HOSPITAL NACIONAL DOCENTE MADRE NIÑO SAN BARTOLOME SERVICIO DE MICROBIOLOGIADetección fenotípica de mecanismos de resistencia en gramnegativos Lic. T:M Juan Carlos Riveros Quintana Introducción • El Laboratorio de microbiología tiene la responsabilidad de proporcionar al clínico los resultados de susceptibilidad confiables y oportunos, lo cual le permitirá optimizar la terapia antimicrobiana . • La información generada a partir de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos es fundamental para la vigilancia de los perfiles de sensibilidad y la detección de nuevos patrones de resistencia por el laboratorio. PROBLEMAS ACTUALES EN ENTEROBACTERIAS y BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES • β- lactamasas de espectro extendido: - Diseminación mundial en el ambiente hospitalario - Diseminación mundial de clones CTX-M - Emergencia en la comunidad • Amp-C plasmídica • Resistencia a carbapenemes: EB - BNF • Resistencia plasmídica a quinolonas por diferentes mecanismos • Alta co-resistencia a cefalosporinas y quinolonas 1. Baumannii: aumento mundial de aislamientos multi-R Historia La primera evidencia de la presencia de estas enzimas fue Escherichia coli se remonta a los años 60 cuando se describió la betalactamasa TEM-1. A partir de esa fecha y sobre todo durante los años 70-80, se desarrollaron un gran número de antibióticos betalactámicos resistentes a la acción de estas enzimas. . Desde su descripción inicial, se han identificado más de 300 BLEE diferentes, y la mayoría pertenecen a las familias TEM, SHV y CTX-M, Asimismo, aparecieron en el arsenal terapéutico los inhibidores de betalactamasas como el ácido clavulánico, el tazobactam y el sulbactam que permitían recuperar la actividad de las penicilinas. Bacteria Gram Negativa Bicapa Fosfolipídica con Prteínas incrustadas Permeabilidad selectiva y Transporte de Solutos Excreción de Exoenzimas Hidrolíticas y Proteínas de Patogenicidad Bacteria Gram positivo Determina forma celular Protege de presión osmótica Permite clasificación bacteriana Participa en patogenicidad Importante Antígeno de superficie Es blanco de antibióticos Contiene peptidoglicano Mecanismos de Resistencia Bacteriana 1. Modificación enzimática del antibiótico. 2. Bombas de expulsión. 3. Cambios de permeabilidad de la membrana externa. 4. Alteraciones del sitio de acción. β- lactamasas MECANISMO POR LO QUE SE TRANSFIEREN GENES DE RESISTENCIA TRANSFORMACION Intercambio genético producido cuando una bacteria es capaz de captar fragmentos de ADN, de otra bacteria que se encuentran dispersos en el medio donde vive. CONJUGACIÓN Una bacteria donadora F+ transmite a través de un puente o pili, un fragmento de ADN, a otra bacteria receptora F-. La bacteria que se llama F+ posee un plásmido, además del cromosoma bacteriano. • TRANSDUCCIÓN la transferencia de ADN de una bacteria a otra , se realiza a través de un virus bacteriófago, que se comporta como un vector intermediario entre las dos bacterias. • TRANSDUCCIÓN la transferencia de ADN de una bacteria a otra , se realiza a través de un virus bacteriófago, que se comporta como un vector intermediario entre las dos bacterias. PLASMIDOS DNA Extracromosómicos Moléculas de DNA de doble cadena Circular. Autoreplicativo , No vital En E coli, se han aislado mas de 300. FUNCIONES Resist. a Antimicrobianos Factores de Virulencia Síntesis de Colisina Síntesis de Enzimas Producción de Enterotoxinas. Degradacion de moléculas complejas. Resistencia Natural http://www.eucast.org/expert_rules/ Betalactamasas • Enzimas que hidrolizan irreversiblemente el enlace amida del núcleo betalactámico de los antibióticos betalactámicos, transformándolos en compuestos inactivos, incapaces de ejercer su acción antibiótica. CLASIFICACION DE b – LACTAMASAS Bush – Jacoby - Medeiros Grupo 1 2a 2b 2be Características Enzimas Representativas Cafalosporinasas no inhibidas por Acido Clavulánico AmpC Penicilinasas inhibidas por Acido Clavulánico (A.C.) Enz. de amplio espectro inhibidas por A. C. PC1 (S. aureus) TEM-1, TEM-2, SHV-1 TEM-30 - 36, TRC-1 PSE-1, CARB-3 Enz. de espectro extendido inhibidas por A.C. (BLEE) TEM-3 - 28, SHV-2 - 6 2br 2c 2d 2e Enz. de amplio esp. con unión reducida a A.C. (IRTs) Carbenicilinasas inhibidas por A.C. Cloxacilinasas inhibidas por A.C. Cefalosporinasas inhibidas por A. C. OXA-1, PSE-2 P. Vulgaris IMI-1, NMC-A, Sme-1 L1 (Sten. maltophilia) 2f 3 4 Carbapenemasas no metallo b -lactamasas Metallo b – lactamasas Penicilinasas no inhibidas por A. C. P. cepacia β- lactamasas clase C, grupo 1 de KB AMP-C RESISTENCIA a aminopenicilinas, cefalosporinas de 1º G, 2ºG incluidas cefamicinas SENSIBILIDAD a cefalosporinas de 3º y 4º generación y carbapenemes Expresión: - constitutiva/ inducible hiperproducción - desrepresión NO INHIBIBLE POR ÁC. CLAVULÁNICO SULBACTAM NI TAZOBACTAM Inhibidas por ácido borónico Cromosómica VERIANTES PLASMÍDICAS β-lactamasas tipo Ampc • Estas enzimas se han encontrado codifidas por cromosomas en una amplia variedad de bacterias Gram negativas. Aeromonas spp. Morganella morganii. Providencia spp., Pseudomona aeruginosa, Proteus spp. (indol +) Citrobacter freundii Enterobacter spp. Serratia spp. • La inducción es un mecanismo reversible β-lactamasas tipo Ampc • Como ya se mencionó no existen métodos fenotípicos estandarizados por el CLSI, para la detección de enzimas AmpC, no obstante, se han diseñado diversos procedimientos con elevada sensibilidad y especificidad. No inducción AmpC AmpD AmpR ampD ampR ampC • Fragmentos de la pared reciclados por AmpD • Conformación de represor AmpR • No expresión de ampC (gen b-lactamasa). Inducción de AmpC b-lactamasa AmpD ampD ampR ampC • Mayor reciclaje: incremento de AmpD • Los fragmentos de la pared activan el AmpR . • Expresion ampC (gen b-lactamasa ) E. cloacae expresion AmpC cromosómica inducible La derrepresión mutacional es el problema no la inducción Derrepresión AmpC b-lactamasa++ ampD ampR ampC • ampD inactivado por mutación. • AmpR convertido constantemente en activador. • hiper-expresión de ampC E. cloacae derrepresion mutacional de AmpC 29 E. coli con plasmido AmpC Detección de AmpC por el Laboratorio De transmisión plasmidica Klebsiella pneumoniae AmpC Detección de AmpC por el Laboratorio Klebsiella pneumoniae AmpC Detección de AmpC por el Laboratorio Klebsiella pneumoniae AmpC Detección de AmpC por el Laboratorio E. Coli Hiperpoductora de AmpC Detección de AmpC por el Laboratorio Cómo se seleccionan las mutantes? • La derrepresion ocurre en 1 cell / 107 • Estas células son resistentes a cef. de 3ºgen • La selección durante la terapia puede causar falla de tratamiento.... Celulas S muertas por el antibiótico Crecimiento de mutantes R β-lactamasas tipo Ampc • Las bacterias que ya no regulan la producción de AmpC pueden ser seleccionados durante la terapia con cefalosporinas de tercera generacion y pueden acumularse en la microflora hospitalaria. β-lactamasas tipo Ampc • Los genes se codifican típicamente en grandes plásmidos y llevan genes de resistencia adicionales. • No existe consenso respecto al informe de las C3ªG en aislamientos productores de AmpC plasmídico β-lactamasas de espectro extendido (BLEE). • Estas enzimas confieren resistencia a las oximinocefalosporinas (como las cefalosporinas de tercera generacion), aztreonam, las penicilinas y las cefalosporinas de espectro reducido • Son incapaces de hidrolizar cefamicinas (cefoxitina y cefotetan) y carbapenems. β-lactamasas de espectro extendido (BLEE). • Confieren resistencia a: - Penicilinas - Cefalosporinas excepto cefamicinas (con distinto nivel según tipo) - Monobactámicos • Plasmídicas • Frecuentemente con otros determinantes de resistencia (AG, TMP/SXT, quinolonas) • Tipos: TEM, SHV, CTX-M, otras • Sobre todo en enterobacterias β-lactamasas de espectro extendido (BLEE). • Las BLEE son inhibidas por ac. Clavulanico, el sulbactam, y el tazobactam lo que los que lo diferencia de las β-lactamasas tipo AmpC. • En la practica, la presencia de cualquier tipo de infeccion moderada a seria por una bacteria productora de BLEE debe llevar al clínico a considerarla como resistente a las cefalosporinas de amplio espectro y a los monobactamicos. BLEE PRUEBA CONFIRMATORIA BLEE: ES INACTIVADA CON EL ACIDO CLAVULAMICO CTX ATM CAZ AMOXICILINA/Ac. CLAVULAMICO CRO Detección de BLEE por el Laboratorio Klebsiella pneumoniae BLEE + Detección de BLEE por el Laboratorio Serratia Marcecens BLEE + Detección de BLEE por el Laboratorio Klebsiella pneumoniae BLEE ? Detección de BLEE por el Laboratorio Klebsiella pneumoniae BLEE .+ Detección de BLEE por el Laboratorio Combination Disk Method CLSI Approved Method Todas las Enterobacterias CTX–CRO–CAZ-CFTX- AZTFEP y CXM Detección de BLEE + Informar resistencia a todas las penicilinas, cefalosporinas y monobactames sin importar los halos de inhibición obtenidos en las pruebas de sensibilidad Carbapenemasas • Este grupo de enzimas hidroliza hasta los carbapenems. • Pueden estar codificadas en el cromosoma bacteriano o estar presentes en elementos genéticos móviles. • Se ha propuesto una clasificación en dos grupos: carbapenemasas de serina (incluidas en la clasificación molecular de Ambler, clases A y D y metalo βlactamasas , MBL (Ambler , Clase B), denominadas asi por la dependencia de metales como el zinc para su funcionamiento Clasificación de Carbapenemasas Klebsiella pneumoniae ? Detección de carbapenemasas por el Laboratorio Detección de carbapenemasas por el Laboratorio Las carbapenemasas clase A son dependientes de serina, incluye las no metalocarbapenemasas. Son capaces de hidrolizar los carbapenemes, así como las cefalosporinas, penicilinas y aztreonam, adicionalmente son inhibidas por el clavulánico y tazobactam Prueba alternativa sinergismo con doble disco y acido borónico La prueba de acido borónico es específica para detección de KPC en K. pneumoniae. Test de Hodge Modificado Prueba tamiz y confirmatoria para sospecha de carbapenemasas “Test de Hodge Modificado” recomendado por CLSI RESISTENTE A CARBAPENEM POR PRODUCCION DE CARBAPENEMASA TIPO KPC ( PLASMIDOS ). Detección de Metalo β-lactamasas Clase B (grupo 3)IMP-1,VIM-1,CcrA, BcII Detección de Metalo β-lactamasas Clase B (grupo 3)IMP-1,VIM-1,CcrA, BcII Detección de Metalo β-lactamasas Clase B (grupo 3)IMP-1,VIM-1,CcrA, BcII EDTA 0.5M Pseudomonas aeruginosa MBL + Modificación “San Bartolomé” Dil 1/10 de 0.5 Mc farland EDTA 0.1M EDTA 0.5M EDTA 0.1M Informe microbiológico en la decisión clínica El impacto del informe del laboratorio en la decisión clínica depende de: Situación previa y evolución del paciente y necesidad de cambio de actitud clínica Calidad y contenido de la información. CONCLUSIONES Las resistencias bacterianas son un problema cada vez mayor, debido a que constantemente aparecen nuevas cepas resistentes de especies normalmente sensibles a un determinado antibiótico. Los microorganismos multirresistentes se seleccionan con mayor facilidad en unidades hospitalarias, particularmente en las salas de cuidados intensivos, en las que se emplean antibióticos amplio espectro como terapia empírica inicial; por selecciones sucesivas emergen microorganismos con escasas alternativas terapéuticas. El monitoreo continuo de la resistencia antimicrobiana podrá proveernos de estrategias para controlar la diseminación de bacterias resistentes
Report "Deteccion Fenotipica de Resistencia en Gram Negativos"