueda surgir en el mismo y deberá quedar claramente establecido el horario y las personas responsables de la cobertura de este servicio.8. • Servicio de formación a cargo de la casa comercial encargada del sistema de automatización o de los analizadores aislados.8.3 Capacidad de almacenamiento El almacenamiento refrigerado de muestras con recuperación automática puede mejorar el flujo de trabajo. mediante: • Sistema manual • Sistema automatizado/robotizado 5. diagnóstico y resolución de incidencias a tiempo real. 2. resulta muy importante asegurar la trazabilidad entre las calibraciones y las determinaciones realizadas en cada muestra. En todos los laboratorios deben existir: 1. 4. la organización varía según sea personal fijo o a turnos.8. • Existencia de soporte de aplicaciones. Características de calidad. que son controlados por el sistema informático.3 Mantenimientos del sistema Existen dos tipos de mantenimientos a realizar en el sistema: los que realizará el servicio técnico de la casa comercial del sistema de automatización y/o de los analizadores y los mantenimientos que realizarán los técnicos del laboratorio.2 Formación de personal Con todo nuevo sistema es necesario un periodo de familiarización que puede ser muy variable en el tiempo y que si no se valora adecuadamente puede generar en el personal dedicado al sistema de automatización desconfianza y desasosiego. Se valorará: • La disponibilidad de servicio técnico 24 horas o vía on line. cuando sea necesaria. 4.8. resulta muy útil que sea el SIL el que gestione los archivos de muestras. En algunos casos existen instrumentos automáticos de archivo de muestras. Debido a que en los grandes laboratorios se manejan miles de muestras diariamente. • Asistencia cercana e inmediata. 5. En el sistema deberá quedar registrado cuáles son los calibradores y controles con los que aseguramos la trazabilidad de las determinaciones que realizamos a cada muestra. La gestión de los archivos de muestras implica la creación y el mantenimiento de un número variable de almacenes en los que cada muestra ocupa un lugar fijo asignado de forma manual o automática y controlado por el sistema informático. Por último. cuánto tiempo empleamos en la recuperación automática de la muestra. informe de laboratorio. alertando enseguida de cualquier fallo en las conexiones. para facilitar su archivo y almacenamiento.48:691-8. 5. La dimensión del laboratorio. quizás es la peor resuelta. y evaluar su capacidad de trabajo en modo manual. Ceriotti F. . La fase postanalítica. También se valorará la capacidad del sistema de exportar los datos (tanto resultados de pacientes como de control de calidad) de una forma accesible para su posterior manejo en una base de datos externa o un programa estadístico. en un futuro cercano serán indispensables en cualquier laboratorio clínico. así como nuestra situación actual y el tipo de laboratorio que nos gustaría o nos sería posible tener. Dadoun R. 5. así como establecer las pautas a seguir en caso de que sea preciso recuperar resultados ya obtenidos para realizar un volcado de datos al sistema informático del laboratorio. Bonini P.1 Sistema de taponado En aquellos sistemas que no requieran el destapado de los tubos o alícuotas para su procesamiento. podría mejorarse estudiando las distintas posibilidades existentes en el mercado. se garantizará mejor la integridad de los constituyentes durante el almacenamiento de las muestras. Medical Laboratory Observer 2002. con el SIL y. incluyendo el hardware. por otro. Es importante determinar qué muestras es necesario almacenar (tubo primario o alícuota). como un disco duro externo. y por tanto. pues además de las muchas ventajas que aportan. pero hay otros muchos trabajando en ello. 7. se documenta y valida de forma adecuada para su utilización en la instalación. etc. el laboratorio se debe asegurar de que: a) el software informático. las prestaciones del autoanalizador aumentan considerablemente. o bien sean capaces de retaponarlos a posteriori. La fase preanalítica automatizada poco a poco va implantándose. los sistemas analíticos deben tener una extensa capacidad de almacenamiento de datos de resultados de pacientes. 5. 6. con los distintos analizadores integrados en el sistema de automatización. debe hacerse de acuerdo con una política aprobada. CONCLUSIONES En los últimos años los avances en la informática. procesado. El software ha de estar validado considerando las normas de calidad y protección de datos vigentes. los reactivos y otros materiales fungibles. y los mecanismos para corregir un funcionamiento defectuoso. Los hospitales cada vez invierten más en realizar una gestión que les permita reducir costes. Dicha conexión puede efectuarse de tres modos diferentes: • Directamente a los puertos de los terminales del laboratorio • Centralizadas en un servidor de terminales usando cableado estructurado • Mediante un sistema de concentración de información (middleware) que se conecta.4 Trazabilidad de las muestras El sistema debe permitir localizar en todo momento una muestra concreta. Si el operador puede transferir todos esos datos directamente a un CD-ROM u otro dispositivo de almacenamiento. En un modelo de laboratorio altamente automatizado. será interesante que el diálogo entre los módulos analíticos y el sistema informático sea lo más eficaz posible. Documentos de la SEQC 2009 • 15 . calibraciones y controles de calidad. La fase analítica aunque actualmente es la más automatizada. incluyendo el que está incorporado en el equipo. Case study: automation’s impact on productivity and turnaround time. Rubboli F. BIBLIOGRAFÍA . un fallo del sistema de información de la cadena puede provocar una importante incidencia en cada una de las etapas anteriormente descritas. Será necesario establecer cuáles son los equipos críticos del sistema. alteración o destrucción por personal ocasional o personas no autorizadas. Es fundamental minimizar el riesgo de problemas o errores a la hora de transmitir los resultados desde el autonalizador al sistema informático del laboratorio. y los sistemas analíticos se deben proteger contra desajustes o alteraciones que puedan invalidar los resultados de los análisis. el volumen de pruebas y el número de ampliaciones son importantes para determinar el coste-beneficio de este tipo de almacenamiento.34:36-8. será el propio sistema informático el que facilitará esta tarea. una vez se haya restablecido su correcto funcionamiento. los materiales de referencia. Sólo así se podrá garantizar que una incidencia informática no desencadene retrasos innecesarios en la emisión de los resultados. Plebani M. c) los equipos informáticos y el equipo automatizado se mantienen para asegurar su funcionamiento apropiado y se proporcionan las condiciones ambientales y de funcionamiento necesarias para mantener la integridad de los datos. nos permiten obtener la información necesaria para la certificación y acreditación. d) los programas y rutinas informáticos están adecuadamente protegidos para impedir el acceso. ampliación de pruebas solicitadas. los sistemas de automatización global.5 Conexión de los autoanalizadores con el sistema de información del laboratorio Cuando se utilizan equipos informáticos o equipo de análisis automatizado para la toma. Por tanto. pero ya existen muchas opciones en el mercado que habría que estudiar Por tanto. pues se minimizan los errores que muy frecuentemente se cometen en esta etapa. almacenamiento o recuperación de los datos de análisis. Por otra parte. el sistema debe asegurar la integridad de los resultados una vez terminado el proceso analítico. Clin Chem 2002. el software. por un lado. b) se establecen e implementan procedimientos para proteger la integridad de los datos en todo momento. en la automatización han dado un vuelco a la idea tradicional que se tenía de laboratorio clínico. En el caso de muestras ya procesadas que pueden ser requeridas para un reanálisis.3. registro. Errors in laboratory medicine. registrando cualquier modificación realizada a posteriori e identificando en todo momento al usuario que la realiza mediante contraseñas personalizadas. El equipo. El almacenamiento de la muestra primaria y de las posibles alícuotas generadas en el laboratorio.Criterios para la selección de un modelo de automatización del laboratorio Sólo dos fabricantes ofrecen esta posibilidad en la actualidad. por ello un correcto planteamiento inicial a la hora de programar un nuevo laboratorio puede ser fundamental para obtener beneficios a largo plazo. present and the future. Selecting automation for the clinical chemistry laboratory. Arch Pathol Lab Med 2007. Holman JW. Geary TD. Lindeman NI. Hamilton LT.ed Public Health 2002. .tiempo necesario .12:38-41. A model for an uncertainty budget for preanalytical variables in clinical chemistry analyses.Blick KE. Garr SB. Hamilton LT. Ueta T. Penrose JR.278:217-27. Anexo. lipemia e ictericia Detección fibrina Detección volumen Resolución muestras especiales: • contaminantes • líquidos biológicos • orinas Posibilidad de: • dilución • repetición y comprobación • pruebas reflejas Tiempo de obtención resultados: • rutina • urgencia Posibilidad de intercalar las urgencias Fabricante X* 16 • Documentos de la SEQC 2009 . Wentzel-Larsen T. Sasaki M. Listado de aspectos a tener en cuenta al comparar modelos de automatización con vistas a la selección del más adecuado a las necesidades del laboratorio Etapa preanalítica Identificación de pacientes Identificación de especímenes Sistema de numeración de especímenes Identificación de tipo de muestra Códigos de barras que soporta el sistema Posibilidad de impresión de etiquetas (para contenedores. Evaluation of Needs and Alternatives and Development of a Plan. Kwon GC. Implementation of the System and Performance Measures over Three Years. Melanson SE.manual/automático Índice hemólisis. Seaberg RS. Jarolim P. Stallone RO. Am J Clin Pathol 2006. Koo SH. Automated Transport and Sorting System in a Large Reference Laboratory: Part 1.36:1551-5. Felder RA.48:1751-60. Clin Chim Acta 1998. Clin Biochem Revs 1991. . Evaluation of an au tomated preanalytical robotic workstation at two academic health centers. Statland BE. Park JW. Clin Chem 2000.43:540-8. Ogura K. Reynolds P. Park BK. Garr SB. Kageoka T. Bolann BJ. . 125:765-70. Automated Transport and Sorting System in a Large Reference Laboratory: Part 2.34:32-6. . Three-year experience in using total laboratory automation system. Goh L. . Ashwood ER et al. Clin Chem 2007. Bodtker K. . Total laboratory automation in Japan: past. . Holland LL.48:1761-7. The role of total laboratory au tomation in a consolidated laboratory network. Instrumental monitoring of quality. Total laboratory automation can help eliminate the laboratory as a factor in emergency department length of stay. Mifflin TE. Hawker CD. Ashwood ER. Kataoka H. Roberts WL. Clin Chem 2002. .33:68-73. Southeast Asian J Trop. Demers LM. personalizadas. Medical Laboratory Observer 2002. Uyeno D. Sugihara S.46:751-6. . Clin Chem 2002. Clin Chem 2002.53:1343-8. Laboratory automation: Simplifying the process up front. .. Penrose JR.131:1063-9. Automated blood-sample handling in the clinical laboratory. . Clin Chem 1990. Rynning M. Weiss RL. SmithLL . para alícuotas…) Identificación de especímenes cuya extracción es externa al laboratorio Etiquetado automático de los contenedores primarios Clasificación y pretratamiento de especímenes Trazabilidad Fabricante X* Etapa analítica Posibilidad de integrar el sistema en una cadena Equipos disponibles y metodologías empleadas Panel de pruebas Posibilidad de canales abiertos Posibilidad ampliar: .equipos Pruebas problemáticas Pruebas imposibles Reactivos: • información de caducidades y lotes • preparación y conservación • presentaciones disponibles • frecuencia de calibración Mantenimiento: .pruebas . Godolphin W. Hawker CD. controles y calibraciones Posibilidad de intervención manual en el sistema Servicio técnico Servicio de aplicaciones Software Trazabilidad Fabricante X* Etapa postanalítica Recuperación de muestras ya procesadas Capacidad de almacenamiento de muestras Condiciones de refrigeración Retaponado de tubos Trazabilidad Diálogo con el SIL Autonomía y capacidad de volcado de datos Tipo de conexiones Capacidad de almacenamiento de datos Versatilidad del soporte informático para la exportación de datos * El número de fabricantes consultados debería ser al menos 3 (establecer una columna para cada fabricante). Documentos de la SEQC 2009 • 17 .Criterios para la selección de un modelo de automatización del laboratorio Calibradores: • preparación • estabilidad • información de lotes y caducidades • frecuencia y programación Controles: • preparación • estabilidad • información de lotes y caducidades • frecuencia y programación Almacenaje de resultados de pacientes. Consideraciones preanalíticas y fuentes de error 3.35 a 7. R. Marín Soria. Muñoz Pérez. transporte y preparación de las muestras de sangre destinadas a la medición del pH. ya que mediante la modificación de la ventilación pulmonar o de la reabsorción tubular renal pueden modificarse la pCO2 y la concentración de bicarbonato respectivamente.2.8 a 7. quirófano. Tipo 3. Errores durante el procedimiento de obtención 3. entre otros procesos fundamentales para la vida. Díaz García.3.2. M. De igual modo.4.). No es fácil medir la concentración de hidrogeniones en los tejidos. en su implicación directa o indirecta en múltiples reacciones celulares. Contenedores 3. El pH del medio interno se mantiene estable gracias a los tampones o sistemas amortiguadores que existen en dicho medio.1.1. Navarro Segarra. la identificación y transporte de la muestra y sobre los factores 18 • Documentos de la SEQC 2009 .3. etc. Objeto y campo de aplicación 3.2.4. del Río Barcenilla. P. Bibliografía Por otro lado. Galán Ortega.Recomendaciones preanalíticas para la medición del equilibrio ácido-base y gases en sangre Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular Comité Científico Comisión de Magnitudes Biológicas relacionadas con la Urgencia Médica Documento H. 3. P. Buño Soto. Manejo y conservación de la muestra 3. en la conformación de las proteínas y en el intercambio de iones a través de las membranas celulares. el más importante de todos ellos es el sistema formado por el ácido carbónico y el bicarbonato. Muestra: obtención y tipos 3. 2.3. Guillén Campuzano.1. se revisan las posibles fuentes de variabilidad o error originadas en la fase preanalítica que pueden afectar al resultado del análisis. L. Existen diversos procesos nosológicos cuyo manejo puede beneficiarse de la medición del pH. J.45). No es objeto de este documento la revisión profunda de la técnica de extracción para los diferentes tipos de muestra. Tanto una excesiva alcalinidad como una excesiva acidez son incompatibles con la vida por lo que el pH debe mantenerse en un estrecho margen (6. Sangre capilar “arterializada” 3.3. Anticoagulantes 3. La responsabilidad de reducir la incidencia de errores preanalíticos recae fundamentalmente en el laboratorio. Los procedimientos deben ser reunidos en un manual que debe estar disponible para el personal del laboratorio y en todas las áreas de recogida de muestras (enfermería. pero los cambios que tienen lugar en éstos pueden interpretarse a través de las variaciones de pH que se producen en la sangre.3.2. En general. la calidad del resultado entregado es especialmente importante y por ello conviene conocer las causas potenciales de un resultado inexacto.4. Versión 5 Preparado por: X. Proporción 3. Introducción 2. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN Este documento establece recomendaciones para una correcta obtención. INTRODUCCIÓN Un aspecto crítico de la fisiología humana es la capacidad del organismo para preservar la homeostasis o equilibrio fisiológico. Fase 3. E.2. Sangre arterial 3.2. Guevara Ramírez. las variaciones de la ventilación pulmonar y del proceso de la respiración determinan variaciones en la presión parcial de los gases sanguíneos (pO2 y pCO2) que llevan implícitos cambios en el equilibrio ácido-base. aún más estrecho cuando se trata de los valores considerados fisiológicos (7.8). Estos procedimientos deben incluir apartados sobre la verificación y preparación del paciente. La importancia de la homeostasis de la concentración de hidrogeniones (H+) radica. Recomendaciones 5. Errores atribuibles al anticoagulante 3. pO2 y pCO2. Sangre venosa 3. ÍNDICE 1. Errores derivados de la conservación y transporte 4. A. Dado que la medición de estas magnitudes puede estar asociada a procesos patológicos que pueden comprometer de manera importante la vida del paciente y que en función de este resultado pueden iniciarse maniobras diagnósticas o terapéuticas invasivas para él. esta práctica está justificada cuando se desea evaluar la capacidad de oxigenación del paciente.1. conservación. el equilibrio ácido-base y controlar la oxigenoterapia. 1. el buen funcionamiento de los procesos de ventilación pulmonar y respiración (intercambio de gases). A. la pO2 y la pCO2.3. N. Oliver Sáez.3. CONSIDERACIONES PREANALÍTICAS Y FUENTES DE ERROR Los resultados de los análisis de gases sanguíneos son susceptibles de sufrir diversos tipos de errores preanalíticos debido a una praxis incorrecta en su obtención y manipulación antes de su procesamiento o en su preparación en el mismo laboratorio. que debe suministrar procedimientos escritos detallando los requisitos de la muestra y su manipulación. 3. Se ha demostrado que 200 µL de heparina sódica o de litio (1. La presencia de coágulos dará lugar a mediciones inexactas por el paso de microcoágulos al sistema analítico que interfirieren el contacto del electrodo con la muestra. la posibilidad de rotura y un coste inicial relativamente alto. siempre que se sellen convenientemente. Sin embargo.3 Muestra: obtención y tipos Deben seguirse todas aquellas recomendaciones dirigidas a la práctica segura de los diferentes tipos de punción.2).1. la no necesidad de restringir la ingestión de alimentos o líquidos y. un lavado deficiente de la vía del catéter. Uno de los primeros fue la jeringa de vidrio. Las jeringas que contienen heparina liofilizada (congelada y desecada) presentan notables ventajas: a) ahorro de tiempo.5 mm Hg y pO2=160 mm Hg). el seguimiento de una correcta técnica extractora (1. la temperatura y el tiempo de conservación.8). por tanto. ya que no es necesario humidificar previamente el cuerpo de la jeringa con heparina líquida y b) no se plantean problemas de dilución por el exceso de anticoagulante. la punción venosa en lugar de arterial. Los fenómenos de interferencia son particularmente probables cuando el volumen de muestra es muy bajo respecto al de anticoagulante. 3. 3. La concentración de bicarbonato y exceso de base (parámetros calculados a partir de la pCO2) también se verán afectados.2. Contenedores Se han evaluado y recomendado muchos tipos de recipientes.2.000 IU/mL) y vaciarla luego (lo que deja aproximadamente un volumen residual de 0. la variable proporción de sangre capilar que pueden contener. como por ejemplo una anticoagulación inadecuada. citratos y el EDTA no son aceptables para estos fines. 