Desarrollo y validación de un método analítico para la dosificación de Ibandronato sódico en comprimidosCespedes, M.; Colman, S.; Lopez, L.; Gonzalez,M.; Saucedo, S.; Báez,E. * Departamento de Desarrollo de Productos Laboratorios Lasca, Ruta Mcal Estigarribia Km 9,5,San Lorenzo,Paraguay *e-mail:
[email protected] 1-Introduccion El ibandronato sódico es un bisfosfonato nitrogenado de tercera generación caracterizado por presentar una cadena lateral de amina terciaria alifática. El nombre químico del ibandronato sódico es sal 5 monosódica de ácido (1-hidroxi-3-(N-metil-N-pentilamino)propilidén)bisfosfónico y la fórmula empírica del ibandronato sódico es C9H22NO7P2Na·H2O con un peso molecular de 359,24. El ibandronato sódico se presenta como polvo blanco o casi blanco . Es fácilmente soluble en agua y prácticamente insoluble en disolventes orgánicos. Este principio activo ha sido desarrollado para el tratamiento de trastornos óseos tales como la hipercalcemia por tumor maligno, osteolisis, enfermedad de Paget, osteoporosis y enfermedad ósea metastásica . Diversos estudios justifican su gran utilidad para el aumento de la densidad mineral ,con mejoría de la resistencia reduciendo notablemente el riesgo de fracturas (1) Se comercializa en las formas inyectables y comprimidos. Estos ultimos presentan una dosificación mensual, con pocos efectos adversos considerando la relacion riesgo -beneficio, con alto potencial de prevención en un transtorno que afecta a la Salud Pública. Este activo no se encuentra codificado en farmacopeas y las referencias bibliograficas encontradas al momento del presente estudio sobre dosificacion del mismo, se refieren a fluidos biologicos utilizando derivatizacion (2) o cromatografia de intercambio ionico (3) 2-Objetivo Desarrollar y validar un metodo analitico HPLC-UV simple y accesible,especifico, exacto ,preciso y robusto para la dosificación de ibandronato sódico, para luego ser utilizado en control de calidad y estudios de estabilidad de comprimidos en laboratorios farmaceuticos públicos o privados. 3-Metodología El desarrollo y validación del método analítico fueron llevados a cabo en un equipo Waters Alliance con modulo de separacion 2695, auto sampler y detector de arreglo de fotodiodos (PDA) 2996 a una longitud de onda de 195 nm y una temperatura de 30 ºC. La señal de salida fue monitoreada y procesada utilizando el software Empower residente en una computadora personal. La separación cromatográfica fue lograda en una columna Octa Decyl Silyl (C-18, 250 mm x 4.6 mm con particulas de 5 μm ) con una mezcla de 995 mL de Agua a pH 2.0 con Acido fosforico,0.87 g de LiChropur® (Ácido hexano-1-sulfónico, sal sódica ),0.1 g Titriplex® III (ácido etilendinitrilotetraacético, sal disódica, dihidrato) y 5 mL de acetonitrilo como fase movil. El flujo fue de 1.5 mL/min, con una concentracion de solucion de 3000 ug de Acido Ibandrónico/mL usando agua destilada como solvente y un loop de inyeccion de 20 uL. Se obtuvieron Platos teóricos = ≥ 1000 Factor de cola: ≤ 2.0 y un Tiempo de retención aprox.de 7.5 min.(ver figura 2) Los analisis se efectuaron sobre un lote piloto de tabletas conteniendo 150 mg de Acido Figura 2 Validación del metodo: Siguiendo los lineamientos de ICH Q2 (4) y USP (5) se evaluaron los siguientes parametros: 1.con placebo x 100 Area sol.Area sol. El método debe ser capaz de cuantificar un % de Discrepancia inferior al 2 % entre la Solución Referencia y la Matriz de excipiente cargada con Solución Referencia según la siguiente formula: % Discrepancia = Area sol Ref. Especificidad: Considerando una posible interferencia del solvente y la matriz de excipientes se evaluó la