IUniversidade Camilo Castelo Branco Instituto de Engenharia Biomédica DÉBORA ALICIA BUENDÍA PALACIOS OZONIZAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ÓLEOS VEGETAIS PARA USO DERMATOLÓGICO São José dos Campos - SP 2010 II Débora Alicia Buendía Palacios Ozonização e caracterização de óleos vegetais para uso dermatológico Orientador: Prof. Dr. Renato Amaro Zângaro Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioengenharia da Universidade Camilo Castelo Branco, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Bioengenharia. São José dos Campos, SP 2010 III IV . simples e inolvidables. Eliana y Diana Mis abuelos (in memoriam): Enrique y Débora. Me han enseñado a vivir y a amar sin medida.V DEDICATÓRIA Dedico este trabajo a mi famila. Antonio y Alicia Que han compartido conmigo alegrías. No imaginan cuanto los amo! . tristezas. Mis papás: Ariel y Deborita Mis hermanos: Ernesto. Se han convertido en el motor que mueve mi alma y no permite que desista ante nada. a creer en mí y me da la confianza de que pase lo que pase siempre vamos a estar bien y unidos. que me ayuda a crecer. triunfos y sobre todo momentos. Fernando Ortega. Zamir. que me escutou. Landulfo Silveira Junior. Aos colegas de estudo: Ariane. Dr. pela oportunidade de alcançar uma meta. que han comprendido.VI AGRADECIMENTOS A Deus que me guia e fortalece. que han aprendido algo nuevo y un eterno sentimiento de gratitud…INFINITAS GRACIAS!” Débora. pois com muita paciência e sabedoria me ajudou a culminar esta etapa! Ao Professor Dr. Gaby. realização de um objetivo profissional e pela possibilidade de contemplar um horizonte mais amplo. Marco Antonio de Oliveira. Guille. “Cuando uno enseña lo que sabe. Caro. apoiou. esteve disposta a ajudar e tornou-se uma amiga. infinitamente. Aos Amigos: Jenny. Milene. Angelita. Edna. À Helena Maria de Oliveira: amiga. À Nidia Lucia que sempre foi atenciosa. pessoa a qual admiro. Ao meu orientador: Prof. Norma. Rogério. Jozi. animou e ajudou. À minha família que me ama. À Universidade Camilo Castelo Branco. Natalia. . que colaborou e me ensinou com grande disponibilidade. Aos professores: Luis Carlos de Lima. Renato Amaro Zângaro. Andrés… A todas as pessoas que colocaram seu grão de areia para que fosse possível a finalização de esta fase. acredita em mim e sempre está comigo. tão importante na minha vida. Sonia. Dani. Kátia Calligaris. Leandro. Marcos Tadeu Tavares Pacheco. Erik. Judy. recibe una enorme recompensa: El brillo de unos ojos que han entendido. VII EPÍGRAFE “Há homens que lutam um dia, e são bons; Há outros que lutam um ano, e são melhores; Há aqueles que lutam muitos anos, e são muito bons; Porém há os que lutam toda a vida Estes são os imprescindíveis” Bertold Brecht VIII OZONIZAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ÓLEOS VEGETAIS PARA USO DERMATOLÓGICO RESUMO O objetivo deste trabalho é ozonizar 5 óleos vegetais (óleo de girassol, glicerina, azeite de oliva, óleo de soja, e vaselina) e caracterizá-los espectral e morfometricamente. Os óleos vegetais ozonizados são uma excelente opção para armazenar o ozônio facilitar a manipulação do ozônio terapêutico, evitar sua rápida degradação e realizar tratamento de ozônio terapia no ramo extra-hospitalar. Ainda, este trabalho pode contribuir para os profissionais que atuam na área de ozônio terapia, pois o conhecimento das particularidades dos óleos vegetais ozonizados e a reação do ozônio com os óleos e suas vantagens terapêuticas têm se tornado objeto de estudo. A metodologia do trabalho se caracteriza pela observação analítica. Para descrever as características espectrais e morfométricas dos cinco óleos vegetais ozonizados foram utilizadas técnicas ópticas confiáveis, rápidas e não destrutivas, sendo estas: a espectroscopia Raman e a microscopia óptica. Os resultados mostraram mudanças espectrais, observadas na técnica Raman, durante o processo de ozonização o azeite de oliva não evidenciou mudanças, já o óleo de girassol, a glicerina o óleo de soja e a vaselina mudaram mostrando quebra das ligações duplas correspondentes a insaturação e novos produtos derivados da oxidação lipídica. Com a microscopia óptica evidenciou-se a presença de bolhas de ozônio dentro dos óleos vegetais e permitiu definir a estabilidade do produto, sendo o óleo de girassol o mais estável. Palavras chave: ozonioterapia, óleos vegetais ozonizados, espectroscopia Raman, microscopia óptica. IX OZONIZATION AND CHARACTERIZATION OF VEGETABLE OILS FOR DERMATOLOGICAL USE ABSTRACT The aim of this paper is ozonate 5 vegetable oils (sunflower oil, glycerin, olive oil, soybean oil and vaseline) and characterize them spectrally and morphologically. Ozonized vegetable oils are an excellent option for storing ozone, facilitate therapeutic ozone manipulation, avoiding their rapid degradation and perform ozone therapy at the extra-hospitalary treatments. This work can assist professionals working in the field of ozone therapy, since knowledge of the characteristics of ozonized vegetable oils, the reaction of ozone with the oils and their therapeutic benefits have become an object of study. The methodology of work is characterized by analytical observation. To describe the spectral and morphometric characteristics of five ozonized vegetable oils were used optical techniques reliable, fast and nondestructive, which are: Raman spectroscopy and optical microscopy. Results showed spectral changes observed by Raman technique during the ozonation process. Olive oil showed no changes, bat sunflower oil, glycerin, soybean oil and vaseline changed showing breakdown of a corresponding unsaturated double bonds of fatty acids and new products of lipid oxidation. With optical microscopy showed the presence of ozone bubbles into vegetable oils and helped define the stability of the product, being the most stable is a ozonized sunflower oil. Keywords: ozonetherapy, ozonized vegetables oils, Raman spectroscopy, optical microscopy. la glicerina. siendo estas: la espectroscopia Raman y la microscopía óptica. Palabras clave: ozonoterapia. El aceite de oliva no evidenció cambios. glicerina. . La metodología del trabajo se caracteriza por la observación analítica. aceite de soya y vaselina) y caracterizarlos espectral y morfológicamente. Los resultados mostraron cambios espectrales observados por medio de la técnica Raman durante el proceso de ozonización. la reacción del ozono con los aceites y sus ventajas terapéuticas se han tornado objeto de estudio. facilitar la manipulación del ozono terapéutico. evitar su rápida degradación y realizar tratamientos de ozono terapia a nivel extra-hospitalario. Los aceites vegetales ozonizados son una excelente opción para almacenar el ozono. rápidas y no destructivas. aceite de oliva. Para describir las características espectrales y morfométricas de los cinco aceites vegetales ozonizados fueron utilizadas técnicas ópticas confiables. mostrando ruptura de enlaces dobles correspondientes a la insaturación de ácidos grasos y nuevos productos de oxidación lipídica. el aceite de soya y la vaselina cambiaron. microscopia óptica. aceites vegetales ozonizados. Este trabajo contribuye para profesionales que actúan en el área de ozono terapia. Con la microscopía óptica se evidenció la presencia de burbujas de ozono dentro de los aceites vegetales y permitió definir la estabilidad del producto. espectroscopia Raman. siendo el aceite más estable el aceite de girasol ozonizado. pues el conocimiento de las particularidades de los aceites vegetales ozonizados. el aceite de girasol.X OZONIZACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ACEITES VEGETALES PARA USO EN DERMATOLOGIA RESUMEN El objetivo de este trabajo es ozonizar 5 aceites vegetales (aceite de girasol. Microfotografias dos óleos vegetais ozonizados 36 Figura 7. Histograma de distribuição bolhas para óleo de girassol ozonizado 44 Figura 15. Espectros Raman dos óleos vegetais ozonizados 49 Figura 21. Microfotografia do óleo de soja ozonizado e imagem binarizada 42 Figura 13.XI LISTA DE FIGURAS Figura 1. Passos realizados nas microfotografias para análise digital 40 Figura 10. Espetros do PC1 e PC2 do azeite de oliva ozonizado 53 Figura 24. Rotas de aplicação do ozônio medicinal por via parenteral 25 Figura 2. Histograma de distribuição bolhas para glicerina ozonizada 44 Figura 16. PC1 e PC2 em função do tempo. Curva de distribuição acumulada (FUI) para óleos vegetais ozonizados 46 Figura 20. Microfotografia da vaselina ozonizada e imagem binarizada 42 Figura 14. Microfotografia da glicerina ozonizada 41 Figura 