3.000 UI/mL. Los oxalatos. lo que convertiría a las jeringas de vidrio en el dispositivo óptimo para la obtención de la muestra si no fuera por sus diversas desventajas. por supuesto.000 ó 10. El vidrio es un material inerte e impermeable a los gases. que se desplaza debido a la presión arterial y la heparinización previa del dispositivo. son más baratas y relativamente irrompibles. venosa o capilar) y.3. El pH de la heparina sódica estará aproximadamente entre 6 y 8 (5). mayor es la posibilidad de intercambio entre ambos medios (1. pueden conducir a errores de difícil estimación. así como aquellas maniobras dirigidas a impedir daños colaterales sobre el paciente. además de la dificultad que ofrecen para una óptima homogeneización (3). Todas ellas eliminan la necesidad de esterilizar el dispositivo. pO2. Anticoagulantes 3. que probablemente debe considerarse un recipiente de “referencia” con el que comparar la exactitud de otro tipo de recipientes (jeringas de plástico regulares. puede ser recomendable lavar la jeringa con un chorro de heparina sódica o de litio (1. Debe explicarse correctamente al paciente el fin de la prueba. En el caso del uso de jeringas convencionales donde la heparinización deba realizarla el usuario. La interferencia por quelación producirá una disminución de la concentración del ión calcio si los centros de enlace de la heparina no están convenientemente saturados o tamponados con este ión (heparinas equilibradas con electrolitos) (2. debe prestarse especial atención a los procedimientos básicos de identificación del paciente. Errores atribuibles al anticoagulante El efecto interferente del anticoagulante sobre la muestra de sangre puede producirse por quelación o por dilución si se usa un preparado líquido añadido en exceso en jeringas corrientes no heparinizadas.2. identificación de la procedencia del espécimen (arterial. la posible dilución por la heparina. al ser éste el anticoagulante de elección. situación frecuente en la realización de gasometrías por diversos motivos. se producirá la coagulación de la muestra que dejará de ser homogénea y. pCO2 (18-21).Recomendaciones preanalíticas para la medición del equilibrio ácido-base y gases en sangre preanalíticos que la afectan de modo directo. Cuanto mayor es la diferencia existente entre la pO2 y pCO2 de la sangre y la del aire ambiental.1 mL en una jeringa estándar de 2 mL). muchas veces con heparina cristalina que minimiza los errores por dilución pudiéndose obtener muestras de pequeño volúmen de de manera fácil. Documentos de la SEQC 2009 • 19 .11). Proporción El volumen de heparina utilizado debe ser alrededor del 5% del volumen total de la muestra y nunca superior al 10%. En el proceso de recogida de la muestra. Por otro lado. los microcoágulos pueden inutilizar el sistema. pO2 y pCO2 debe efectuarse en sangre homogeneizada tratada con heparina (sódica o de litio) liofilizada o líquida. contaminación con aire o la conservación incorrecta. Su principal desventaja técnica es el intercambio de gases a través del plástico (pues se trata de un material permeable) que puede representar un problema importante según el tipo de plástico.2.000 UI/ mL) evitan la coagulación de 5 mL de sangre (alcanzando una concentración final de 40 UI/mL) sin afectar la medición de pH. El incremento de la presión osmótica del plasma al añadir una sustancia seca que no atraviesa las membranas (como la heparina).000 UI/mL) no debería usarse ya que puede alterar el pH (dado su carácter ácido) y el calcio iónico (por su efecto quelante) (4). Tipo La medición de pH. El pH es muy resistente a este efecto de dilución (incluso con diluciones del 50%) y la pO2 puede incrementarse si la dilución es alta (35-50%) (18-21). En el caso de la heparina líquida la pCO2 y la pO2 suelen tener valores cercanos al aire ambiente (pCO2=7. Entre éstas destacan la necesidad de esterilizarlas adecuadamente si van a reutilizarse. La heparina de mayor concentración (5. Las jeringas de plástico diseñadas especialmente para el análisis de gases incorporan ventajas técnicas como el émbolo elevable. demorando la atención urgente de otros pacientes.1. Otra fuente de error preanalítico es la deficiente dosificación de heparina (en jeringas no heparinizadas por el fabricante). Como efecto. Los dispositivos usados mayoritariamente son las jeringas estándar de plástico (polipropileno) de 1 a 5 mL y las jeringas de plástico diseñadas específicamente para contener una muestra destinada a la medición de gases en sangre. Esto permite la anticoagulación adecuada de una muestra de 2 a 4 mL de sangre y asegura que el anticoagulante no sea añadido en exceso pudiendo alterar el resultado (4. adecuada para su fin. a una concentración de 1. produce una disminución del agua intraeritrocitaria con la posible disminución del VCM y aumento de la CHCM (12).2. 7).4.3. La interferencia por dilución debida al exceso de heparina produce una disminución de la pCO2 en la muestra al equilibrarse los gases de la muestra con los de un líquido con una composición similar al aire ambiental (este efecto se puede observar con diluciones superiores al 10%). jeringas de plástico “especializadas” y los tubos capilares). Otro tipo de recipiente aceptable para recoger y transportar la muestra son los tubos capilares especiales de vidrio heparinizados. 3. las presiones parciales de los gases del espécimen. quemados. Errores durante el procedimiento de obtención Una mala praxis en la obtención de la muestra de sangre venosa puede hacer que esa muestra sólo refleje el equilibrio ácido-base de una extremidad y no del organismo en su totalidad. en esencia. la muestra destinada a la medición de pH. El paciente que respira espontáneamente debe mantenerse en reposo durante 15 min. La muestra deberá ser sangre capilar “arterializada”. de lo contrario la anoxia hística producirá alteraciones en las magnitudes medidas (acidemia. Sangre capilar arterializada La sangre capilar. pO2. muestras venosas mixtas extraídas a partir de un catéter de Swan-Ganz (arteria pulmonar) para evaluar la pO2. si el análisis se puede realizar en un plazo de 30 minutos es mejor la conservación a temperatura ambiente. Por lo tanto. Las arterias son conductos en los que. deberá impedirse la formación de burbujas que representan una fuente de error en la medición de los gases sanguíneos al alterar las presiones parciales de éstos en la muestra.4. Debe escogerse el decúbito supino que asegura una correcta y homogénea ventilación pulmonar. En algunos casos se utilizan. Cuando se toman muestras capilares arterializadas. la posibilidad de aparición de dolor pulsátil en el caso de la punción arterial. la presencia de aire en la muestra tenderá a reducir la pCO2 (produciendo un aumento en el pH) y a aumentar o disminuir la pO2 equilibrando la muestra con el aire ambiente (10). sea cual sea el origen de la muestra. 3. cuando la arteria radial no es adecuada. • La sangre que se obtiene para el estudio del gradiente alveoloarterial o de “shunt” debe analizarse dentro de los cinco minutos que suceden a su extracción independientemente de la temperatura de conservación.1 Sangre venosa Las muestras de sangre venosa se recomiendan para valorar el estado del equilibrio ácido-base del paciente y no son válidas para conocer el estado de oxigenación del mismo (9).durante la extracción. la ansiedad y el dolor. debido a un aumento del gradiente entre la muestra y el aire exterior al producirse una disminución relativa del O2 en la muestra debido al enfriamiento (aumenta la solubilidad del O2 y aumenta la afinidad de la hemoglobina por el O2). El lugar preferido para la punción suele ser la arteria radial. incremento del 20 • Documentos de la SEQC 2009 .4).3. pacientes en síncope. Si se usan catéteres permanentes o cánulas para la toma de muestras. debe ponerse especial atención en que el fluido o las soluciones de lavado se eliminen completamente del sistema. derivado de la fisiología pulmonar. por tanto. El paciente debe estar en un estado de equilibrio ventilatorio antes y durante la extracción para asegurar que la muestra es representativa del estado del paciente. Puesto que el aire ambiente contiene una pCO2 prácticamente nula y una pO2 de alrededor de 150 mm Hg. Para asegurarse de la existencia de un correcto flujo colateral por la arteria cubital se utiliza la maniobra de Allen modificada (1) que. al ser una extracción destinada a la medición del equilibrio ácido-base. Este efecto es mayor cuanto mayor es la superficie de contacto aire/sangre (burbujas pequeñas y múltiples) y se manifiesta sobre todo en la pO2 (11). Así pues. 3. saturación de O2. refleja de forma precisa la fisiología ácido-básica y el estado de oxigenación del organismo.8). pues de hacerlo se produce un vertido de productos a partir del componente intra y extracelular que pueden alterar el valor de diversas magnitudes. para ello debe conseguirse una vasodilatación local por masaje y calentamiento del lecho capilar con agua a una temperatura # 42° C durante 10 a 15 minutos (3.4. no se produce intercambio gaseoso y por lo tanto una muestra arterial tiene el mismo pH. la primera gota se debe eliminar pues ésta es rica en fluido extracelular y puede ser una causa de mediciones erróneas al alterar la concentración de ciertos electrolitos como el potasio o producir interferencias por dilución. Debe evitarse. • Si no puede garantizarse la medición en los 30 minutos siguientes a la obtención de la muestra. 3. Los resultados son estables durante al menos una hora.3. destinadas a paliar las desviaciones en los resultados debidas al proceso de conservación (6. ésta debe recogerse en recipiente de cristal y almacenarse en agua–hielo (0-4º C) hasta su análisis. Otros lugares de punción. cuidadosamente recogida. Manejo y conservación de la muestra Idealmente. Cuando esto no es posible. debe dejarse fluir la sangre siguiente en un capilar heparinizado sin exprimir.2. con la ventaja de requerir sólo pequeñas cantidades de ésta para la determinación. La extracción puede realizarse bien por punción directa de la arteria o a partir de un catéter arterial. mantener la anaerobiosis y evitar cualquier riesgo biológico potencial.3. La conservación de la jeringa de plástico en agua–hielo producirá cambios en las presiones parciales de los gases sanguíneos (sobre todo en la pO2). cuyas presiones son cercanas al aire ambiental (10). En el caso de obtención de una muestra de origen venoso.4.3.3. puede manejarse de manera muy semejante a la sangre arterial contando. la función pulmonar (shunt) y el consumo de oxígeno. de forma adicional a la muestra arterial. la pedía y la femoral como última opción. En ningún caso la muestra debe quedar sellada por una aguja sino por un tapón o mecanismo diseñado específicamente para sellar la muestra. deben contemplarse las siguientes recomendaciones generales.3. La sangre debe recogerse en condiciones anaerobias para impedir el intercambio de gases con el aire circundante y debe sellarse el contenedor para asegurar el mantenimiento de la anaerobiosis. El uso de sangre capilar para la medición de gases y del equilibrio ácido base puede ser necesario cuando la punción arterial es muy difícil o está contraindicada (recién nacidos.).9). la extracción de muestras capilares y arteriales para obtener resultados sistémicos del equilibrio ácido-base y de las presiones parciales de los gases en sangre. Sangre arterial La sangre arterial resulta el espécimen preferido para el estudio de los gases sanguíneos y equilibrio ácido-base. por lo tanto. La contaminación de la muestra con líquido procedente de una perfusión determinará la disminución de los valores de la pCO2 y la obtención de valores de pO2 cercanos a los 150 mm Hg al equilibrarse los gases de la muestra con los del líquido en perfusión. son la humeral. La oclusión producida debe minimizarse. Además. Es preferible. Por lo tanto. pCO2 y pO2 que la sangre del ventrículo del que procede.13): • Las muestras en jeringas de plástico destinadas a la medición de pH y gases en sangre deben medirse dentro de los 30 minutos tras su extracción. etc. pCO2 debe procesarse inmediatamente tras su extracción. 3. lactato) (2. y en caso de respiración asistida u oxigenoterapia no deben introducirse cambios al menos 30 minutos antes de la extracción. 3. permite evaluar la existencia de dicho flujo. personas obesas. debe tenerse especial precaución con el uso del torniquete. así como la necesidad de respirar normalmente (1. la diferencia arterio-venosa de la concentración de O2 en sangre venosa mixta. además. con un procedimiento simple. 4. 2001 4. Para detectar y evitar la presencia de coágulos deben despreciarse de 100 a 200 µL de la jeringa. Además. La demora en el análisis no debe exceder los 30 minutos tras la extracción. La existencia de coágulos puede dar lugar a mediciones inexactas al interferir sobre el electrodo directamente. principalmente en los eritrocitos. 2004 NCCLS. 3. ya que para ralentizar el consumo de oxígeno por estas células. 3) Muestra • La muestra debe representar el estado de ventilación del paciente. 4th Edition. Approved Standard. H4-A5. RECOMENDACIONES Se resumen los principales factores a tener en cuenta en el análisis de las muestras destinadas a la medición del equilibrio ácido-base y gases en sangre. 3. Las jeringas de vidrio o plástico deberán invertirse 10 veces y luego agitarse mediante giros sobre los dos ejes del recipiente de la muestra durante 60 segundos. 5th Edition. pCO2 y del equilibrio ácido-base. La caída en pO2 se acelera si en la muestra original la pO2 estaba elevada.13): a) Metabolismo de las células de la sangre: la glicólisis. • La sangre arterial es el espécimen preferido para el estudio de los gases sanguíneos. c) Sedimentación celular: se ha demostrado variabilidad de la medida en las magnitudes pH. se producen cambios después de pocos minutos de obtenida la muestra en la pO2 (incrementos mayoritariamente). 2004 Preanalytical aspects in STAT analysis.000 UI/mL) por cada mililitro de sangre (alcanzando una concentración final de 40 UI/mL). • Contenedores de vidrio: deben analizarse antes de 30 minutos tras la extracción. Los procesos metabólicos pueden reducirse enfriando la muestra (10). Approved Standard. mientras que los capilares y jeringas de vidrio permanecen sin alteraciones en los gases durante al menos una hora si se conservan en hieloagua. bicarbonato y exceso de base hacia el intervalo de la acidosis metabólica. 6) Preparación de la muestra: homogeneización y purga de la jeringa La alícuota de la muestra que se transferirá al analizador debe ser homogénea y representativa de la muestra. nº 1 NCCLS. los materiales plásticos no son absolutamente impermeables a los gases. Para ello debe homogeneizarse adecuadamente la muestra y despreciar las primeras gotas para asegurar la ausencia de coágulos y eliminar cualquier burbuja residual. La homogeneización debe ser más intensa cuando la muestra se ha sometido a enfriamiento. a temperatura corporal) y plaquetas disminuye la pO2 y aumenta la pCO2. 1) Contenedor • Se recomienda el uso de jeringas de plástico específicamente diseñadas para gasometrías tratadas con heparina seca equilibrada con electrolitos.Recomendaciones preanalíticas para la medición del equilibrio ácido-base y gases en sangre • Debería utilizarse la jeringa de vidrio conservada en agua-hielo cuando el paciente presente leucocitosis o trombocitosis. De no existir la posibilidad de jeringa de vidrio puede usarse la de plástico analizando la muestra inmediatamente. Documentos de la SEQC 2009 • 21 .1. • La sangre capilar “arterializada” es válida para la valoración del equilibrio ácido-base y presiones parciales de los gases y puede utilizarse cuando la extracción arterial es difícil o está contraindicada. C46-A. H11-A4. Errores derivados de la conservación y transporte Las muestras obtenidas para la medición de la presión parcial de gases en la sangre y equilibrio ácido-base pueden afectarse durante la conservación y transporte debido a los siguientes procesos (2. Este fenómeno no afecta a las jeringas o capilares de cristal (2. por lo tanto el paciente que respira espontáneamente debe hallarse estable y no deben introducirse cambios en la media hora que precede a la extracción en el que está sometido a ventilación asistida o en tratamiento con oxigenoterapia. 2) Anticoagulante • Se recomienda heparina seca equilibrada con electrolitos con el fin de evitar errores por dilución. es necesario que las muestras sean homogeneizadas cuidadosamente antes de las mediciones para evitar la sedimentación.1 mL de oxígeno de 100 mL de sangre en 10 min. 2. para ello deben extraerse las burbujas que se hayan generado durante la extracción y sellar convenientemente el contenedor. 4) Estado de la muestra: burbujas y coágulos La muestra debe conservarse en anaerobiosis. Procedures and devices for the collection of diagnostic capillary blood specimens. Blood gas and pH analysis and related measurements. 5. • Las muestras de sangre venosa sólo se recomiendan para valorar el estado del equilibrio ácido-base del paciente y no son válidas para conocer el estado de oxigenación. Se ha podido demostrar que la entrada de O2 a la jeringa de plástico es mayor cuando se refrigera la muestra que cuando permanece a temperatura ambiente. conservándose a temperatura ambiente. Se recomienda rechazar la muestra ante la presencia de burbujas o coágulos visibles.11. se conservarán a 0-4º C en agua-hielo no más de una hora. pO2 y pCO2 cuando se compara la fracción rica en células con la fracción rica en plasma.15). Las muestras en capilares de vidrio deberán volver a mezclarse moviendo la barrita de metal desde un extremo a otro del tubo durante unos 10 segundos. BIBLIOGRAFÍA 1. vol. 5) Conservación: tiempo y temperatura • Contenedores de plástico: deben analizarse lo antes posible.14. por ello cuando se use heparina líquida la dosis será de 40 µL de heparina sódica o de litio (1. por lo que es fundamental la homogeneización de la muestra previamente al análisis (11). Cuando se esperan pO2 elevadas o en estudios especiales (gradiente alveolo-arterial o shunt) deben analizarse antes de cinco minutos. Müller-Plathe O.4. b) Intercambio de gases: Como se ha mencionado. debe enfriarse la muestra con los condicionantes explicados en el primer punto. En las jeringas de plástico. 7. NCCLS. al despreciar estas primeras gotas se purga la sangre en la jeringa evitando la introducción de burbujas de aire en el instrumento. El consumo de oxígeno por los leucocitos (0. Este fraccionamiento es fruto de la sedimentación de la muestra durante el transporte o espera en el propio laboratorio. Durante el mezclado no debería formarse ninguna burbuja o espacio muerto (4). Si no fuera posible. Para la medición de la pO2. • La dosificación de heparina deberá prevenir la coagulación y evitar efectos de dilución. ocasiona la formación de lactato y cambios en el pH. Cuando se esperan pO2 elevadas o en estudios especiales (gradiente alveolo-arterial o shunt) deben analizarse antes de cinco minutos. Procedures for the collection of arterial blood specimens. Approved Guideline.13. Blood gas news 1998. Rayfield JM. Dahl M. Schmidt C. Western J Med. www. Recommendations for collection of skin puncture blood from children. Fogh-Andersen N. 2001 13. Mullin RA. 47: 199-205 9. Dake MD. Mejoría continua de la etapa preanalítica.. Clark CG. Clinical application of blood gases. blood gases. 