implicancia de ambos factores en el metodo HPLC. se elaboró un placebo con excipientes. sin placebo . sin placebo Tambien se evaluó la especificidad del método sometiendo la muestra a degradación forzada o stress por hidrolisis acida con la incorporación de Acido Clorhídrico al 5 % (v/v). Ref. Para ello se prepararon e inyectaron : a) mezcla de excipientes del comprimido (placebo o Matriz de excipientes) b) solucion de excipientes c) solucion de Matriz de excipiente cargada con Solución Referencia d) solucion del standard de referencia (Solución Referencia). Ref. y se utilizó como standard Ibandronato sodico standard de trabajo proveido por JPN Pharma PVT LTD.Ibandronico ( como sal sodica). El método debe ser capaz de cuantificar la degradación del principio activo con una disminución en los mg/mL recuperados y según la siguiente fórmula: .sonicando por 30 minutos . 5 2. SCe = Σ (Cf2/8) MCe = SCe/f . la suma de cuadrados del error.5 2. Se incluyen 2 factores falsos.3 1.5 2 2 2 B Factor FALSO + + + + - Nivel del factor C D Longitud de Columna 125 125 250 250 250 125 250 125 Loop 50 20 20 50 50 50 20 20 E Factor FALSO + + + + - F Flujo 1.3 1. el cuadrado medio y el cálculo de la Fcal para cada factor según las siguientes fórmulas: • Suma de cuadrado para cada factor SCci = Ci2/8 Donde Ci : Factor A. para lo cual se definen previamente 5 factores que puedan incidir sobre la metodología analítica.(Y2 + Y4 + Y5 + Y8) CG= Y1 + Y2 + Y4 + Y7 . D. C.3 1.7 1. G. F.7 1. Se utilizó un lote piloto de Ibandronato sódico comprimidos.5 2 2.3 G Temperatura de la columna 40 40 30 40 30 30 40 30 1 2 3 4 5 6 7 8 En base a la concentración en mg de Acido ibandronico /comp obtenidos en los 8 ensayos.% Degradación = Dosis Muestra sin tratar .(Y2 + Y3 + Y7 + Y8) CE= Y2 + Y5 + Y6 + Y7 . se calcularon los factores y factores falsos segun las formulas: CA= Y1 + Y2 + Y3 + Y5 .(Y1 + Y3 + Y4 + Y8) CF= Y1 + Y3 + Y6 + Y7 .(Y4 + Y6 + Y7 + Y8) CB= Y2 + Y3 + Y4 + Y6 .Dosis Muestra tratada x 100 Dosis Muestra sin tratar 2. Robustez: Para la realización del estudio de robustez se utilizó la Matriz de Plackett Burman (6) .(Y1 + Y5 + Y7 + Y8) CC= Y3 + Y4 + Y5 + Y7 .7 1. o celdas dummys para completar la matriz ( ver Tabla 1) Tabla 1 A Ensayo pH del componente de FM (Agua) 2.(Y1 + Y2 + Y6 + Y8) CD= Y1 + Y4 + Y5 + Y6 .7 1.(Y3 + Y5 + Y6 + Y8) Luego se calculó la suma de cuadrados para cada factor. • Suma de cuadrados del error Donde Cf • Cuadrado medio del error : Factor B y E. Donde SCe f • F calculado para cada factor Donde SCci : Suma de cuadrados de cada factor MCe : Cuadrado medio del error Fcal : F calculado para cada factor : Suma de cuadrados del error : Nº de ensayos falso. Linealidad: Se evaluaron soluciones con concentraciones equivalentes al 80. en µg/mL (para los 5 diferentes niveles). la desviacion standard. para la expresión porcentual de g cada 100 g X : Concentración teórica agregada de (3000 µg de Acido Ibandrónico). Ftablas = 18.gl Criterio de aceptación El factor analizado presenta efecto sobre el método analítico El factor analizado no presenta efecto sobre el método analítico 3. t observado de Student .999. 100.Exactitud: Sobre las 15 muestras con inyecciones triplicadas cada una se calcula el porcentaje de recuperacion de Ibandronato sobre la cantidad real agregada . 90. Astd : Area de la referencia.110 y 120 % de acido ibándronico en relacion a la concentracion propuesta para el método. %Std : Pureza de la referencia en mg de referencia.100. 120).110.90. F : 100. con un α= 0. por mg de droga tal cual T : Niveles de concentración.05 y los grados de libertad: 1 de numerador y 2 de denominador. 4. en muestras triplicadas ( total 15 muestras con inyecciones triplicadas cada una) . Concentración recuperada (%):= Cstd* Am * %Std * T/ Cm * Astd Donde: Cm : Concentración de la muestra en µg/mL Cstd : Concentración de la referencia en µg/mL Am : Area de la muestra. Los criterios de aceptación se encuentran en la Tabla 2 Tabla 2 Parámetro Si el Fcal ≥ Fα. según las siguientes fórmulas: Desviación estándar ∑( x − promedio ) i 2 N −1 . Luego se graficó la curva de regresión lineal utilizando Area (Y) vs Concentracion recuperada (X) donde la ecuación de la pendiente de la curva es: Y = b* x + a . intervalo de confianza . Fcal = SCci/MCe Luego se comparó el F calculado contra el F de tablas.51. Se calcularon las concentraciones agregadas y recuperadas segun las formulas: Concentración agregada (%):= Cm *F/X Donde: Cm : Concentración de la muestra. el coeficiente de regresión lineal (r) no deberá ser menor a 0.gl Si el Fcal ≤ Fα. g cada 100 g (80. 14 para un nivel de probabilidad del 95% y un grado de libertad de 14. se rechaza la Hipotesis nula y el método es considerado exacto. si el T observado es menor al t de tablas. con un analista diferente. N=15 Utilizando la teoria de la Hipotesis nula . según la siguiente fórmula: Coeficiente de variación (CV): Donde: δ: ∑ ( xi % de Recuperación . Σ (yi – promedio)2 N-1 ♦ Pendiente (b) = Σ( x – x ) * ( y – y ) Σ (x – x)2 . Se evalúa la Reproducibilidad repitiendo el análisis de 15 muestras con inyecciones triplicadas.Coeficiente de variación (CV): promedio Intervalo de confianza (LC): promedio ± δ ×100 tδ N Donde t tablas = 2.Precision: Se evalua la Repetibilidad calculando el Coeficiente de Variación (CV) de los resultados obtenidos sobre 15 muestras con inyecciones triplicadas.promedio N–1 ∑ xi % de Recuperación___ N δ prom edio ×100 % de Recuperación Promedio: Siendo N = 15 El CV debe ser inferior al 2% . el CV entre analista 1 y 2 debera ser menor a 2%. 5.se calculan para cada nivel: Desviación estándar de área (YA): Donde: (N – 1) número de muestras. T observado = ( xagregado − xrecuperado δ× N ) . según la siguiente fórmula: 6.Límite de detección: A partir de los datos obtenidos en el ensayo de linealidad . y–b* x a (X/Y) + [3* a (X/ YA) ] b (X/Y) * √n El límite de detección (LD) deberá ser menor a Acido Ibandrónico: 2400 µg/mL (equivalente a 80% de la conc. a (X/Y) + [10* a (X/ YA) ] b (X/Y) * √n El límite de cuantificación (LC) deberá ser menor a: Acido Ibandrónico: 2400 µg/mL (equivalente a 80% de la conc.0 % Resultado 17.0 % 0. con una disminución en los mg/mL recuperados El método es capaz de cuantificar un % de Discrepancia inferior al 2 % Capacidad de Discrepancia del entre la Solución Referencia y la procedimiento Matriz de excipiente cargada con Solución Referencia. final de la muestra) 7 -Límite de cuantificación: Se calculó según la siguiente formula: Límite de cuantificación (LC) = Donde n = 3. Tabla 3 Criterio de aceptación El método es capaz de cuantificar la Porcentaje de degradación del principio activo (ver degrdación figura 3).final de la muestra) Resultados 1-Especificidad: Los resultados se encuentran en la Tabla 3 . en figura 3 se puede ver el cromatograma obtenido.42 % CUMPLE .Intersección (a) = Límite de Detección (LD) = Donde: n = 3 número de tratamiento por nivel. numero de tratamiento por nivel.98% CUMPLE < 2. Parámetro Limites > 2. por lo tanto la longitud de columna en el ensayo podrá ser de 125 mm y 250 mm El método analítico es robusto para el principio activo utilizando loop de 20 Loop y 50 µL.96 1.77 0.23 0. por lo cual el pH de la Fase Móvil deberá ser de FM (Agua) 2.96 Tabla 5 F0.10 0.0 El método analítico es robusto para los principios activos utilizando como Longitud de columna longitud de columna 125 mm y 250 mm.51 Decisión Presenta efecto No presenta efecto No presenta efecto No presenta efecto No presenta efecto Conclusión El método analítico no es robusto para el principio activo en el intervalo de pH del componente pH 2.2 18.Figura 3 2-Robustez : Los resultados se encuentran tabulados en Tablas 4 y 5 Tabla 4 Factor pH del componente de FM (Agua) Longitud de Columna Loop Flujo Temperatura de la columna Factor Fcal 5001.0 + 0.05. .1.5 de la fase móvil. 30 87.55 Lím > 0.000 0.2 mL/min.96 99.Flujo Temperatura de la columna El método analítico es robusto para los principios activos en el intervalo de 1.39 99. Linealidad: Los resultados se encuentran tabulados en Tabla 6 y Figura 4 Cuadro Concentración vs. Respuesta .38 99.20 107.93 119.91 89.29 78.2 mL/min. por lo tanto el flujo del ensayo podrá ser de1.999 Y(área) 1212368 1221743 1214604 1351796 1369634 1375646 1532088 1541138 1526266 1685383 1680577 1680327 1844385 1835079 1850516 1. recuperada) 78.77 78.11 118. El método analítico es robusto para el principio activo con temperatura de 30ºC y 40ºC por lo tanto la temperatura de la columna podrá ser de 30ºC y 40ºC.53 119. Figura 4 .95 107. Tabla 6 Datos correspondientes a (%) 80 80 80 90 90 90 100 100 100 110 110 110 120 120 120 coeficiente de correlación r coeficiente de correlación r2 X(conc. 4.08 108.01 89.5 ± 0.5 ± 0.999 Se graficaron los datos obtenidos y se determinó la ecuación de la recta obteniéndose un coeficiente de regresión lineal (R) de 1.0 . 532.00 150.11 118. en otras palabras el método no es exacto.37 97.835.59< 2.46 98.39 90% 97.963 1.80 100.476.351.Exactitud: Hipótesis nula (H0): Se postula que no existe relación entre la cantidad agregada (valor verdadero) y la cantidad recuperada (valor obtenido).75 110.16 98.60 99.95 107.85 120.72 110.94 80% 97.30 87.743 1.08 98.214.369.487.327 1.00 AREA 4.65 97.516 1.095 1.52 .30 97.00 110.08 108.079 1.74 97.55 97.138 1.29 78.00 90.850.680.60 80. (%) 78.53 119.91 100% 98.680.604 1.93 119.385 1.266 1.14300 R2 = 0.80 110.14 El método es considerado Exacto Se grafican los resultados obtenidos con Analista 1 en la Tabla 7.Linealidad Ac.541.71 110% 97. se rechaza la Hipótesis nula y el método es considerado exacto.577 1.474. T tablas para un grado de libertad de 14 y un intervalo de confianza del 95 %= 2. 130.9992 1900000 1800000 1700000 1600000 1500000 1400000 1300000 1200000 1100000 1000000 70.62 90. Para comprobar o rechazar la hipótesis nula.81 100.87 120.47 97.55 98.796 1.96 99.12 97. Ibandrónico y = 15618x .375.39 99. (mg/mL) 3040 2386 2390 2390 2687 2689 2689 3044 2989 2989 2986 3044 3285 3284 3284 3048 3584 3583 3583 3040 CONC. Tabla 7 AREA ST1 M1 M2 M3 M1 M2 M3 ST2 M1 M2 M3 ST3 M1 M2 M3 ST4 M1 M2 M3 ST5 1.01 89.088 1.634 1.383 1.00 CONC.77 78.38 99. % de Promedio Recuperada recuperación % de recup.55 98.15 98.466.646 1.840 1. Agregada (%) 80.468.20 107.61 90.844.774 CONC.91 89.70 100.897 1.14 T observado = 0.221.685.212.68 90.53 120% 98.75 120.00 98.83 CONC. se calcula la t de Student Si t observado < a t tablas.368 1.47 80.526. 75 97.898 1.49 97. (%) 78.48 97.485 1.476.63 90% ST2 97.853 1.83 98. se obtuvo un Coeficiente de Variación (CV) entre ambos analistas de 0.01 95. Reproducibilidad: Los resultados obtenidos en las determinaciones efectuadas con el analista 2 se tabulan en Tabla 8.61 95.496.87 120.49 80.38 0.49 97.005 1.6 .39 Lim < 2 % 0.50 97.79 97.36 97.204.503.59 98.78 100.87 100.01 110% ST4 97.65 118.672.12 97.80 110.70 100% ST3 96.282 1.96 120.776 1.473.468.92 96. % de Promedio Recuperada recuperación % de recup.679.01 5.465.734 CONC.67 0.92 80% 97.835.50 80.75 110.833.211.48 88.87 CONC.77 110.84 