UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLOING. AGROINDUSTRIAL DETERMINACION DE CLOROFILA INTRODUCCIÓN La fotosíntesis es un proceso de suma importancia para la biosfera porque convierte la energía de la radiación solar en energía química que puede ser usada por todas las formas de vida. La fotosíntesis comprende dos reacciones globales diferenciadas. En la primera se realiza la transducción de energía, y en la segunda la reducción y fijación del carbono. Los pigmentos fotosintéticos son los únicos que tienen la capacidad de absorber la energía de la luz solar y hacerla disponible para el aparato fotosintético. Los cloroplastos de las plantas superiores contienen siempre varios pigmentos, clorofila a, clorofila b, algunas xantofilas y carotinas. Todos estos pigmentos son insolubles en agua, pero se disuelven fácilmente en algunos solventes orgánicos. Además de las clorofilas y carotenoides, muchas plantas poseen otros pigmentos, tales como antocianos, flavonoles, etc. Los Pigmentos biológicos, también conocidos como pigmentos o biocromos son sustancias producidas por microorganismos que tienen un color resultante de la absorción selectiva de la luz. Los pigmentos biológicos incluyen pigmentos vegetales y animales. Muchas estructuras biológicas, como la piel, ojos, plumas y cabello contienen pigmentos como la melanina en las células especializadas llamadas cromatóforos. Los colores pigmentarios difieren del color estructural ya que los primeros son los mismos indistintamente del ángulo de visión mientras que el color estructural es el resultado de la reflexión selectiva de la luz o iridiscencia. PIGMENTOS EN PLANTAS La función principal de los pigmentos en las plantas es la fotosíntesis, que utiliza la clorofila, pigmento verde junto con varios pigmentos rojos y amarillos los que ayudan a captar la mayor cantidad de energía de luz como sea posible. Otras funciones de los pigmentos en las plantas incluyen la atracción de los insectos a las flores que fomentan la polinización. Los pigmentos vegetales incluyen una variedad de diferentes tipos de moléculas, incluyendo porfirinas, carotenoides, antocianinas y betalaínas. Todos los pigmentos biológicos absorben selectivamente ciertas longitudes de onda de la luz mientras que reflejan otras. La luz que es absorbida puede ser utilizada por la planta ANALISIS DE LOS PAI UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. AGROINDUSTRIAL para alimentar las reacciones químicas, mientras que las longitudes de onda reflejadas de la luz determinan el color del pigmento que aparecerá a la vista. LOS PRINCIPALES PIGMENTOS SON: La clorofila es el pigmento principal en las plantas; es una clorina que absorbe longitudes de onda amarillas y azules de la luz mientras que refleja verde. Es la presencia y abundancia relativa de clorofila la que da a las plantas su color verde. Todas las plantas terrestres y las algas verdes poseen dos formas de este pigmento: clorofila a y la clorofila b. Laminarias, diatomeas, y otros organismos fotosintéticos contienen clorofila c en lugar de b, mientras que las algas rojas sólo poseen clorofila a. Todas las clorofilas sirven como medio principal que las plantas utilizan para interceptar la luz con el fin de impulsar la fotosíntesis. Los carotenoides son de color rojo, naranja o amarillo. Las antocianinas (literalmente "flor azul") son pigmentos flavonoides hidrosolubles que aparecen de color rojo a azul, de acuerdo con el pH. Disponible. Las betalaínas son pigmentos rojos o amarillos. METODOS PARA DETERMINAR CLOROFILA ANALISIS DE LOS PAI UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. AGROINDUSTRIAL DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LAS CLOROFILAS INTRODUCCION La fotosíntesis, consiste en la reducción de C02 atmosférico por medio de los protones del agua obtenidos con la energía proveniente del sol. Así la planta almacena energía electromagnética como energía potencial en los compuestos orgánicos. Los compuestos carbonados ricos en energía, obtenidos de esta manera, son usados después como fuente de energía por la propia planta y por otros organismos que son incapaces de fabricar sus propios alimentos, pero que si pueden aprovechar la materia vegetal. El organismo vegetal ha desarrollado un sistema para capturar un fotón de luz y utilizar la energía para elevar el nivel energético de un electrón determinado que posteriormente regresa a su nivel basal; cuando esto sucede, el exceso de energía es liberada en diferentes formas. Los organismos fotosintéticos atrapan la luz solar formando ATP y NADH, que utilizan como fuente de energía para formar lúcidos y otros componentes orgánicos a partir de bióxido de carbono y agua de forma simultánea liberan oxigeno molecular. El bióxido de carbono formado en la respiración de los heterótrofos regresa a la atmósfera para volver a ser utilizado por los organismos fotosintéticos. De este modo la energía solar proporciona la fuerza motriz para la circulación continua del bióxido de carbono y oxigeno molecular atmosféricos a través de la biosfera y proporciona los substratos reducidos (combustible). La evolución de la vida vegetal ha logrado a través de mecanismos bioquímicos, desviar del retorno del electrón a su nivel primitivo y utilizar el exceso de energía para sintetizar carbohidratos. Las plantas superiores contienen también un complemento de enzima, semejante a los de la levadura, que son capaces de convertir la glucosa en alcohol etílico y bióxido de carbono. Esta conversión, se produce cuando las plantas están privadas de oxígeno. ANALISIS DE LOS PAI en el proceso alternativo. es la clorofila. el 7% de minerales y el 5% de pigmento verde llamado clorofila. En estas condiciones invariablemente producen bióxido de carbono y forma alcohol etílico en sus tejidos. que incide en la planta. En todos los casos la fotosíntesis está asociada con corpúsculos verdes aislados. 35% de lípidos. B)los grana sólidos (verde) y C)las paredes celulares mezcladas con células integras. Se recuperan tres fracciones principales: A) el citoplasma. La cola es una cadena de carbonos enlazados unidos a la cabeza. que son todavía capaces de llevar a cabo la fotosíntesis contienen. Esta molécula de pigmento se encuentra incluida en la unidad estructural fotosintética llamada cuantosoma que ANALISIS DE LOS PAI . Una molécula de clorofila se compone de una cabeza y una cola. Es posible romper la célula de la hoja en varias fracciones triturándolas con una solución amortiguadora. AGROINDUSTRIAL Permanecen vivas durante periodos variables de tiempo que dependen del tipo de planta. Un gran número de productos intermedios o fragmentos carbohidratos se producen en el proceso principal de oxidación (respiración aeróbica) de la glucosa a bióxido de carbono y agua. el 40% de proteínas. Este tratamiento rompe los cloroplastos en fragmentos más pequeños llamados grana. La capacidad de capturar el fotón y convertir en la energía luminosa en energía química es propiedad exclusiva de las plantas verdes. que están suspendidos en el citoplasma de la célula. referido al residuo seco aproximadamente. Las substancias que absorben la energía radiante. Los granas. llamados cloroplastos. Etc.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. el grado de crecimiento. una solución transparente de color café rojizo. La cabeza contiene cuatro anillos de carbono nitrógeno unidos formando un anillo mayor en el centro de este anillo hay un átomo de magnesio y tiene un pigmento color verde con estructuras policiclicas planas. fermentación alcohólica (respiración anaerobia). MATERIALES 1 Mortero 1 Embudo de Buchner 1 Matraz de filtración 1 Matraz aforado de 50 mil Probeta de 100 ml Vaso de precipitados de 200ml. Y se distingue de la clorofila B ya que esta tiene un grupo CH3. mechero. tripie y rejilla Espectrofotómetro y celdas 2 Discos de papel filtro Gradilla 1 gr de hojas frescas de espinacas. Tubos de ensayo 1 Pipeta de 5ml. Los pigmentos más importantes que absorben luz en las membranas de los tilacoides son las clorotila. Arena REACTIVOS Acetona al 80% (v/v) ANALISIS DE LOS PAI . 