1988 8. Scand J Clin & Lab Invest. 287: 1131-2 22 • Documentos de la SEQC 2009 . 6: 251-5 20. Sampling and storing of blood for determination of acid-base status. The effect of heparin dilution on arterial blood-gas analysis. 2003 10. Too much heparin: possible source of error in blood-gas analysis. sample storage time and temperature on blood gases and oxygen saturation in arterialised human blood samples. C27-A. Blood gas pre-analytical considerations: specimen collection. Shapiro.A. Crockett RJ. Small M. 1983. 33: 247 – 53 6. Zijlstra WG. Clin Chem 1991.A. análisis y correlación. Wimberley PD. and storage for simultaneous determination of pH. Walton. with special reference to production of reference values. 1978. Hunter JA. Kantero R. Maas AHJ. Wong RJ. Changes in oxygen measurements when whole blood is stored in iced plastic or glass syringes. Approved IFCC recommendations on whole blood sampling. Siggaard-Andersen O. 37: 1244-8 15. R. Siggaard-Andersen O. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1992. Arterial blood-gas analysis: potential errors due to the addition of heparin. NCCLS. Külpmann WR. Diciembre 2007 17. Effects of syringe material. Edit. Blood Gas News 1998. Argentina. Dryburgh FJ. Buenos Aires. Obtención de muestras sanguíneas de calidad analítica. Panamericana. van Kessel AL. J. Luis Morán Villatoro. Hjelm M. pCO2 and pH in heparinized whole blood samples: influence of storage temperature with regard to leukocyte count and syringe material. BMJ. Anaesth Intensive care. 1977 11. 2ª ed.es. Douce FH. Alpers JH. calibration and controls. Gräsbeck R. 1984. 30:767-73 16. Van Kessel AL. Hamilton RD. teoría. electrolyte and metabolite analysis.5. Järvenpää AL. Hutchison AS. Médica Panamericana. Müller-Plathe O. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1995. Scand J Clin Lab Invest 1987. 13: 196-204 19. Larsson A. Procedures for the collection of diagnostic blood specimens by venipuncture. Year Book Medical Publisher. 5th Ed.. Respiratory care. Ralston SH. Chicago. Fogelman I. 51: 732-6 14. Knowles TP. NCCLS. Hagenfeldt L. H3-A5.com/Preanalytical. and electrolytes. Müller-Plathe O. Preanalytical errors in simultaneous blood gas.deep-picture. Pesce A.A. Química clínica.R. approved standard. Stability of pO2. Harvey JA. Covington AK. Peters J. Teague R. Harrison.J. Leskinen EE. Diciembre 2007 18.radiometer. Hertz H. www.. B. Burnett RW. 140: 792-3 21. transport. 1993 7. Alström T. Clague AE. Kaplan L. Mahoney JJ. técnicas de laboratorio-fisiopatología-métodos de análisis. 2006. Edit. 1961. 7: 12–5 12. la capacidad de interactuar con la zona pelúcida. Fase 3. Marcos. Aulesa. Preparación del semen 5. Eliminar el plasma seminal que contiene sustancias inhibidoras de la capacitación. Semen fresco 5. la reacción acrosómica y el inicio de la fusión con el ovocito (5).4). 1. V. Sánchez. preparación del semen para la técnica de repro ducción asistida de elección. La capacitación es un fenómeno reversible necesario para la inducción del movimiento hiperactivo. C Sánchez. Persigue dos objetivos: 1. agentes infecciosos y proteínas antigénicas. Sustancias captadoras como la albúmina localizadas en el moco cervical actuarían facilitando los cambios en el componente lipídico de la membrana del espermatozoide (8). C. En condiciones in vivo los espermatozoides móviles se separan del resto del eyaculado por migración activa a través del moco cervical.3. Moreno. 2. Bases fisiológicas de la capacitación del espermatozoide 4. La finalidad de este proceso es seleccionar los espermatozoides móviles morfológicamente normales y mejorar la calidad de los mismos. ya que Documentos de la SEQC 2009 • 23 . 4. Generación de cantidades controladas de especies reactivas de oxígeno 4. 3. porque disminuye la liberación de linfoquinas y reduce la formación de radicales libres (1). prostaglandinas. Métodos de preparación del semen: 5. Gradientes de densidad 5. Objetivo de las técnicas de preparación de semen 5.1. Lozano.1. Introducción 2.2. Migración 5. Materiales y medios necesarios: 5. M. 3.3. treonina y tirosina. Galán. INTRODUCCIÓN La preparación de los espermatozoides es un requisito previo para la realización de cualquier técnica de reproducción asistida. La modificación de los esteroles de la membrana plasmática del espermatozoide se inicia tras la retirada del plasma seminal (7). incluyendo la inseminación artificial. Fosforilación de proteínas en los residuos de serina. determinará la técnica de reproducción asistida a aplicar en cada caso (2). Jiménez. a unas condiciones de cultivo que faciliten y aporten los cambios y las señales de transducción de forma semejante a las condiciones in vivo (8). en respuesta a la creciente necesidad. OBJETIVOS DE LAS TÉCNICAS DE PREPARACIÓN DE SEMEN El plasma seminal puede contener agentes infecciosos que deben eliminarse antes de cualquier técnica de reproducción asistida. J de Montserrat ÍNDICE 1. 3. deben ofrecer en su cartera de servicios técnicas de preparación de semen para reproducción asistida.6): 1. Fluidificación de la membrana celular debido a modificaciones de la estructura lipídica. Selección de espermatozoides para pruebas funcionales.2. 2.2. Objeto y campo de aplicación 3.2.3. de los leucocitos. Muestra 5. en el estudio básico de la pareja estéril. Recomendaciones 7. El resultado de la preparación.2. Semen congelado 5. A. Separar los espermatozoides móviles de los inmóviles. Bibliografía El campo de aplicación de esta técnica es: 1. JM. Versión 4 Preparado por: I. Actualmente no se conocen todos los sucesos implicados en el complejo proceso de la capacitación. El objeto de este documento es establecer unas recomendaciones para la realización de las técnicas de recuperación de espermatozoides móviles. La capacitación de los espermatozoides se puede conseguir in vitro. Martín. Tratamiento. de las células germinales inmaduras y de otras células redondas. MG. Conclusiones 8. si son sometidos durante el tiempo necesario. I. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN Los laboratorios clínicos. Serrano. Mar. Castilla. y deben experimentar un proceso en el que se producen cambios moleculares denominados capacitación.Técnicas para la preparación de semen en reproducción asistida Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular Comité Científico Comisión de Seminología y Técnicas de Reproducción Asistida Documento C.1. Resultados 6. tanto in vivo como in vitro y será fundamental para el éxito de la reproducción asistida (3. MI. junto con otros factores dependientes de la mujer. 2. BASES FISIOLÓGICAS DE LA CAPACITACIÓN DE LOS ESPERMATOZOIDES Los espermatozoides de todos los mamíferos placentarios son incapaces de fecundar el ovocito directamente desde el eyaculado. Se diferencian las siguientes etapas (5.4. 2. Los espermatozoides adquieren la capacidad de fecundar el ovocito después de haber permanecido durante un tiempo en el tracto genital femenino. I. JA. García-Cobaleda. Flujo de Ca++ hacia la cabeza y flagelo del espermatozoide. C. Diagnóstico. El adecuado procesamiento de la muestra va a influir en la capacidad fecundante del espermatozoide. son susceptibles de provocar infecciones en la mujer y contaminar los cultivos de ovocitos y embriones (9). fosfato o bicarbonato. 5. 5. así como la concentración de sales necesaria para la homeostasis del espermatozoide y en la mayoría de los casos gentamicina como agente bacteriostático.2. 1. Colocar aproximadamente 250 µL de semen licuado en el fondo de un tubo no cónico (para aumentar la superficie de contacto). 2. Retirar el sobrenadante con cuidado de no aspirar el botón celular. 3. Los gradientes de densidad separan los espermatozoides en función de su punto isopícnico. Los medios para la preparación de semen son de dos tipos: 1.2-7. Depositar sobre el semen 500 µL de medio de cultivo resbalando por las paredes del tubo. dextrano… 24 • Documentos de la SEQC 2009 . de migrar desde el semen al medio cultivo. los que realmente tienen utilidad clínica son los de migración y gradientes de densidad. Centrifugar y llevar a un volumen final de 300-500 µL para inseminar. El inconveniente de estos métodos es que los espermatozoides inmaduros y el resto de las células permanecen en contacto durante todo el proceso con los espermatozoides maduros y pueden producir efectos adversos sobre estos.1 Materiales y medios necesarios Todos los materiales empleados así como los medios de cultivo deben ser estériles y manejarse en condiciones de asepsia. 2. Aportar un medio de cultivo que contenga moléculas captadoras de esteroles (albúmina) y una composición iónica que apoye la homeostasis del espermatozoide y facilite las señales de transducción (calcio. Retirar los espermatozoides muertos. puede impedir de forma permanente la fecundación.2. ácido hialurónico. con cuidado de que no se mezcle con el semen. homogeneizar. deberían abandonarse y emplear técnicas más seguras de preparación de espermatozoides (4). No más tiempo para evitar la contaminación con plasma seminal (10) 4. Si el volumen obtenido es mayor de 500 µL. El pH debe mantenerse en un rango entre 7. El contacto durante un tiempo prolongado de los espermatozoides con el plasma seminal produce un efecto adverso. 5. electroforesis. 5. Migración 3. Centrifugar durante 10 minutos a 500 g. Dilución y lavado del semen 2. Métodos avanzados: anticuerpos monoclonales. Medios de lavado y cultivo. Dentro de esta categoría existen dos formas principales Swim Up directo y Swim Up convencional. Añadir medio de lavado en una proporción v/v. Pasado este tiempo aspirar aproximadamente 300 µL de medio de cultivo. por lo que tienen que usarse en estufa con temperatura y CO2 controlados.1. para ello es necesario utilizar medios tamponados. porque la mayor parte del proceso se realiza en atmósfera aire. Añadir resbalando lentamente por las paredes del tubo 500 µL de medio de lavado. Los medios específicos para semen suelen estar tamponados con HEPES y pueden usarse en atmósfera aérea. PREPARACIÓN DEL SEMEN 5. Además los medios deben tener una concentración de calcio. Adherencia-Filtración 5. bicarbonato y proteínas específica para que los espermatozoides adquieran la capacidad de fecundar. en campana de flujo laminar. Los métodos que utilizan solo lavado. 4.2. Dejar en un incubador a 37ºC formando un ángulo de 45º. Además muchos de los espermatozoides móviles pueden quedar atrapados en el fondo del sedimento y no alcanzar nunca el medio de cultivo (4). prostaglandinas y linfoquinas. Los medios de cultivo han de atemperarse antes de su uso y tener la certificación CE. 5.2 SWIM UP CONVENCIONAL Se basa en el mismo principio pero requiere un primer paso de lavado 1.4. Así la separación de los espermatozoides del plasma seminal debe realizarse lo más rápido y eficazmente posible (3. el resto no se exponen en el documento. tecnología de microesferas (anexina V magnetic-activated cell sorting). En los métodos de adherencia-filtración. Gradientes de densidad 4. De todos los métodos. para aumentar la interfase. Continuar el proceso desde el punto 3 del método anterior. Contienen proteínas. células redondas y agentes infecciosos. 3. bicarbonato) (8). Los medios tamponados con bicarbonato necesitan una atmósfera rica en CO2 y una temperatura de 37ºC para que se mantenga el equilibrio iónico. El proceso consta de varias fases: 1. con cuidado de no aspirar semen (para lo cual durante todo el proceso se debe mantener el ángulo del tubo). Se recomienda utilizar medios que no requieran CO2.1. durante un tiempo entre 30-60 minutos dependiendo de la calidad del semen. 5. 3. Para los métodos de migración el movimiento del espermatozoide es un requisito esencial. 2. valorar el grado de movilidad y la concentración de los espermatozoides. Utilizar tantos tubos como sea necesario para mejorar la recuperación de los espermatozoides. mayoritariamente albúmina que actúa como captadora y transportadora de moléculas.1 SWIM UP DIRECTO El semen licuado se deposita debajo o sobre un medio de cultivo y los espermatozoides con buena movilidad se dirigen al medio de cultivo de forma semejante al proceso in vivo a través del moco cervical. Por lo tanto los objetivos de las técnicas de preparación de semen serán: 1. es necesaria la combinación de la movilidad de los espermatozoides con la adherencia a las matrices de filtración (lana de vidrio. sefadex) (11). Los tampones más utilizados son: HEPES. Separar los espermatozoides del plasma seminal que contiene sustancias decapacitantes. Si hay más de un tubo de una misma muestra se unifica todo el aspirado en un único tubo. Los métodos avanzados se desarrollan para investigación.2 Métodos de preparación del semen Los métodos incluyen desde la simple dilución y centrifugación hasta técnicas más complicadas. Los medios de cultivo deben tener una osmolalidad entre 280-300 mOsm/kg. leucocitos.1 Migración Se basan en la capacidad de movimiento de los espermatozoides.10). Medios para preparación de gradientes. 2. Los más usados contienen una suspensión coloidal de partículas de sílice unidas de forma covalente a moléculas de silano y se preparan en solución isotónica. Se recomienda una centrífuga de cabezal fijo para que el botón celular tenga una amplia superficie de contacto con el medio de cultivo. La ventaja respecto del método anterior es que disminuye la contaminación con el plasma seminal (10). 3. Los resultados se obtienen multiplicando el tanto por ciento de espermatozoides con movilidad progresiva. El semen debe quedar encima del gradiente de 40%. La muestra de semen criopreservada contiene un agente crioprotector que debe ser retirado antes de utilizarla para cualquier técnica de reproducción asistida. ausencia de espermatozoides en testículo. Pasados 30 minutos de la eyaculación separar una alícuota de semen para su valoración siguiendo las recomendaciones de la ESHRE (13). se centrifugará y resuspenderá en un volumen entre 300-500 µL de medio de cultivo para inseminar.5 mL del gradiente de 80% en el fondo del tubo (cono). Repetir el proceso con todos los tubos de la misma muestra. 2. Transferir a un único tubo nuevo (para evitar contaminaciones) con 1-2 mL de medio de lavado. y multiplicarse por el factor de corrección. homogeneizar y centrifugar a 500 g durante 10 min. los resultados deben expresarse en función del volumen utilizado. Resuspender en 300-500 µL de medio de cultivo.5 mL de semen por tubo. Cambiar de pipeta. con cuidado de no aspirar el botón celular.3. 5. Los diferentes componentes se separan hasta alcanzar una posición en la que su densidad sea igual a la de su entorno (situación de flotabilidad neutra). RECOMENDACIONES Para el correcto desarrollo de este proceso se debe tener en cuenta las siguientes recomendaciones: Documentos de la SEQC 2009 • 25 . Si el semen se va a utilizar para inseminación artificial se informará como millones inseminados y se calcularán multiplicando por el volumen inseminado. 3. resbalando por las paredes de los tubos. En caso de utilizar parte del volumen eyaculado. Se preparan los tubos que sean necesarios por muestra teniendo en cuenta que no se debe depositar más de 1. 1. Se recomienda utilizar volúmenes de 0. 2. preferiblemente por gradientes de densidad. donde se encuentra el sedimento con los espermatozoides maduros. La dilución debe ser un proceso lento para evitar el choque osmótico (14). 6. 5. Decantar el semen licuado. depositar 0. a continuación con una jeringa de 1 mL conectada a una aguja larga de carga. muy despacio para que el gradiente de 40% suba y queden bien definidas las dos capas. 4.2 Semen congelado En aquellas situaciones en las que no se puede emplear semen fresco se puede recurrir a semen congelado. parejas serodiscordantes. los espermatozoides inmaduros y muertos se sitúan en la interfase entre los dos gradientes. hasta alcanzar claramente el gradiente de 80%.1 Semen fresco La muestra de semen debe recogerse siguiendo las recomendaciones de la fase preanalítica previamente publicadas (12). enfermedades hereditarias en las que el varón es el portador y mujeres sin pareja masculina. La forma habitual para descongelar el semen es dejar las pajuelas de seguridad biológica a temperatura ambiente durante 10 minutos. Procesar igual que el semen fresco. Se debe valorar y si es necesario. Una vez descongelado el semen y antes de procesarlo debe valorarse la concentración y el grado de movilidad de los espermatozoides. Decantar el contenido de las pajuelas en un tubo estéril. Centrifugar a 300 g durante 20 minutos. Los gradientes de densidad utilizados actualmente parten de una suspensión coloidal de partículas de sílice unidas de forma covalente a moléculas de silano. En determinadas circunstancias como son oligozoospermias severas. homogeneizando. Existen dos tipos de muestras de semen criopreservadas: 6. Dispensar 0. Aspirar las distintas capas con una pipeta pasteur en la zona del menisco para evitar alterar las interfases y las posibles contaminaciones. Retirar todo el sobrenadante.5 mL de medio de lavado.3. 5. Diluir (aproximadamente a 1/5) en medio de lavado.Técnicas para la preparación de semen en reproducción asistida Para mejorar la tasa de recuperación de espermatozoides móviles se puede fraccionar la muestra en varios tubos.2 Gradientes de densidad Los gradientes de densidad disgregan las partículas en función de su densidad de flotación.5-1 mL de cada gradiente de concentración. La relación del total de espermatozoides presentes en el eyaculado con el número de espermatozoides móviles recuperados. durante al menos 10 minutos (gota a gota) 4. Se añaden lentamente. 5. El plasma seminal permanece flotando sobre el gradiente de menor densidad y las células. etc. Se expresará como millones de espermatozoides recuperados con movilidad progresiva. • Semen criopreservado antes de iniciar terapias que pueden comprometer la capacidad reproductora del paciente. se expresa como porcentaje de recuperación (4) y se calcula con la siguiente formula: Porcentaje de recuperación = [(VF x CF x REM)/(VU x CI x IEM) ]x 100 VF= volumen final CF= concentración final de espermatozoides REM= tasa de espermatozoides con movilidad progresiva recuperados VU= volumen semen utilizado CI= concentración inicial de espermatozoides IEM=tasa de espermatozoides con movilidad progresiva en el eyaculado 5. al aspirar el/los sedimentos. para que se produzca el equilibrio osmótico sin daño para el espermatozoide. donde ya no se desplaza más. procesarlos siguiendo el protocolo y unificar el aspirado de cada tubo en un único tubo.5 mL del gradiente de 40% en un tubo cónico. se utilizan de forma discontinua en soluciones isotónicas a una concentración del 80 y del 40% y pueden adquirirse ya preparadas. 