11. Sistema para geração de óleos vegetais ozonizados 28 Figura 4. Microfotografia da amostra do óleo de girassol ozonizado 40 Figura 9. Equipamento gerador de ozônio 34 Figura 5. Espetros do PC1 e PC2 do oleo de soja ozonizado 54 Figura 25. dos óleos vegetais ozonizados 57 . Microfotografia do azeite de oliva ozonizado 41 Figura 12. Espetros do PC1 e PC2 do oleo de girassol ozonizado 51 Figura 22. Histograma de distribuição bolhas para vaselina ozonizada 46 Figura 19. Histograma de distribuição bolhas para óleo de soja ozonizado 45 Figura 18. Sistema para ozonização de óleos vegetais 35 Figura 6. Rotas de aplicação do ozônio medicinal por via tópica ó regional 26 Figura 3. Sistema Raman Dispersivo utilizado na coleta dos dados espectrais 38 Figura 8. Histograma de distribuição bolhas para azeite de oliva ozonizado 45 Figura 17. Espetros do PC1 e PC2 do oleo da vaselina ozonizada 55 Figura 26. Espetros do PC1 e PC2 da glicerina ozonizada 52 Figura 23. V solares 19 Equação 2.XII LISTA DE EQUAÇÕES Equação 1. Dose de ozônio com aplicação terapêutica 23 Equação 3. Catalise do oxigênio em ozônio por raios U. Índice de uniformidade 31 . Descrição de etapas e comandos utilizados para processamento de imagens em ImageJ 37 Tabela 4. Valores de densidade e viscosidade dos óleos vegetais (a 20°C) 61 Tabela 6. Efeitos tóxicos do ozônio nos seres humanos 20 Tabela 2.XIII LISTA DE TABELAS Tabela 1. Parâmetros medidos em cada amostra de óleo vegetal ozonizado 43 Tabela 5. Possíveis grupos funcionais novos. Concentração terapêutica de ozônio para diferentes enfermidades 24 Tabela 3. derivados do oxigênio no espectro de óleos vegetais ozonizados 62 . 5.1.6.1.2.2. Geração de ozônio 32 3.5. Objetivos específicos 18 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 19 2.6. RESULTADOS 39 4.4.5. Processamento de imagens 36 3. Aquisição dos espectros 38 3.1.1. MATERIAIS E MÉTODOS 32 3. Amostras 32 3. Aplicação do ozônio medicinal 24 2.2.1. Microscopia óptica 34 3.2. Aquisição de imagens 34 3. CONCLUSÃO 61 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 62 .1.2. Microscopia óptica 39 4. Espectroscopia Raman 30 3.6.2.3.1. INTRODUÇÃO 15 1. Geração de ozônio terapêutico e concentrações adequadas 22 2. Microscopia óptica 29 2. Produção de óleos vegetais ozonizados 26 2.1. Ozonioterapia 19 2.XIV SUMÁRIO 1.1.4. DISCUSSÃO 56 6. Espectroscopia Raman 37 3. Óleos vegetais ozonizados 25 2.1.3. Tipologia do estudo 32 3. Objetivo geral 18 1. Ozonização de óleos vegetais 33 3. Espectroscopia Raman 46 5.2. 2. Tratamento dos espectros 38 4.2. indicando que a ocorrência de efeitos colaterais do ozônio terapêutico são muito menores com a aplicação correta desta técnica (Nagib. por meio de respostas naturais. o uso do ozônio vem apresentando inúmeros benefícios no tratamento de diferentes doenças. a mesma declarou que até esse ano foram tratados com ozônio 384. foram internadas 1. sua atuação pode . depois em 1875 foi usado pelo cientista Von Marum.238 aplicações e taxa de efeitos colaterais de 0. INTRODUÇÃO A História revela que ao longo das últimas décadas.579. Em 1980. por ausência de medicamentos. ele sintetizou-o e deu-lhe o nome de ozônio. na limpeza e desinfecção de ferimentos. O químico Alemão Christian Frederick Schönbein foi o primeiro a usá-lo com fins industriais em 1840. 2006). um grupo interdisciplinar de terapeutas tem usado o ozônio para o tratamento de doenças severas e confirmaram suas múltiplas propriedades farmacológicas. também para aplicações industriais. Hoje é totalmente claro que o ozônio se dissolve rapidamente na água.775 pacientes. Joachim Haüsler desenvolveu um equipamento de uso eletromédico para dosificação do ozônio no âmbito terapêutico. em 1935. a melhora do organismo aproveitando a ação do gás.500. Em 1936.15 1. em 1978. Fisch (1915) e na medicina pelo Dr.0005% por aplicação. tanto na medicina tradicional quanto na medicina alternativa. Auborg incluiu a ozonioterapia por insuflação retal e. com um mínimo de 5. Em 1988. Posteriormente Payr apresentou. 2005). no plasma e em fluidos biológicos. em 1950. foi fundada a Sociedade Médica Alemã de Ozonioterapia (Bocci. Wolf (1914 -1918) durante a primeira guerra mundial. o grupo começou um projeto para demonstrar os mecanismos de ação do ozônio no sangue e no corpo humano. resultando em 279 pessoas afetadas pelo tratamento. trabalhos sobre os efeitos cicatrizantes do ozônio no Congresso da Sociedade de Cirurgia de Berlim. nos Estados Unidos. imediatamente reage com as biomoléculas e gera mensageiros importantes como: ROS (espécies reativas do oxigênio) e LOPs (produtos de oxidação lipídica) e desaparece. Na odontologia foi usado primeiramente pelo Dr. Por mais de 150 anos. em combatentes. Em 1972. milhões de pessoas têm sido favorecidas com os efeitos positivos do ozônio que elimina focos de doenças e permite. Em Cuba.000 pessoas como consequência do uso de medicamentos prescritos. Comparativamente. 16 ser explicada com conhecimentos clássicos de bioquímica.. e problemas dermatológicos em geral. As técnicas de diagnóstico utilizadas são rápidas. desenvolveu-se uma fórmula de ozônio derivado com óleo vegetal ozonizado. Isso é . porém tem limitada evidência científica com respeito às características físico-químicas e estruturais. Foi aprovado pelos ensaios de toxicidade estabelecidos internacionalmente como LD50 oral e intraperitoneal. foto toxicidade e teratogenicidade (Rodríguez et al. 2008). irritação oftálmica e dérmica. soja e vaselina. e permitem analisar a estabilidade dos produtos partindo da capacidade dos mesmos de servir como reservatório do gás. em diversas enfermidades. Diferentes estudos têm validado esta técnica para determinar o grau de insaturação de ácidos graxos em óleos vegetais (Baeten et al. Permitem avaliar as mudanças apresentadas nos óleos. depois do processo de ozonização. Como opção para facilitar a manipulação do ozônio terapêutico. não destrutivas e podem ser empregadas para controle de qualidade. Sadeghi-Jorabchi et al.. Consideraram-se suas propriedades terapêuticas e dados bibliográficos destacando suas aplicações farmacológicas. sendo a espectroscopia Raman utilizada para óleos vegetais comestíveis e a microscopia óptica para caracterização de espumas de consumo humano. esses benefícios do ozônio restauram a saúde e reativam funções biológicas (Bocci. A Espectroscopia Raman é uma técnica óptica que fornece em poucos segundos informação qualitativa e quantitativa das frequências vibracionais dos grupos funcionais de qualquer material ou composto orgânico. Estes óleos foram escolhidos como amostras a ser ozonizados porque são validados para consumo humano e de uso comercial. A utilização de óleos vegetais ozonizados representa uma alternativa cada vez mais explorada e promissora para o tratamento de múltiplas doenças. Apresenta também excelente atividade biológica local e efeito terapêutico similar ao do ozônio gasoso. 1990)... Assim. vírus. Foram caracterizados cinco óleos vegetais ozonizados. 2005). evitar sua rápida degradação e permitir um tratamento extrahospitalar. Tem sido testado e demonstrado. glicerina. É um produto 100% natural. azeite de oliva. 1998. melhorar seu armazenamento. 1990). dermatológicas e cosméticas. sendo eles: girassol. causadas por: bactérias. fisiologia e farmacologia. que o ozônio induz a adaptação do estresse oxidativo crônico equilibrando tanto o sistema antioxidante quanto a liberação de proteínas antioxidantes. fungos. livre de aditivos. com boa estabilidade e atividade biológica. o que dificulta sua incorporação à prática clínica (Diaz et al. sensibilização. e outros aspectos que ressaltam a versatilidade da técnica e a repetibilidade do processo quando necessária. à dose de ozônio aplicada.17 relevante para detectar alterações espectrais nos óleos vegetais ozonizados. Ainda. e saturação. o que acontece molecularmente. . aspecto que favorece a aplicação da técnica para ser utilizado também no controle de qualidade de óleos vegetais ozonizados. nos óleos vegetais. 2006). presença de aditivos. em relação ao tempo de ozonização. A Espectroscopia Raman tem se tornado útil para o controle de qualidade de óleos comestíveis permitindo determinar a pureza dos mesmos e quantificar o conteúdo de gorduras. a técnica Raman permite visualizar e analisar. O estudo por microscopia óptica permite verificar a presença de bolhas de ozônio dentro dos óleos vegetais e possibilita realizar a análise morfométrica das mesmas. claramente. tanto no referente a reação entre os produtos e mudanças apresentadas. sua relação com a estrutura do produto e sua qualidade (Castillo Castañeda et al.. quando ozonizados. 