UNIVERSIDAD NACIONALAGRARIA LA MOLINA PRÁCTICA N°11 “DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ASCÓRBICO POR TITULACIÓN VISUAL CON 2,6-DICLOROFENOLINDOFENOL” CURSO Análisis de Alimentos PROFESOR Aguilar Gálvez, Ana INTEGRANTES González Zúñiga Sánchez, Gianfranco 20150440 Limo Escobar, Claudia Andrea 20150444 Niquén Curo, Jorge Alberto 20150447 Olivero Atoche, Fabiana Elisa 20150410 HORARIO DE CLASES Martes de 11:00-1:00 p.m. 2017-II 1 I. INTRODUCCIÓN La vitamina C es un compuesto hidrosoluble de 6 átomos de carbono relacionado con la glucosa. Su papel biológico principal parece ser el de actuar como cofactor en diversas reacciones enzimáticas que tienen lugar en el organismo. Se encuentra principalmente en alimentos de origen vegetal y puede presentarse en dos formas químicas interconvertibles: ácido ascórbico (forma reducida) y ácido dehidroascórbico (forma oxidada), siendo ambas formas funcionales biológicamente y manteniéndose en equilibrio fisiológico (Ciancaglini, 2001). Según Harris (2001) la vitamina C es un compuesto inestable, debido a la facilidad con la que se oxida e hidrata. Se destruyen con facilidad en el procesamiento y conservación de los alimentos, por lo que es utilizada como indicador de la pérdida vitamínica de un alimento durante su procesamiento y almacenamiento. Por otra parte, el calor y los cationes metálicos (cuidado al cocinar en recipientes de cobre) destruyen la vitamina C. Alimentos como los cítricos, kiwi, fresones, brócoli, lechuga, entre otros, son fuente natural de vitamina C, y su contenido depende de la especie, área geográfica en las que son cultivados, las condiciones de almacenamiento una vez recogidos y del estado de maduración (generalmente aumenta con la maduración). El método oficial de análisis para la determinación de la vitamina C en los zumos es método volumétrico del 2,6-dicloroindofenol, (Método 967.21 de la AOAC, asociación de los químicos analíticos oficiales). Aunque este método no es oficial para otros tipos de productos alimentarios, se usa a veces como un ensayo de control de calidad rápido para una variedad de productos alimentarios, en lugar del método microfluorométrico (Método 984.26 de la AOAC), más costo en tiempo. El objetivo de la presente práctica fue determinar el contenido de ácido ascórbico de varios productos (limón, naranja, aguaymanto y kiwi) mediante un método volumétrico, utilizando el reactivo 2,6-diclorofenolindofenol. II. REVISIÓN DE LITERATURA 2 Vitamina C (ácido ascórbico) La vitamina C, o ácido ascórbico, es una vitamina hidrosoluble. La CDR y la IDR de la vitamina C son 60 µg/día para un adulto. En los niños la cantidad recomendada es algo menor. Las mejores fuentes de vitamina C son las frutas y las verduras, en especial los cítricos y las hojas de las verduras. Fuentes excelentes de esta vitamina son las naranjas, los pomelos, el brócoli y las verduras para ensalada. Otras buenas fuentes son los pimientos verdes, las patatas, las fresas y los tomates. Una sola naranja contiene la CDR. La leche, la carne y los cereales tienen un bajo contenido de vitamina C (Melvin, 2002). Aunque la vitamina C no participa directamente en las conversiones catalizadas por enzimas en las que su sustrato se transforma en producto, se cree que modifica los iones minerales de las enzimas y los hace activos. La vitamina C desempeña muchas funciones distintas en el organismo, algunas de ellas de vital importancia para el individuo activo. Su función principal consiste en sintetizar el colágeno necesario para la formación y el mantenimiento del tejido conjuntivo del organismo, como por ejemplo los cartílagos, los tendones y los huesos. La vitamina C participa también en la formación de determinadas hormonas y neurotransmisores como la adrenalina, que son secretados durante situaciones estresantes, como el ejercicio. Colabora también en la absorción de algunas formas de hierro en el tracto intestinal –hace que la absorción sea de dos a cuatro veces más rápida- y está implicada en la síntesis de los GR. La vitamina C ayuda a regular el metabolismo del ácido fólico, el colesterol y los aminoácidos. Es también esencial para la