7. 1. con cuidado de no romper la interfase. • Semen de donante. Los espermatozoides maduros son células compactadas y alcanzan el gradiente de mayor densidad (el fondo del tubo). por los millones de espermatozoides recuperados y por el volumen final.4 Resultados Una vez terminada la técnica hay que calcular el porcentaje de espermatozoides con movilidad progresiva y realizar el recuento de los mismos siguiendo las directrices de la ESHRE (13).3 Muestra 5.2. cuando exista dificultad para conseguir coordinar el momento de la inseminación con la recogida del semen. 8. Morshedi M. De Lamirande E. Mortimer D. 6. 2. et al.update-software.1784:106-15 7. 7. 2:75. Ltd. 69:529-34. En: La Biblioteca Cochrane Plus. 26:170-3. la movilidad así como los efectos del procesamiento de los espermatozoides (17. Sperm activation: Role of reactive oxygen species and kinases. Rogers BJ. Decrease in order of human sperm lipids during capacitation. Cohlen BJ. 85:1697-707. Oxford: Update Software Ltd. porque incluye la concentración. Es difícil establecer un número mínimo de espermatozoides recuperados para realizar inseminaciones intraútero y obtener una tasa de gestación adecuada. Boomsma CM. L. Inseminación intrau terina para la subfertilidad masculina (Revisión Cochrane traducida). • Utilizar siempre material estéril. Schill W. capaces de predecir el embarazo con alta especificidad y valor predictivo positivo en parejas con subfertilidad masculina (reacción acrosómica. (2002) ESHRE Monographs: Manual on Basic Semen Analysis. mientras que la técnica de swim up recupera los espermatozoides con mejor movilidad. • Diluir muy lentamente el semen descongelado. 19. BIBLIOGRAFIA 1. Dorion A. Pourian M. Morshedi M. Repping S. Nicholson CM. Van Weert J. et al. Sperm morphology. aunque debe confirmarse con ensayos clínicos de calidad Debido a que no existe una conclusión definitiva para definir que característica del semen puede predecir la capacidad de fecundar. 4:485-92. 2007 Número 4. Albert M. 8. Rajesh P. Disponible en: http://www. O´Flaherty C. 2007 Issue 4. Bacterial contamina tion and sperm recovery after semen preparation by density gradient centrifugation using silane-coated silica particles at different g forces. Heineman MJ. Androl 2000. Sperm preparation methods. 19: 2060-5. Aulesa C. Chichester. Duran HE. Deblaere K. Factor-Litvak. Henkel R. Ltd. Técnicas de preparación de semen para la inseminación intrauterina (Revisión Cochrane tradu cida). 5. 13.com. deberá usarse lo antes posible. Reproductive BioMedicine Online 2004. et al. van Voorhis B. J Androl 2005. 18. Bensdorp AJ. algunos autores proponen el uso de pruebas adicionales de función 26 • Documentos de la SEQC 2009 . • No mezclar plasma seminal con los espermatozoides recuperados. 14. Abramsson L. Naz R. Ombelet W. Human Reprod Update 2002. et al. Mohammadieh M. (Tradu cida de The Cochrane Library. Predictive value of the hemizona assay for pregnancy outcome in patients undergoing controlled ovarian hyperstimulation with intrauterine insemination.16). La técnica de gradientes parece mejor en cuanto a concentración de espermatozoides y a tasa de recuperación de espermatozoides móviles. • Aspirar siempre las diferentes fases en la zona del menisco para no alterarlas. Kruger T. N Engl J Med 2001. 10. 17. Reprod.15. Role of tyrosine phosphorylation in sperm capacitation/ acrosma reaction Reproducitive Biology Endocrinology 2004. En cuanto a resultados clínicos (tasa de embarazo/tasa de recién nacidos vivos). 12: 987-93. Algunos autores proponen que cada centro establezca su punto de corte en función de datos clínicos y de laboratorio de cada centro (17. Bosman E. De Jonge C. Biological basis for human capacitation. 345:388-93. Reprod Biol Endo 2003. Janssen M. 15:662-6. • Si el semen preparado va ser utilizado para inseminación artificial. et al.update-software.com. 9:134-51. Chichester. and Björndahl. • Deben utilizarse pipetas Pasteur en lugar de agujas para aspirar espermatozoides. 15. Disponible en: http://www. 2004. Oxford University Press.21). No se ha podido identificar un umbral óptimo de REM que permita aconsejar a las parejas. Arslan M. Oxford. 2. 16. unión a la zona pelúcida HZA) (1. puede impedir la capacitación. 1:108. (eds). et al . Biochem. y en cuanto a la morfología no se encontraron preferencias. Influence of the number of motile spermatozoa inseminated and of their morphology on the success of intruterine insemination. Hum Reprod Update 2005. 12. Heineman MJ. CONCLUSIONES El papel de los parámetros seminales como factor pronóstico en la fertilidad masculina está actualmente sometido a debate (2. Cálculo de los g de una centrifuga: g= 0. et al. Contamination by seminal plasma factors during sperm selection. Human Reprod 2000. motility. Sperm preparation for ART. Cross N. ya que la capacidad de fecundar el ovocito puede verse afectada. 2007 Número 4. Perreault SD. Reproductive BioMedicine Online 2003. UK: John Wiley & Sons.8 a 5 millones. En términos generales la técnica de gradientes puede parecer superior.). Holm SE. Wainer R. 1983. Guzick DS. Bosmans E. Current and future concepts and practices in human sperm cryobanking. Fertil Steril 2006. 21. Performance of the post wash total motile sperm count as a predictor of pregnancy at the time of the intrauterine insemination: a meta-analysis. Se requieren estudios adicionales para evaluar la capacidad predictiva del REM en los estudios de fertilidad (19).). Mortimer D. Arslan EO.18). al considerar resultados de los ensayos cuasialeatorios.18). la técnica de gradientes de densidad puede parecer mejor. Intrauterine insemina tion: a systematic review on determinants of success. Semen parameters in a fertile versus subfertile population: a need for change in the interpretation of semen testing Human Reprod 1997. 20. Los niveles umbral en los distintos trabajos oscilan desde 0. UK: John Wiley & Sons. 8:373-84. Cohlen BJ.0000112 x r x N2 g= fuerza centrifuga en el fondo del tubo r= radio de la centrifuga en cm N= revoluciones /minuto espermática en el estudio de infertilidad. • La preparación del semen debe comenzar no más tarde de 30 minutos de la eyaculación. No hay evidencia científica suficiente para recomendar una técnica de preparación de semen. En: La Biblioteca Cochrane Plus. 2007 Issue 4. UK. Mar C. Kvist. Bjurulf E.19. Quím Clín 2006. Se ha propuesto el test de recuperación de espermatozoides móviles (REM) en el estudio de la pareja estéril como prueba para distinguir que parejas se beneficiarán de la inseminación artificial y cuales no. Respecto a los parámetros seminales tras la preparación de semen. Biophys Acta 2008. Oxford: Update Software Ltd. Variability in the human-hamster in vitro assay for fertility evaluation Fertil Steril. et al. et al. Human. Björndahl L. Bentwood BJ. and concentration in fertile and infertile men. Biol Reprod 2003. Ombelet W. 25:416-8. Fertil Steril 2004. U. Una revisión Cochrane sobre las diferentes técnicas de preparación de semen concluye (20): 1. Semen quality and intrauterine insemination. Recomendaciones en la fase preanalítica para el análisis del semen. J.11:205-14 9. 11. (Tradu cida de The Cochrane Library. Oehninger S. pero necesita confirmarse con ensayos clínicos aleatorios. Overstreet JW. 4. 3. • Centrifugar siempre a los g recomendados. 82:612-20. 39:204-11. 21:357-66. Por otra parte. Vocabulario internacional de términos fundamentales y generales de metrología (VIM). La apropiada metodología para estimar la incertidumbre se describe en la Guía para la Expresión de la Incertidumbre de Medida (GUM). se evalúan los efectos aleatorios sobre el resultado de una medida y se establece un intervalo en el que se encuentra el valor verdadero de la magnitud medida con un determinado nivel de confianza (3). En la actualidad. Fase 3. en condiciones especificadas. S. • Directiva 98/79/CE del Parlamento Europeo y del Consejo sobre Productos Sanitarios para Diagnóstico In Vitro. • Asociación Española de Normalización (AENOR). Sánchez Manrique ÍNDICE 0. Tradicionalmente se ha relacionado la exactitud con el error de medida. Transportes y Medio Ambiente. En cambio.4 Error sistemático 5. DEFINICIONES 3. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN Este documento proporciona recomendaciones para la estimación de la incertidumbre de medida en los laboratorios clínicos. Bibliografía pueden mantenerse sus principios generales (5.2). La GUM (4) fue desarrollada de forma conjunta por diversos organismos internacionales de normalización y metrología para su utilización en laboratorios de calibración y ensayo y aplicada a medidas físicas o de análisis químico. INTRODUCCIÓN Los resultados que proporciona el laboratorio clínico deben ser exactos (veraces y precisos) para que permitan una interpretación clínica correcta y para que sean comparables con resultados anteriores o posteriores y entre distintos laboratorios. La incertidumbre de medida no se aplica a las pruebas de tipo cualitativo. es posible atribuir una incertidumbre de medida y una trazabilidad metrológica a cada resultado. Gella Tomás. Canalias Reverter. la GUM es de difícil aplicación a las medidas que se realizan en el laboratorio clínico. Versión 2 Preparado por: F.1994. Trazabilidad metrológica de los valores asignados a los calibradores y a los materiales de control. 1. Madrid: Ministerio de Obras Públicas.2 Calibración Conjunto de operaciones que establecen. La trazabilidad relaciona el resultado con referencias establecidas permitiendo su reproducibilidad en el tiempo y entre laboratorios (1. La norma para la acreditación de laboratorios ISO 15189 requiere una estimación de la incertidumbre de los resultados.3 Valor asignado al calibrador 4.6). Definiciones 4. Madrid : AENOR . V. F.Recomendaciones para la estimación de la incertidumbre de medida en el laboratorio clínico Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular Comité Científico Comisión de Metrología Documento H.1 Definición del mensurando 4. UNE-EN-ISO 15189. Productos sanitarios para diagnóstico in vitro.1 Analito Componente que se indica en el nombre de una magnitud mensurable 3. Introducción 1. Martínez Vázquez. • Asociación Española de Normalización (AENOR). Aplicaciones 8. Madrid : AENOR . Izquierdo Álvarez. No obstante. Objeto y campo de aplicación 2. M. Laboratorios Clínicos. teniendo en cuenta las limitaciones que son propias de las mediciones biológicas y los principios básicos de la GUM. el error de medida de los resultados del laboratorio clínico es casi siempre desconocido. en las que el resultado no es un valor numérico. Interpretación 7. UNE-EN ISO 17511. La incertidumbre es una expresión numérica del grado de duda del resultado. Normas para consulta 3. la complejidad y el coste de obtener una estimación de la incertidumbre de medida deben ser proporcionales con los requisitos de calidad aplicables a la utilización clínica de los resultados. 2. o los valores representados por una medida materializada o por un material de referencia. y los valores correspondientes de esa magnitud realizados por patrones (VIM) Documentos de la SEQC 2009 • 27 . 0. Requisitos particulares relativos a la calidad y la competencia. corregido o ignorado. 2004. Diario Oficial de las Comunidades Europeas L 331/1. NORMAS PARA CONSULTA • Centro Español de Metrología. Medición de magnitudes en muestras de origen biológico.J. la relación entre los valores de una magnitud indicados por un instrumento de medida o un sistema de medida. Cálculo de la incertidumbre 6. Limitaciones 9. aunque 3. 2007.2 Imprecisión 4. Fuentes de incertidumbre 4. En la estimación de la incertidumbre de medida se asume que cualquier error sistemático es eliminado. etc. semanal. generalmente a patrones nacionales o internacionales. FUENTES DE INCERTIDUMBRE Son fuentes que contribuyen a la incertidumbre de un resultado las siguientes: obtención de la muestra. colocar la muestra en un analizador) y termina con la obtención de un valor numérico. antiestreptolisina O. Por ejemplo: proteína. c) Tipo de magnitud y unidad. asociado al resultado de una medición. 3. (VIM) NOTA: También denominado “error máximo tolerable” o “límite de error permitido” 4.1. d) Procedimiento de medida.4 Error máximo permitido Valor extremo de un error permitido por especificaciones. colesterol. Los principales componentes de la incertidumbre de la fase analítica corresponden a la indefinición del mensurando. Por ejemplo: concentración de sustancia (mmol/L).7 Imprecisión Coeficiente de variación de un conjunto de resultados obtenidos al medir repetidamente un mensurando con un mismo procedimiento de medida 3. la estabilidad de la muestra en el sistema de medida. ion sodio. Habitualmente descrito en un procedimiento documentado de trabajo o similar. orina. distintos operadores. el equipo instrumental. utilizadas en la ejecución de mediciones particulares según un método dado (VIM) NOTA: Existe una jerarquía metrológica de procedimientos de medida (ver ISO 17511) 28 • Documentos de la SEQC 2009 . que es susceptible de ser distinguido cualitativamente y determinado cuantitativamente (VIM) 3. reglamentos.13 Trazabilidad (metrológica) Propiedad del resultado de una medición o de un patrón tal que pueda relacionarse con referencias determinadas. 3. etc. preparación de la muestra. su influencia. absorbancias). etc.9 Incertidumbre de medida Parámetro. concentración catalítica (nkat/L). equipo instrumental empleado. magnitudes de entrada (por ejemplo. que caracteriza la dispersión de los valores que podrían razonablemente ser atribuidos al mensurando (VIM). condiciones ambientales. resultado de la medida.8 Imprecisión interdiaria Imprecisión observada en un laboratorio a partir de resultados obtenidos en días diferentes NOTA: Los resultados pueden estar afectados por distintas calibraciones (calibración diaria. los operarios y las condiciones ambientales. número de leucocitos.5 Error sistemático Media que resultaría de un número infinito de medidas del mismo mensurando realizadas bajo condiciones de repetibilidad menos un valor verdadero del mensurando (VIM) NOTA: Para obtener una estimación. En los laboratorios clínicos. etc. b) Sistema. la calibración.10 Magnitud (mensurable) Atributo de un fenómeno. En los apartados siguientes. calibradores o materiales de referencia. Esta fuente de incertidumbre puede reducirse o eliminarse mediante la cuidadosa definición del procedimiento de medida.3 Calibrador Material de referencia cuyo valor se utiliza como variable independiente en una función de calibración (ISO 17511) NOTA: Existe una jerarquía metrológica de calibradores (ver ISO 17511) 3. ya que pueden reaccionar de diferente manera con unas u otras formas moleculares. sangre venosa. el lote de reactivos. se realiza un número finito de mediciones y se utiliza un valor convencionalmente verdadero del mensurando.12 Procedimiento de medida Conjunto de operaciones. Por ejemplo: suero. cuerpo o sustancia. La incertidumbre de medida es un parámetro que se asocia específicamente a cada resultado. NOTA: También llamado “desviación” y “sesgo” 3. Definición del mensurando El mensurando se define mediante los siguientes parámetros: a) Analito a medir. por medio de una cadena ininterrumpida de comparaciones teniendo todas las incertidumbres determinadas (VIM) 3. 3. por lo que se realiza una estimación general de la incertidumbre de medida para un mensurando definido y para valores del mismo cercanos a los de decisión clínica.11 Mensurando Magnitud particular sometida a una medida (VIM) 3. La incertidumbre relacionada con la obtención y preparación de la muestra es de dificil estimación y debe ser reducida mediante la rigurosa normalización de procedimientos. líquido pleural. es imposible realizar una estimación particular de la incertidumbre de medida para cada mensurando de cada muestra.6 Exactitud (de medida) Grado de concordancia entre el resultado de una medición y un valor verdadero del mensurando (VIM) 3. en lo posible. concentración de masa (g/L).). Otra fuente de incertidumbre relacionada con la definición del mensurando son las posibles reacciones cruzadas e interferencias que pueden ocurrir con algunas muestras y que deben estar identificadas y documentadas para prevenir. hemoglobina. que se inicia cuando la muestra interacciona con el primer paso técnico del procedimiento de medida (por ejemplo. etc. descritas de forma específica. distintos lotes de calibradores y distintos lotes de reactivos 4. En este documento solo se consideran las fuentes de incertidumbre de la fase analítica. estabilidad de la muestra y cambios de operarios. pero puede ser reducida o eliminada mediante la detallada especificación del mensurando.3. los volúmenes dispensados. En resumen. se comentan con mayor detalle los principales componentes. La existencia de diferentes formas moleculares del analito puede introducir incertidumbre en los resultados. la incertidumbre ocasionada por la indefinición del mensurando no puede ser cuantificada. Uncertainty of measurement in quantitative me dical testing. Para ello.2%. 24:474-6. corregido o es ignorado (4. Esta estimación debe realizarse con el suficiente número de datos para recoger las diferentes fuentes de incertidumbre que aplican. Ed Cont Lab Clin 2004. Junto con el valor de incertidumbre debe especificarse también el factor de cobertura empleado.4. deberían incluirse varias calibraciones para recoger la incertidumbre generada por el proceso de calibración. La comisión de Metrología publicará próximamente recomendaciones para la estimación del error sistemático y para la estimación de la incertidumbre asociada a su corrección (ufc) Documentos de la SEQC 2009 • 29 . según la siguiente fórmula: Donde: uc: incertidumbre estándar combinada relativa (%) CVid: imprecisión (coeficiente de variación) interdiaria ucal: incertidumbre estandar relativa (%) del valor asignado al calibrador (ver 4. Trazabilidad metrológica y laboratorio clínico. Requirements for the estimation of measurement uncertainty (2007 edition). En caso de que fuera superior. Error sistemático La estimación de la incertidumbre de medida asume que cualquier error sistemático significativo del procedimiento de medida ha sido eliminado. 4. Australia 2007. 2. 54:1587-8. Como habitualmente se trata de materiales comerciales. 5.7).3. el fabricante debe proporcionar estos datos (Directiva 98/79/CE).6. • Interpretación objetiva de la significación de un resultado en comparación con un valor de decisión clínica 4. Farrance I. Gella FJ.Recomendaciones para la estimación de la incertidumbre de medida en el laboratorio clínico 4. La identificación de un eventual error sistemático debería realizarse durante la validación del procedimiento de medida. Recomendaciones para la utilización de calibradores con tra zabilidad metrológica en el laboratorio clínico. Kristiansen J. National Pathology Accreditation Advisory Council. especificando el procedimiento de medida. identificar las más significativas y realizar las acciones oportunas para reducirlas. 