1 Embudo Pipeta Pasteur. OBJETIVO Calcular la cantidad de clorofila que se encuentra en una determinada porción de extracto por una determinación cuantitativa. Además en el cloroplasto de las plantas superiores. La clorofila a es de color verde debido a que absorbe preferentemente la luz roja y azul y transmite la verde.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. hay otros grupos de pigmentos que son los carotenoides y de las xantótilas. AGROINDUSTRIAL corresponde a una parte del tilacoide. 652. Anota las densidades medidas. sin las venas grandes.Agregue otros 50ml de acetona a la pulpa de las hojas y reanude la molienda y el filtrado.-Agregue arena y 4 ml de acetona al mortero. Este segundo extracto agréguelo al primero. 5. que se denomina fase obscura porque puede tener lugar en ausencia de luz. cortadas en pequeños tamaños.-Transfiera cuidadosamente el extracto resultante al embudo de Buchner provisto de papel filtro. violeta y azul.. AGROINDUSTRIAL METODOLOGIA 1..UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING.Lea la densidad óptica (D) a 645. Usando como blanco el acetona. La clorofila absorbe sobre todo la luz roja. En una segunda etapa.663 nm del extracto.. El tejido debe de quedar sin clorofila.Coloque en el mortero 1 g de hojas de espinacas. que es una sustancia capaz de absorber las radiaciones luminosas.Lave el mortero y el embudo con 50ml de acetona que se incorporara al filtrado. Esta captación de energía luminosa se realiza en una primera etapa en la fotosíntesis. que produce de la escisión de una molécula de agua. y filtre al vacío. En el proceso interviene un pigmento.. Adicione 20ml más de acetona. de lo contrario repita el proceso con otros 20ml de acetona y reúna todos los filtrados. En todo el proceso no debe de usar más de 100ml de acetona se aconseja aforar a 50ml en un matraz. ANALISIS DE LOS PAI . y refleja la verde. 4. la clorofila. DISCUSIÓN La fotosíntesis es un proceso que transforma en carbono orgánico el gas carbónico tomado del aire o disuelto en el agua. en la cual se produce energía química en forma de moléculas de adenosintrifosfato (ATP) y se desprende oxígeno. para moler el tejido y obtener una pasta fina. 2. 6. el dióxido de carbono se combina con una pentosa para formar glucosa a través de una serie de reacciones químicas. 3. Cabe mencionar que no todas las soluciones obtenidas en la práctica por los demás equipos tenían la misma tonalidad de verde. ya que el espectro de absorción de la clorofila es más amplio en la zona del rojo.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. AGROINDUSTRIAL La luz roja es la de mayor eficacia para la fotosíntesis. ya que el espectro de absorción de la clorofila es más amplio en la zona del rojo. Lo anterior nos explica porque cuando llevábamos la solución de clorofila a la luz del sol esta cambiaba a un color rojo. En cambio la luz verde carece de acción sobre este proceso. ANALISIS DE LOS PAI . esto es porque no todas las hojas de espinacas tenían la misma frescura. esto es que entre más frescas se encuentren las hojas mayor contenido de clorofila. La luz roja es la de mayor eficacia para la fotosíntesis. CONCLUSIÓN Sabemos que la clorofila es un factor importante en la fotosíntesis y que es capaz de absorber la energía luminosa y gracias a ello puede promover la serie de reacciones que conducen al almacenamiento de dicha energía en un compuesto de alto poder calórico. En cambio la luz verde carece de activación sobre este proceso. Se cocinó a vapor a 100 °C durante 1.Cuantificación de clorofila α. 3 y 5 minutos para cada tratamiento respectivamente. METODO 1. los valores de clorofila total más altos se presentaron en espinaca procesada al vapor. Combinando tiempos y procesos. espinacas. 49. Se tomó una muestra de material vegetal fresco. β y total. Al finalizar el tiempo establecido se pasaron inmediatamente a un baño con agua helada por 30 segundos para cortar la cocción. Los resultados mostraron que el mayor contenido de clorofila total así como el de sus componentes α y β se presenta en la espinaca al registrarse valores de 62. verdolaga y berro directamente del súper mercado. espinaca.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING.78. AGROINDUSTRIAL EFECTO TIEMPOS Y PROCESOS DE COCCIÓN EN EL CONTENIDO DE CLOROFILA DE VARIOS VEGETALES INTRODUCCION El propósito del presente trabajo. utilizando una estufa con control de temperatura.3 y 5 minutos.. β y total acelgas.68 y 20. se separó la lámina foliar libre de nervaduras de cada vegetal y se sometieron a los diferentes procesos y tiempo de cocción. fue evaluar la posible pérdida de este pigmento presente naturalmente el los vegetales de hoja verde por efecto de diferentes tiempos y procesos de cocción mediante la técnica colorimétrica de Goodwin. El salteado fue el proceso de cocción que mejor conserva el contenido de clorofila en los vegetales de hoja verde. MATERIALES Se adquirieron muestras de acelga. Se determinaron clorofila α.83 mg/g respectivamente. cocinados a vapor a 1. Se colocaron sobre papel secante para eliminar el exceso de líquido. verdolagas y berros. ANALISIS DE LOS PAI . Se colocaron sobre papel secante para eliminar el exceso de líquido. durante 1. Al finalizar el tiempo establecido se pasaron inmediatamente a un baño con agua helada por 30 segundos para cortar la cocción. β y total en acelgas. El filtrado se aforo a 10 mL con la misma solución. y verdolagas mediante la técnica de Goodwin. 3 y 5 minutos para cada tratamiento respectivamente. AGROINDUSTRIAL 2. 3 y 5 minutos a 200 °C para cada tratamiento respectivamente. β y total acelgas. verdolagas y berros. β y total en acelgas. verdolagas y berros. Al finalizar el tiempo establecido se pasaron inmediatamente a un baño en agua helada por 30 segundos para cortar la cocción. Se cocinó en agua hirviendo durante 1.Análisis del contenido de clorofila α. 1. Se tomó una muestra de material vegetal fresco. Se determinó clorofila α. ANALISIS DE LOS PAI . espinacas. espinacas.3 y 5 minutos. β y total. cocidos mediante el hervido a 1. 3. β y total.5 g de cada una de las muestras sometidas a los diferentes procesos de cocción y se maceraron en una solución de acetona-agua al 80% v/v. berros. Se colocaron sobre papel secante para eliminar el exceso de agua. Se tomó una muestra de material vegetal fresco.. Se pesó por triplicado 0.Determinación del contenido de clorofila α. cocinados mediante salteado a 1.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. Se cocinó mediante salteado en una plancha eléctrica con control de temperatura. espinacas.. Se determinaron clorofila α. Se leyó absorbancia en un espectrofotómetro SEQUOIA-TURNER 690 a una longitud de onda de 648 y 663 nm.. El extracto obtenido se pasó a través de un embudo buchner con papel filtro Whatman No. 4.3 y 5 minutos.Determinación de la cantidad de clorofila α. 68) (A 663) A= Absorbancia a 648 y 663 nm según corresponda.89 mg/g respectivamente. (2000). figura 1.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING.2) (A 648) + (8.58 mg/g cifra que es estadísticamente diferente a la obtenida con los otros procesos. reportó que el método de escaldado influye más que la temperatura de secado en la misma. ANALISIS DE LOS PAI .62 mg/g y 28. Schmalko y Alzamora (2001) estudiaron la pérdida de color y clorofilas en el procesamiento industrial de hojas de yerba mate encontrando que el 80% de la pérdida de las clorofilas tenía lugar en el hervido.7) (A 663) + (2. siendo estos contenidos diferentes estadísticamente a los valores obtenidos en vapor y hervido.02) (A 663) mg/g peso fresco de CLOROFILA α = (12.9) (A 648) . Por el contrario en berro y verdolaga el valor más alto se presentó con el proceso de salteado obteniéndose 62.69) (A 648) mg/g peso fresco de CLOROFILA β = (22. β y total se realizó de acuerdo a las siguientes ecuaciones. mientras que con cocción seca se tenía una pérdida menor (10%). AGROINDUSTRIAL La cuantificación de clorofila α. El calor húmedo hace que la clorofila se pierda mayormente que el calor seco. mg/g peso fresco de CLOROFILA TOTAL = (20. un estudio de las pérdidas de clorofila durante el escaldado y el secado de okra realizado por Shivhare et al. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La comparación múltiple de medias entre las muestras y los diferentes procesos aplicados nos demuestra que los valores de clorofila total más altos se presentan en espinaca procesada al vapor registrando 67. Asimismo.(4. 53 mg/g) y es el que marca estas diferencias. AGROINDUSTRIAL La comparación de medias para cada una de las muestras en relación al tiempo de aplicación de los diferentes procesos nos demuestra que en acelga y verdolaga el mayor contenido de clorofila se presenta en el control con 67. lo cual concuerda con el estudio realizado por Ahmed et al. (2002).. En acelga con el proceso de vapor se forman dos grupos estadísticamente diferentes siendo con el control el valor mas alto (76. El comportamiento general de estos resultados se presenta en la Figura 2. definitivamente se fue degradando durante el proceso térmico. De acuerdo a estos tenemos que existen diferencias estadísticamente significativas con la formación de al menos dos grupos estadísticamente diferentes para cada conjunto de datos.04 mg/g y 38.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. En la tabla 1 se presentan los resultados obtenidos al analizar la interacción de procesos y tiempos para cada una de las muestras. con el proceso de hervido se presentan tres grupos estadísticamente por un lado el control con 77. ANALISIS DE LOS PAI .19 mg/g en espinaca y 60.60 mg/g y 23.86 mg/g y por otra parte los tratamientos de 3 y 5 minutos con 50.64 mg/g respectivamente. hoja de mostaza y el puré de ambas hojas. Por el contrario en espinaca y berro la mayor cantidad de clorofila se presenta a los 5 minutos con 67.88 mg/g cifras estadísticamente diferentes a las obtenidas en el resto de los tiempos. siendo mayormente afectado el puré.26 en berro. en el cual concluye que el color de las espinacas. los valores de clorofila total más altos se presentaron en espinaca procesada al vapor. A. ANALISIS DE LOS PAI . CHERMONOSKY. DASHWOOD. 2002. S. BAILEY. No. V. M. 8. 67. Combinando tiempos y procesos. 49. mustard leaves. siendo ligeramente menor a la cantidad obtenida en el control. 1995.. Chem.322.. KAUR. mantuvo la máxima concentración de clorofila.. Toxicol. and mixed puree. Journal of Food Science Vol. 2002. Mechanisms of Chlorophyllin Anticarcinogenesis against Aflatoxin B1: Complex Formation with the Carcinogen. Color degradation kinetics of spinach. 506 – 514. G. PORETS. SCHIMERLIK. 1995. SEGELMAN..78.. R.. A. Res.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING.. U. Effect of dietary chlorophyll derivatives on mutagenesis and tumor cell growth. 3.. el mayor contenido de clorofila total así como el de sus componentes α y β se presenta en la espinaca al registrarse valores de 62.68 y 20. AGROINDUSTRIAL CONCLUSIONES En conclusión. Teratogen Carcinogen Mutagen. 1999. J. El salteado fue el proceso de cocción que mejor conserva el contenido de clorofila en los vegetales de hoja verde. R. El tratamiento de 5 minutos de cocción. BIBLIOGRAFÍA AHMED.83 mg/g respectivamente. SHIVHARE.. 19:313.. BREINHOLT. M. GS. TÉCNICAS ANALÍTICAS BÁSICAS EN FISIOLOGÍA VEGETAL DETERMINACIÓN DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS La fotosíntesis. Toxicology 196. Chemopreventive properties of chlorophyll in inhibition of aflatoxin B1 (AFB1)DNA binding in vivo and antimutagenic activity against AFB1 and two heterocyclic amines in the Salmonella mutagenicity assay. 1991. ZHEN YU.E.E. Antiproliferative effect of chlorophyllin derived from a traditional Chinese medicine Bombyx mori excreta on human breast cancer MCF-7 cells. Estabilidad de Pigmentos en Frutas Sometidas a Tratamiento con Energía de Microondas.W.. pp. 61-66.. and aflatoxin B1 across Caco-2 cell monolayers. Carcinogenesis. LAWRENCE.. 2003. proceso que permite a los vegetales obtener la materia y la energía que necesitan para desarrollar sus funciones vitales.. BAILEY.A. Chemistry and biochemistry of plant pigments. G.. C. T. M.. J. Effects of chlorophyllin on transport of dibenzo (a. capaces de captar la energía lumínica. GOODWIN.E.. HARTTIG. L. New York. Vol. 2-amino-1-methyl-6. V. AGROINDUSTRIAL DASHWOOD. 1 & 2. U. Vol. 729 – 735. ZAMBRANO. M. 1998..1) pyrene-DNA adducts in rainbow trout liver.12:939-942. 1323 – 1326. Academic Press Inc. R. GRAY.S..phenylimidazo-[4. no. pp. BAILEY. 15 N° 3. que es una técnica que permite la separación de las sustancias de una mezcla y que tienen una afinidad diferente por el disolvente en que se encuentran. CARRIE K. MATA. Vol. M. RODRÍGUEZPROTEAU.. Chemoprotection by natural chlorophylls in vivo: inhibition of dibenzo (a. se lleva a cabo gracias a la presencia en las hojas y en los tallos jóvenes de pigmentos.S. 19. 2004.. International Journal of Oncology 23. De tal manera que al introducir una tira de papel en esa mezcla el ANALISIS DE LOS PAI .. J. JIMÉNEZ. 2004.5-b]pyridine. D. RH. 1976. BREINHEIT. Y AGUILAR.. WILLIAMS.1)pyrene.R. Entre los distintos métodos que existen para separar y obtener esos pigmentos se encuentra el de la cromatografía. Información Tecnológica. CHIU. U.E. Carcinogenesis...UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. pages 117-125. 7 pp. Se filtra el líquido utilizando el embudo en el que se ha puesto el filtro de café. ANALISIS DE LOS PAI . MATERIALES Hojas de espinaca o de cualquier planta cortadas en porciones. se añade un poco de alcohol y se trituran hasta que el alcohol adquiera un tinte verde intenso. permitiendo identificarlos perfectamente según su color.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. AGROINDUSTRIAL disolvente arrastra con distinta velocidad a los pigmentos según la solubilidad que tengan y los separa. PIGMENTO Clorofila A Clorofila B Carotenos Xantofilas COLOR Verde azulado Verde amarillento Naranja Amarillo La técnica que se describe a continuación se puede realizar sin ningún problema. Alcohol de 96º (sirve el que utilizamos para desinfectar las heridas) Un mortero Dos filtros de café Un embudo Un vaso Una pinza de la ropa PROCEDIMIENTO Se coloca en el mortero las hojas que se hayan elegido. Resuspender el precipitado en 4ml de acetona para extraer pigmentos 4. Cálculos: -para clorofila A: multiplicar resultados por factor de 10. Posibles resultados: -750nm turbidez -664nm máximo de absorción de la clorofila A 8. Mezclar y enrasar a 5ml con H2O destilada 5. Materiales: Espectrofotómetro Centrífuga de mesa Tubos Acetona MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y MEDIDA 1.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. Centrifugar 1min 6. OTROS MÉTODOS MEDIDA DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS EN DUNANIELLA VIRIDIS Extracción de acetona a partir de precipitados y medida espectrofotométrica. Guardar sobrenadante para medir fosfato con método verde malaquita 3. Medir la absorbancia del sobrenadante resultante 7.3 (mg /ml) ANALISIS DE LOS PAI . Tomar 5ml de muestra y centrifugar durante 5min 2. AGROINDUSTRIAL Se recortan unas tiras de papel del otro filtro y se introducen en el vaso hasta que toquen su fondo procurando que se mantengan verticales con la ayuda de la pinza Se esperan 30 minutos y aparecerán en la parte superior de la tira de papel unas bandas de colores que señalan a los distintos pigmentos. 