118.11 100.33 98.35 96.42 78.62 78.85 96.54 90.62 98.18 98.98 108.Precisión: Repetibilidad: El Coeficiente de Variación (CV) obtenido fue de 0. Agregada (%) 80.81 % Lim < 2 Tabla 8 AREA ST1 M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3 1.76 88.98.57 90.28 88.26 107.72 Lim < 2 para t = 2.666.79 97.58 107.208.252 1.510.472.244 1.Media Desviación estándar Coeficiente de variación Intervalo de Confianza T observado 100.01 0.827.48 120% ST5 Media Desviación estándar Coeficiente de variación entre porcentajes de recuperación de analista 1 y analista 2 98.385 1.66 100.365.599 1.694 1.052 1.69 Lim < 2 .086 1.167 1.72 98.66 97.154 1.64 90.856 1.412 1.39 0.43 97.361.013 1.371.81 % . (µg/mL) 3040 2386 2387 2388 2685 2688 2688 3036 2988 2991 2989 3036 3284 3284 3286 3036 3584 3586 3584 3044 CONC.69 97.14 99.453 1.41 118.09 97.82 120. El coeficiente de regresión lineal fue superior a 0.por tanto. Patel H. Desviación Estandard 4897 4897 4897 12404 12404 12404 7494 7494 7494 2850 2850 2850 7773 7773 7773 Rango 80 80 80 90 90 90 100 100 100 110 110 110 120 120 120 Intersección Pendiente Lim.19 526. resultando en una alternativa sencilla y accesible para cualquier laboratorio analítico. excepto frente al Factor pH de la fase móvil. S. Keaveny TM.43 -1.indicando la especificidad del método. Genant HK. .439 µg/mL 98.A simple and sensitive HPLCMS/MS method to determine ibandronate in human plasma for pharmacokinetic applications. Cuantificación.Límite de detección y Límite de cuantificación: Los resultados obtenidos se tabulan en Tabla 9. La repetibilidad y reproducibilidad produjeron un coeficiente de variación menor a 2 demostrándose precisión. Kivitz A. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 94(1):171-180.The AAPS Journal . Kale . Once-Monthly Oral Ibandronate Improves Biomechanical Determinants of Bone Strength in Women With Postmenopausal Osteoporosis . 2010. C. Patel .S. y se ha logrado la detección esperada tras la degradación forzada. No se ha detectado interferencia con el solvente y la matriz de excipientes .14. se considera validado y apto para los análisis de control de calidad y de estudios de estabilidad de comprimidos de Ibandronato sódico. recomendándose que este factor no se varíe al lleva a cabo el método. Hussain .vol 12. Jadeja . Ene 2009 2-P. Gupta .999 demostrandose linealidad en un rango de 80 a 120 % de la concentracion de trabajo y se comprbó la exactitud del método con un t observado menor a 2. Bibliografia 1-Lewiecki EM.51 -14300. rechazándose así la Hipotesis Nula.Fuerst T. Kopperdahl DL.036 µg/mL 1. Detección Lim.12 18. Davies RY y Fitzpatrick LA. A. La robustez del método fue demostrada. El método. Los límites de detección y cuantificación se encotraron dentro de los valores esperado.75 Media 1216238 1365692 1533164 1682096 1843327 Lim < 2400 µg/mL Lim < 2400 µg/mL 10374.000 Conclusión. R Area (Y) 1212368 1221743 1214604 1351796 1369634 1375646 1532088 1541138 1526266 1685383 1680577 1680327 1844385 1835079 1850516 Conc(x) 2321 2336 2321 2606 2639 2650 2947 2964 2938 3208 3201 3200 3532 3514 3544. Engelke K.6.Nº S2. 18(3):254-5. Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria AEFI Año 2001. Validación de Métodos Analíticos. Zhou XQ. Determination of ibandronate by high performance ion exchange chromatography.<1225> Validacion de procedimientos Farmacopeicos. 60:11260 5-The United States Pharmacopoeia. pag 102-105 . Edición 2012. 35/NF 30. Pujol M.3-Hu MY. Federal Register 1995.Wang BC.pag 967-971 6-Perez Cuadrado. 4-International Conference on Harmonization ICH guidelines on validation of analytical procedures:text and methodology Q2 (R1): FDA. 2000 May. Se Pu. JA .