6. La u relativa (%) del valor asignado al calibrador no debería variar excesivamente lote a lote y debería ser generalmente más baja que el CVid. 7. CÁLCULO DE LA INCERTIDUMBRE La incertidumbre se calcula combinando sus diversas fuentes. Los errores sistemáticos ocasionados en el uso rutinario del procedimiento de medida por las inevitables diferencias entre distintas calibraciones se comportan de forma aleatoria a largo plazo. con lo que este componente de la incertidumbre se recoge en el CVid. se multiplica el valor de uc por k = 2. 4. 16%. BIBLIOGRAFÍA 1. Clin Biochem Rev 2004. La incertidumbre expandida relativa debe expresarse con dos cifras significativas. Para ello. Se recomienda expresar la incertidumbre combinada para un nivel de confianza del 95% (incertidumbre expandida. por ejemplo: 4. INTERPRETACIÓN La estimación de la incertidumbre de medida proporciona una indicación cuantitativa del nivel de duda que el laboratorio tiene en cada resultado y es por tanto un elemento clave en el sistema de calidad analítico de los laboratorios clínicos. la incertidumbre se expresa como incertidumbre expandida (U) para un nivel de confianza del 95% (factor de cobertura = 2). los laboratorios clínicos deberían definir cada mensurando. 3. En cambio no es necesario utilizar distintos lotes de calibrador si se dispone de la incertidumbre del valor asignado. Imprecisión La mayor parte de los componentes de la incertidumbre de medida de la fase analítica se encuentran contenidos en la estimación de la imprecisión interdiaria (CVid) que normalmente se obtiene empleando materiales de control. • Interpretación objetiva de la significación de un cambio entre dos valores consecutivos de una magnitud bioquímica. deberían estudiarse con mayor detalle las diferentes fuentes de incertidumbre. LIMITACIONES El valor de la incertidumbre de medida varía con la concentración del mensurando y puede ser sustancialmente diferente para concentraciones muy bajas o muy altas del analito. 7. Valor asignado al calibrador El laboratorio clínico debe conocer la incertidumbre y la trazabilidad metrológica de los valores asignados a los materiales de calibración que utiliza. White GH. y realizar para cada uno de ellos el cálculo de la incertidumbre combinada a partir de los datos de control interno de la calidad y otros datos.3) 1 9. Normalmente. A laboratory implementation guide. Clin Chem 2003. Los materiales de control que se utilizan para estimar la imprecisión interdiaria pueden no ser representativos del comportamiento analítico que tienen las muestras de los pacientes. ISO Geneva. la corrección tiene una incertidumbre asociada (ufc) que debe ser considerada en el cálculo de la incertidumbre de medida combinada1. Quim Clin 2005. The guide to the expression of uncertainty in measure ment approach for estimating uncertainty: An appraisal. Guide to the expression of uncertainty in measurement (1995). Se recomienda un mínimo de 6 meses de datos y una nueva estimación cada año. 8:1-11. 6. 25:suppl (ii). Calculation of measurement uncertainty – Why bias should be treated separately. Cuando se corrige un error sistemático mediante un factor. La incertidumbre estándar (u) se calcula dividiendo U por el factor de cobertura. 49:1822-9. La estimación del CVid debe realizarse para un valor del mensurando cercano a los valores de decisión clínica. Clin Chem 2008. Uc). Thienpont LM. En el periodo de recogida de datos.2. APLICACIONES La incertidumbre de medida debe ser utilizada principalmente para la: • Selección de procedimientos de medida que cumplan las especificaciones de exactitud. Gella FJ. La incertidumbre expandida relativa de un mensurando debería ser inferior a dos tercios del error máximo permitido. Por este motivo se recomienda realizar su estimación para una concentración cercana a los valores de decisión clínica. 5. ufc: incertidumbre estandar relativa (%) del factor empleado para corregir un error sistemático1. 8. 1.3 Medida 2.2 Espectrofotometría UV 2. Alegre. Objeto y campo de aplicación 2. San Miguel. Cárdenas Fernández. Propuesta de protocolo de seguimiento 7.2. J.1 Detección 2. L.3 Cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas 2. Aunque en la mayoría de los casos las GM no tienen consecuencias clínicas importantes a lo largo de la vida del individuo.2 Estudio en orina 2.4 En recaídas o progresiones de pacientes previamente tratados 4.1. M. Metodología 2. Aguzzi y Whicher) (3).2 Identificación del componente monoclonal 4. Prosper. Composición de la Comisión de Proteínas de la SEQC: Mª C. F.1. INTRODUCCIÓN Las gammapatías monoclonales (GM) constituyen un conjunto de trastornos diversos asociados a una proliferación de células B maduras (1.1. MM en fase de “plateau” y GMSI 3. A.Bargay. M.1.1 Detección (cribado) del componente monoclonal 5. Díaz-Mediavilla. Martínez-Brú (Presidente). de Arriba.3 Medida del componente monoclonal 5. Introducción 1. Rosiñol.1. F. García-Laraña. M. Se caracterizan (con alguna excepción como es el caso del mieloma no secretor) por la secreción de moléculas de inmunoglobulinas (intactas o fragmentos) homogéneas desde el punto de vista inmunoquímico y electroforético. R.1 Detección del componente monoclonal 3. 2 Composición del Grupo Español de Mieloma de la AEHH: A. Viedma Contreras. J.1. R.2.6 Monitorización de MM quiescentes. T.2 Electroforesis capilar 2.3 En el seguimiento de pacientes bajo tratamiento 3.1.1 Detección del componente o proteína monoclonal 2. Oriol. J.2 Inmunosustracción e inmunotipado 2.5 Monitorización de MM en tratamiento 5.3. Fase 3. J.1.2.2 En el seguimiento de los MM quiescentes. Martínez-López. Cibeira. Bladé.3 Medida de distintas proteínas en orina 2. C.2 Electroforesis capilar 2.2. GMSI y MM en fase de “plateau” 5.1.1. de la Rubia. Hernández-García. Las condiciones clínicas que se asocian a gammapatías monoclonales se listan en la tabla I (modificada de Merlini. a las que habitualmente se conoce como componente monoclonal (CM) (1). Martínez-López ÍNDICE 0. Versión 3 Preparado por: C. M.1 Detección del componente monoclonal 4.1. Martínez-Martínez. en ocasiones se producen manifestaciones clínicas debido a la proliferación celular clonal neoplásica o al efecto biológico de la proteína monoclonal sobre diferentes órganos o sistemas.1. Rodríguez González.1. JF. Metodología recomendada 5. C.4 Estudio en orina 5. Besalduch.1 Electroforesis en gel de agarosa 2. García Sanz y J. Cortés Rius.1.2 Identificación del componente o proteína monoclonal 2.1 Electroforesis en soporte sólido 2. A.2. Bibliografía 0. García-Sanz.2. Requerimientos clínicos 3.Recomendaciones para el estudio de las gammapatías monoclonales Documento de consenso Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular (SEQC) y Asociación Española de Hematología y Hemoterapia (AEHH) Comité Científico Comisión de Proteínas1 (SEQC) y Grupo Español de Mieloma2 (AEHH) Documento I.1.1. J.2 Identificación del componente monoclonal 5. Mateos. Zapico Muñiz.1 Inmunofijación 2.3.3 Medida del componente monoclonal 5. Requerimientos analíticos 1 4.2.3 Medida del componente monoclonal 3. JJ. I.2 Identificación del componente monoclonal 3. R. J. J. E.1 En el momento del diagnóstico 3.1. Llompart Alabern. García-Montes (asociado).2. Conclusiones 8. Lahuerta.Valldecabres Ortiz.1 Estudio en suero 2. JA. Fernández García.2 Identificación 2. Sureda 30 • Documentos de la SEQC 2009 .1.1 Densitometría 2. Mª V. Mª T. Martínez-Brú.7 Detección de recidivas y casos específicos con escasa síntesis de proteína monoclonal 6.3 Medida 2.2. Pérez Surribas. D.4 Tipo de muestra de orina 3.2). ocasiona un 2% de todas las muertes atribuibles a cáncer y posee el índice de mortalidad más elevado de todos los cánceres (1). En estos casos la GM es clínicamente sintomática. a la vez que un Sistema Internacional de Estratificación (ISS) ha ido sustituyendo el sistema clásico de Durie y Salmon (9. si son secundarias. con una clínica sólo relacionada con la propia enfermedad de base. a pesar de haberse introducido nuevos tipos de tratamiento. la tasa de progresión de GMSI a MM sintomático es de tan sólo un 1% anual (6). No obstante. Aunque la GMSI puede considerarse una etapa premaligna del MM (5). una característica esencial de las GMSI es la estabilidad de la situación clínica y de las magnitudes biológicas. γ.1% de todos los tipos de cánceres y entre un 10% y un 15% de los de tipo hematológico (2)). amiloidosis AL.10). detectar e identificar las proteínas monoclonales. en caso de sospecharse un CM. Para establecer este diagnóstico es imprescindible que no haya síntomas o lesiones propias de MM. Por su parte. es posible que ésta no llegue a ser detectada o identificada. existe una serie de GM que cursan de manera asintomática o. Los criterios que permiten establecer el diagnóstico diferencial entre GMSI. Puesto que la concentración de la inmunoglobulina monoclonal está relacionada directamente con la masa del clon de células que la produce (con la excepción del mieloma no secretor). MW o deterioro orgánico por depósito de sustancia amiloide o inmunoglobulinas. o MM de inmunoglobulinas (Ig) intactas o enteras que responden favorablemente al tratamiento y entran en respuesta completa. en una minoría de casos en los que la población de células plasmáticas no sintetiza o secreta proteína monoclonal en cantidad suficiente. La contribución del laboratorio al estudio de las GM es determinante para su correcto diagnóstico y seguimiento. de un estudio inmunoquímico que permite identificar el isotipo de inmunoglobulina implicada en dicho CM. el MM (aproximadamente. Sin embargo. Los métodos citados anteriormente permiten. 1. Sin embargo. con su posterior cuantificación. síndrome de POEMS. ya sea debido a la proliferación neoplásica de células B o a sus efectos patológicos directos sobre algún órgano diana. el CM constituye un marcador bioquímico esencial tanto en el momento del diagnóstico del MM (10.Recomendaciones para el estudio de las gammapatías monoclonales Las dos entidades clínicas sintomáticas más importantes asociadas a trastornos de células B maduras son el mieloma múltiple (MM) y la macroglobulinemia de Waldenström (MW). en la mayoría de los casos. En este sentido. el MM sigue siendo una enfermedad incurable. la sensibilidad de los procedimientos hasta aquí comentados puede resultar eventualmente insuficiente ante entidades clínicas tales como MM no secretores. Además. La interpretación de la electroforesis de proteínas por un profesional experto es imprescindible puesto que un porcentaje no despreciable de GM se diagnostica en el laboratorio por la detección de un CM en la electroforesis. estas dos enfermedades representan una proporción relativamente pequeña de todos los CM detectados en el laboratorio. μ) Enfermedades relacionadas con la presencia de CM Crioglobulinemia Amiloidosis AL Enfermedad por depósito de cadenas ligeras o pesadas Polineuropatías secundarias a CM Crioaglutininas *CM: componente monoclonal Sin clínica Gammapatías monoclonales transitorias Infecciones (víricas o bacterianas) Enfermedades autoinmunes Estados de inmunodeficiencia transitorios Reconstitución de la médula ósea después de un trasplante de progenitores hematopoyéticos Gammapatías monoclonales de significado incierto (GMSI) Documentos de la SEQC 2009 • 31 .11) como en la monitorización y en la evaluación de la respuesta al tratamiento (los cambios en la concentración del componente monoclonal representan el principal indicador utilizado en la evaluación de la respuesta al tratamiento (1)). Condiciones clínicas asociadas a gammapatía monoclonal Clínicamente manifiestas Derivadas de enfermedades malignas de las células B Mieloma Múltiple y sus variantes Mieloma sintomático Mieloma quiescente. se han establecido nuevos criterios diagnósticos. identificación y medida de los CM con las máximas garantías de Tabla I. así como la presencia de diversos trastornos asociados con gammapatía monoclonal transitoria (1) (tabla I). MM secretores de cadenas ligeras. Dentro de este grupo de GM. es necesario descartar la presencia de otros síndromes linfoproliferativos como leucemia linfoide crónica o linfomas. latente o asintomático Mieloma no secretor Leucemia de células plasmáticas Mieloma Osteosclerótico (POEMS) Plasmocitoma Óseo Solitario Extramedular Otros procesos linfoproliferativos Macroglobulinemia de Waldenström Linfoma No Hodgkin Leucemia linfocítica crónica Enfermedad de cadenas pesadas (α. El diagnóstico de una GM supone la realización de una electroforesis de proteínas séricas y urinarias seguida. Sin embargo. se encuentran las gammapatías monoclonales de significado incierto (GMSI) que corresponden a aquellos procesos con presencia de una proteína monoclonal con carácter permanente y de concentración estable en el tiempo. Además. la aparición de nuevos tratamientos ha hecho que la mediana de supervivencia haya subido hasta los 5 años (7) y en algunas series llegue a superar los 8 años (8). Así. MM quiescente y MM sintomático se detallan en la tabla II (4). En contraposición a estos casos. Por todo lo expuesto anteriormente. el laboratorio debe disponer de métodos analíticos y estrategias que permitan la detección. que permita una categorización exacta del grado de respuesta al tratamiento y asegure simultáneamente la detección precoz de recidivas. ya que 2. con movilidad electroforética similar a la de algunas inmunoglobulinas. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN El presente documento pretende establecer las características de los métodos analíticos habitualmente empleados para la detección. y/o lesiones óseas líticas u osteoporosis con fracturas compresivas no atribuibles a otra causa.1 Estudio en suero 2. se puede garantizar una óptima monitorización de los pacientes con MM. aplicando cada uno de ellos según el tipo de gammapatía monoclonal y el momento evolutivo de cada enfermedad. En ambos casos debe pasarse por una 32 • Documentos de la SEQC 2009 . Debe analizarse el trazado electroforético para observar el aspecto y la localización del pico monoclonal. Por ello.75 mmol/L (11 mg/dL).25 mmol/L (1 mg/dL) por encima de lo normal o cifra absoluta de Ca >2. Es recomendable procesar suero en lugar de plasma para así obviar la presencia de fibrinógeno. es necesario que la interpretación final del proteinograma corra a cargo de un profesional de laboratorio experimentado. de acuerdo con el tipo de gammapatía monoclonal (ya se trate de MM o de GMSI). y/o insuficiencia renal (creatinina >173 μmol/L (2 mg/dL). si bien pueden aparecer en cualquier región electroforética.Asimismo. siempre y cuando ambos hallazgos coexistan con la presencia de daño orgánico. debida a Presencia de tumoración de células infiltración por células plasmáticas plasmáticas clonales clonales Seriada ósea radiológica normal Seriada ósea radiológica normal Otros fiabilidad y sensibilidad.1. y/o aumento del calcio sérico >0. Componente monoclonal Plasmocitosis medular Daño orgánico DISCRASIAS DE CÉLULAS PLASMÁTICAS ESPECIALES Mieloma no secretor Plasmocitoma solitario del hueso Plasmocitoma extramedular Ausente Presente o ausente Presente o ausente (Inmunofijación negativa) y y y ≥10% o presencia de Ausente Ausente plasmocitoma y y y Presente Ausente Ausente y y Área de destrucción única. desde la zona α1 hasta el extremo más catódico de la región γ (6) . Así. Renal impairment. b) En caso de mieloma múltiple sintomático no se requiere un nivel mínimo de componente monoclonal o infiltración plasmocitaria de la médula ósea. Cabe destacar aquí que aunque hay autores que sostienen que la detección de cadenas ligeras libres en suero puede desplazar al estudio en orina. estableciendo la periodicidad con la que debe realizarse el seguimiento analítico del paciente.Tabla II. identificación y medida de los componentes monoclonales. Detección del componente o proteína monoclonal La electroforesis de proteínas séricas constituye. una posterior de identificación y finalmente una de cuantificación o medida del CM (12). Criterios diagnósticos y diagnóstico diferencial de las gammapatías monoclonales DEFINICIÓN DE GAMMAPATÍAS MONOCLONALES Gammapatía Monoclonal de Mieloma asintomático (Mieloma Mieloma Múltiple Significado Incierto (GMSI) Múltiple Quiescente) sintomático ≥ 30 g/L en suero y/o <30 g/L en suero Presente b presente en orina y o o <10% y Ausente >10% y Ausente >10% b y Presente CM Plasmocitosis medular Daño orgánico a a) Daño orgánico o lesión tisular relacionada con el Mieloma o con la proliferación de células plasmáticas: anemia con reducción de la Hb de al menos 20 g/L respecto al nivel normal o nivel de Hb <100 g/L. [Se resume con el acrónimo inglés CRAB: Calcium increase. el primer paso en la búsqueda de CM. tal como acaba de ratificarse recientemente en el XIIth International Myeloma Workshop celebrado en Washington (14). sobreponiéndose o no a cualquiera de las zonas normalmente observadas en la electroforesis. También se incluirían otros signos/síntomas menos frecuentes: hiperviscosidad sintomática. y el tratamiento al que esté sometido el paciente. Los CM suelen migrar en la zona γ de la electroforesis. Anemia and Bone lesion]. esta posibilidad no cuenta aún con evidencia científica suficiente y por el momento sigue siendo necesario el estudio del CM en orina (13).1. y recomendando las mejores opciones analíticas para el diagnóstico y seguimiento de las gammapatías monoclonales. 1. citando su sensibilidad analítica. por norma general. amiloidosis y/o infecciones bacterianas recurrentes (>2 episodios graves –con ingreso – en 12 meses). 2. METODOLOGÍA Para el estudio analítico correcto de las GM deben analizarse muestras de suero y de orina. primera fase de detección del CM. se define la estrategia de laboratorio que se debería seguir ante la detección de un componente monoclonal en la electroforesis. Este fenómeno puede incluso observarse más frecuentemente si se opta por un método electroforético de alta resolución. En caso de optar por este tipo de electroforesis. y posteriormente se valora las distintas fracciones por densitometría (evalúa la intensidad de la coloración de cada una de las zonas del gel de acuerdo a la diferente afinidad que tienen las proteínas por el colorante). azul brillante de Coomassie y negro amido). 