644 y 662 nm en un espectrofotómetro Perkin Elmer 550 SE de doble haz. mediante una junta de goma. donde se recogió el filtrado. 6. para evitar la destrucción de los pigmentos fotosintéticos. En el interior del kitasato se realiza vacío para acelerar la filtración y evaporar el disolvente. 5 x Abs (662) – 0. 3. en un kitasato con un tubo de ensayo sumergido en hielo. 4. 5. 14 x Abs (662) Cl total: 100. A este sistema se le conecta una corriente de nitrógeno que se adapta mediante un embudo invertido a la boca del crisol. con lo que se arrastra el nitrógeno y se crea una atmósfera inerte que evita la oxidación de los pigmentos. 2.166x Abs (644) Cl b: 16. para eliminar el agua del extracto. Durante todo el proceso la muestra se mantuvo en penumbra y sumergida en hielo. 7. El conjunto va encajado a su vez. a un embudo con filtro de vidrio poroso nº 3 (Pobel). 37 x Abs (644) – 3. El contenido en clorofilas se determinó según las fórmulas: Cl a: 10. se enrasa a un volumen de 25 ml. El homogeneizado se lava con éter dietílico hasta que éste sale incoloro y. AGROINDUSTRIAL MÉTODO DE LICHTENTHALER Y WELBURN (1983) MATERIALES 1gr de hojas Éter dietilico Crisoles Kitasato Espectrofotómetro Perkin Elmer 550 SE de doble haz Placas Petri Embudo Matraz PROCEDIMIENTO 1. El homogeneizado obtenido se filtra a través de un crisol con placa filtrante nº 3 (Pobel). En un mortero se homogeniza 1 gr de hojas con éter dietílico en frío. A continuación se midió la absorbancia de la muestra a 600. Sobre la placa del primer crisol se colocó una capa de celulosa nativa en polvo de 1 cm de espesor.5 x Abs (600) ANALISIS DE LOS PAI .UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. finalmente. acoplado. bia. MATERIALES Y MÉTODOS Las muestras se tomaron en el lago Guatavita.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. ANALISIS DE LOS PAI .dos a partir de los métodos espectrofotométrico (fórmula tricromática) y fluorométri. una profundidad máxima de 30 m. Briceño y H. El análisis demostró que el método espectrofotométrico sobreestimó la concentración de clorofila-a. Colombia. durante campañas realizadas entre abril y agosto de 2003 (Tabla 1). AGROINDUSTRIAL Los resultados se expresan en mg de clorofila /gr COMPARACIÓN DE LA ESTIMACIÓN DE LA CLOROFILA-a MEDIANTE LOS MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICO Y FLUOROMÉTRICO RESUMEN En cuatro ecosistemas acuáticos de montaña del altiplano Cundiboyacense. H. y la cuenca hace parte de una pequeña reserva forestal.co (método de Welschmeyer). presenta un diámetro de 400 m. Colombia. Se halló una ecuación que permite relacionar las medidas de clorofila-a obtenidas con las dos metodologías. se compararon mediante un análisis de regresión los datos de clorofila-a obteni. El lago de Guatavita está ubicado en el municipio de Sesquilé. no tiene afluentes ni efluentes superficiales. Guatavita). y en tres humedales del altiplano Cundiboyacense. Colom. Siberia). es monomíctico. Llano Grande. pero se puede utilizar con precaución en ambientes de baja trofia. (H. (L. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. PRS: fósforo reactivo soluble.1 363.1 166% 0.6 8.2 7632.3 1747. NT: nitrógeno total.1 151.6 O2 (mg l-1) 16% 6. a (mg m-3) 12.9 NT (µmol l-1) 22. NH4: amonio disuelto. ANALISIS DE LOS PAI . Llano 4°59’28’’ N 74°06’06’’ W 73°47’43’’ Municipio W Sesquilé Tenjo H.26 137% 15.5 NH4 (µmol l-1) 5. químicas y de la clorofila-a de los ecosistemas acuáticos estudiados.6 132. valores promedio y coeficiente de variación de las variables físicas.8 9.6 658. 4°58’50’’ N H. O2: oxígeno.9 2508.4 53% 0. 4°43’40’’ H. Ubicación geográfica.6 Cl.2 11% 2.2 Fluorometría 45% 144% 129% 148% Cl.9 376.4 1471. 4°58’14’ N ’N 74°11’40’’ 73°57’10’ W Briceño ’W Facatativ á Cond.9 44.3 Espectrofotometría 49% 151% 230% 280% Tabla 1. Cl: cloro.0 3883. AGROINDUSTRIAL Ubicación geográfica L.4 73% 27.7 23. a (mg m-3) 10.7 42% 1. (µS cm-1) 9.9 170.0 PRS (µmol l-1) 95% 1. En L. Al calcular el porcentaje del número de muestras cuya medición de clorofila por el método espectrofotométrico presenta un valor más alto (sobreestimación) o más bajo (subestimación) que el obtenido por el método fluorométrico. Guatavita y 22% en H. AGROINDUSTRIAL RESULTADOS La Cl. mientras en H. Los humedales Llano Grande y Briceño presentaron el r más alto y el valor más bajo se obtuvo con los da. Siberia).tos de Guatavita.afluorom. presentaron relaciones significativas con r > 0. El porcentaje de diferencia absoluta con respecto al método fluoro. Los datos promedio de Cl. Llano Grande (1. 36% en H. Briceño el porcentaje de sobreestimación fue aproximadamente del 70%. 27% en L.a para cada ecosistema se presentan en la tabla 1.) (E.93 (Fig.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING.6 mg m3).1 mg m-3 con el método fluorométrico y 66. se observaron promedios de la diferencia más bajos para el H. Llano Grande sobrestimaron el valor de clorofila. Siberia la correlación del modelo se incrementó (r = 0.a presentó un promedio de 30. 1).1338 + 0. mientras que en los otros humedales el promedio de la diferencia fue superior a 40 mg m-3. Briceño.2 mg m-3 con el método espectrofotométrico.9192 x arcoseno H (log10 Cl. De las 200 muestras incluidas en el análisis.8 mg m-3. Guatavita y H. Al establecer la diferencia entre los datos hallados por espectrofotometría y fluorometría. Cuando se excluyeron los datos de H.) = 0. Los modelos de regresión lineal simple (con excepción del modelo para H. Los valores obtenidos con el método fluorométrico oscilaron entre 0. El valor más alto se presentó en el ANALISIS DE LOS PAI . Llano Grande. El valor más bajo se presentó en el grupo de datos de la L.9 y 4158.1) La DS fue baja y no superó 0.8 mg m-3) y la L. Llano Grande. Guatavita que no incluyeron las muestras del hipolimnio y en el modelo para el H.métrico fue de 66% en H. Siberia el porcentaje de sobreestimación fue igual al de subestimación (50%). El modelo desarrollado con todos los datos presentó un r = 0. Siberia. Guatavita (2. se encontró que en el 100% de los datos espectrofotométricos de H.96) y la relación de las dos variables se describió mediante la ecuación: arcoseno H (log10 Cl.6 y 845.1 en los modelos significativos.87 (Tabla 2). el 76% presentaron registros más altos con el método espectrofotométrico.aespectro.1 mg m-3 y con el método espectrofotométrico entre 0. 00 H. Al utilizar el procedimiento gráfico con los residuales del modelo y la concentración de nutrientes (Fig. Estas condiciones de nutrientes ocurrieron cuando la concentración de Cl.045 0.870* 0. Una m > 1 solo se presentó en el H.052 0.630* 12 5. Tabla 2.960* 0. Briceño 0.6 µmol L -1.a fue menor cuando el NH4 < 2000 µmol L-1. p < 0.097 0.990* 0. 0.1. 0. se estableció que la dispersión de los datos de Cl.s.042 0.0001). Guatavita Guatavita sin H. La m de los modelos significativos osciló entre 0.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING.020 n.93 (n = 172. los residuales no superaron dos veces la DS del modelo. 18 L.930* 0.940* 00 13.870* 00 20 Todos sin H.020 n. Es decir.267 0.a fue generalmente < 60 mg m-3 (este criterio se cumple en todos los casos para el H.059 0. Principales parámetros obtenidos en modelos de regresión lineal simple realizados entre la clorofila-a estimada mediante los métodos espectrofotométrico y fluorométrico. hipolimnio Siberia Siberia n 4. Guatavita y el H.040* 14.750* 15 0. Todos 0. 