cicatrización de las heridas porque favorece la formación de tejido cicatrizal. Por último, la vitamina C es un potente antioxidante (Melvin, 2002). Ácido ascórbico - Importancia El ácido ascórbico y sus derivados son muy utilizados. Son muy solubles en agua, excepto el palmitato de ascorbilo, que es más soluble en grasas. La limitación en su uso está basada más en evitar el enmascaramiento de una mala manipulación que en razones de seguridad. En España, el E-304 está autorizado en aceites de semillas. El ácido ascórbico y sus derivados se utilizan en productos cárnicos y conservas vegetales y en bebidas refrescantes, zumos, productos de repostería y en la cerveza, en la que se utiliza el ácido ascórbico para eliminar el oxígeno del espacio de cabeza. El ácido ascórbico contribuye a evitar el oscurecimiento de la fruta cortada en trozos y a evitar la corrosión en los envases metálicos. También se utiliza el ácido ascórbico en panadería, no como antioxidante sino como auxiliar tecnológico, para mejorar el comportamiento de la masa. Su adición a mostos y vinos permite reducir el uso de sulfitos (Astiasarán et al., 2003). Oxidación de la Vitamina C con 2,6-diclorofenolindofenol En los procesos de degradación de vitamina C en alimentos procesados, los estudios reportados indican que los productos finales son ácidos de furfural y pigmentos oscuros formados con aminoácidos (Ocampo et al., 2008). La oxidación de la vitamina C con el agente oxidante 2,6-diclorofenolindofenol (2,6-DFI) es uno de los procedimientos empleados para cuantificarla a nivel de laboratorio. El 2,6-DFI es azul en su forma oxidada e incolora cuando se reduce (Ocampo et al., 2008). 3 FIGURA 1. Reacción de oxidación-reducción entre el 2,6-diclorofenolindofenol y la vitamina C. Fuente: Ocampo et al. (2008) El ácido ascórbico es oxidado por el colorante 2,6-diclorofenolindofenol a ácido deshidro-L- ascórbico. Al mismo tiempo, el colorante se reduce a un compuesto incoloro permitiendo determinar el punto final de la reacción (Ocampo et al., 2008). Esta metodología no sirve para cuantificar al ácido deshidro-L-ascórbico, pero éste se puede reducir al ácido ascórbico con un agente reductor y recuperar su actividad vitamínica. Métodos para la determinación de la vitamina C. A la vitamina C se le ha realizado estudios con los siguientes métodos de determinación utilizados como un parámetro de calidad para comprobar su concentración y la aceptabilidad del control de calidad. Los métodos de determinación analizados por Gutiérrez et al. (2007) son los siguientes: - Método volumétrico Se utiliza 0,5 g (sólido) de muestra homogeneizada en 50 ml de ácido meta fosfórico al 1%, esta solución se centrifuga durante 5 minutos a 3000 rpm, y el sobrenadante resultante se utiliza para la titulación, se adiciona una solución de 2ml de indicador DCFI (2,6-diclorofenolindofenol) y 18 ml de agua destilada. El punto final de la titulación se define en el momento en la que la solución titulada presentó una coloración idéntica a la solución titulante, reservándose un período de 15 segundos para la confirmación del punto de viraje. - Método de Espectrofotometría UV visible En el método de Espectrofotometría UV visible hace la validación del método considerando linealidad, límite de detección, precisión y exactitud que permita obtener resultados confiables; 4 se debe ejecutar un tiempo determinado de homogenización de las muestras, eliminando el aire con la ayuda del nitrógeno, continuando con la homogenización por un tiempo de 5 minutos adicionales, se debe realizar ajustes de pH de ser necesario con diferentes reactivos considerando el tipo de analito de estudio, la longitud de onda puede variar desde 405 hasta 578 nm con una temperatura de 37°C. - El Método de HPLC En el método de HPLC se realiza la validación del método considerando rango de linealidad, precisiones, repetibilidad, reproductibilidad, sensibilidad y exactitud que permita obtener resultados veraces y confiables, minimizando oxidación y degradación del ácido ascórbico. En la preparación de la muestra, se pesa 10 mg de analito a estudiar y se diluye en µL de ácido metafosfórico 4.5%. Para los estándares se prepara considerando la solución stock (2mg de ácido ascórbico y se diluye en 100 µL de ácido meta fosfórico 4.5%). Se usa HPLC Modelo Agilent Technologies 1200 series, con bomba cuaternaria y detector de absorbancia fase reserva 5 µm columna LiChrocart RP 18 (4.0 x 250 mm) con detector de absorbancia UV-visible. Como fase móvil se utiliza 600 ml de agua nanopura acidulada con ácido sulfúrico concentrado hasta alcanzar un pH 2.2. La razón de flujo de la fase móvil es de 0.5 ml/min, la longitud de detección es de 245 nm, la presión en torno de 800 psi con presión máxima monitoreada de 1500 psi. - Limón El árbol limonero se cultiva en zonas mediterráneas y cuyo nombre científico es Citrus limonum Risso. Es destacable cómo en los cultivos mediterráneos se encuentran una gran cantidad de alimentos muy saludables que desde luego hay que tener en cuenta si se quiere seguir una dieta sana. El limón contiene muchas sustancias muy beneficiosas. La más conocida de todas ellas es la vitamina C, en cantidades importantes, pero no es la única componente beneficiosa del limón, sino que posee además potasio y cloro en cantidades considerables, ácido cítrico, ácido cafeico y cafeína, aunque únicamente en las hojas. También tiene otros muchos principios activos, como la limotricina, aceites esenciales ricos en isopulegol, betabisolobeno, alfapineno, alfaterpineno, betabergamoteno, limoneno, etc. Todas estas sustancias de distinta naturaleza hacen que el limón posea muchas propiedades medicinales (Mejías y Aflallo, 2007). Por su contenido en vitamina C se puede decir que es un alimento antioxidante, además de aumentar la actividad del sistema inmunológico, ayudando por tanto a prevenir muchas infecciones. La carencia de vitamina C produce una enfermedad llamada escorbuto que, afortunadamente, cada vez es más rara, pero que todavía aparece de forma epidémica en situaciones de hambrunas, campos de refugiados, etc. El escorbuto afecta a muchos tejidos (uñas, piel, mucosas) para los que la vitamina C es imprescindible para su desarrollo (Mejías y Aflallo, 2007). - Aguaymanto El aguaymanto es una fruta típica de los Andes Suramericanos, pertenece a la familia de las solanáceas y el género Physalis; cuenta con más de ochenta variedades que se encuentran en 5 estado silvestre. Es originaria del Perú y existen diversas referencias históricas que indican que fue domesticado, cultivado y muy apreciado por los antiguos peruanos. La Physalis peruviana posee diferentes nombres comunes, dependiendo de la región: capulí, aguaymanto, awaymanto, bolsa de amor, cereza del Perú, uchuva, etc. El fruto es una baya carnosa, jugosa, 1 en forma de globo con un diámetro entre 1,25 - 2,5 cm y contiene numerosas semillas. (Gutiérrez et al., 2007). Herrera (2000) encontró entre 13 y 15º Brix y un buen contenido de ácidos (1,6 a 2,0% de acidez). Además, el fruto se destaca por su alto contenido de antioxidantes, ácidos grasos poliinsaturados y fitoesteroles (Puente et al., 2011). El aguaymanto (Physalis peruviana) contiene entre otros nutrientes compuestos bioactivos como el ácido ascórbico, β-caroteno (provitamina A) compuestos fenólicos, entre otras vitaminas que podría proporcionar un efecto fisiológico beneficioso en la salud, en el funcionamiento del organismo o en el bienestar, mayor que el proporcionado por los nutrientes sencillos que contiene, dado que se conoce que existe un efecto sinérgico entre los compuestos que presenta un alimento con estas características. (Muñoz, 2003). El fruto que necesita entre 60 y 80 días para madurar, tiene extraordinarias propiedades nutricionales y medicinales y su exquisito sabor y aroma atraen los consumidores favoreciendo la conquista de nuevos mercados (Galvis et al., 2005), especialmente su alto contenido de provitamina A (1.000-5.000 U.I., principalmente beta-caroteno) y ácido ascórbico (11-42 mg/100 g peso fresco [PF]). (Fischer et al., 2014). - Kiwi Es el fruto de la actinidia, planta trepadora de la familia de las actinidiáceas. El kiwi es una baya con forma de elipse y cubierta de una piel repleta de vellosidades. Su piel es de color marrón oscuro, y encierra una pulpa verde y jugosa, de sabor ácido muy agradable (Cotter et al., 1991). Según Moreiras et al. (1996) el kiwi se caracteriza por un alto contenido en ácido ascórbico, dos frutos de tamaño medio aportan cerca del 250% de la cantidad diaria recomendada de esta vitamina. Es el fruto más rico en vitamina C que se conoce (59-300 mg por 100 fruta, es decir diez veces más que el limón), lo que supone que tenga un elevado valor dietético por potenciar las defensas del organismo contra las enfermedades más corrientes del periodo invernal como resfriados y gripes. Además del ácido ascórbico, están presentes otras vitaminas y minerales en este alimento, aunque en proporciones muy inferiores. Es posible que los supuestos efectos beneficiosos para la salud de este alimento estén relacionados con sus propiedades antioxidantes. 6 III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Materiales En la Figura 1, se presentan los materiales que fueron usados en la práctica. Aguaymanto Kiwi Naranja Limón Buchner y Kitasato Microbureta x 5mL Erlenmeyer Pipetas Ácido ascórbico Solución de 2,6- Beaker Diclorofenollindofenol FIGURA 2. Materiales y reactivos utilizados la práctica. 7 3.2 Métodos 3.2.1. Análisis del estándar de trabajo Tomar 1 mL de la solución del estándar y colocarla en un erlenmeyer de 50 mL. Agregar 30mL de solución de ácido oxálico al 0.5% y titular con la solucion 2,6-diclorofenolindofenol. El final de la titulación de la titulación será indicada por un cambio de color rosado débil. Cálculo de equivalente en ácido ascórbico por mL de solución 2,6- diclorofenolindofenol (T): T = X / Y. FIGURA 3. Procedimiento para el análisis del estándar de trabajo 3.2.2. Análisis de la muestra Colocar 5mL/100mL de ácido oxálico de las muestras líquidas o 10g/100mL de ácido oxálico de las muestras sólidas previamente molidas o licuadas. La muestra puede ser centrifugada o filtrada. Poner la muestra filtrada en un erlenmeyer. Pipetear 30mL en un erlenmeyer de 50mL y titular rápidamente hasta obtener un color rosado débil, con la solución de 2,6- diclorofenolindofenol. Calcular el contenido de ácido ascórbico. FIGURA 4. Procedimiento para el análisis de la muestra 8 IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES 4.1 Resultados En el siguiente cuadro se muestra el contenido de ácido ascórbico (mg/100g de Muestra), así como la desviación estándar y el coeficiente de variación para cada muestra trabajada. Cuadro 1. Contenido de ácido ascórbico mgAA/100g Muestra Muestras mg AA/100g mgAA/100g Desviación Coeficiente de REP 1 REP 2 Promedio Estándar Variación Aguaymanto 19.50 20.26 19.88 0.53 2.69 Limón 15.98 14.89 15.43 0.77 4.98 Naranja 23.15 23.04 23.09 0.08 0.33 Kiwi 43.13 42.58 42.85 0.38 0.90 - Nota: Para el cálculo del contenido de ácido ascórbico de las muestras liquidas se consideró que la densidad tanto del limón como la naranja fue igual a la del agua. 4.2 Discusiones 4.2.1 Limón 4.2.2 Naranja 4.2.3 Aguaymanto Según los resultados en la práctica, el contenido promedio de ácido ascórbico del aguaymanto analizado es de 19.88 (mg/100 g de muestra fresca). Según la literatura, este resultado se encuentra dentro del rango reportado por varios autores; así tenemos que es un valor bastante cercano al reportado por Tapia (2000), para el cual el contenido promedio de ácido ascórbico obtenido en su estudio sobre cultivos andinos del Perú, fue de 20 mg/100g. Mientras que por otro lado Encina et al. (2012), determinó los compuestos bioactivos en el aguaymanto, correspondientes a un estado de madurez 2 y 3 (Según la norma técnica Colombiana 4580, en la cual se indica una clasificación objetiva relacionando el contenido de grados brix y la acidez en la materia prima) un valor promedio mayor de ácido ascórbico de (28,55 mg/100 g de fruto). De acuerdo con la ICMSF (2000), los niveles de ácido ascórbico en los frutos son variables tendiendo a disminuir estacionalmente. Estos valores pueden diferir por varios factores, entre ellos: suelo, clima, labores culturales, variedad, estado de madurez, etc. Muñoz (2003), menciona que la madurez influye directamente en el contenido de compuestos bioactivos, dado que se generan durante la madurez procesos de biosíntesis los que generan mayor contenido de carotenoides, compuestos fenólicos, ácido ascórbico, etc.; compuestos bioactivos que al encontrarse en mayor cantidad en el fruto conllevan a dar una mayor capacidad antioxidante al fruto; llegando hasta un contenido de compuestos bioactivos en el aguaymanto fue para un estado de “madurez seis” con un 51,65 mg ácido ascórbico/100 g muestra. 