2. La electroforesis capilar constituye una muy buena opción electroforética para el estudio de las GM en suero. en el año 2007 (15). el soporte recomendado es el gel de agarosa (prácticamente ha quedado obsoleta la electroforesis en acetato de celulosa) utilizando cualquiera de los tres colorantes aquí mencionados.Recomendaciones para el estudio de las gammapatías monoclonales resulta imprescindible para estudiar la evolución del componente a lo largo del tiempo. Por ello. la asociación de las cadenas ligeras y pesadas enmascara ciertos epitopos de la cadena ligera que quedan expuestos cuando ésta se encuentra circulando libremente. tales como mielomas no secretores o poco secretores. no debería considerarse como método de primera línea en la detección de componentes monoclonales. La sensibilidad analítica alcanzada varía en función del colorante empleado (de mayor a menor sensibilidad. La principal utilidad de la medida de las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas en suero es la de poder identificar aquellas situaciones en las que la proteína monoclonal sintetizada y secretada en la circulación está presente a concentraciones no detectables por electroforesis o por un método inmunoquímico de identificación (detección negativa e identificación negativa). y es el método mayoritariamente empleado entre los participantes en el Programa de Garantía de la Calidad de los Laboratorios Clínicos de la Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular. 2.1.20). su uso juntamente con la electroforesis y la inmunofijación (inmunosustracción o inmunotipado) permite alcanzar mayor sensibilidad. están descritos diferentes intervalos de referencia según el tipo de analizador utilizado para la medida de las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas.1.3. Es importante saber que en la conformación normal de la inmunoglobulina.2. ELeCTROFOReSIS eN SOPORTe SÓLIDO En este tipo de electroforesis la resolución final obtenida está fuertemente influenciada por el tipo de soporte empleado y por las características físicas de la técnica electroforética (pH. y son estos epitopos los que se utilizan para la producción del antisuero específico anti-cadenas ligeras libres.1.1. Interpretaciones erróneas en la electroforesis Falsos positivos (se informa de un CM que no existe) Fibrinógeno (y sus productos de degradación) Proteína C reactiva Variantes fenotípicas de proteínas (transferrina. hemoglobina) Muestras contaminadas y muestras sometidas a procesos repetidos de congelación / descongelación Administración endovenosa de contrastes iodados * CM: componente monoclonal * C3: fracción C3 del complemento Falsos negativos (no se informa de un CM que sí existe) CM débil CM débil superpuesto a una banda Inmunoglobulinas monoclonales polimerizadas (banda de aspecto policlonal) Crioglobulinas Documentos de la SEQC 2009 • 33 . El principal inconveniente del método es la falta de estandarización (17) (no existe material de referencia internacional) y la falta de experiencia que existe sobre este componente biológico. pues su significado puede ser completamente opuesto. 2.).y lambda –λ-) de cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas con dos antisueros específicos distintos y con el posterior cálculo del cociente κ/λ. Sólo de este modo se puede distinguir bien si las modificaciones de la zona donde migra el CM son debidas a variaciones en el CM o a alteraciones de la fracción policlonal de las inmunoglobulinas. Con ambas técnicas electroforéticas pueden observarse trazados que lleven a interpretaciones erróneas (falsos positivos y falsos negativos) que se resumen en la tabla III. 2) presenta valor pronóstico en la gran Tabla III. violeta ácido. y se interpreta directamente el espectro de absorción. que es el que permite sospechar monoclonalidad. La presencia de un cociente κ/λ alterado en estas situaciones permite mantener un elevado índice de sospecha de persistencia de la proteína monoclonal y puede facilitar diagnósticos difíciles así como un seguimiento más objetivo de estos casos. La evaluación del trazado electroforético supone una inspección visual del gel.1. La resolución que proporcionan estos sistemas es similar a la obtenida con geles de agarosa. etc. síndrome de POEMS. α1-antitripsina. además constituye un marcador tanto del grado de respuesta alcanzado con el tratamiento como de detección precoz de recidivas (19. aunque esta última opción proporciona una mayor sensibilidad analítica. dado que su empleo en el laboratorio clínico es relativamente reciente. motivo por el cual cada laboratorio debería de establecerse sus propios valores de referencia (18). aunque no puede confirmarla. El procedimiento implica la medida de los dos tipos (kappa –κ. enfermedad por depósito de cadenas ligeras. Recientemente han sido publicadas unas recomendaciones internacionales en las que se resume las principales indicaciones de la medida de las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas en suero (21): 1) en el diagnóstico. temperatura. C3. Se realiza en sistemas totalmente automatizados que emplean volúmenes muy reducidos de muestra y aplican un elevado voltaje.1. CADeNAS LIGeRAS LIBReS De INMUNOGLOBULINAS eN SUeRO Las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas pueden medirse en suero por un método específico basado en una reacción inmunoquímica (Ag-Ac) (16). La medida de las diferentes fracciones se realiza por espectrofotometría directa en la zona UV. amiloidosis. mielomas con buena respuesta al tratamiento y algunos mielomas secretores de cadenas ligeras. Además. voltaje. especialmente en centros con un gran número de muestras.1. con o sin tratamiento. ELeCTROFOReSIS CAPILAR Constituye una alternativa electroforética de creciente implantación en los laboratorios clínicos. La diferencia esencial respecto a una electroforesis en soporte sólido estriba en que no se realiza tinción alguna. Respecto a los métodos inmunoquímicos como turbidimetría y nefelometría. se procede a una lectura densitométrica del gel que proporciona una estimación cuantitativa de la concentración de proteína monoclonal (ya que refleja la cantidad de colorante fijado a la proteína).2. anti-μ. 2. Identificación del componente o proteína monoclonal Todos los métodos de identificación se basan en la combinación de una separación de las proteínas por electroforesis y una reacción inmunoquímica con antisueros específicos (anti-γ. La inmunoelectroforesis no se recomienda como método de identificación de los componentes monoclonales detectados por electroforesis al poseer menor resolución. y ofrecer problemas en su interpretación. posteriormente a la inspección visual cuidadosa para detectar bandas con signos de monoclonalidad (aún a bajas concentraciones). la visualización de un componente monoclonal se completa con una integración del área bajo la curva de dicho pico obtenida por espectrofotometría en la zona UV. anti-μ. 4) en los MM tratados es necesaria la normalización del cociente κ/λ para determinar la denominada Respuesta Completa estricta (CRe). debe procederse a la tinción del gel (violeta ácido.1. Las principales limitaciones del procedimiento se manifiestan en la medida de CM débiles sobre fondo de inmunoglobulinas policlonales y en la subjetividad para decidir los puntos de corte del área correspondiente al CM. cuando existe una fuerte sospecha clínica de gammapatía monoclonal maligna. en cada canal se aplica un anticuerpo determinado. anti-α. se ha descrito que la presencia de un cociente κ/λ sérico alterado constituye un factor de riesgo de progresión hacia malignidad (22).1.1. o para confirmar una remisión completa de un paciente con MM.1. resulta esencial para evaluar la respuesta terapéutica en aquellos pacientes con MM o MW con elevado grado de respuesta al tratamiento.2. 2. debe siempre realizarse inmunofijación del suero y la orina. ya que en muchos pacientes el componente monoclonal no se detecta por electroforesis. Si no se produce reacción con los antisueros anti-γ. los problemas citados en el apartado anterior se reproducen también en este caso (medición de un CM pequeño sobre un fondo policlonal.1. y se han adaptado al mismo sistema electroforético. Así. DeNSITOMeTRÍA En el caso de la electroforesis en gel de agarosa. practicabilidad y rapidez analíticas que los otros métodos. 34 • Documentos de la SEQC 2009 .3. decisión arbitraria de los puntos de corte de la banda y medida de las inmunoglobulinas monoclonales pero también de las policlonales). si bien con muy buenas prestaciones analíticas. anti-κ y anti-λ libres. pero sí se identifica por inmunofijación. anti-κ. Como ventajas de estos métodos frente a la inmunofijación.1. puesto que se trata de un procedimiento totalmente automatizado. Aunque su elevada sensibilidad generalmente no es necesaria en el momento del diagnóstico. aunque la electroforesis no evidencie la presencia de un componente monoclonal. debido a sus buenas prestaciones analíticas y facilidad de interpretación. pueden no quedar perfectamente categorizadas. En GMSI. puede destacarse su practicabilidad y su rapidez. posteriormente. Cabe destacar que. seguida de una segunda etapa de inmunoprecipitación de la proteína monoclonal con los anticuerpos específicos. Finalmente. El antisuero utilizado (afinidad. Sin embargo. Como inconveniente principal destaca el hecho de que bandas muy débiles o muy tenues (sospechadas a través de la inspección del primer trazado electroforético) que levantan dudas respecto a su monoclonalidad. los resultados se ven influenciados por las condiciones electroforéticas y el tipo de colorante empleado. al final de todo el estudio. Igual que sucede con una electroforesis convencional. y sí se produce con anti-κ o anti-λ debe enfrentarse la muestra a otros antisueros (anti-d. negro amido) y consiguiente decoloración. pueden considerarse como métodos complementarios a los que se comentan a continuación. Ello ha hecho que el grupo internacional de mieloma haya recomendado utilizar esta metodología (21).2. anti-μ. y por lo tanto no deben ser utilizados con esta finalidad. INMUNOFIJACIÓN El método de identificación más extendido entre los laboratorios clínicos es la inmunofijación (IFE). anti-α. ESPeCTROFOTOMeTRÍA UV En el caso de emplear la electroforesis capilar. para evitar que el empleo de diferentes principios de medida pueda incidir en las decisiones clínicas. y anti-e). y por lo tanto en caso de duda. debe procederse a realizar una inmunofijación. INMUNOSUSTRACCIÓN e INMUNOTIPADO Estos métodos de identificación de CM se han desarrollado simultáneamente a la implantación de la electroforesis capilar.2.mayoría de discrasias de células plasmáticas. 2. 2. título) constituye una variable fundamental de los métodos inmunoquímicos. anti-α. Sin embargo. avidez. El principio del método consiste en realizar una electroforesis después de que la posible proteína monoclonal haya reaccionado con antisueros específicos en los pocillos del analizador preparados para tal uso. en el año 2007 (15). no son los adecuados para medir la proteína monoclonal debido a que los antisueros empleados reconocen tanto la inmunoglobulina monoclonal como la policlonal.1. debe aplicarse siempre la misma estrategia de medida del CM. Medida del componente o proteína monoclonal Para la medida del CM el laboratorio clínico puede optar por dos principios de medida que son la densitometría (realizada tras una electroforesis en gel de agarosa) y la espectrofotometría directa en la zona UV (realizada a 200 nm ó 214 nm. Otro inconveniente importante de estos dos métodos es que los sistemas capilares actuales no están todavía adaptados para enfrentar la muestra de suero frente a otros tipos de anticuerpos distintos de anti-γ. según el sistema. aplicándose muestra en cada uno de ellos para que se produzca la migración electroforética. 2. anti-λ). a cada muestra sospechosa de tener un CM se le habrá realizado una primera electroforesis capilar (detección de CM) seguida de una reacción inmunoquímica y de una segunda electroforesis capilar que permitirá concluir el proceso. tras una electroforesis capilar). La inmunofijación consiste en la separación de las proteínas por electroforesis en gel de agarosa.3. Este principio de medida presenta una mayor exactitud en la medida de la proteína monoclonal puesto que la absorbancia a 200 nm ó 214 nm es directamente proporcional a la cantidad de enlace peptídico de la muestra. azul brillante de Coommassie.2. Este fue el método mayoritariamente empleado entre los participantes en el Programa de Garantía de la Calidad de los Laboratorios Clínicos de la Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular. 2. 3) permite un seguimiento objetivo en gammapatías con escasa secreción de proteína monoclonal. El gel consta de seis canales de reacción.3.1. anti-κ y anti-λ. En cualquier caso. Es importante destacar aquí que se trata de la técnica convencional más sensible de la que se dispone. Aunque no se dispone actualmente de estudios comparativos contrastados en orina. ya sea por el empleo de antisueros anti-cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas de tipo κ y de tipo λ (dos antisueros). se requerirá inmunofijación).1. globulinas y proteínas de baja masa molar como las cadenas ligeras de inmunoglobulinas). debe utilizarse un procedimiento capaz de medir todas las proteínas en orina (albúmina. su uso para las muestras de orina es limitada. La espectrofotometría UV es problemática debido a la presencia en la orina de numerosas sustancias que absorben en la zona UV y requiere dializar previamente la muestra de orina para eliminar las interferencias.1. Los métodos de identificación del CM en suero (inmunofijación. Detección del componente monoclonal Ante la sospecha de una gammapatía monoclonal.3. cadenas ligeras libres o totales de inmunoglobulinas) y el cálculo posterior de diversos cocientes (cociente entre suma de proteínas individuales como albúmina.2. de una electroforesis de proteínas en suero con el gráfico del trazado electroforético.2. cociente κ/λ -totales o libres-) permite sospechar la presencia de proteinuria de Bence Jones (23.2.24) .2.1. Estudio en orina En la orina. REQUERIMIENTOS CLÍNICOS 3. con las consiguientes adaptaciones. debido a que existe cierto grado de degradación enzimática bacteriana de las cadenas ligeras de inmunoglobulinas. Se pueden emplear distintos colorantes. Además. Los diversos inconvenientes (tanto para el paciente como para el laboratorio) de trabajar con orina de 24 horas convierten lo que sería la muestra ideal para obviar la variabilidad intraindividual en la excreción diaria de proteínas en una muestra difícil de obtener correctamente. Detección Los métodos de detección del CM en suero sirven también para la detección del CM en orina. MeDIDA De DISTINTAS PROTeÍNAS eN ORINA La medida de la concentración de distintas proteínas en orina (albúmina. algunos grupos de expertos recomiendan el uso de la segunda muestra del día (29) (expresando la proteinuria en función de la concentración de la creatinina de la muestra). es posible que a medida que se extienda su uso.1.1. 2. 3. la finalidad del estudio analítico de las GM radica en detectar e identificar la presencia de cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas monoclonales (proteinuria de Bence-Jones). Identificación La presencia de cadenas ligeras libres monoclonales en orina (proteinuria de Bence-Jones) debe confirmarse por un método inmunoquímico. En el momento del diagnóstico 3. debido a su más reciente adaptación. α1-microglobulina. Inevitablemente. debe procederse previamente a una diálisis de la orina para eliminar sustancias interferentes presentes en la muestra y que absorben en la región UV. Ello facilita el seguimiento del CM durante la Documentos de la SEQC 2009 • 35 . estos métodos permiten un seguimiento más objetivo de la cantidad de cadenas ligeras que se excretan por orina. Distintas sociedades científicas y grupos de expertos recomiendan el uso de muestras de orina aisladas para la medida de la proteinuria (27. 2.2.2. Por otra parte.28). aunque el Violeta Ácido es el que ofrece mayor sensibilidad. con la posibilidad de poder llevar a confusión en la interpretación de los resultados de la medida de distintas magnitudes proteicas. concretamente para medir cadenas ligeras de inmunoglobulinas en los casos en que existe una proteinuria de Bence Jones. Así como el estudio de las gammapatías monoclonales en suero es bastante uniforme entre los distintos laboratorios.μ). expresando los resultados en función de la creatinina de la muestra (25. Nuevamente. El cociente proteína/creatinina permite corregir las posibles variaciones en la concentración de la orina.3.4. ELeCTROFOReSIS CAPILAR Si bien es una metodología ampliamente utilizada para la detección de CM en suero. y la proteína total. En caso de utilizar esta metodología. ya sea de manera convencional (concentrando la muestra en función de la concentración de proteínas en la misma) ya sea de alta resolución. 2.Recomendaciones para el estudio de las gammapatías monoclonales 2. las guías de práctica clínica vigentes siguen expresando la proteinuria como cantidad excretada (gramos o miligramos por 24 horas). Son diversos los estudios que avalan la posibilidad de utilizar muestras aleatorias de orina. es imprescindible que el clínico disponga desde el momento del diagnóstico. Pueden emplearse la densitometría y la espectrofotometría UV. 2. para así descartar aquella orina que durante toda la noche ha ido acumulándose en la vejiga urinaria. aunque no están exentas de inconvenientes. en el caso de la orina.1.2.26). Quizás aquí tengan un valor añadido los métodos inmunoquímicos (nefelometría y turbidimetría).2. Medida La medida del componente monoclonal en orina ofrece mayores dificultades que en suero. 2. Las opciones más empleadas se listan a continuación: 2. las estrategias varían de un laboratorio a otro. Puede optarse ya sea por una combinación de un antisuero anticadenas pesadas (γ. la elección de la metodología deberá basarse en las necesidades de sensibilidad para la muestra concreta (por ejemplo. En el caso concreto de la proteinuria de Bence Jones. inmunoglobulina G. ELeCTROFOReSIS eN GeL De AGAROSA Puede realizarse.2. si la determinación se lleva a cabo para confirmar una respuesta completa en un mieloma que presentaba proteinuria monoclonal. la electroforesis capilar constituya una buena alternativa metodológica para el estudio del CM en orina. en ambos casos. y lo que es más importante.1.α.1. Tipo de muestra de orina La medida de proteínas en orina se ha realizado tradicionalmente en orina de 24 horas. en el contexto de las gammapatías monoclonales. aunque con las adaptaciones pertinentes. además de los antisueros frente a cadenas ligeras totales de tipo κ y de tipo λ (por lo tanto tres antisueros distintos). inmunoglobulina G y α1-microglobulina. 2. Aunque los antisueros comercializados para la medida de la concentración de cadenas ligeras (libres o totales) de inmunoglobulinas reconocen tanto las cadenas ligeras monoclonales como las policlonales. el hecho de utilizar muestras de orina aisladas y expresar los resultados de la proteinuria en función de la creatinina de la muestra.2. inmunosustracción o inmunotipado) sirven también para la identificación del CM en orina. hace necesario definir unos nuevos valores discriminantes equivalentes a los establecidos en las guías de práctica clínica actuales. En este apartado. Si bien en ciertos casos la medida por nefelometría o turbidimetría de las inmunoglobulinas y de las cadenas ligeras totales permite intuir el tipo de inmunoglobulina que conforma el CM. separada del resto de las regiones. MM en fase de plateau y GMSI La característica esencial de estos casos es que los pacientes están asintomáticos aunque presentan un CM medible. En todos los casos se necesita también el estudio de proteínas en orina. el seguimiento se basa en la observación del componente monoclonal. inmunosustracción o inmunotipado. 