14. Briceño (Tabla 2).7. El modelo realizado para establecer en qué concentraciones de nutrientes se cuantifican con mayor exactitud los valores de Cl.066 1. Llano Grande y la L. 0. Guatavita). H. Grupo de Coeficiente Desviació Pendie datos de n nte (m) incluidos correlación estándar (r) (DS) 0.a estimados espectrofotométricamente presentó un r = 0.980* 0.63 y 1. Llano Grande 0. en ambientes la L. el NT < 1400 µmol L -1 como y el PRS < 2.910* 0. Llano Grande. ANALISIS DE LOS PAI . AGROINDUSTRIAL modelo que incluyó los datos de todos los ecosistemas.900* 0.04. DS = 0. 2).s. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. AGROINDUSTRIAL DISCUSIÓN ANALISIS DE LOS PAI . Los H. el estudio de los pigmentos degradados merece espe. Briceño algunas de las muestras presentaron valores de clorofila y nutrientes por encima del límite establecido mediante el análisis de los residuales. elevadas concentraciones de nutrientes y bajas concentraciones de oxígeno debido a la acumulación de materia orgánica (inferido a partir de la concentración de nutrientes y observaciones de campo). Llano Grande y la L. Los modelos de regresión mostraron una tendencia a tener coeficientes de correlación altos y desviaciones estándares bajas. Llano Grande y de la L. al igual que los carotenoides. En concordancia con estos resultados. 1989). la sobreestimación fue en promedio del 27%. y por esta razón solo es posible establecer que existe un factor asociado a la alta concentración de nutrientes que interfiere con el método.ponentes orgánicos e inorgánicos pueden ser también los causantes de interferir con el método espectrofotométrico. podrían interferir fuertemente con su determinación es- pectrofotométrica (APHA. por lo que la cuantificación por medio del método espectrofotométrico estuvo posiblemente sesgada en algunos casos.bidos y feofitinas son dos productos comunes de la degradación de la Cl. 1998). Briceño. El análisis de los modelos de regresión indicó que la tendencia de los resultados espectrofotométricos (independientemente de la sobreestimación) fue altamente coherente con los datos obtenidos por el método fluorométrico para el H. no se puede descartar el uso de este método debido a que en los sistemas que tuvieron baja concentración de nutrientes. el análisis de los residuales del modelo y los valores de nutrientes señaló que en el H.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING.a por el método espectrofotométrico ha sido ampliamente documentada en la literatura (Rowan. Los valores de sobreestimación por la aplicación de la fórmula tricromática presentaron diferentes amplitudes. Llano Grande. AGROINDUSTRIAL La sobreestimación de los valores de Cl. Sibe. Guatavita. especialmente en sistemas acuáticos con bajas concentraciones de nutrientes.a que.a fue más adecuada. Este valor es bajo si se compara con valores > 100% descritos por Sartory (1985). Guatavita la estimación de Cl. Siberia y Briceño presentaron una alta mineralización. Si bien otros com.ria. En H. como es el caso del H. Guatavita y el H. Estos pigmentos no fueron cuantificados en este trabajo. según la concentración de nutrientes del ecosistema. Aún así. Los feofor. En ambientes altamente enriquecidos y productivos como el de H.a. la L. la acumulación y descomposición de materia orgánica permite el aumento de algunos pigmentos que pueden interferir con la cuantificación de la Cl.cial atención ANALISIS DE LOS PAI . 24:1259.a. Water Pollution Control Federation (WPCF). BANDERAS A. Sin embargo. y que el método espectrofotométrico puede utilizarse con precaución en ecosistemas acuáticos con baja concentración de nutrientes. BIBLIOGRAFÍA APHA. 1998. este método es útil para describir patrones espaciales y temporales. Limnological Aspects of a HighMountain Lake in Mexico. BÜHRER H. GONZÁLEZ R. 1991. no obstante. 20a ed. Guatavita el método espectrofotométrico utilizado puede ser conveniente para describir los patrones verticales de distribución de la Cl. Estos resultados sugieren que para L. ante la dificultad de utilizar en forma rutinaria metodologías más exactas pero costosas.224:1-10. La pendiente de los modelos indica que en estos ecosistemas el método espectrofotométrico sobreestima la clorofila con respecto al método fluorométrico. Association (AWWA). AGROINDUSTRIAL en futuras investigaciones para establecer el papel de tales sustancias en las determinaciones de la Cl. New York. CONCLUSIONES Los coeficientes de correlación obtenidos demostraron que los dos métodos pre.a. American Waterworks. DETERMINACIÓN DE CLOROFILA A Y FEOPIGMENTOS RAMÓN VARELA INTRODUCCIÓN ANALISIS DE LOS PAI . Problems in Estimation of Pheophytine.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. a pesar de los valores más sesgados hallados en el hipolimnio. la inclusión de los datos del hipolimnio en el modelo incrementaron la DS debido a la mayor dispersión de los datos. LANZA G. Verh Internat Verein Limnol. Standard Methods for Examination of Water and Sewage and Wastewater. Hydrobiologia. American Public Health Association. 1991.sentan una tendencia semejante con el tipo de muestras analizadas. también se incrementó la correlación entre los dos métodos porque la amplitud en la estimación de la variable aumentó. Guatavita. El método espectrofotométrico puede utilizarse en sistemas acuáticos con baja concentración de nutrientes y con concentraciones de clorofila-a inferiores a 60 mg m-3. En el caso de la L. 2. interfieren en forma negativa con la clorofila a y positiva con los feopigmentos (Knap et al. clorofila c y/o divinil clorofila a en la muestra pueden acarrear error en la medición. Concentraciones elevadas de clorofila b.5 L).UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. y los cálculos se efectúan como se indican en Lorenzen (1966). El procedimiento sigue los lineamientos propuestos por Holm-Hansen et al. Este método se puede aplicar en todos los rangos de concentración de clorofila a que se encuentran en el mar. El límite de detección del método es de 0. AGROINDUSTRIAL La determinación de clorofila a se emplea para estimar la biomasa de los productores primarios (fitoplancton) que se encuentran como partículas en suspensión en el agua. FUNDAMENTOS DEL MÉTODO Una muestra de agua de mar se filtra a través de un filtro de fibra de vidrio sobre el cual se retienen las partículas en suspensión. La extracción de estos pigmentos de las células se efectúa usando metanol como disolvente. Esta interferencia es importante si son abundantes algas pertenecientes a la clase clorofíceas y/o proclorofitas. La presencia de clorofila b. Luego de aclarar el extracto por centrifugación se coloca en un fluorómetro donde los pigmentos de las algas se excitan con luz de longitud de onda azul. Entre las modificaciones se encuentran el uso de metanol en vez de acetona como un disolvente de extracción debido a su mayor eficiencia (Holm-Hansen y Riemann. Seguidamente. y el ultrasonido (sonificación) se usa para romper el filtro y las células. ADVERTENCIAS ANALÍTICAS 1. 1997). El límite de detección del equipo se sobrepasa cuando el nivel de los pigmentos en los extractos es muy alto. ANALISIS DE LOS PAI . emitiendo fluorescencia con longitud de onda roja. El fluorómetro siempre se mantiene en su máxima sensibilidad.. La fluorescencia se detecta por medio de un fotomultiplicador. Los resultados se expresan en µg L-1 ó mg m-3..01 µg L-1 para aguas naturales (muestra de 0. 1978) y el empleo de un sonificador (Wright et al. El procedimiento que se describe a continuación cuantifica la concentración de clorofila a y feopigmentos presentes en una muestra utilizando técnicas fluorométricas. Entre estas partículas se encuentran organismos del fitoplancton los cuales poseen pigmentos clorofílicos como clorofila a y feopigmentos. 1997). especialmente en la zona del máximo de clorofila. la muestra se acidifica para convertir toda la clorofila a en feopigmentos y se mide en el fluorómetro nuevamente. (1965). Embudos para filtros de 25 mm.7 µm. MATERIALES Filtros de fibra de vidrio (Whatman grado GF/F o su equivalente. 0. Espátulas pequeñas. Por lo tanto. ANALISIS DE LOS PAI . La alternativa más recomendable en aguas muy productivas con una concentración elevada de fitoplancton es filtrar un volumen menor de agua (250 mL o menos) de manera de evitar cortar el filtro o diluir la muestra. Para solventar este problema. 5.3%/°C. AGROINDUSTRIAL por lo tanto. Pipetas de 5 y 10 mL. Una alternativa no muy recomendable es diluir la muestra lo cual aumenta la incertidumbre del método. Si el filtro se encuentra saturado de material después de la filtración. existen varias alternativas. Guantes de vinilo. Pipetas automáticas monocanal con capacidad de 200 y 1000 µL.ñas y realizar el análisis por separado a cada fracción. La luz intensa puede degradar con rapidez la clorofila. El coeficiente de temperatura para la fluorescencia de la clorofila es 0. las mediciones tienden a subestimar concentraciones elevadas. Realizar todo el análisis en un ambiente con luz tenue. posiblemente por efecto de la extinción (“quenching”). otra opcion es cortar el filtro en fracciones más peque. 200 mL de capacidad. Unidad de filtración y bomba de vacío. 4. Celdas de 13-mm específicas para el fluorómetro.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. La fluorescencia depende de la temperatura. 3. realizar la calibración del equipo así como el análisis de muestras a una temperatura ambiental constante entre 20-25 °C. Tanto el material que se emplea en el análisis como el metanol deben permanecer libres de residuos de ácido. 25 mm). Tubos de centrífuga de polipropileno con tapa. de 15 mL. 0 . Para determinar la concentración precisa. 4.3900 r. con fotomultiplicador sensitivo al rojo (λ 185-870 nm). filtro azul (λ 340 – 500 nm CS 5-60) y filtro rojo (λ > 665 nm CS 2-64). Determinar la concentración de clorofila a en la solución aplicando la siguiente formula: ANALISIS DE LOS PAI .UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. 4. Centrífuga.p.48 N). AGROINDUSTRIAL EQUIPOS 1. La concentración de esta solución debe ser aproximadamente de 1 µg L-1. 0. Metanol (CH3 OH). Fisher Scientific modelo 100. Solución de trabajo para la calibración. 1 mg) libre de clorofila b. 2. 2. Los cristales de clorofila se disuelven muy lentamente. 3. 3. Una vez disuelta.m. Diluir 1 mL de la solución concentrada de clorofila a en 49 mL de metanol. realizar la dilución dos días antes de la calibración. REACTIVOS 1. Fluorómetro Turner Designs (10-AU-005). Disolver el contenido de una ampolla con cristales de clorofila a en 15 mL de metanol. medir la absorción a cada nanómetro entre 660 y 670 nm empleando un espectrofotómetro recién calibrado y ubicar la longitud de onda con absorción máxima (Amax). por lo tanto. Ácido clorhídrico (HCl. Unidad de filtración y bomba de vacío. Solución concentrada de clorofila a. lámpara F4T5/d. Sonificador.20 °C. mantener esta solución almacenada a . Se emplea una ampolla de solución estándar comercialmente disponible de clorofila a pura (Anacystis nidulans Sigma C-6144. Filtrar 250 mL por triplicado si la biomasa es > 1 mg m-3. 4.81 g-1 cm-1 (Jeffrey y Welschmeyer. El volumen a filtrar depende de la cantidad de clorofila presente en el agua. Filtrar la muestra inmediatamente a través de filtros de fibra de vidrio.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. Anotar el volumen filtrado. 2. 5. AGROINDUSTRIAL DONDE: Amax = absorción máxima (entre 660 . Al finalizar la filtración. 3. Congelar a . Para las aguas con biomasa baja (< 1 mg m-3) se filtran 500 mL por duplicado. 1997). El metanol debe estar libre de contaminantes o de algún otro elemento que pueda alterar los resultados del análisis.500 mm Hg para no romper las células.20 °C. ANALISIS DE LOS PAI . 10-cm. L = longitud de la celda en cm. lo cual se puede estimar a través del fluorómetro del CTD. sacar el filtro con una pinza plana y doblarlo por la mitad o enrollarlo con el lado que contiene las partículas hacia adentro. 79. CAPTACIÓN DE MUESTRAS 1. E = coeficiente de absorción específica de la clorofila en metanol. A750nm = absorbancia a 750 nm. Introducir el filtro en un tubo de centrífuga debidamente identificado. 1. Mantener el nivel de vacío de la bomba entre 400. Colocar 5 mL de metanol con una pipeta limpia en una celda del fluorómetro. Captar las muestras de agua en botellas oscuras de polietileno de 1 L lavando tres veces con la muestra antes de llenar. Realizar el análisis antes de un mes.670 nm). ANÁLISIS DEL BLANCO Antes de realizar el análisis de clorofila a es imprescindible evaluar el funcionamiento del fluorómetro así como la calidad analítica del metanol con un análisis del blanco. c. ANÁLISIS DE MUESTRAS Se recomienda comenzar el análisis a partir de las muestras con menor concentración y terminar con las que posean la mayor concentración (usualmente las superficiales). ANALISIS DE LOS PAI . Sonificación. lavar la punta del sonificador con metanol puro y secar. Es conveniente verificar la estabilidad del equipo antes del análisis utilizando un estándar sólido suministrado por el fabricante. Mantener en esta lectura por 30 segundos. Realizar una lectura en el fluorómetro. Verificar que todos los tubos contengan la misma cantidad del líquido y que el filtro quede totalmente sumergido. Colocar los tubos en una gradilla cubriéndolos con papel de aluminio para protegerlos de la luz. Prender el sonificador y aumentar gradualmente la potencia hasta la posición 15. a. b. Una lectura mayor de cero indica posible contaminación del reactivo o un equipo descalibrado. Introducir la punta del sonificador en el metanol sin tocar el fondo del tubo de centrífuga.ña espátula para homogenizar la muestra. e. f. AGROINDUSTRIAL 2. tapar el tubo de centrífuga y guardarlo protegido de la luz. Entre muestra y muestra. 3. NO SE DEBE realizar el análisis hasta calibrar el equipo o cambiar de reactivo. Romper el filtro dentro del tubo con una peque.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. apagar el equipo y retirar la punta del sonificador. 1. Realizar los duplicados en forma consecutiva. Preparación de las muestras antes del análisis. Agregar a cada tubo 10 mL de metanol puro sin formar burbujas. g. La sonda debe estar lo más perpendicular posible y no tocar las paredes del tubo. Sacar los tubos de centrífuga con los filtros del congelador y descongelar a temperatura ambiente a resguardo de la luz. Esto favorece la ruptura de las células del fitoplancton e incrementa la eficiencia de extracción del solvente. d. por lo tanto. Usar guantes en todo momento durante el análisis y atender las medidas de seguridad para el manejo del metanol. Este estándar se ajusta durante la calibración. protegiéndolos de la luz. 1 mg) libre de clorofila b. Entre muestra y muestra. Esperar tres minutos como mínimo para que se complete la reacción. b. realizar la lectura de la muestra acidificada. d. Esta lectura corresponde a la fluorescencia acidificada (Fa). Una deriva mayor de un ANALISIS DE LOS PAI .p.m. f. comercialmente disponible. AGROINDUSTRIAL h. Esta lectura corresponde a la fluorescencia inicial (Fo). y utilizar esta lectura para verificar la estabilidad del equipo en análisis sucesivos. Encender el fluorómetro una hora antes de comenzar el análisis para permitir que estabilice. Es recomendable agitar ligeramente los tubos tres o cuatro veces durante este periodo. Agregar 100 µL de HCl 0. y realizar la lectura una vez que el equipo estabilice (~ 8 s). c. 2. a. Colocar la celda en el fluorómetro previamente calibrado. Medición de clorofila a y feopigmentos con el fluorómetro. cada seis meses con un estándar. Una vez finalizada la calibración. siguiendo las instrucciones del fabricante. para clarificar el extracto. Colocar los tubos en una centrifugadora por 30 minutos a 3000 r. e. Colocar los tubos en una gradilla y almacenar a 4 °C (no congelar) por 24 horas para permitir que el metanol extraiga los pigmentos. g. medir el estándar sólido que suministra el fabricante. sin tocar las partículas del filtro ni producir turbulencia y transvasarlo a la celda del fluoró. Realizar cinco diluciones con la solución de trabajo de clorofila a para alcanzar concentraciones entre 0 y 130 µg L-1 con lo cual se puede calibrar el equipo para una escala de valores de 0 a 150 µg L-1. CALIBRACIÓN DEL FLUORÓMETRO El fluorómetro se calibra.48 N y agitar levemente. extraer cuidadosamente 5 mL de metanol de la mitad superior del líquido en el tubo. Con una pipeta. lavar la pipeta y las celdas del fluorómetro un mínimo de tres veces con metanol puro. Colocar la celda en el fluorómetro y esperar que el equipo estabilice. Transferir los tubos a una gradilla y ordenarlos por réplicas.metro.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. de clorofila a pura (Anacystis nidulans Sigma C-6144. AGROINDUSTRIAL 10% indica la necesidad de una nueva calibración. CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS La fórmula basada en Lorenzen (1966) empleada para el cálculo de la concentración de clorofila a y los feopigmentos en el agua de mar es: ANALISIS DE LOS PAI . Famax = fluorescencia acidificada máxima. Un incremento pequeño en el volumen produce valores de R anómalos. Para el metanol.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. el valor de R es más variable que cuando se emplea acetona.48 N. igual en la calibracion como para las muestras. R es la razón máxima de fluorescencia. R varía entre 2. antes y después de acidificar. Tomar las lecturas de varias diluciones (Fomax) y acidificar con 100 µL de HCl 0.4 y 2. Cuando se utiliza metanol. La cantidad de ácido añadido a la celda debe ser fijo. Las mismas diluciones se pueden emplear para determinar la razón de acidificación máxima (R) después de la calibración. DONDE: Fomax = lectura antes de la acidificación. calculada a partir del estándar de clorofila a pura usada para calibrar el fluorómetro. Medir las muestras nuevamente en el fluorómetro (Famax).7. Vm = volumen de muestra filtrada. EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS: PROTOCOLO 1: Extracción con acetona Extraer los pigmentos de cloroplastos de 0. disgregando el tejido vegetal en un mortero. Cuando la acetona está bien verde. con 5 ml de acetona al 80%. de modo que los pigmentos salgan al exterior y se disuelvan en acetona. AGROINDUSTRIAL Ve = volumen de metanol (10 mL). ANALISIS DE LOS PAI .UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING.5 g de hojas frescas de espinacas o de cualquier otro material verde. Después de centrifugar se obtiene un sobrenadante verde que contiene los pigmentos. Fa = lectura después de la acidificación. el macerado se introduce en un tubo de centrífuga de plástico y se centrífuga a 2000 rpm durante 10 minutos. Fo = lectura antes de la acidificación. Ajustar el volumen final a 6 ml con acetona al 80%. CUANTIFICACIÓN DE CLOROFILAS OBJETIVO Y DESARROLLO DE LA PRÁCTICA El objetivo de esta parte de la práctica es extraer los de pigmentos de cloroplastos de un material vegetal y determinar la cantidad de clorofila contenida en el mismo. Para calcular las clorofilas totales aplicaremos la siguiente fórmula: DETERMINACIÓN DE CLOROFILA EN FRUTOS DE CUATRO VARIEDADES DE CHILE (Capsicum sp) RESUMEN La importancia del chile (Capsicum sp.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING.). La mayor concentración de carotenoides totales y grupos carotenoides (R) y (A) se obtuvo en la muestra fresca de chile habanero después de una hora de extracción.) es por su amplia distribución. El objetivo del presente estudio fue cuantificar el contenido del color extractable. Es una fuente excelente de colorantes naturales. AGROINDUSTRIAL PROTOCOLO 2: Extracción con etanol Extraer los pigmentos de cloroplastos de 0.5 ml del sobrenadante de cada uno de los extractos y se diluye hasta 5 ml con acetona al 80% en la extracción con acetona (protocolo 1) y con etanol al 80% en la extracción con etanol (protocolo 2). vitaminas y minerales que representan una importante materia prima en la elaboración de alimentos y en la industria.5 g de hojas frescas de espinacas o de cualquier otro material verde cortando las hojas en segmentos de aproximadamente 0. Después se mide en un espectrofotómetro a longitudes de onda de 645 y 663 nm. Incubar durante 20 minutos en un baño a 80° para que las clorofilas salgan al exterior y se disuelvan en el etanol.5 cm que se introducen en un tubo de ensayo con 6 ml de etanol al 80% de modo que los segmentos queden bien sumergidos en el etanol. MEDIDA DE CLOROFILA: Se toman 0. El mayor contenido de clorofila total así como el de sus componentes y β se presentan en la muestra seca de chile chilaca después de 4h de extracción. y los diversos usos que se le da a los frutos. En la variedad ANALISIS DE LOS PAI . gran diversidad de tipos de chiles cultivados y silvestres. La determinación de carotenos y clorofilas se realizó por dos métodos de extracción y la determinación de color extractable por el método ASTA 20-1. y carotenoides de los grupos rojos (R) y amarillonaranja (A) en cuatro variedades de chile (Capsicum sp. y β. clorofila total. Al cabo de este tiempo los segmentos deberán quedar totalmente decolorados y el etanol queda de color verde. estado de madurez y condiciones de crecimiento. 1998). con excepción de algunas gomas de mascar y pastillas. la importancia económica del chile (Capsicum sp. AGROINDUSTRIAL habanero en muestra fresca se presentó el mayor contenido de unidades ASTA y en las muestras secas el mayor contenido de estas se obtuvo en la variedad de chile chilaca. Dentro de este grupo de compuestos se encuentran los ácidos fenólicos. iluminación y tiempo de secado para almacenar ANALISIS DE LOS PAI .. el interés por clorofilas se centra en las reacciones poscocecha que degradan a estos pigmentos. capsorubina contribuyendo a la coloración roja del fruto (Philip et al. incluso los que ocurren durante el procesamiento y almacenamiento. Existen varias clorofilas reportadas. posee acción antioxidante. zeaxantina. 2000). de los cuales se sabe que reducen el riesgo de contraer cáncer. El interés por este cultivo se ha incrementado por la presencia de otros compuestos. Las clorofilas se emplean poco como aditivos alimentarios. La clorofila ayuda a la fijación del hierro en casos de anemia. En estados Unidos se emplean como aditivos a través del uso de jugos de vegetales. nutre y fortalece el sistema circulatorio e intestinal. Desde el punto de vista de la tecnología de los alimentos. aflatoxinas. oleorresinas y como especias en colorantes alimenticios. Además. la clorofila y la clorofilina poseen actividad antimutagénica y anticarcinogénica. es decir están formados por unidades de isopreno y su biosíntesis se produce a partir de isopentil pirofosfato. la temperatura. 1999).criptoxantina son responsables del color amarillo-naranja. problemas cardiovasculares y otras enfermedades crónico degenerativas (Dillard y German. tales como la reducción de algún tipo de tumores en animales de laboratorio. 1971). pertenecen a la familia de los terpenos. capsantina.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. tiene actividad desintoxicante contra metales pesados. De acuerdo con Almeda et al. 1995. como ceto-carotenoides. Paralelamente se reconoce que la clorofila tiene efectos sobre la salud. Los pigmentos y precursores de color de frutas y hortalizas desde el punto de vista químico. acción deodorizante (ayuda a neutralizar el olor corporal) (Breinholt et al. Los frutos de Capsicum se han utilizado en forma de concentrados. INTRODUCCIÓN En México. conocidos como fitoquímicos. las clorofilas y β están presentes en el tejido fotosintético en una relación 3:1.) es evidente por su amplia distribución y los diversos usos que se da a los frutos. (1991). que tienen un efecto benéfico sobre la salud humana (GuzmánMaldonado y Paredes-López. luteína y β. Los frutos presentan carotenoides. junto con sales cúpricas. el contenido total de carotenoides en el fruto varia de acuerdo al tipo de cultivar. Chermonosky et al. mientras que β-caroteno. superando el valor mínimo exigido por la Federal Specification que es de 120 unidades. chilaca y jalapeño) y se refrigeraron a 5ºC por 24 horas. Por lo que el objetivo del presente estudio fue cuantificar el contenido del color extractable. 1996).58 mg. reportaron valores de 150 y 214 unidades ASTA en carotenoides de pimentón (Capsicum annuum) var. Posteriormente. se desvenaron y se eliminó la semilla.). (2003).kg-1 de peso fresco. METODOLOGIA: Material biológico y procesamiento de muestras Se obtuvieron 200 g de frutos frescos de chile de cada una de las variedades (serrano. clorofila y β. Hornero-Méndez et al. AGROINDUSTRIAL y/o elaborar subproductos pueden generar incrementos o decrementos en la concentración de los carotenoides (Gómez-Ladron y Pardo-González. trompa de elefante. reportando 12607. ANALISIS DE LOS PAI . Los procesos de secado. Por otra parte Arjona et al.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. carotenos y clorofilas Las muestras frescas y secas de cada una de las variedades fueron sometidas a dos métodos de extracción: MÉTODO DE EXTRACCIÓN 1. los frutos se desinfectaron con cloro 10% v/v y se enjuagaron con agua destilada. Una vez eliminadas las semillas se dividieron las muestras en partes iguales. fabricación y extracción de pigmentos deben estar eventualmente resueltos para evitar pérdidas de color y conservar en forma más natural estos pigmentos (Minguez-Mosquera et al. Determinación de color extractable. una de las cuales se refrigeró hasta su posterior uso (muestra fresca) y la otra se colocó en papel aluminio para efectuar el secado de las muestras el cual se realizó en un horno eléctrico durante tres días a 60oC. El conocer el contenido de pigmentos en frutos frescos y secos. determinó el contenido de carotenoides en el chile pimiento cv.. (2002). MA1. es de gran importancia ya que debido a los efectos antitumorales que se le atribuyen a los pigmentos podrá recomendarse su consumo.. habanero. y carotenoides rojos (R) y amarillo- naranja (A) en cuatro variedades de chile (Capsicum sp. 1994). además observaron que la materia prima influye en el contenido total de carotenoides. 5g de cada muestra (fresca y seca) por variedad en seis repeticiones. 1972. Haspel-Horvatovic y Horickova. 648nm-663nm para clorofila (Godwing. Britton. el polvo así obtenido se transfirió a un vaso de precipitado de 200mL y se adicionaron 400mL de acetona y se mantuvieron en reposo durante 1h. demostrándose una amplia variabilidad. que existen diferencias altamente significativas (P<0.01) entre variedades y entre tratamientos. MÉTODO DE EXTRACCIÓN 2. Éste se determinó solamente de las muestras procesadas por el método1. posteriormente se filtró dos veces en papel Whatman No. 4 y se aforó a 100mL con acetona. En cuanto a la clorofila el más alto contenido de este pigmento se presento en las muestras secas de los frutos de la variedad chilaca independientemente del ANALISIS DE LOS PAI . AGROINDUSTRIAL Se colocaron 0.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. Los resultados obtenidos fueron analizados mediante un Análisis de Varianza para detectar diferencias significativas entre las variedades. se agregaron 50mL de acetona y se agitaron durante 4 h. y mediante comparación múltiple de medias (Tukey).5g de cada una de las muestras y se molieron en mortero evitando la incidencia de luz. 450nm-508nm para carotenos amarillos y rojos respectivamente (Fekete et al. 4. RESULTADOS Y DISCUSION En relación al contenido de pigmentos en frutos de cuatro variedades de chile (Capsicum annuum L. a la muestra se le adicionaron otros 50mL de acetona y se agitaron nuevamente (estos pasos podrán repetirse hasta obtener la decoloración total de la muestra). así como en la interacción de las diferentes fuentes de variación. A partir de las soluciones obtenidas mediante los métodos de extracción 1 y 2. 1976. se tomaron 5mL de cada una de las muestras y se realizaron lecturas de absorbancia en el espectrofotómetro a diferentes longitudes de onda. 480nm-750nm para carotenos totales (Strickland & Parsons. 1976).) se encontró con base en el Análisis de Varianza. 1985). 1986) para lo cual se tomaron 5mL de la solución final y se determinó por seis repeticiones la absorbancia a 460nm en un espectrofotómetro (Spectrphotometer BioMate TM 3). se filtró dos veces con papel Whatman No.. El volumen total de acetona fue de 100mL. 1976). Se tomaron 0. se colocaron en vasos de precipitado de 100mL. La determinación de color extractable se realizó por el método ASTA 20-1 (Anónimo. De manera general se observa un drástico decremento en este pigmento cuando los frutos fueron deshidratados a 60oC durante 72h (Figura 2). esta misma tendencia se observa para la muestra seca de chile serrano dando 2.92g/L cuando el tiempo de extracción fue de 4h.25g/L cuando el tiempo de extracción en acetona fue de 1h. Este comportamiento se observó también en la muestras de las variedades de chilaca y jalapeño. En cuanto a los resultados obtenidos de clorofila y β se reporta que para ambos métodos la muestra de chile chilaca (tanto muestra fresca. cuyo contenido se incrementó a 116. AGROINDUSTRIAL tiempo de extracción. Para el color extractable. alcanzado valores de hasta 8. como seca) presentan valores relativamente altos comparados con los demás variedades evaluadas.3mg/g (Figura 1). Respecto al contenido de carotenoides totales en las muestras de las cuatro variedades se encontró que la mayor concentración se presenta en las muestras frescas de los frutos de habanero registrándose 93.34mg/g de muestra. mientras que la muestra seca de chile chilaca da como reportado 22.49 unidades ASTA. Por otra parte en las muestras secas de chile habanero se registraron los valores mas bajo con 0. El contenido de grupos carotenoides reporta que para ambos grupos (A y R) las muestras frescas de chile habanero del método de extracción 2 (1h) registran una mayor cantidad de grupos carotenoides en relación a las demás variedades estudiadas (Tabla 1).05 unidades ASTA para muestra fresca de chile habanero.65 unidades ASTA por encima de su contraparte fresca. ANALISIS DE LOS PAI . se reporta un alto índice de 35.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. en cambio por parte de la muestra seca el mayor contenido de unidades ASTA lo obtuvieron la variedad de chile chilaca (uso del método de extracción 1. AGROINDUSTRIAL CONCLUSIONES El mayor contenido de clorofila total así como el de sus componentes y β se presentan en la muestra seca de chile chilaca del primer método (4h). La variedad chile habanero en muestra fresca presentó el mayor contenido de unidades ASTA. ANALISIS DE LOS PAI . 4h). El contenido de carotenoides totales y grupos carotenoides se obtuvo la mayor cantidad de la variedad chile habanero muestra fresca del segundo método de extracción (1h).UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ING. FEKETE. T. IRIARTE A. Inc. J. SEGELMAN. DASHWOOD. 1985. GODWING. BREINHOLT. ASTA. BAILEY. ARJONA.E.. R.H. 2003.. Academic Press Inc. R.. 2003. Ed: J. 19:313-322. Universidad Nacional de Catamarca. Academic Press inc. 80:1744-1756. Lancaster. M.). T. 293. 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