9 Por otra parte, la diferencia del resultado obtenido con respecto a la literatura puede deberse también a que el ácido ascórbico es muy sensible a diversas formas de degradación y a los métodos empleados para su cuantificación. Entre los numerosos factores que pueden influir en los mecanismos degradativos cabe citar la temperatura, la concentración de sal, el pH, el oxígeno, las enzimas, los catalizadores metálicos, la concentración inicial del ácido y la relación ácido ascórbico y ácido dehidroascórbico (Luximon et al., 2003). 4.2.4 Kiwi El contenido promedio de ácido ascórbico de los kiwis analizados es de 42.85 (mg/100 g de muestra fresca). Esta concentración es comparada con los valores encontrados por otros autores. Según Cotter et al. (1991) la concentración inicial de ácido ascórbico en kiwis de la variedad Hayward es de 98,5 mg/100 g de muestra fresca, valor que disminuye cerca del 22,0% en frutos almacenados durante 8 semanas a temperatura de 0ºC. Rinallo y Mori (2000) indican un contenido inicial de 93,56 mg/100 g de muestra fresca que se reduce cerca del 11,5% a lo largo de un periodo de almacenamiento de 5 meses a temperatura de 3ºC y humedad relativa del 90%. Van Gorsel et al. (1992) indican una concentración de ácido ascórbico de 110 ± 6 mg/100 mL de zumo, Serra et al. (1997) indican una concentración de 71,0 mg/100 g de muestra fresca y Nishiyama et al. (2000) de 65,5 mg/100 g de muestra fresca para la variedad Hayward. Para Gökmen et al. (2000) el contenido es de 40,7 mg/100 g de muestra fresca. Según Bunkova et al. (2005), el valor medio es de 71,20 mg/100 g de muestra fresca. Lo Voi et al. (1992) presentan un rango de 370,0 a 1965,0 mg/100 g de muestra fresca para otras variedades de kiwi (Abbot, Bruno, Elmwood, Gracie y Monty). Según Kvesitadze et al. (2001) y Carvalho y Lima (2002), el contenido de vitamina C difiere significativamente en el kiwi pudiendo variar de 7,27 a 550 (mg/100 g de muestra fresca) en variedades como Cardinal, Bruno, Monti, Colomicta, Purpuria y Gaivard o de 30 a 110 (mg/100 g de muestra fresca), en la variedad Hayward dependiendo del cultivar, estadio de madurez, condiciones de cultivo, época del año, etc. Leong y Shui (2002) indican una concentración de 52,8 mg/100 g de muestra fresca y que ese contenido contribuye con un 38,7% a la capacidad antioxidante total del fruto, lo que les lleva a incluir el kiwi en la categoría de frutos de mediana actividad antioxidante. Según Guo et al. (2003), el ácido ascórbico contribuye en un 62% a la capacidad antioxidante del kiwi. Para Ferguson et al. (2004) el kiwi presenta alto contenido de vitaminas antioxidantes e indica que el consumo regular de kiwi ayuda en la síntesis del DNA. Según González-Rodríguez (1991) no se producen pérdidas importantes en el contenido del ácido ascórbico durante 5 – 6 meses de almacenamiento en cámara fría. Sin embargo, como se ha comentado previamente, autores como Cotter et al. (1991) y Rinallo y Mori (2000) encuentran pérdidas de este compuesto a lo largo del tiempo de almacenamiento a temperaturas de refrigeración. 10 V. CONCLUSIONES El contenido de ácido ascórbico del limón, naranja, aguaymanto y kiwi determinado por la titulación con el reactivo 2,6-diclorofenolindofenol fueron 15.43, 23.09, 19.88 y 42.85 (mgAA/100g) respectivamente. VI. BIBLIOGRAFIA - A.O.A.C. 1975. Methods of Analysis of Official Analytical Chemist, Ed. 12. Washington. - Astiasarán, I; Lasheras, B; Ariño, A y Martinez, J. 2003. Alimentos y nutrición en la práctica sanitaria. Ediciones Díaz de Santos. Madrid-España. - Bernal, J. 1986 Ciencia y Agricultura: "Generalidades sobre el cultivo de la Uchuva". Facultad de Ciencias Agropecuarias UPTC - TUNJA. 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