3. sin que precisen tratamiento alguno. Identificación del componente monoclonal Una vez detectado el CM. es necesario identificar convenientemente el isotipo de inmunoglobulina que lo integra (cadena pesada y cadena ligera). se podría excluir un diagnóstico de gammapatía monoclonal.2. La medida de inmunoglobulinas por métodos como la nefelometría o la turbidimetría puede resultar un método complementario a la electroforesis. Por otra parte. al clínico le supone una información complementaria al proteinograma. Los protocolos clínicos persiguen.3. En el seguimiento de los MM quiescentes. Dada la mayor resolución gráfica de la electroforesis capilar. y es de ayuda en el seguimiento de los pacientes para conocer la respuesta alcanzada cuando el CM no se puede cuantificar por electroforesis. Hay grupos que definen además la “respuesta parcial muy buena” (RPMB). Esto puede suceder en los siguientes supuestos: • Mieloma múltiple oligosecretor y no secretor • Amiloidosis primaria tipo AL • Enfermedad por depósito de cadenas ligeras • Mieloma osteosclerótico o síndrome de POEMS • Plasmocitoma solitario (óseo o extraóseo) • Polineuropatías por componente monoclonal • Crioglobulinemias y Síndrome por crioaglutininas Sólo después de comprobar que no se aprecia CM por electroforesis ni por inmunofijación. aunque ya hay numerosos estudios que avalan su uso. respectivamente. este es el método preferido desde el punto de vista clínico. mayor o igual al 50 y al 90%. ya sea bajo tratamiento (para constatar su descenso) o en abstención terapéutica (para controlar un posible ascenso). Puesto que la observación del pico monoclonal en el trazado electroforético constituye para el clínico la mejor forma de evaluar la gammapatía monoclonal. concretamente en casos en que la delimitación del área del CM resulta difícil (CM sobre fondo policlonal o superpuesto a otras regiones del proteinograma). es obligatorio proceder a una inmunofijación de la muestra. muchas veces años e incluso decenios. Aunque la cuantificación de cada una de las inmunoglobulinas por nefelometría o turbidimetría no proporciona una medida exacta del componente monoclonal. En caso de que no se haya podido detectar el CM por electroforesis pero persista la sospecha clínica de gammapatía monoclonal. Debe prestarse especial atención al posible aumento de la concentración del CM (se producirá seguramente en algún momento u otro en el curso de la enfermedad). • Pacientes con gammapatías asociadas a otras condiciones clínicas: no necesitan seguimiento si desaparecen. en principio. hasta el 60% de los MM de inmunoglobulina intacta tiene proteinuria de Bence Jones). 36 • Documentos de la SEQC 2009 . sino también para complementar el estudio diagnóstico en gammapatías con CM de inmunoglobulinas intactas o enteras. Sin embargo.1. Si el paciente presenta una proteinuria de Bence Jones. Pese a la subjetividad que implica este método.2. Aparte de la vigilancia que hay que prestar sobre la posible aparición de síntomas y signos clínicos. Esta respuesta parcial implica una reducción del CM en suero y en orina. delimitando el pico en el trazado y ajustando el área para su determinación de forma individual. el objetivo primordial es evaluar esta pretendida reducción a través de su medida.Pacientes con bajo riesgo de progresión: cada 12 meses. todavía no existe suficiente experiencia como para hacer una recomendación firme respecto a su empleo generalizado en este apartado. no sólo para identificar los casos de gammapatías monoclonales de cadenas ligeras. Medida del componente monoclonal Junto a la electroforesis de proteínas debe proporcionarse la concentración de proteínas y la concentración de cada una de las distintas fracciones del proteinograma. especialmente cuando el CM es de tipo IgA o IgM. puede resultar de interés la determinación absoluta de la cadena ligera libre perteneciente al clon tumoral en MM secretores de cadenas ligeras y en Amiloidosis AL (21). • Pacientes con MM quiescente: .Pacientes con bajo riesgo de progresión: cada 6 meses • Pacientes con GMSI: . es altamente recomendable que el laboratorio no proporcione únicamente datos expresados en porcentajes. Estos pacientes son seguidos durante mucho tiempo.Pacientes con alto riesgo de progresión: cada 3 meses . que el cociente κ/λ sérico es normal y que no existe proteinuria de Bence Jones. 3. dependiendo del riesgo de progresión. Respecto a la medida de cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas. no es necesario identificar el CM de manera repetida. Siempre que la morfología y la migración del CM lo permitan. .3. la periodicidad recomendada de los controles analíticos (electroforesis con medida del CM) varía según el tipo de paciente: • Pacientes tratados que han alcanzado una fase de plateau (o respuesta parcial sostenida): cada 1-3 meses. una respuesta objetiva ahora definida como “parcial” (RP). En el seguimiento de pacientes bajo tratamiento En este apartado. 3.Pacientes con alto riesgo de progresión: cada 3-6 meses. la medida del componente monoclonal debe realizarse a partir de la electroforesis. Por ello. La proteinuria de Bence Jones puede tener un valor pronóstico y evolutivo relevante (de hecho. es recomendable incorporar el gráfico del trazado electroforético al informe del laboratorio.evolución. 3. de acuerdo a criterios clínicos. no puede nunca obviarse la identificación del CM por inmunofijación. en el seguimiento clínico. la finalidad principal del tratamiento consiste en la reducción de la concentración del componente monoclonal. aunque por lo general con elevaciones poco apreciables. Por este motivo.1. la medida de cadenas ligeras (libres o totales) en orina es de gran ayuda. es fundamental medir con la máxima exactitud el componente monoclonal para asegurar que el valor obtenido corresponde al CM y que las posibles variaciones respecto a concentraciones anteriores son debidas exclusivamente a variaciones en la concentración del CM (y no a otras alteraciones como expansiones policlonales o cambios en la elección de los puntos de corte del proteinograma). es el más fiable desde el punto de vista clínico. la concentración de las inmunoglobulinas aporta una información complementaria al clínico (especialmente en casos IgA e IgM. de inmunoglobulina completa a sólo cadena ligera). En recaídas o progresiones de pacientes previamente tratados En estos casos el abordaje es semejante al momento del diagnóstico. incluyen altas dosis de quimioterapia y transplante de progenitores hematopoyéticos –TPH-). el porcentaje de casos que alcanza RC tras TPH es del 40%. la inmunofijación de referencia tendría que ser la del momento del diagnóstico.1. Esta respuesta al tratamiento se asocia con una notable mejoría en la evolución de los pacientes y se obtiene en un 40-65% de los pacientes jóvenes (30) y en más del 35% de los mayores de 65 años (31). muchos grupos ya consideran un cociente κ/λ (libres) normal como criterio de respuesta y. como la inmunofijación. puede suceder que aunque parece que el paciente permanece estable (en relación a su CM en suero) en realidad está progresando con un aumento del componente monoclonal a expensas sólo de cadenas ligeras. la utilidad de este nivel de respuesta todavía no ha sido validada en estudios multicéntricos. Idealmente. Esto es especialmente atribuible a mielomas Bence Jones. los coeficientes de variación son inferiores al 11% para ambos tipos de cadenas ligeras (37. cuya información parece muy útil (33). En cualquier caso. existen unos requisitos mínimos que garantizan una separación de elevada calidad (35): • visualización de la banda tenue de prealbúmina • detección de ciertos estados de heterozigosis de la α1-antitripsina • visualización de los dos componentes principales de la zona α2 (haptoglobina y α2-macroglobulina) • visualización de los dos principales componentes de la zona beta (transferrina y C3 nativo) • detección de componentes monoclonales de concentración igual o inferior a 1 g/L y de oligoclonalidad en la zona gamma Independientemente del tipo de soporte. El límite de detección alcanzado con la IFE (negro amido – azul brillante de Coomassie o violeta ácido) para este tipo de muestra alcanza este nivel de sensibilidad. embargo. En el caso de la orina. el método seleccionado debe cumplir estas características. conviene recordar aquí que es posible que se produzcan fenómenos de escape. debe realizarse una inmunofijación a todos los pacientes en tratamiento que presentan una electroforesis sin componente monoclonal. el CM desaparece tanto en la electroforesis como en la inmunofijación. y también medir la proteinuria de Bence Jones (34). y del colorante y del sistema empleado en el caso de usar gel de agarosa. Identificación del componente monoclonal Las guías de práctica clínica de National Academy of Clinical Biochemistry (NACB) (2) recomiendan que el método de identificación de los CM en suero presente un límite de detección de 0. Detección del componente monoclonal Sea cual sea el método electroforético por el que se opte. REQUERIMIENTOS ANALÍTICOS 4.2 g/L. pero las evidencias respecto al mieloma de inmunoglobulina intacta son todavía poco consistentes. mientras que para RcC es del 24%. y en los pacientes con proteinuria de Bence Jones). En los distintos trabajos en los que se cita la imprecisión analítica interserie alcanzada. Sin embargo. 4. Así se define la RC como la situación en la que.38. Por este motivo. de hecho. el inmunotipado y la inmunosustracción no tienen sensibilidad suficiente para definir la respuesta completa ni cuentan con evidencias que respalden que la desaparición del CM con estos procedimientos tenga una relevancia clínica superior a la inmunofijación.1).4. hoy por hoy no es todavía obligatoria. es obligatorio realizar electroforesis e inmunofijación en suero (siendo también altamente recomendable medir las cadenas ligeras libres). 4. Así. definida por citometría de flujo y por reacción en cadena de la polimerasa o PCR. es necesario que todos estos pacientes dispongan de una muestra anterior en la que se distinga bien el componente monoclonal para tomarlo como referencia y poder compararlo con la muestra en la que puede haber desparecido. además de los nuevos fármacos. Tal como se ha apuntado. En la tabla IV se expone los valores de la imprecisión analítica deseable y los de la variabilidad biológica (36). Amiloidosis y MM no secretores. Empleando gel de agarosa y con cualquiera de los colorantes citados anteriormente o con electroforesis capilar se alcanza la sensibilidad analítica citada previamente.Recomendaciones para el estudio de las gammapatías monoclonales cuando la reducción en suero supera el 90%. La falta de datos referentes a variabilidad biológica de las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas en suero dificulta el establecimiento de estándares analíticos de imprecisión. el Internacional Myeloma Working Group (9) ha definido la Respuesta Completa estricta (RCe). es muy importante la interpretación final del proteinograma por parte de un profesional de laboratorio con experiencia demostrada en la técnica. generalmente tratados. en la que además de los criterios de RC citados anteriormente.39) aunque en algún caso (13) se alcanzan valores cercanos al 20%. No obstante. aparte de conseguir mejoría clínica y desaparición de la plasmocitosis medular. la mejor forma de evaluar estas reducciones es midiendo el pico monoclonal en el trazado electroforético. Los casos en los que el pico desaparece de la electroforesis pero permanece en la inmunofijación se consideran como “Respuestas casi Completas” (RcC). pero también necesita ser validada. De nuevo. en estos casos la sensibilidad del proteinograma es insuficiente para poder definir correctamente el grado de respuesta alcanzado y se hace necesario recurrir a técnicas más sensibles. La sensibilidad metrológica de la electroforesis capilar es ligeramente superior a la de la electroforesis en gel de agarosa (siempre y cuando no se empleen tinciones específicas y no se trate de electroforesis de alta resolución). Resulta algo similar a lo que sucede con la RC inmunofenotípica y molecular. Con los tratamientos actuales (que. Actualmente. en muchos pacientes se consigue una reducción de la concentración del CM que lo convierte en indetectable por electroforesis. La utilización de la medida de cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas ha proporcionado algunas evidencias sobre el hecho de que la normalización de su cociente supone una ventaja pronóstica relevante. y ello conlleva un pronóstico notablemente diferente (32). por lo que aunque sería deseable disponer de esta información. por lo que la estrategia debe ser la misma (ver epígrafe 3. se exige la normalización del cociente κ/λ y una inmunohistoquímica negativa en la médula ósea. En la experiencia española. Sin Documentos de la SEQC 2009 • 37 . Por lo tanto. La electroforesis en gel de agarosa y la electroforesis capilar cumplen los objetivos analíticos de calidad en cuanto a la imprecisión analítica de las distintas fracciones del proteinograma. en los que las células plasmáticas sintetizan menores cantidades de cadenas pesadas pero mantienen la producción de cadenas ligeras (se asiste a un cambio en el componente monoclonal en pacientes bajo seguimiento.2. 3. dado que tras el TPH pueden aparecer bandas oligoclonales que compliquen la interpretación de la electroforesis e inmunofijación. Además. las pautas de seguimiento clínico y analítico de las GM difieren según se trate de GMSI o de MM.6.3 Especificaciones deseables ES % 1.6 5. Detección de recidivas y casos específicos con escasa síntesis de proteína monoclonal • Inmunofijación. • Medida: cualquiera de los comentados. se asiste a una eliminación del posible CM a consecuencia de la reacción con el anticuerpo específico. Si no se observa CM pasar a la etapa siguiente. En MM bajo tratamiento. • La inmunosustracción y el inmunotipado son válidos también para identificar el CM siempre y cuando éste no sea de baja concentración.3 4. Además. debe realizarse un seguimiento del CM cada 1-3-meses si hay alto riesgo de progresión o cada 6 meses si el riesgo es bajo. IgE. se evidencia de esta manera una banda mejor coloreada y más fácil de identificar que la banda resultante de la electroforesis. 38 • Documentos de la SEQC 2009 .4 4. y en caso de no visualizarse CM saltar a la etapa siguiente.6 12. 5.4 10. medida del mismo.2 22.1 7. 6.6 CVInter % 4. GMSI y MM en fase de plateau • Electroforesis sérica con medida del CM. Una vez alcanzada la respuesta. es preferible la inmunofijación a la inmunosustracción o al inmunotipado (concretamente en CM de baja concentración o en aquellos casos que requieren para su identificación de antisueros frente a IgD. En todos los casos.1 12.3.8 ET % 3. En orina debe descartarse la presencia de proteinuria de Bence-Jones.1 14. Medida del componente monoclonal Las prestaciones analíticas relativas a la densitometría y la electroforesis capilar se corresponden con las expuestas para la electroforesis en gel de agarosa y la electroforesis capilar.7 16.3 6.CVInter coeficiente de variación interindividual – CVa coeficiente de variación analítico .6 11. suele añadirse la medida de la concentración sérica de las inmunoglobulinas A. 4.8 CVIntra coeficiente de variación intraindividual .1 3. 5. Se recomienda monitorizar el CM mediante electroforesis.4. En la inmunofijación el posible CM detectado por la electroforesis se pone de manifiesto por la reacción con el anticuerpo específico. Especificaciones analíticas Variación biológica CVIntra % Albúmina α1 α2 β γ 3. es recomendable remitir al laboratorio muestra de sangre y de orina a fin de asegurar un estudio exhaustivo. los controles se pueden espaciar a una determinación cada mes o cada tres meses según el riesgo de progresión. Por el contrario. Estudio en orina • Detección: electroforesis o cribado mediante la medida de distintas proteínas urinarias. En el caso de los MM no tratados.1 11. si bien la medida por métodos inmunoquímicos de cadenas ligeras de inmunoglobulinas (libres o totales) permite realizar un seguimiento más objetivo de la cantidad de cadenas ligeras excretada. Identificación del componente monoclonal • Tanto en suero como en orina.7.3 10.7 12. • Inmunofijación: en caso de no visualizarse CM realizar la etapa siguiente. • Medida de cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas en suero y cálculo del cociente κ/λ (libres).3 CVa % 1. añadiendo la inmunofijación si el CM ha desaparecido 5. 5. No obstante.3.7 9. 5. y su medida ajustada son suficientes).9 15. respectivamente.2. por densitometría o espectrofotometría asociada a electroforesis capilar. Monitorización de MM quiescentes. 5.2 5. en la inmunosustración y el inmunotipado.1. una propuesta de seguimiento clínico de las gammapatías monoclonales. cadenas ligeras libres). por norma general a las 4-5 semanas.ET error total la sensibilidad para la detección de CM (esencialmente cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas) debe ser inferior a 10 mg/L.Tabla IV.7 5. METODOLOGÍA RECOMENDADA 5.5.ES error sistemático . No es necesario repetir en cada control analítico la identificación del isotipo (la localización y correcta delimitación del pico en el trazado electroforético. Detección (cribado) del componente monoclonal • Indistintamente electroforesis en gel de agarosa o electroforesis capilar. Medida del componente monoclonal • Densitometría (gel de agarosa) o espectrofotometría UV (electroforesis capilar)(preferentemente esta última). • Medida de las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas en suero y cálculo del cociente κ/λ (libres). G y M (a menudo está reprimida la síntesis de las inmunoglobulinas no implicadas en el CM). PROPUESTA DE PROTOCOLO DE SEGUIMIENTO En la figura 1 se muestra una estrategia general aplicable al estudio de los componentes monoclonales en el laboratorio y en la figura 2. 5. Monitorización de MM en tratamiento • Electroforesis y en caso de que persista el CM. El estudio bioquímico supone la monitorización del CM mediante electroforesis con posterior medida del CM por densitometría o espectrofotometría UV. el seguimiento debe realizarse a intervalos de tiempo más reducidos. • Identificación: inmunofijación. la medida de dichas cadenas ligeras constituye una opción recomendable en aquellas situaciones en las que la proteína monoclonal sintetizada tiene una concentración muy baja (MM no secretor y oligosecretor. Amiloidosis AL. The International Myeloma Working Group. aunque no sea obligatorio. Además. requiriendo normalmente de electroforesis e identificación. y se recomienda también determinar la concentración de las inmunoglobulinas A. Aquellas GM asociadas a otras condiciones clínicas (gammapatías monoclonales transitorias y enfermedades relacionadas con la presencia de CM) deben monitorizarse de acuerdo a la enfermedad de base en cuestión. algunos plasmocitomas. inmunosustracción o inmunotipado). En caso de que por ninguno de los dos procedimientos anteriores se ponga de manifiesto la presencia de la proteína monoclonal. 