1.18 1.2. Ozonizar óleos vegetais utilizando o método de inserção de bolhas. 1. Caracterizar morfometricamente bolhas de ozônio inseridas em diferentes óleos vegetais usando microscopia óptica.2.2. . 1. Objetivo geral Ozonizar e caracterizar cinco óleos vegetais.1.3.1. Analisar as características espectrais de óleos vegetais ozonizados utilizando espectroscopia Raman. dirigidos à aplicação dermatológica.2.2. utilizando espectroscopia Raman e microscopia óptica. Objetivos específicos 1. V emitidos pelo sol e protege os sistemas biológicos.p. olhos. 1] Equação 1: Catálise do oxigênio em ozônio por raios U. Fonte: Bocci. seus pontos de fusão e ebulição são 193 e 112ºC respectivamente. 1999).02 µg/mol (Bocci. é tóxico para pulmões. Ozonioterapia O ozônio é uma molécula com três átomos de oxigênio. sua densidade é 1.. nariz. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2. Em altas concentrações. equivalente a 0. pois absorve os raios U. em particular para a mucosa respiratória (Nagib. monóxido de carbono (CO) e metano (CHA) dissociam o ozônio existente e evita a formação de novas moléculas de O3.1. O ozônio é geralmente encontrado na estratosfera a uma altura de 22 km. 2005). é pouco solúvel em água (1.V solares são catalisadores na produção do ozônio: [Eq. permitindo-lhe reagir com uma grande classe de compostos. 2006). seu tempo de vida depende da temperatura. É considerado uma molécula natural.09 g/L a 0ºC). No entanto. tais como NO (óxido nitroso). 2005 A presença do ozônio na atmosfera é muito importante. a 20°C se desintegra em 40 minutos.19 2. A concentração máxima na estratosfera é de 10 p. derivados do cloro (CFCS). sua cor é azul. Decompõe-se espontaneamente. pele. considerado um agente oxidante forte. Os raios U.m (partes por milhão). depois do flúor e do persulfato. instável. e a -50°C pode levar até três meses para se decompor. O ozônio puro ou associado a outros componentes.V solares. mas em equilíbrio dinâmico. .66 g/cm3. por exemplo: a 30oC se desintegra em 25 minutos. o excesso de solventes. podendo ser definido como oxigênio em seu estado mais ativo (Kunz et al. em condições ideais é incolor e de odor pungente. A Tabela 1 mostra os efeitos tóxicos do ozônio em organismos vivos quando inalado. 20 minutos) Diarréia que se incrementa progressivamente.p. 5. náusea e refluxo. em água ou óleo.m (0. CO2 (dióxido de carbono) e CO (monóxido de carbono). dor de cabeça.0 (10 .0 . 2. quais as doses que representam perigo a saúde e quais as não-prejudiciais. É muito importante não usá-lo em presença de NO2 (dióxido nítrico). espasmo bronquial. embora existam muitos estudos que demonstrem a eficácia terapêutica. por isso sua utilização em medicina é controversa.5. agrava predisposição a asma. na formação de altas quantidades de prótons necessários para restaurar as capacidades tampão de oxidantes que defendem o sistema dos radicais livres e dos pró-oxidantes. local.20 Tabela 1: Efeitos tóxicos do ozônio nos seres humanos. As mudanças químicas que surgem dependem dos altos e baixos nas relações do oxigênio no metabolismo e no ciclo de Krebs. a ozonioterapia pode ser aplicada por via vaginal. .0 . 2005 Concentração de ozônio no ar (p. mesoterapia e através de pontos de acupuntura (sistêmica).0 (4 horas) Morte 50. endovenosa.0 Rinite. As análises têm ajudado a definir os mecanismos de ação do O3.m) Efeitos tóxicos 0.2.1 Lacrimação e irritação do sistema pulmonar 1. De acordo com a patologia apresentada pelo paciente.12 µ g/L) (Bocci.0 Morte instantânea O ozônio pode ser protetor ou ofensivo para seres humanos dependendo da concentração e via de contato. Segundo a OMS (Organização Mundial da Saúde) o limite permitido para o trabalho com ozônio é de 8 h com uma concentração de 0. 2005). hemática. infiltrações.06 p. retal (por insuflação). 10.p.0 (60 minutos) Edema pulmonar e ocasionalmente paralisia respiratória. O ozônio é capaz de manter o equilíbrio dinâmico do metabolismo das membranas celulares e o poder desinfetante do mesmo se dá pela sua capacidade e habilidade de destruir. Fonte: Bocci. Yersenia enterocolítica. Cuba. Itália. 5 escalas logarítmicas na população de aproximadamente 1x106 bactérias de Eschirichia coli. dos métodos de uso e dos equipamentos utilizados. Espanha. Ao tratamento com ozônioterapia são atribuídos efeitos como: • Inibição e destruição de micro-organismos patogênicos em qualquer parte do corpo graças ao poder que o O3 tem de penetrar e difundir-se nos tecidos. Aeromona hidrophilae. aplicadas no corpo por diversas vias e que produz no organismo mudanças químicas que dependem da concentração. sendo essa terapia avançada nos seguintes países: Alemanha. devido ao ozônio que se une às cadeias duplas dos ácidos graxos insaturados da porção fosfolipídica da membrana celular dos glóbulos vermelhos. mas com concentração de ozônio menor que 1 milésimo (Nagib. quando se compara à concentração de 0. A ozonioterapia é aceita como uma técnica que consiste na aplicação de doses em baixas quantidades do gás. Uma concentração de 0. permitindo maior penetração do oxigênio na micro circulação. 1991). Nibrio cholerhae. elementos necessários para manter os tecidos oxigenados. houve o incremento da prática da ozonioterapia que mostrou excelentes resultados dependendo das técnicas. Nos últimos 40 anos.3 difosfoglicerato que atua como intermediário da glicólise: processo no qual os açúcares se decompõem para converterem-se em energia e água. • Aumento da formação de peroxidase com papel primordial no metabolismo celular através do sistema redox.21 neutralizar e suprimir o crescimento de micro-organismos patogênicos. • Produção de 2. 2006). Diferentes sociedades médicas tem implementado o uso da ozonioterapia.5 mg/mL de cloro se observa a ação similar dos componentes. Estados Unidos. proporcionando um papel imuno-modelador e imuno-restaurador (Valacchi & Bocci. . Rússia. reduz pelo menos. Salmonella typhy. Argentina. Disteria monoyitegenes e Staphylococus aureus. 2000). • Aumento da elasticidade ao nível hemático. Pseudomona aeruginosa.35 mg/L de ozônio. e seu papel se torna essencial devido à ativação das reações dependentes do oxigênio (Esterbauer. • Afinidade com o grupo sufidrilo (-SH) característicos nos aminoácidos essenciais. Japão. cisteína e metonina. que permite interferir no metabolismo das proteínas. como: aço inoxidável 31GL. Da mesma maneira. sendo expresso em volume (L/min) e normalmente regulado por 1/10 L/min. 2. não tóxicos. A estes dois tubos metálicos é aplicada uma diferença de potencial entre 4 e 13 kV (efeito corona) e por eles passam uma determinada concentração de oxigênio. O critério de cálculo das doses de ozônio é função de: • Concentração de ozônio expresso por µg/mL. teflon ou poliuretano.1.22 Chile e México. um gás contendo 5% ozônio e 95% de O2. 2008). • Espaço entre eletrodos: a geração de ozônio aumenta com a diminuição da espessura da camada dielétrica. • Fluxo de oxigênio: a concentração de ozônio é diretamente proporcional ao fluxo de oxigênio por unidade de tempo. em todos estes países. A concentração de ozônio durante a produção.. Essa técnica produz como resultado. O rendimento de geração de ozônio varia entre 1 a 4% para sistemas de alimentação com ar e de 6 a 14% para sistemas alimentados com oxigênio (Kunz et al. vidro. . • Volume total da mistura de gás composta por oxigênio e ozônio. existe a preocupação de como é manipulado o ozônio e os efeitos que ele produz (Díaz et al. reproduzíveis e construídos com materiais resistentes ao gás. 1999).1. Geração de ozônio terapêutico e concentrações adequadas Os geradores de ozônio devem ser seguros. diferente da normal. circuncêntricos e separados por um material isolante.. • Pressão barométrica (mmHg). é dependente dos seguintes fatores: • Tensão: maior tensão de polarização implica no aumento da concentração do ozônio. É comum que os geradores de ozônio medicinal tenham como princípio dois tubos metálicos. titânio puro grau dois. por razões de segurança usa-se pressão hiperbárica. respeitando-se o limite de isolação. Fonte: Bocci. aplicar o gás de maneira imediata para que não ocorram mudanças (± 1%) na concentração do mesmo (KUNZ et al. 10. (1996). 2005 Concentração de O3 (µg/mL) Enfermidade Inicio Final 20-25 70 Vascular 20 40 Degenerativa 20 30-40 Respiratória 10 30-40 Auto-imune 50 80 Tumores metastáticos 25 70-90 Infecciosa . 20.. Os geradores de ozônio medicinal devem produzir concentrações equivalentes a 2. e 30 µg/mL. 1999). 5. Tabela 2: Concentração terapêutica de ozônio para diferentes enfermidades. sendo definido conforme a equação 2 (Bocci. segundo a sociedade médica européia. 2005 A dose de ozônio para uso medicinal está entre 1-100 µg/mL. Outro método aceito para medição de concentrações de ozônio (especialmente para óleos ozonizados) é considerado padrão pela IOA (International Ozone Association) na Europa é o iodométrico descrito por Masschelern et al. isto é possível porque o ozônio tem importante absorção na região espectral próxima a 253 nm e 600 nm. 2005): Dose de O3 = VG [mL] x CO [µg/mL] [Eq. Fonte: Bocci. É de grande importância em todos os métodos de análise. 2] Equação 2: Dose de ozônio com aplicação terapêutica. Para medir a concentração de ozônio em tempo real são aplicadas técnicas fotométricas. Na Tabela 2 se mostra um guia de concentrações terapêuticas de ozônio para diferentes enfermidades. multiplicado pela concentração de ozônio (CO) expresso em µg/mL.23 A dose de ozônio é equivalente ao volume de gás (VG) expresso em mL. Bocci (2002) realizou estudos dos efeitos biológicos induzidos pelo ozônio no corpo humano e afirma que o sangue é o melhor veículo para transmitir os mensageiros gerados pelo O3. em que se destaca o uso de óleos ozonizados (Werkmeister. em segundo lugar vem a pele. o método mais utilizado é a auto-hemoterapia. o tecido subcutâneo. Aplicação do ozônio medicinal Existem várias vias de aplicação do ozônio terapêutico. músculos e. Atualmente. Fonte: adaptado de Werkmeister. porém desenvolveram-se outras opções especialmente as de exposição corporal ao ozônio e aplicações tópicas. 1995 .2. dentre elas as parenterais e tópicas que são mostradas nas figuras 1 e 2.24 2. por fim o lúmen.1. Subcutâneo Intravenoso Intra-arterial Administração por via parenteral Intramuscular Intraperitoneal Intralesional Miofasial Intra-articular Intradiscal Periarticular Figura 1: Rotas de aplicação do ozônio medicinal por via parenteral. 1995). a ozonioterapia é utilizada em diferentes modalidades. etc. cápsulas líquidas. cremes. (causadas por arterioscleroses. pomadas. cura de feridas crônicas (pé diabético. supositórios. Nasal 30-60s. tem atividades biológicas locais e . 20µgrml Auricular Uretero-vesilcal 3-5-15 µg/ml Administração por via tópica Vaginal 50-100µg/ml Intravesical Retal Cutânea Dental Figura 2: Rotas de aplicação do ozônio medicinal por via tópica ou regional.2. entre outros. 20µg/ml Oral 30-60s. fistulas. 1995 2. lesões da pele e boca) e infecções vaginais e retais. Óleos vegetais ozonizados O óleo vegetal ozonizado é o produto da reação entre o ozônio e o óleo vegetal em condições apropriadas. sendo considerado um medicamento 100% natural que se apresenta em diferentes formas: líquido oleoso. os resultados são potencializados. Entre suas principais aplicações destacam-se o tratamento de enfermidades isquêmicas.25 A ozonioterapia é uma técnica amplamente utilizada em diferentes enfermidades e se combinada com as terapias convencionais. uremia. diabetes.). Fonte: adaptado de Werkmeister. emulsões. chagas. vasculares. que possuem boa estabilidade (Diaz et al. A Figura 3 mostra o diagrama desta operação. . 2008). Atualmente. criando um gel natural com ozônio em suspensão. anti-bacteriana e anti-micótica. dando prioridade à sua ação anti-virica. existe no mercado Cubano um produto chamado OLEOZÓN®. Também existe outro medicamento denominado Bioperoxoil composto por óleos ozonizados com adição de ácido α-lipoico. 2006). colocando ozônio no óleo em banho-maria pelo menos por 30 minutos ou até dois dias quando se solidifica e este é usado para tratamentos intra-hospitalares e não é comercial. permitir um tratamento extrahospitalar e diminuir o risco de usá-lo na forma gasosa.. Em 1954. bactérias e fungos. úlceras. o Dr. Este produto foi chamado “ozo-oil”.. 2001). registrado pela Doutora Renate Viebann. William Torska da universidade de A&M no Texas descobriu que o processo de ozonização de óleos vegetais gera uma vasta cadeia de espécies reativas do oxigênio (ROS) C10H1803 (MORALEDA.2.26 efeitos terapêuticos similares ao do ozônio gasoso ministrado (SAKASAKI et al. para: facilitar a manipulação do ozônio gasoso. melhorar seu armazenamento. em doses altas e inadequadas. No Hospital Universitário de Siena foi produzida uma preparação de óleo de oliva ozonizado.. na Espanha. foi criado na Universidade de Alfenas. 2008). Apesar do óleo ozonizado estar disponível em vários países. Desde o final de 1986 no laboratório de ozônio do Centro Nacional Cubano de Investigações Científicas (CNIC) têm sido realizados diferentes estudos sobre as possibilidades terapêuticas oferecidas pelos óleos ozonizados em diversas enfermidades. O produto é óleo de girassol ozonizado destinado ao tratamento da tênia perdis. O cientista Nicola Tesla aperfeiçoou a técnica borbulhando o ozônio de forma contínua durante três semanas através do óleo. 2. entre outros (SECHI et al.1 Produção de óleos vegetais ozonizados Os óleos vegetais ozonizados são gerados por meio do método de injeção direta de bolhas a qual consiste em inserir os óleos vegetais puros num recipiente com difusor de gás por onde é injetado o ozônio de uma maneira contínua a um fluxo constante.. evitar sua rápida degradação. 2008). não há uma norma de preparação regularizada (Zanardi et al. O óleo ozonizado foi criado por médicos alemães no ano de 1905 com a finalidade de obter formulações de ozônio derivados. tipo de reator.. O comportamento ideal dos . na indústria de alimentação. 1999). cosmética e farmacêutica. 2006). os quais explicam o processo de oxidação em fase líquida quando um gás à base de oxigênio é injetado no interior do recipiente de um reator de coluna de bolhas que contém um líquido orgânico oxidável. temperatura.. sua distribuição é mais uniforme e alta. 2002). Gardiner & Dlugogorski. 1993. À medida que as bolhas são menores e circulares. o óleo será de excelente qualidade. 1998.. Castillo Castañeda et al. assim como a fração de gás líquido (Bawel et al.. Em relação inicial de gás-volume. Esta técnica é também conhecida como CAF (Compressed Air Foam) e tem sido usada durante várias décadas em poços de petróleo. também existem vantagens frente a circularidade das bolhas que é o fator determinante da persistência das mesmas. Este método é detalhadamente descrito por Kingsley et al. entre outras (Magrabi et al. O método de produção de óleos ozonizados pode ser diretamente relacionado ao método padronizado para geração de espumas por meio da difusão de gás. terá uma ótima estabilidade e seu tempo de decomposição será maior.27 O rendimento dos compostos oxigenados dos óleos ozonizados depende das condições de reação como: meio. Este é um sistema de alta energia que produz bolhas uniformes de diâmetro pequeno. A estabilidade do produto resultante está fortemente influenciada pelo tamanho das bolhas. dose de ozônio aplicada e tempo de ozonização (Travagli et al. 2010). Válvula de alívio de pressão Recipiente com óleo vegetal Gerador de ozônio Fluxo constante de ozònio Difusor de gás Figura 3: Sistema para geração de óleos vegetais ozonizados.. presença de aditivos. fortemente impulsionado na forma de jato tendo como resultado uma espuma (Gardiner et al. (2001) e Leduc (2007). . aldeídos.28 óleos vegetais ozonizados como espuma se dá quando as bolhas de ozônio são mais uniformes. ácidos carboxílicos entre outros elementos que são responsáveis pela atividade microbiológica presentes nos óleos vegetais ozonizados. exclusivamente.. . Díaz Gomez & Gavín Sazatornil. cuidadosamente. Zanardi et al. 2006). Rodríguez et al. 2005b. Diferentes estudos têm demonstrado que a variação de parâmetros como pressão de injeção do gás e o fluxo do mesmo não são determinantes na qualidade do produto e sim o tempo de borbulhamento.. 2006. Magrabi & Dlugogorski. A reação do ozônio com óleos vegetais e lipídios ocorre. Lee & Chan. 1978. com uma circularidade próxima a 1... 2005. Díaz et al.. 2005). Além de desempenhar no organismo funções que incluem estimulação de vários sistemas enzimáticos de óxido-redução a qual influi. 1999).. Este método foi exposto pela primeira vez por R. 2007. o tamanho dos poros do difusor de bolhas. 2006. São formadas diferentes espécies oxigenadas como: peróxidos. 1990. bloqueio de receptores virais e morte das células infectadas por vírus assim como um efeito sinérgico que reforça a capacidade fagocitária (Díaz Gomez & Gavín Sazatornil. Nas pesquisas realizadas para caracterização de óleos vegetais ozonizados destacam-se técnicas de diagnóstico como: determinação do índice de peróxidos. Segundo o mecanismo de Criegge que descreve o processo de ozonização de compostos insaturados. 1978) e. Bocci et al.. detalhado por Lee & Chan (2007). Muitos estudos foram feitos para desenvolver novas técnicas analíticas do óleo ozonizado que implicam a mínima manipulação da amostra e que permitem identificar óleos vegetais e lipídios. porém são escassos na literatura dados sobre os espectros de ácidos graxos ozonizados e análises morfométricas das bolhas no óleo ozonizado. nas ligações duplas de carbono-carbono presentes na insaturação dos ácidos graxos (Martínez et al. sobre o transporte do oxigênio aos tecidos e à cadeia respiratória mitocondrial. 2005b. 2005.. durante a reação se formam diferentes produtos oxigenados que ampliam o índice de peróxidos e contribuem com o aumento do conteúdo de oxigênio nas amostras ozonizadas (Bailey. ROS (espécies reativas do oxigênio). Criegge em 1975. (Bailey. Diaz et al. possivelmente. a dose de ozônio aplicada e o tamanho das bolhas (Castillo Castañeda et al. Díaz et al. 2005. Diaz et al. 2008) o qual incrementa seu poder benéfico a nível terapêutico. estes aspectos permitem definir seu padrão micro-estrutural. O trabalho de Castillo Castañeda et al. como é o óleo vegetal ozonizado. A simples observação das imagens permite obter uma descrição qualitativa dos parâmetros do óleo vegetal ozonizado. estes problemas são solucionados com aplicação de algoritmos de detecção. 2008).3. bolhas de ozônio dentro do óleo vegetal). Normalmente. Os possíveis problemas apresentados são: sistemas de iluminação deficiente. com esta técnica pode-se observar o tamanho. todo o processo de aquisição de imagens se encontra exposto a condições próprias do experimento que podem reduzir. contagem e medição de partículas (neste caso. 2. e NMR (Díaz & Gavín. Os parâmetros utilizados para avaliação de espumas por meio de microscopia óptica e digitalização de imagens são: . distribuição das bolhas de ozônio dentro do óleo vegetal. entre outros. baixa resolução do dispositivo de digitalização. Também tem se utilizado métodos espectroscópicos. regiões da imagem fora de foco. 2006). Microscopia Óptica A microscopia óptica é uma ferramenta de grande ajuda que reduz as limitações da visão humana. escassa uniformidade na cor das partículas. Estas pesquisas coincidem que a reação dos óleos vegetais com o ozônio e seus produtos são identificados de acordo com o mecanismo de Criegge. quantidade. Geralmente apóia-se de programas específicos para análise digital das imagens captadas (microfotografias) (Campbell & Mougeot.29 análise elementar e cromatografia gasosa (especialmente para parâmetros de qualidade) (Zanardi et al. 1H NMR (Díaz Gomez & Gavín Sazatornil. (2006) propõe uma metodologia baseada na microscopia óptica e o processamento digital de imagens para a extração automatizada de características importantes em um líquido impregnado de bolhas. severamente. morfologia. cromatográficos (Sadowska et al.. porém para que estes parâmetros sejam válidos é necessário obter informação quantitativa confiável e seguir um conjunto de etapas sequenciais: aquisição... 2008. Estes algoritmos são suficientemente robustos para serem aplicados de forma automática a um número considerável de imagens. 2005). 2007). a capacidade de extrair características geométricas de forma precisa. análise das imagens e interpretação dos resultados. processamento. Díaz et al. 1993). 4. quando as bolhas são mais circulares (valor médio próximo a 1) é menor a probabilidade de ruptura das mesmas (Bayvel & Orzechowski. O índice de uniformidade (FUI) pode ser calculado por meio da equação mostrada na equação 3.9) e Φ(D0. estes picos aparecem combinados ou . Foi definido. 3] ∑ ∆n i i =1 Equação 3: Índice de uniformidade numa espuma. O FUI varia sempre entre 0 e 1 sem atingir os extremos. descrita por Bayvel & Orzechowski (1993). 1985).9) e Φ(D0.9 ) − φ ( D0. quando este interage com o material. por Chandrasekhara Vekata Raman. do tamanho das mesmas e da relação destes parâmetros. o qual chamou inicialmente de “fluorescência fraca” e mais tarde de “nova radiação” (Clark & Hester. • Persistência: Entende-se como sendo a capacidade do óleo vegetal em reter as bolhas de ozônio e está ligada à média da circularidade das bolhas. Espectroscopia Raman O efeito Raman é uma dispersão inelástica da luz. Os espectros são um conjunto de picos derivados de aspectos fundamentais.1). expressa em nanômetros (nm). os valores próximos de zero correspondem à baixa uniformidade e os próximos do um correspondem à uniformidade elevada. Fonte: Bayvel & Orzechowxki (1993) Onde Φ(D0. FUI = φ ( D0. elétron volt (eV) ou centímetros recíprocos (cm-1).1) são valores correspondentes à 90% e à 10% da distribuição acumulada Φ(D) e ∑∆ni é a somatória do número de bolhas dos m intervalos compreendidos entre Φ(D0. Uma espuma será considerada uniforme quando suas bolhas apresentarem o mesmo tamanho. em 1928.1 ) m [Eq.30 • Uniformidade: depende da quantidade de bolhas. relacionados aos modos vibracionais normais de uma molécula. em que se observa uma mudança de frequência em um fóton incidente. 2. Hertz (Hz). O resultado prático de uma medida espectroscópica é um espectro que consiste de intensidades versus energia do fóton. 1993). As primeiras aplicações biomédicas da espectroscopia Raman datam do final dos anos 80 e início dos anos 90. promovendo diagnósticos em tempos muito curtos e não invasivos (Dou et al. intensidade do pico máxima e integrada (Imax e lint. respectivamente) e largura a meia altura (FWHM). permite o estudo de doenças humanas in vitro por meio da detecção de componentes bioquímicos em diferentes produtos. (2007) foi uns dos primeiros a utilizar espectroscopia Raman para o estudo de óleos ozonizados e sustenta que esta técnica é totalmente eficaz e confiável para analisar as reações causadas pelo ozônio a diferentes substâncias (particularmente a óleos vegetais). médio ou longo prazo. na qual λmax dá informações sobre o tipo de vibração. rede de difração. na qual se tem estabelecido bandas espectrais dos mesmos e identificado claramente seus componentes e o efeito que produz diferentes processos (especialmente frituras) sobre estes óleos. carbonílicos (C=O) e hidroxílicos (O-H). Imax fornece informação do número de grupos moleculares vibrando com determinada freqüência e FWHM depende das condições do instrumental utilizado (largura da fenda do espectrômetro. A espectroscopia Raman tem sido vastamente utilizada para caracterização e análises de óleos vegetais.) e das condições intrínsecas da molécula (número e natureza das interações físicas com a molécula vizinha) (Hollas. ozônidos (O-O).. Atualmente. facilita a manipulação da amostra e tem mostrado excelentes resultados. Cada pico ou banda é caracterizado pela: posição máxima do pico (λmax).31 sobrepostos formando bandas de um espectro. especialmente na área de controle de qualidade. 1997). Os diagnósticos de processos biológicos e químicos (entre outros) por meio da espectroscopia Raman diminuem o tempo de análises. a técnica se tornou uma ferramenta potencialmente importante na análise bioquímica de tecidos biológicos.. por essa razão se tem implementado o uso desta técnica em laboratórios. 2004). . etc. Lee et al. qualidade espectral do feixe de excitação. seja a curto. Em seu estudo também demonstrou a formação de produtos por oxidação lipídica sendo predominantes os grupos: peróxidos. tendo como consequência direta avanços na técnica e no instrumental (Dou et al. 1997). 3. Devlin. validados para consumo humano. Essa caracterização realizou-se por técnicas ópticas. planificado para caracterizar cinco óleos vegetais submetidos à ozonização. azeite de oliva. 2004. glicerina. O . O equipamento gerador de ozônio é de marca DISUFIL (Colômbia).2. foi descrito por Kunz A. encontram-se duas malhas metálicas de formato tubular concêntricas. de marcas conhecidas no Brasil e uso comercial. consideraram-se estudos de ozonização realizados anteriormente e os registros sobre sua aplicação nos aspectos farmacológico. enquanto o ar do compressor circula pelo interior da câmara. Às malhas metálicas se aplicam a tensão de 5 kV.32 3.. de la Cruz. Amostras Foram utilizados cinco óleos vegetais comerciais. 1990. 1998. MATERIAIS E MÉTODOS 3. rápidas e não destrutivas. modelo Ozonofil JE9000 (Figura 4). Dentro da câmara geradora de ozônio.. Para a escolha das amostras. conhecido como efeito corona. Carelli. e vaselina.1. dermatológico e cosmético (Rodríguez et al. 2008). Geração de ozônio O método usado para geração de ozônio. todos com apresentação líquida. et al (1999). 3. óleo de soja. Zanardi et al. sendo a formação de ozônio consequência da recombinação de espécies radicais de oxigênio com as moléculas existentes no sistema. 1997. O ozônio se produz pela passagem de ar com fluxo constante através de uma câmara hermeticamente selada que contêm dois eletrodos submetidos a uma elevada diferença de potencial que causa a dissociação do oxigênio presente. Tipologia do estudo O presente estudo é observacional analítico.3. separadas por um material dielétrico e neste caso composto por um tubo de vidro. sendo eles: óleo de girassol. Este equipamento é constituído por um compressor que proporciona um fluxo constante de 270 L/h e um reator que utiliza uma tensão de entrada de 5 kV. Ele contém um compartimento que aloja uma cápsula porosa de sílica (poros entre 50 µm e 100 µm).33 produto final é ozônio com uma concentração de 2.4. uma entrada de ozônio posicionada na parte inferior e a saída do gás na parte superior. composto por um cilindro de aço inoxidável (Figura 5) com capacidade de 150 mL de fluído. 3.p. Figura 5: Sistema para ozonização de óleos vegetais.35 p.m) quando alimentado com ar (presente caso).m) quando alimentado com oxigênio e 0. Figura 4: Equipamento gerador de ozônio utilizado (marca DISUFIL. .p.05 p.10 µg/L (0.7 µg/L (1. modelo Ozonofil JE9000). Ozonização de óleos vegetais Para a ozonização de óleos vegetais utiliza-se um reator de coluna de bolhas. 10x/0.5) com formato TIF e com resolução de 764x574 pixels. quatro para cada óleo ozonizado (um por objetiva). dentre as quais foram selecionadas as que apresentavam maior nitidez. sendo estas.30 e L40X/0. com os objetivas de 4X/0. utilizou-se 100 mL de cada amostra (óleo de girassol. Foi adquirido um total de 60 imagens (12 imagens para cada óleo ozonizado dividido em grupos de três para cada objetiva).22. L20X/0. Aquisição de imagens Foram obtidas microfotografias com um microscópio LEICA DIASTAR QG2-32. A figura 6 (a-t) mostra as microfotografias selecionadas para a análise. respectivamente) mantidos no reator de bolhas durante um período contínuo de 11 h (cada amostra de óleo. óleo de soja. Microscopia óptica 3. Analisaram-se 20 fotos no total. processadas digitalmente.1. 3. armazenadas em um PC mediante o software QWin (versão V2.5. respectivamente) a uma temperatura ambiente de 22°C.10.5.50.34 Para o procedimento de ozonização de óleos vegetais. . azeite de oliva. glicerina. e vaselina. objetiva L40X/0.22 s) Vaselina ozonizada.22 c) Óleo de girassol ozonizado.22 g) Óleo de oliva ozonizado.30 p) Glicerina ozonizada. objetiva 20X/0. objetiva 10X/0. objetiva L40X/0. objetiva 20X/0.50do m) Glicerina ozonizada. objetiva 4X/0.50do Figura 6: Microfotografias dos óleos vegetais ozonizados.30 t) Vaselina ozonizada. objetiva 10X/0.50do q) Vaselina ozonizada.30 h) Óleo de oliva ozonizado.30 d) Óleo de girassol ozonizado. objetiva 10X/0. objetiva 4X/0.10 f) Óleo de oliva ozonizado. objetiva L40X/0. .30 l) Óleo de soja ozonizado. objetiva 4X/0.10 b) Óleo de girassol ozonizado. objetiva 4X/0.22 k) Óleo de soja ozonizado. objetiva 10X/0.22 o) Glicerina ozonizada. objetiva 20X/0.10 r) Vaselina ozonizada. objetiva 20X/0.50do e) Óleo de oliva ozonizado. objetiva 10X/0. objetiva L40X/0.10 n) Glicerina ozonizada.35 a) Óleo de girassol ozonizado.10 j) Óleo de soja ozonizado. objetiva 4X/0. objetiva 20X/0.50do i) Óleo de soja ozonizado. objetiva L40X/0. 2. Procedimento Abrir imagem Opção de menu Comando File Open Seleção retangular Seleção de imagem Edit Clearoutside Retirar borda da imagem Converter intensidade da cor em cada pixel Calibrar programa com microscópio para realizar medições Ajuste para maior visualização de bolhas Image Type 8 bit Open Seleção de imagem Seleção de linha Medir imagem Analyse Set scale (ajustar valores.5. Processamento de imagens O processamento de imagens foi realizado com o software ImageJ (Wayne Rasband. USA). conforme procedimento descrito na tabela 3. Tabela 3: Descrição de etapas e comandos utilizados para processamento de imagens em ImageJ. global e ok) Edit Invert Image Image Adjust Brigthness/contrast Adjust Threshold Analyse Set measurements (seleccioar medidas a realizar) Analyse Analyse particles Results Summarize Medições .36 3. National Institute of Health. A calibração espectral de intensidade foi realizada pelo fornecedor do equipamento e consiste na coleta do espectro de uma lâmpada de filamento de tungstênio com espectro rastreado pelo NIST (“National Institute of Standards and Technology”). Este sistema possui um cabo de fibras ópticas “Raman probe” para excitação e coleta do sinal Raman da amostra. Lambda Solutions.. que possui bandas intensas e características na região espectral de interesse (“fingerprint”). com faixa espectral útil entre 800 a 1800 cm-1. . MA.6. atingindo uma temperatura de trabalho de -75ºC. O espectrômetro do sistema Raman possui resolução de aproximadamente 2 cm-1. USA) que utiliza um laser de diodo multimodo estabilizado. Este cabo foi posicionado a 5 mm da parede lateral do porta-amostras. que continha o óleo em processo de ozonização. de maneira que as alterações espectrais pudessem ser acessadas via fibra óptica. O espectrômetro foi calibrado utilizando as posições das bandas principais do naftaleno.37 3. deepdepletion” 1340X100 pixels refrigerada por elemento termoelétrico (Peltier) ventilado. Espectroscopia Raman Foi utilizado um espectrômetro Raman dispersivo (modelo P1-. com repetibilidade da geometria de excitação e coleta do sinal. Inc. sintonizado em 830 nm e 350 mW de potência de saída (Figura 7). Figura 7: Sistema Raman Dispersivo utilizado na coleta dos dados espectrais. A detecção do sinal luminoso espalhado pela amostra é efetuada por uma câmera CCD “back thinned. 6. verificar os efeitos do ozônio no espectro dos óleos identificando elementos de oxidação lipídica. que coletou o espectro Raman a cada 15 min (o espectro possui tempo de leitura de 20s). A filtragem realizou-se por um filtro digital e implementado com a utilização do software Matlab (The Mathworks. observado através das alterações nas bandas espectrais das ligações duplas e ao aparecimento de novas espécies oxigenadas. os espectros Raman também foram submetidos à Análise de Componentes Principais. (2003).6.1. MA. versão 4.38 3. 3.2. Essas operações facilitam a interpretação dos dados e contribuem para simplificar a análise estatística. subtração do espectro de fluorescência de fundo das amostras (sinal de baixa frequência) e filtragem do ruído de alta frequência. A primeira aquisição para cada amostra foi no tempo zero do processo de ozonização. Aquisição dos espectros A aquisição dos espectros foi realizada com o software RamanSoft. Tratamento dos espectros Os espectros obtidos passaram por diversas etapas de pré-processamento. USA. As aquisições seguintes tiveram como objetivo. por um período de 5 horas durante o processo de ozonização. fornecendo espectro original de cada óleo. .2) conforme descrito por Cunha et al. De maneira a refinar-se os dados. que incluem calibração em frequência (eixo deslocamento Raman). 1. com imagem binarizada das mesmas.8 bits Óleo de girassol ozonizado após tratamento digital Óleo de girassol ozonizado Imagem binarizada Figura 9: Passos realizados nas microfotografias para análise digital. Óleo de girassol ozonizado . da primeira amostra analisada.39 4. Figura 8: Microfotografia da amostra do óleo de girassol ozonizado. . do azeite de oliva ozonizado. na Figura 9 se mostram os passos da digitalização das microfotografias. respectivamente. do óleo de soja ozonizado e da vaselina ozonizada. Nas Figuras 10 a 13 mostram-se as microfotografias da glicerina ozonizada. RESULTADOS 4. tendo como exemplo o óleo de girassol. Microscopia óptica Na Figura 8 observa-se a microfotografia do óleo de girassol ozonizado. a) Azeite de oliva ozonizado b) Azeite de oliva ozonizado . .40 a) Glicerina ozonizada b) Glicerina ozonizada .Imagem binarizada Figura 10: Microfotografia da glicerina ozonizada e imagem binarizada.Imagem binarizada Figura 11: Microfotografia do azeite de oliva ozonizado e imagem binarizada. Imagem binarizada Figura 12: Microfotografia do óleo de soja ozonizado e imagem binarizada. Na Tabela 4 são mostrados os valores médios encontrados para cada uma das amostras analisadas. .41 a) Óleo de soja ozonizado b) Óleo soja ozonizado .Imagem binarizada Figura 13: Microfotografia da vaselina ozonizada e imagem binarizada. a) Vaselina ozonizada b) Vaselina ozonizada . .95 0.08 Soja 77 0.58 0.68 0.97 0.11 Glicerina 639 7. são mostrados os histogramas de distribuição das bolhas de ozônio para cada óleo vegetal. Óleo ozonizado Número de bolhas Média da área das bolhas (µm) Média de circularidade das bolhas Desvio Padrão Girassol 1167 1.87 0.69 0.19 Nas Figuras 14 a 18.16 0.01 0.42 Tabela 4: Parâmetros medidos em cada amostra de óleo vegetal ozonizado.20 Vaselina 543 0.42 0.87 0. Figura 14: Distribuição de bolhas para óleo de girassol ozonizado.17 Oliva 1098 1. .43 Figura 15: Distribuição de bolhas para glicerina ozonizada. Figura 16: Distribuição de bolhas para azeite de oliva ozonizado. 44 Figura 17: Distribuição de bolhas para óleo de soja ozonizado. Figura 18: Distribuição de bolhas para a vaselina ozonizada. . 95 • Glicerina: 0. a região da curva cuja derivada é mínima. são eles: • Óleo de girassol: 0.92 • Óleo de soja: 0.19 . A partir da Equação 3.30 • Azeite de oliva: 0.45 Outra forma de visualizar as informações contidas nos histogramas é através da distribuição acumulada. ou seja grande variações de diâmetros destas bolhas. pode-se calcular os índices de uniformidade das bolhas de ozônio para os diferentes óleos. A região da curva cuja derivada é máxima. explicita uma alta concentração de bolhas de ozônio com pequena uniformidade. conforme pode ser observado na Figura 19.81 • Vaselina: 0. Figura 19: Curva de distribuição acumulada (FUI) para óleos vegetais ozonizados. explicita uma alta concentração de bolhas de ozônio com grande uniformidade. Analogamente. Esses vetores apresentam componentes principais. (2010). objetos do presente estudo. L. Nas Figuras 21 a 25 podem ser observados os espectros do PC1 e PC2 de cada óleo vegetal ozonizado. 1263 cm-1 e 1301 cm-1. na região entre 900-1100 cm-1. O espectro do PC2 é o segundo componente principal.46 4.2. na região entre 1100 e 1500 cm-1 encontram-se três picos correspondentes a 1443 cm-1. Na região compreendida entre 1500-1700 cm-1 é observado um pico em 1567 cm-1 que é característico da vibração C-C de moléculas oleofínicas. se encontram picos característicos da cadeia básica de carbono e vibrações com enlaces de CO. em que o PC1 mostra o espectro do componente principal do mesmo. Nos espectros Raman dos óleos vegetais ozonizados podem ser observados os picos Raman correspondentes ao espectro Raman característico dos óleos vegetais (girassol. glicerina. . oleo de soja (20d) e vaselina (20e) respectivamente. evidenciando que a intensidade das bandas aumenta com o tempo e mostram as mudanças dos componentes principais dos óleos vegetais em função do tempo de ozonização. Espectroscopia Raman A Figura 20 mostra o espectro Raman normalizado dos óleos vegetais ozonizados: óleo de girassol (20a). oliva.. o primeiro indica a deformação-vibração de CH do CH2. buscando evidenciar as mudanças espectrais dos óleos em função da incorporação de ozônio. e os dois seguintes correspondem a enlaces duplos nos conjugados do cis ou insaturação. sendo este (em todos os casos) o espectro original do óleo vegetal. soja vaselina) de uso comercial descritos por Silveira Jr. Na Figura 26 (a-j) são mostrados os dois primeiros vetores PC dos cinco óleos vegetais ozonizados. Estes espectros apresentam picos com intensidades atribuídas aos modos vibracionais dos diferentes grupos moleculares de ácidos graxos. et al. glicerina (20b). azeite de oliva (20c). c. . e. d.47 a. b. Figura 20: Espectros Raman dos óleos vegetais ozonizados. .48 Figura 21: Espectros do PC1 e PC2 do óleo de girassol ozonizado. 49 Figura 22: Espectros do PC1 e PC2 da glicerina ozonizada. . .50 Figura 23: Espectros do PC1 e PC2 do azeite de oliva ozonizado. .51 Figura 24: Espectros do PC1 e PC2 do óleo de soja ozonizado. As diferenças espectrais mais importantes em cada um dos óleos vegetais ozonizados são enumeradas a seguir: • Óleo de girassol: Evidenciou-se a presença de um novo pico em 829 cm-1 que correspondente a formação de peróxidos. os picos que determinam as ligações duplas entre C=C foram quebradas isto é determinado pelo decaimento dos picos .52 Figura 25: Espectros do PC1 e PC2 da vaselina ozonizada. mesmo assim podem ser observadas mudanças nos picos correspondentes a 912 cm-1. • Glicerina: Apresentou mudanças nas regiões espectrais correspondentes a 800 . • Vaselina: Os efeitos ocasionados pelo ozônio nos grupos moleculares presentes na vaselina foram de uma baixa intensidade. finalmente. • Azeite de oliva: O espectro Raman do azeite de oliva não evidenciou mudanças espectrais. isto é confirmado pelo PCA aplicado ao mesmo. 1263 cm-1 e 1301 cm-1.1433 cm-1 (redução de ligações duplas de C=C) e decaimento da intensidade nos 1632 cm-1. 1332 cm-1 . . 1000 cm-1 . O pico encontrado nos 1661 cm-1 teve um deslocamento que representa o decaimento da ligação dupla do cis. • Óleo de soja: Na região dos 974 cm-1 . (formação de peróxidos e ozonidos). 1044 cm-1. na primeira região têm um deslocamento no pico de 852 cm-1 atribuído ao resultado da ozonólise e ao CH3. em 1055 cm-1 evidenciou-se também um deslocamento do pico que indica a presença de novos elementos na cadeia básica de carbonos.1600 cm-1. nos picos correspondentes as ligações duplas de C=C mostraram decaimento (1265 cm-1 – 1300 cm-1).1081 cm-1 se apresentou um pico nos 1075 cm-1 que pode ser designado ao CO. no que tange ao tempo de ozonização. A Figura 26 mostra o comportamento dos óleos vegetais.1000 cm-1. teve um deslocamento no pico correspondente a vibração do CH e CH2 .53 encontrados ao redor dos 1443 cm-1. apresentou um decaimento no pico assinado pelas moléculas oleofinicas.1200 cm-1 e 1400 . e. 22 100 150 200 -0.0955 0. un.14 0.22 -0.) Intensidade (arb.10 0 50 100 150 200 250 -0.80 Tempo (min) i.00 -0.30 -0.54 a.10 0 50 100 200 250 300 -0.20 0.00 0 50 100 150 200 -0. PC1 do óleo de soja ozonizado h.22 250 2 R = 0. PC2 do oleo de girassol ozonizado c.20 0.18 0.20 -0.) 0 PC1 50 Intensidade (arb.12 2 PC2 0.23 -0. PC2 da vaselina ozonizada Figura 26: PC1 e PC2 em função do tempo.20 0.20 0. PC2 da Glicerina ozonizada e. PC1 do azeite de oliva ozonizado f.50 300 Tempo (min) Tempo (min) g. un. PC1 da vaselina ozonizada Tempo (min) j.22 Intensidade (arb.23 2 PC2 300 R = 0. un.3625 0.) 150 -0.40 0.10 0. PC1 da Glicerina ozonizada d.4441 -0.22 -0. dos óleos vegetais ozonizados.0008 0.22 -0.24 R = 0. 250 300 .16 0. PC2 do óleo de soja ozonizado 0.60 -0.40 -0. un.40 Intensidade (arb. PC2 do azeite de oliva ozonizado 0.60 -0.30 0.40 PC1 2 R = 0. PC1 do oleo de girassol ozonizado b.) 0. atingindo a saturação. O óleo de soja apresentou um incremento positivo. aproximadamente. com exceção da vaselina que mostra um comportamento aleatório.55 O PC 1 corresponde ao espectro de cada óleo vegetal na qual é observada a composição original dos óleos e que estes apresentam um comportamento estável. aproximadamente. aos 120 minutos de ozonização. A glicerina mostrou um comportamento exponencial negativo que representa o decaimento do sinal Raman. A vaselina teve inicialmente um comportamento aleatório. e. atingindo a saturação aos 120 minutos de ozonização. O azeite de oliva não apresentou diferenças espectrais na presença do ozônio. . nem em relação ao tempo de ozonização. pois as mudanças espectrais se apresentaram entre os 100 e 150 minutos de ozonização. No óleo de girassol as mudanças foram contínuas. Já no PC2 observou-se o comportamento das mudanças espectrais com relação a adição de ozônio e ao tempo de ozonização. para em seguida decrescer e estabilizar. diretamente proporcionais ao tempo de ozonização. Du et al. sendo estas a microscopia óptica e a espectroscopia Raman.05 p. As análises. 2006. as respostas espectrais e as características morfométricas das bolhas de ozônio. O conhecimento de ozônio derivados... 1999) com consequente menor probabilidade de ruptura das mesmas.p. 2006.. A dose de ozônio gerada pelo equipamento utilizado foi de 0. com propriedades terapêuticas quando combinado com substratos insaturados. objeto deste estudo. o óleo ozonizado. ou seja. Travagli et al. podem auxiliar na obtenção de dados importantes para a estabilidade do produto. dentro dos limites da dose definida para uso terapêutico. Neste sentido a quantidade de bolhas em cada amostra. visando controlar sua reatividade. evitando extensas manipulações das amostras. reproduzíveis. encontram-se na forma líquida. As ferramentas estatísticas para análise de uniformidade e persistência são geralmente empregadas em estudos de granulometria de partículas sólidas e em análise de atomização de líquidos (Castillo Castañeda et al.. impregnados com bolhas de ozônio em suspensão. sendo que somente na última década se estabeleceu o parâmetro “dose específica”. 1993. morfológica e morfométrica das bolhas. Considerando que a concentração de ozônio gerada é constante.m.. Estes parâmetros determinam a capacidade do produto em reter bolhas (Mangas et al. dependem do tempo de ozonização dos óleos (Castillo Castañeda et al. ou seja. 1993). Bayvel & Orzechowski. seu tamanho médio e circularidade permitiram definir aspectos como a uniformidade e a persistência que são empregados na hora de avaliar a qualidade final do produto (Campbell & Mougeot. 2001). DISCUSSÃO O ozônio tem reconhecidamente uma efetiva ação bactericida. 2010). mas sua utilização foi limitada devido as suas propriedades oxidativas. Essas ferramentas definem como ideal o produto com bolhas de menor diâmetro e de mesma área (comparado com um padrão). e uma média de circularidade próximo ou igual a 1.56 5. permitiu desenvolver produtos como os óleos vegetais ozonizados que são eficazes e estáveis para o uso terapêutico. Para sua análise foram propostas duas técnicas ópticas que se destacam por serem não destrutivas. . Os óleos vegetais ozonizados. 1 µm2 (>23 bolhas). explicita a concentração de bolhas de ozônio com pequena ou grande uniformidade em função da taxa da derivada da curva. a curva de distribuição acumulada (Figura 19). em seu trabalho sobre caracterização de espumas utiliza também esse tipo de informação para evidenciar as características do seu produto. Rabelo et al. O índice de circularidade das bolhas de ozônio nos óleos vegetais podem definir sua persistência no interior destes óleos. No presente trabalho.57 No presente trabalho. conforme mostra Ligier-Belair et al. Neste trabalho. 2000). Da mesma forma.25 µm2 (>118 bolhas). análises químicas e moleculares evidenciam que estes óleos apresentam características similares. estes histogramas correspondem as microfotografias dos óleos vegetais ozonizados. seguido pelo azeite de oliva e o óleo de soja. Neste trabalho.1 µm2. porém. uma vez que. ou seja. a circularidade média é um índice que caracteriza um determinado conjunto de bolhas uniformes e determina a persistência destas dentro do substrato. já na glicerina evidenciou-se que a maior quantidade de bolhas situa-se entre 0 e 1 µm2 (>130 bolhas). Estatisticamente. As diferenças morfométricas das bolhas de O3 nos óleos vegetais podem ser atribuídas às características reológicas de cada óleo como densidade e viscosidade. (2001). para o óleo de girassol a maior quantidade de bolhas situa-se entre 0.5X103 µm2 (>87 bolhas).. . A primeira idéia de uniformidade foi obtida a partir dos histogramas de distribuição de bolhas mostrados nas Figuras 14 a 18. maiores valores de circularidade. coincidindo com o girassol no mesmo intervalo de dimensões. levando a resultados análogos.05 µm2 e 0. A vaselina teve o maior número de bolhas com área da ordem de 2. a uniformidade entende-se como a variabilidade de área das bolhas de ozônio. próximos de 1. Du et al. No óleo de soja a maior quantidade de bolhas situa-se entre 0. evidenciaram que maior persistência das bolhas no interior do substrato. conforme anteriormente evidenciado.2 e 0. 1998. número superior a 400 bolhas de ozônio. o melhor índice de uniformidade foi obtido com o óleo de girassol. As características reológicas dos materiais analisados neste trabalho são mostradas na Tabela 5 (Gardiner & Dlugogorski. com um número bastante inferior de bolhas. enquanto no azeite de oliva o intervalo com maior quantidade de bolhas situa-se entre 0.05 µm2 e 0. (1999). nos quais pode ser observado que. apresentando nesta faixa. neste caso características apresentadas pelo azeite de oliva e óleo de girassol. Uma primeira avaliação destes espectros. Baeten et al. Também é possível evidenciar a aparição de novos grupos funcionais derivados do oxigênio e identificados na Tabela 6.19 0. Palacios et al. glicerina e oliva. Silveira et al.2613 8. tendo sido necessária aplicação da análise multivariada de componentes principais (Figuras 21 a 26). A escolha da espectroscopia Raman como técnica para caracterização de óleos vegetais ozonizados se fundamenta em estudos anteriores (Sadeghi-Jorabchi et al. sendo as bandas Raman associadas aos modos vibracionais dos grupos funcionais característicos dos ácidos graxos.89 1. evidenciando como resultado o consumo das bandas correspondentes às ligações duplas de C=C ou insaturação (1263 cm-1 e 1301 cm-1)..5 79.58 Tabela 5: valores de densidade e viscosidade dos óleos vegetais (a 20°C). seriam mais apropriados para armazenar bolhas de ozônio. 2010) nos quais é utilizada esta técnica para determinar o grau de insaturação em óleos vegetais próprios do consumo humano.s) 58. . Os espectros dos óleos vegetais ozonizados em função do tempo de ozonização são mostrados na Figura 20... 2007.7 59 10. 2000 Óleo de girassol Glicerina Azeite de oliva Óleo de soja Vaselina Densidade (g/cm3) 0.856 Viscosidade (Pa.819 0. 2000.08 De posse das definições anteriores e em uma primeira análise. Fonte: Rabelo et al. 1990. pode-se estabelecer uma relação entre a densidade e os parâmetros morfométricos dos óleos analisados. Lee & Chan. Resultados preliminares indicam que o método Criegge (1975) descreve a reação do ozônio com óleos vegetais e que a espectroscopia Raman pode ser bastante eficiente na detecção de mudanças espectrais resultantes da oxidação lipídica promovida pela presença do ozônio. não mostra mudanças significativas nos espectros dos óleos ozonizados. mostrando que girassol. 1998...3 1. compostos carbonila na região de 1700 -1800 cm-1 e compostos hidroxílicos nas regiões de 3300 cm-1 e 3600 cm-1. o óleo de girassol. óleo de soja e vaselina.estiramento Ozônido ~700 – 900 O-O . tempo de ozonização. Fato este não observado com o azeite de oliva. e tipo de alimentação de gás (oxigênio ou ar).estiramento Simétrico Epóxido ~750 – 950 deformação do anel Álcool ~800 – 900 C-C-O . É importante ressaltar que o rendimento e qualidade dos produtos de derivados de ozonização dependem de parâmetros tais como: tipo do gerador de ozônio. uma vez que a primeira gera informação química (molecular e . As diferenças espectrais mais importantes nos óleos vegetais ozonizados foram: O decaimento nas intensidades dos picos correspondentes às ligações duplas de C=C.59 Tabela 6: Possíveis grupos funcionais derivados do oxigênio no espectro de óleos vegetais ozonizados. decaimento este observado no óleo de girassol. No presente estudo. evidenciados em todos os óleos exceto. Nos espectros de óleos vegetais ozonizados. e a presença de novos grupos moleculares como peróxidos e ozonidos. Fonte: Lee & Chan (2007) Grupo funcional Região espectral Assinatura (cm-1) Peróxido ~800 – 900 O-O .estiramento Eter ~830 – 890 C-O-C .estiramento em fase Os dados da Tabela 6 foram corroborados por Lee & Chan (2007) que demonstrou a presença de ozonidos (O-O) e peróxidos ao redor do pico centrado em 850 cm-1. no azeite de oliva. fluxo do gás. a espectroscopia Raman e a microscopia óptica se complementam. presença de água ou catalisadores. analisados no presente estudo. glicerina e vaselina apresentam mudanças espectrais em função do tempo de ozonização. Todos estes parâmetros foram determinantes nos resultados obtidos neste trabalho. foram observados que. o óleo de soja. 60 espectral) e a segunda gera informação física e morfométrica que permitiram analisar pontualmente cada aspecto relevante dos óleos ozonizados. . os óleos vegetais ozonizados mais estáveis são o óleo de girassol e o azeite de oliva. foram ozonizados 5 tipos de óleo. CONCLUSÃO No presente estudo. robustas. As técnicas são rápidas. à saber: girassol. A metodologia proposta é eficaz e uma das primeiras a associar a espetroscopia Raman com a microscopia óptica para análise e caracterização de óleos vegetais ozonizados. . soja. glicerina e vaselina e apresentadas duas técnicas para o estudo e caracterização dos óleos. o que os torna mais adequados para funcionar como reservatórios de ozônio terapêutico. Observou-se ainda que. oliva.61 6. confiáveis. não destrutivas e permitiram realizar o procedimento com reprodutibilidade. em função da sua concentração. Foi verificado que o ozônio produz mudanças espectrais nos óleos caracterizados. Estudos posteriores são necessários para evidenciar a ação do ozônio em óleos. . T. HESTER. A Critical Evaluation. . P.. Oil and fat classification by FT-Raman spectroscopy. Oxygen-Ozone Therapy. 2006. 46(7): 2638-2646. Modelo de calibração da concentração de metilmetacrilato em solução aquosa utilizando espectroscopia de absorção no ultravioleta.. 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