7. se recomienda. En caso de que los controles se efectúen anualmente. En las GMSI clínicamente estables el seguimiento se realiza con carácter semestral o anual (según el riesgo de progresión) mediante electroforesis e inmunofijación. En los casos en que se aprecie una disminución marcada del CM. se recomienda seguir a los pacientes que cumplan estos requisitos de 8. 121: 749-57. con inmunoparesia o con menos de un 5% de plasmocitos medulares normales respecto a plasmocitos totales. así como en la valoración de la respuesta al tratamiento es imprescindible realizar el estudio inmunoquímico (inmunofijación. Por otra parte. con cociente sérico κ/λ (libres) patológico. y debe realizarse un estudio de la proteinuria de Bence-Jones. Documentos de la SEQC 2009 • 39 . Propuesta de seguimiento analítico de los componentes monoclonales Figura 2. pudiéndose quizás obviar en estos casos la electroforesis convencional en los controles posteriores. Ambos tipos de estudios analíticos son imprescindibles para poder categorizar adecuadamente la gammapatía monoclonal en función del isotipo de inmunoglobulina y de la concentración del componente monoclonal. BIBLIOGRAFÍA 1. MM Bence Jones. Criteria for the classification of monoclonal gammopathies. inmunosustracción o inmunotipado. puesto que en las gammapatías monoclonales la pérdida del control sobre la regulación de la síntesis normal de inmunoglobulinas queda reflejada por la alteración del cociente sérico κ/λ (libres). Conviene además determinar la concentración de las inmunoglobulinas A. ya que ésta es la técnica más sensible y la única que ha demostrado utilidad clínica contrastada. Las opciones analíticas empleadas para el diagnóstico y la monitorización de las GM pueden resumirse en dos grandes metodologías: electroforesis e inmunofijación. G y M. G y M. La presencia de un cociente κ/λ (libres) alterado en estas situaciones permite mantener un elevado índice de sospecha sobre la persistencia de la proteína monoclonal y por lo tanto. Para poder confirmar la ausencia del CM. Figura 1. También es altamente recomendable descartar la presencia de proteinuria de Bence-Jones. con concentraciones superiores a 15 g/L. sólo se recomienda repetir la inmunofijación si el pico monoclonal no se visualiza con facilidad en la electroforesis. mientras no varíe el CM detectado en la electroforesis (ni en su morfología ni en su concentración). CONCLUSIONES La contribución del laboratorio al estudio de las gammapatías monoclonales es determinante para su correcto diagnóstico y seguimiento. multiple myeloma and related disorders: a report of the International Myeloma Working Group. medir las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas en suero. y medida del CM por densitometría o espectrofotometría a UV. cada 3 a 6 meses.Recomendaciones para el estudio de las gammapatías monoclonales manera más continuada. Así. En las GM transitorias. Una vez diagnosticada la gammapatía monoclonal. podría ser un criterio de respuesta y un factor pronóstico. Br J Haematol 2003. Síndrome de POEMS y MM en remisión). Dado que el riesgo de progresión hacia MM sintomático es mayor en pacientes con GMSI con CM de tipo A o M. es obligatorio disponer de una inmunofijación negativa. la desaparición progresiva del CM obliga a utilizar alguna técnica inmunoquímica de identificación (preferentemente inmunofijación) para confirmar definitivamente la normalización del trazado electroforético. el estudio de la proteína monoclonal en orina es obligatorio. o en los que el CM se halle ya desde su inicio en una baja concentración. no es necesario repetir sistemáticamente el estudio inmunoquímico de identificación (inmunofijación. no siempre es necesario pasar nuevamente por ambas etapas (detección e identificación). inmunosustracción o inmunotipado). Propuesta de seguimiento clínico de las gammapatías monoclonales del trazado electroforético. mw-delhi09. Octubre / Noviembre 2008. Tang LX. Dauwalder O. 2004. Haematologica 2008. 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Esta segunda versión difiere de la primera únicamente en que se han corregido los errores mencionados. • Centro Español de Metrología. Madrid: AENOR. Parte 2: Pipetas tipo pistón. 2 Normas para consulta • Asociación Española de Normalización. Parte 6: Métodos gravimétricos para la determinación del error de medición. Cálculo de la incertidumbre 1 Objeto y campo de aplicación La presente recomendación describe un procedimiento gravimétrico para la calibración de pipetas y dispensadores mecánicos.Recomendaciones para la calibración de material volumétrico en el laboratorio clínico* Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular (SEQC) Comité Científico Comisión de Metrología Documento E. UNE-EN-ISO 8655-6: 2002. la calidad de los resultados generados en el laboratorio. • Asociación Española de Normalización. FJ. UNE-EN-ISO 15189: 2003. Este documento se publicó en su primera versión en Quim Clin 2006. directa o indirectamente. Aparatos volumétricos accionados mediante pistón. con varios errores que se explicaban en una fe de erratas posteriormente publicada en Quim Clin 2007. • Asociación Española de Normalización. M. 2002. Batista Castellví. • Asociación Española de Normalización. Gella Tomás. 2003. • Asociación Española de Normalización. Transportes y Medio Ambiente. Madrid:AENOR. 0 Introducción Las pipetas que se utilizan para la dispensación de volúmenes que pudieran afectar. 26:85. 25:104-110. Laboratorios Clínicos. 2002. Madrid: AENOR. Requisitos particulares relativos a la calidad y la competencia.3 Procedimiento de calibración 5. Aparatos volumétricos accionados mediante pistón. 2000. Canalias Reverter. deberían estar apropiadamente calibradas. así como informes que contengan datos de las calibraciones efectuadas. Sistemas de gestión de la calidad. Parte 1: Terminología. * Composición de la Comisión: J. B. Parte 5: Dispensadores. UNE-EN-ISO 8655-5: 2002. requisitos generales y recomendaciones de uso. UNE-ENISO 8655-2: 2002. Fase 3. • Asociación Española de Normalización.2 Condiciones ambientales 5. los laboratorios clínicos deben establecer una programación que controle y demuestre periódicamente que sus instrumentos de medida se encuentran calibrados y mantener documentos que describan los procedimientos de calibración y los criterios de aceptación. UNE-EN-ISO 8655-1: 2002. Madrid: Ministerio de Obras Públicas. Madrid: AENOR. Ruíz Morer.5 Frecuencia de calibración 6 Aplicaciones 7 Bibliografía Anexo 1.05 mL 2. de volúmenes superiores a 0. Versión 2 Preparado por: R. 2002. F.4 Cálculo del error sistemático y de la incertidumbre de medida 5. 1994. UNE-EN-ISO 9001:2000. Aparatos volumétricos accionados mediante pistón.1 Patrones 5. R. Sánchez Manrique (Presidenta) Documentos de la SEQC 2009 • 41 . Madrid: AENOR. 3. NOTA: En el caso de material volumétrico. que caracteriza la dispersión de los valores que podrían razonablemente ser atribuidos al mensurando (VIM). 3.2. Exactitud (de un instrumento de medida) Aptitud de un instrumento de medida para dar respuestas próximas a un valor verdadero (VIM). Calibración Conjunto de operaciones que establecen. en procedimientos de medida manuales o dilución de una muestra para su reproceso D. Expresión de la incertidumbre de medida en las calibraciones. CEA-ENAC-LC/02 (Rev. 3. asociado al resultado de una medición. Imprecisión Coeficiente de variación de un conjunto de resultados obtenidos al medir repetidamente un mensurando con un mismo procedimiento de medida.. etc. 1998 • Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular. Otras mediciones de volumen. Mediciones de volumen que pueden afectar el valor de una magnitud de una muestra. Comisión de Metrología. Estos valores deben considerarse como una aproximación razonable y aplicable a muchas situaciones del laboratorio clínico. Barcelona: Quim. Por ejemplo. Incertidumbre de medida Parámetro. conservar o reproducir una unidad o uno o varios valores de una magnitud para que sirvan de referencia (VIM). 3. Error sistemático Media que resultaría de un número infinito de medidas del mismo mensurando realizadas bajo condiciones de repetibilidad menos un valor verdadero del mensurando (VIM). 3. Recomendaciones para la calibración de balanzas y para la estimación de la incertidumbre de las medidas de masa en el laboratorio clínico. Trazabilidad Propiedad del resultado de una medición o de un patrón tal que pueda relacionarse con referencias determinadas.11. De forma general pueden establecerse las siguientes categorías: A. 3. 3. 3. se recomiendan los requisitos para el error máximo permitido de las mediciones de volumen que se muestran en la siguiente tabla.10. NOTA: En el caso de material volumétrico. en la reconstitución de un calibrador liofilizado.• Entidad Nacional de Acreditación. Intervalo de medida Módulo de la diferencia entre dos límites de un rango nominal (VIM) 3. Por ejemplo. Patrón Medida materializada. y los valores correspondientes de esa magnitud realizados por patrones (VIM). 3 Definiciones 3. Por ejemplo. en la preparación de disoluciones de reactivos.1). por medio de una cadena ininterrumpida de comparaciones teniendo todas las incertidumbres determinadas (VIM). Requisitos metrológicos: criterios de aceptación El error máximo de medida de volumen permitido (EMP) en el laboratorio clínico depende sustancialmente del objeto de la medición. Mediciones de volumen que pueden afectar al valor de una magnitud de un patrón/calibrador o relacionadas con un proceso de calibración.7. material de referencia o sistema de medida destinado a definir.8. 3. reglamentos. generalmente a patrones nacionales o internacionales. 3. Clín. la evaporación durante el proceso de calibración debe ser compensada por cálculo o tomar medidas adicionales para evitarla.9. instrumento de medida. 2 Para volúmenes inferiores a 0. para un instrumento de medida dado (VIM). Comité Científico. 42 • Documentos de la SEQC 2009 . Teniendo en cuenta el estado actual de la tecnología de los instrumentos para la dispensación de volumen utilizables en los laboratorios clínicos. Error máximo permitido (de un instrumento de medida) Valor extremo de un error permitido por especificaciones. 2004. NOTA: En el caso de material volumétrico. 23: 35-39. determinadas circunstancias pueden exigir requisitos más o menos estrictos que los aquí recomendados. Mediciones de volumen que pueden afectar al valor de una magnitud de un material de control o relacionadas con procesos de control/verificación. Rango de indicación Conjunto de valores limitado por las indicaciones extremas (VIM). es la diferencia entre el volumen dispensado y el volumen nominal o volumen seleccionado de un aparato volumétrico accionado mediante pistón (ISO). Valor nominal Valor redondeado o aproximado de una característica de un instrumento de medida que sirve de guía para su utilización (VIM). es el conjunto de operaciones que establecen la relación entre el volumen dispensado y el volumen nominal o seleccionado correspondiente del aparato (ISO). en la reconstitución de un control liofilizado C. o los valores representados por una medida materializada o por un material de referencia. Madrid: ENAC. Por ejemplo. Resolución La menor diferencia de indicación de un dispositivo visualizador que puede percibirse de forma significativa (VIM).12. 3. la relación entre los valores de una magnitud indicados por un instrumento de medida o un sistema de medida.5. en condiciones especificadas. No obstante. es el valor extremo superior o inferior permitido para la desviación del volumen dispensado a partir del volumen nominal o el volumen seleccionado de un aparato volumétrico accionado mediante pistón (ISO).1.05 mL.4.6. B. 4. Condiciones ambientales Deben evitarse situaciones ambientales extremas. Aplicaciones El proceso de calibración de las pipetas y dispensadores permite obtener evidencia objetiva de que. procurando que la calibración se realice bajo condiciones similares a las de uso de la pipeta. d) Calcular la incertidumbre relativa combinada expandida para una probabilidad de cobertura de aproximadamente el 95% (Urel). Frecuencia de calibración Se recomienda calibrar las pipetas y dispensadores cada 3 meses. 3 4 Ver documento "Recomendaciones para la calibración de balanzas y para la estimación de la incertidumbre de masa en el laboratorio clínico. Realizar un ajuste a 0 de la tara. c) Calcular el error sistemático relativo (ESrel). esto es. Procedimiento 5. Esto no cuestiona todas las mediciones que se efectuaron con anterioridad con la misma pipeta. 6. cuando se utiliza el instrumento para efectuar dispensaciones de volumen.3. b) Colocar el recipiente de pesada en el plato de la balanza. e) Evaluar los resultados. 35:141-173. b) Calcular el valor medio (vm) y la desviación típica (si) de cada serie de 10 medidas. d) Repetir el apartado c 10 veces consecutivas. Evitar las corrientes de aire y reducir en lo posible la duración de la ejecución de las medidas u otras condiciones que pudieran favorecer la evaporación. Es posible que. en cuyo caso la calibración debe acompañarse de un certificado de calibración expedido por un laboratorio acreditado o un instituto nacional de metrología. Vocabulary for use in measurement procedures and description of reference materials inlaboratory medicine. expresada en %: En el ANEXO-1 se detalla el origen de los términos de esta ecuación. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1997. Cálculo del error sistemático y de la incertidumbre de medida a) Los cálculos se realizan individualmente para cada uno de los puntos de calibración4. superiores el error máximo permitido. La balanza puede ser calibrada por el propio laboratorio clínico3 o por una empresa externa.Recomendaciones para la calibración de material volumétrico categoría A B C D EMP (%) 1 2 3 5 5. La suma del valor absoluto de ESrel con la U rel debe ser inferior o igual al error máximo permitido.2.1. c) Dispensar el volumen de agua destilada correspondiente al volumen nominal de la pipeta en el recipiente y anotar el valor de la pesada. debiendo constar en dicho certificado la trazabilidad al patrón nacional. 7. Procedimiento de calibración Cuando la pipeta es de volumen variable. en el caso de las pipetas de volumen variable. Patrones Para la calibración de las pipetas debe utilizarse como patrón una balanza previamente calibrada y de resolución adecuada para el volumen de la pipeta a calibrar. 5. 5.4. Para cada pipeta o dispensador del laboratorio deben establecerse las medidas que con dicho instrumento se efectúan y asignarle como error máximo permitido el más estricto de las categorías de medida que se realizan con el mismo. expresado en %. Estas condiciones son aplicables a todos los puntos de calibración. También deberían calibrarse siempre que exista alguna sospecha de funcionamiento incorrecto o de haber sido sometidas a algún trato inadecuado u otra situación que pueda comprometer su funcionamiento. y dividiendo posteriormente por el valor nominal. seleccionar para la calibración el volumen mínimo. pesarlo y anotar el valor de la tara (que se tendrá en cuenta para seleccionar la incertidumbre expandida correspondiente al punto de calibración de la balanza más cercano a la masa total que se mide). La Comisión de Metrología de la SEQC ha preparado una hoja de cálculo apropiada para estos fines y que puede ser obtenida en el sitio de la Comisión de Metrología de la web de la Sociedad Documentos de la SEQC 2009 • 43 .5. La pipeta puede utilizarse restringiendo su intervalo de medida o variando el error máximo permitido en función de la escala de medida. 5. comprobar que esté adecuadamente calibrada y llevar a cabo su limpieza. se obtengan resultados insatisfactorios en alguno de los puntos de calibración (por ejemplo en el volumen de valor más bajo). sino tan sólo aquéllas cercanas al punto de calibración para el que se obtuvieron resultados anómalos. la incertidumbre expandida y el factor (o probabilidad) de cobertura que se ha utilizado en el cálculo de la incertidumbre expandida. y para cada uno de ellos proceder como sigue: a) Antes de realizar la calibración debe llevarse a cabo una inspección visual de la balanza. El error máximo permitido se utilizará como criterio de aceptación de las calibraciones. si es oportuno. 5. el volumen máximo y un volumen intermedio. no se cometen errores inadmisibles. restando el valor nominal (vn) de la media obtenida para dicho volumen. Bibliografía • Dybkaer R. multiplicándola por 100. Este componente de la incertidumbre puede ser calculado a partir de la desviación típica de las medidas repetidas (si). Se calcula a partir de los datos que proporciona el certificado de calibración de la balanza: la incertidumbre expandida (Up) del punto de calibración de la balanza Finalmente. la incertidumbre relativa combinada expandida (Urel) resulta de dividir la incertidumbre absoluta combinada expandida por el valor medio medido de cada punto de calibración (vm)6 y. pueden ser ignorados por su escasa relevancia en las aplicaciones habituales del laboratorio clínico. calcular Up mediante: Up = valor masa x Urel/100. la desviación típica (sr) es igual a la amplitud de la distribución dividida por la raíz cuadrada de 12. en ese intervalo. Los errores aleatorios de dispensación originan imprecisión en las medidas. Cálculo de la incertidumbre Las medidas realizadas con la pipeta. (En las pipetas de volumen fijo. La incertidumbre combinada típica (uc) puede calcularse a partir de la suma de cuadrados de las incertidumbres de cada componente: y la incertidumbre combinada expandida (Uc) para el intervalo de confianza de aproximadamente el 95% resulta de multiplicar la anterior por el factor de cobertura 2. más cercano a la masa total que se mide (incluyendo recipiente)5. se expresa en porcentaje. 5 6 Teniendo en cuenta el tamaño habitual del EMP.Anexo 1. La resolución (r) de la pipeta ocasiona errores aleatorios de redondeo. tienen las siguientes fuentes de incertidumbre (u): a) Incertidumbre debida a la medida (ui). 44 • Documentos de la SEQC 2009 . y el valor del factor de cobertura empleado (habitualmente kp = 2) d) Otros componentes de la incertidumbre. La amplitud de la distribución de los posibles errores es igual a la resolución y. cualquier valor tiene las mismas probabilidades de producirse (distribución rectangular o uniforme). como el ocasionado por la presión del aire y la densidad del agua. Urel En caso de disponer únicamente del valor de la incertidumbre relativa y expandida (Urel) respecto al punto de calibración de la balanza requerido. se ha considerado despreciable la diferencia entre volumen medido y el valor nominal. En este tipo de distribución. el valor de resolución es 0). c) Incertidumbre debida al patrón (up). generalmente para el 95% de confianza. ui = si b) Incertidumbre debida a la resolución (ur). Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular .