__________________________________________________________________División Toxicología DEGRADACIÓN ENZIMÁTICA DE XENOBIÓTICOS: el ejemplo de los insecticidas organofosforados 1 RESUMEN El objetivo general de esta actividad es observar, monitorizar y caracterizar la biodegradación enzimática de insecticidas organofosforados en un sistema biológico modelo. Para ello se estudiará los efectos de cationes divalentes, agentes quelantes y reactivos bloqueantes de grupos tioles sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo. Se utilizará como substrato modelo el organofosforado paraoxon, que es el metabolito tóxico del insecticida parathion. b. FUNDAMENTOS: LOS COMPUESTOS ORGANOFOSFORADOS (ver guión de práctica sobre hidrólisis química de organofosforados) 3 FOSFOTRIESTERASAS: LAS ENZIMAS QUE HIDROLIZAN COMPUESTOS ORGANOFOSFORADOS 3.1 Las esterasas que hidrolizan organofosforados Según la clasificación actual de la IUB las enzimas que hidrolizan compuestos organofosforados (OPs) se hayan encuadradas en el grupo 3.1.8 que se denomina hidrolasas de triésteres fosfóricos o fosfotriesterasas. Normalmente las fosfotriesterasas se nombran de acuerdo con el substrato que hidrolizan. En la siguiente figura se muestran las reacciones catalizadas por algunas fosfotriesterasas conocidas como son la DFPasa, tabunasa, paraoxonasa y diclorovos (DDVP) hidrolasa. La figura muestra como la hidrólisis del OP da lugar a la liberación del grupo saliente (F -, CN-, p-nitrofenol y metanol respectivamente) y a la generación de un residuo fosfórico. Universidad Miguel Hernández. División de Toxicología. Edificio Vinalopó Avenida de la Universidad s/n 03202. ELCHE (ALICANTE). SPAIN Tel: (+34)965222157; Fax: (+34)966658511 1 Esta actividad ha sido estudiada principalmente plasma e hígado de mamífero. ganso. pájaro bobo. se describió la capacidad del suero humano y de conejo de hidrolizar el dialquilfluorofosfato. ELCHE (ALICANTE). alca. codorniz. La actividad fosfotriesterasa mejor estudiada en mamífero corresponde a la paraoxonasa. La mayoría de las aves estudiadas muestran escasa o nula actividad fosfotriesterasa. Además de mamíferos y aves también se han descrito fosfotriesterasas en peces como la trucha Salmo trutta y la carpa Cyprinus carpio. Streptomyces lividans. metabolito tóxico del parathion. En general los mayores niveles de actividades fosfotriesterasas han sido descritos en mamíferos. División de Toxicología. y en bacterias como Pseudomonas diminuta. en moluscos como el calamar Loligo pealei y Todarodes pacificus steenstrup y el mejillón Mytilus edulis. paloma.__________________________________________________________________ División Toxicología O (i C3H7O)2 P F DFPasa O (i C3H7O)2 P OH + FH DFP C2H5O C2H5O O P CN Tabunasa O P OH CNH + (CH3)2N (CH3)2N TABUN O (C2H5O)2 O P O NO2 Paraoxonasa (C2H5O)2 P OH + NO2 HO PARAOXON CH3O O P CH3O 3. La hidrólisis del paraoxon fue estudiada en detalle en 1953. halófilas. Rhizobium y Bradyrhizobium. gorrión y grajo. Es de destacar la gran variabilidad existente entre especies e incluso entre tejidos de la misma especie. SPAIN Tel: (+34)965222157. Estas primeras observaciones demostraron que los OPs pueden ser hidrolizados por una gran variedad de materiales biológicos. Achromobacter sp. y Tetrahymena thermophila. La primera demostración de la existencia de una actividad fosfotriesterasa fue realizada en 1946. Escherichia coli. Universidad Miguel Hernández.2 OCH DDVP CCl2 DDVPasa CH3O O P OCH CCl2 HO + CH3OH Distribución de fosfotriesterasas entre especies y tejidos Las fosfotriesterasas se encuentran ampliamente distribuidas en tejidos animales. Edificio Vinalopó Avenida de la Universidad s/n 03202. Así. estornino. mirlo. gaviota. Fax: (+34)966658511 2 . frailecillo. no se detectó actividad hidrolítica de paraoxon ni de metil pirimifos-oxon en: cormorán. que en presencia del catión Ca2+ hidroliza el insecticida paraoxon. No todos los tejidos de una misma especie hidrolizan los mismos OPs ni la misma actividad fosfotriesterasa se presenta en el mismo tejido de todas las especies. No obstante en los años 90 se han detectado actividades hidrolizantes de algunos fosforamidatos y de diisopropilfluorofosfato (DFP) en tejidos de aves. Es decir. ELCHE (ALICANTE). mono. La hidrólisis estereoespecífica de los isómeros del cianofenfos en ratas es debida a la selectividad de las arilesterasas por el análogo oxon(-). y la actividad hidrolizante de paraoxon y compuestos relacionados estructuralmente con él se localiza preferentemente en la fracción particuladas de hígado. que la estereoespecificidad dependería de si se utilizaban homogeneizados donde pudieran estar actuando varias isoenzimas o de si se utilizaban proteínas más o menos purificadas. tejido en el cual todos los isómeros del soman son hidrolizados a la misma velocidad. de las cuales una era estereoespecífica y las otras dos no. SPAIN Tel: (+34)965222157. Fax: (+34)966658511 3 . Edificio Vinalopó Avenida de la Universidad s/n 03202. La actividad paraoxonasa ha sido descrita mayoritariamente en la fracción particulada de hígado de rata.3 Distribución subcelular La actividad hidrolizante de sarin en conejo. Se ha encontrado una fosfotriesterasa en Escherichia coli que hidrolizó soman. también se ha descrito en hígado de rata una actividad capaz de hidrolizar sarin. rata y ratón se encontró fundamentalmente en la fracción soluble de hígado y riñón. Estos últimos datos contradicen lo publicado por otros autores para hígado de rata. Se ha tratado de explicar las discrepancias sobre la estereoespecificidad de la degradación del soman basándose en las diferentes fuentes de tejido utilizadas.4 Estereoselectividad de las fosfotriesterasas La estereoselectividad en la hidrólisis de los OPs puede ser debida a la hidrólisis de un solo estereoisómero o a la hidrólisis más rápida de uno de ellos que del resto. tabun y DFP con un 85% de actividad en la fracción soluble y el 15% restante en la fracción particulada. Sin embargo. soman. Aunque no existen muchos datos parece claro que las actividades fosfotriesterasas se reparten en distintas fracciones celulares hepáticas. La fracción soluble del homogeneizado de hígado. La bacteria presentó tres isoenzimas. cobaya y marmota. numerosos autores han demostrado la hidrólisis estereoespecífica del soman en tejidos de rata. Otra fosfotriesterasa en la que ha sido descrita estereoespecificidad es la encontrada en Pseudomonas diminuta que sólo hidrolizó el isómero S p del O-etil p-nitrofenil fenilfosfonotioato (EPN) y 100 veces más rápido los enantiómeros S del acefato y del metamidofos que sus correspondientes enantiómeros R. riñón y cerebro de rata contuvo el 80-90% de la actividad DFPasa.__________________________________________________________________ División Toxicología 3. La fracción soluble de hígado y riñón de gallina ha mostrado contener actividad DFPasa. cobaya. Universidad Miguel Hernández. No obstante. 3. División de Toxicología. la hidrólisis estereoespecífica del soman en plasma humano se debe a la diferente velocidad de hidrólisis de sus estereoisómeros. si bien parece que en la fracción soluble de hígado se localizan preferentemente las actividades hidrolizantes de DFP y compuestos análogos. Asimismo. los porcentajes de recuperación de actividad disminuyeron cuando aumentó el tiempo transcurrido entre la inhibición y la adición de Ca2+. SPAIN Tel: (+34)965222157. genéticos etc. lo cual es una diferencia importante respecto a las carboxilesterasas. El hecho de que las fosfotriesterasas sean sensibles a agentes quelantes y que su actividad. ya que éstas últimas son menos sensibles a la acción de los iones y no requieren cofactores. las actividades hidrolizantes de paraoxon y diclorovos (O. Algunos cationes juegan el papel de cofactores. el calcio libre (o débilmente asociado con la fosfotriesterasa) facilitaría la retirada del residuo dietilfosfato del centro activo de la enzima. Resultados similares han sido descritos para la paraoxonasa de hígado humano. a veces dependa de la concentración de iones divalentes en el medio de reacción es compatible con la posibilidad de que se trate de metalo-enzimas.). ELCHE (ALICANTE).7 Otros cationes La fosfotriesterasa de Pseudomonas diminuta posee dos átomos de Zn2+ unidos a su centro activo que resultaron ser necesarios para la actividad catalítica. el patrón de respuesta a éstos ha sido empleado frecuentemente para diferenciar entre actividades fosfotriesterasas. En algunas ocasiones los cationes resultan ser inhibidores de las actividades fosfotriesterasas.__________________________________________________________________ División Toxicología 3. Ni2+. Cuando el catión fue retirado del medio mediante incubación con ácido etilendiaminotetracético (EDTA) la actividad resultó inhibida. Universidad Miguel Hernández. HgCl2 y AgNO3 y EDTA. La actividad paraoxonasa de plasma e hígado de rata dependió de la presencia de Ca 2+ en el medio. probablemente a través de la polarización del enlace P=O del paraoxon. La actividad se recuperó tras la adición de hasta 10 equivalentes estequiométricos metal/proteína. La reactivación de la enzima por adición de Ca 2+ tras inhibición por EDTA fue un proceso dependiente de tiempo. Edificio Vinalopó Avenida de la Universidad s/n 03202. lo que sugiere la necesidad del Ca2+ para el mantenimiento de la conformación de la proteína. 3. Estos átomos pudieron ser sustituidos por Mn2+.5 Activadores e inhibidores de las fosfotriesterasas Diferentes fosfotriesterasas muestran diferentes respuestas a activadores e inhibidores. En plasma humano.O-dimetil 2. moleculares. Fax: (+34)966658511 4 .6 El calcio en las fosfotriesterasas de mamífero Se ha sugerido que el calcio puede desempeñar dos papeles en la hidrólisis de paraoxon por paraoxonasa. La actividad de la mayoría de las fosfotriesterasas depende en gran medida de la presencia en el medio de reacción de cationes inorgánicos que pueden actuar como inhibidores o activadores. El Ca2+ sería requerido principalmente para mantener la conformación del centro activo y.4 mM inhibió hasta un 69% una fosfotriesterasa de bacteria halófila.2-diclorovinil fosfato) fueron inhibidas por CdSO4. El Cu(SO4) a la concentración 1 mM fue un fuerte inhibidor (64%) de una parathion hidrolasa de origen bacteriano. Siempre que se ha descrito una actividad nueva se ha intentado establecer su similitud con la actividad paraoxonasa. El ion Zn2+ a la concentración de 0. La actividad fosfotriesterasa de esta bacteria resultó inhibida tras la incubación con agentes quelantes. Co2+. ya que esta actividad es la más conocida y estudiada a todos los niveles (bioquímicos. aunque dichas actividades fueron restablecidas adicionando concentraciones de Ca 2+ equivalentes a las de EDTA. Cd2+ o Mn2+ sin una pérdida significativa de actividad. Así. División de Toxicología. 3. 5-hexanodiona o metilvinilcetona y sus homólogos. Se ha propuesto que las fosfotriesterasas podrían haber evolucionado para metabolizar los OPs y los halometabolitos que existen en la naturaleza. los mamíferos presentan mayores niveles de actividades hidrolizantes de OPs y son más resistentes a sus efectos tóxicos. ELCHE (ALICANTE). como los análogos de la alanina. cuya distribución es de aproximadamente un 50% de ambos tipos en raza caucasiana.8 Reactivos de tioles y otros compuestos orgánicos Debido a que algunas fosfotriesterasas son inhibidas por reactivos bloqueantes de grupos tioles se ha sugerido que estas proteínas podrían presentar residuos de cisteína en su centro activo. 3. las aves presentan bajos niveles de actividad fosfotriesterasa y son particularmente sensibles a los efectos tóxicos de los OPs.__________________________________________________________________ División Toxicología La actividad hidrolizante de paraoxon en plasma humano presentó dos poblaciones fenotípicas bien diferenciadas. Fax: (+34)966658511 5 . esfingofosfolípidos y fosfoproteínas. La importancia del descubrimiento de baja actividad fosfotriesterasa en suero de pacientes con la enfermedad del "ojo de pez" (caracterizada por una opacidad corneal muy acusada y por alteraciones en las lipoproteínas plasmáticas) es desconocida. Sin embargo. SPAIN Tel: (+34)965222157. el ácido 2-aminoetil fosfónico y varios fosfonatos que se encuentran libres en las células y se incorporan a los glicerofosfolípodos. En ningún caso se ha descrito un sustrato endógeno pero parece clara su función en la destoxificación de xenobióticos organofosforados. Estas actividades no parecen vitales para la salud ya que en un estudio realizado con suero humano se comprobó que los individuos que carecían de actividad paraoxonasa no presentaban ningún desorden aparente. Esto ha llevado a sugerir la posibilidad de utilizar los niveles de actividad fosfotriesterasa como indicativo de la susceptibilidad al desarrollo de la arteriosclerosis coronaria.9 Función de las fosfotriesterasas Función biológica de las fosfotriesterasas A pesar del gran número de estudios realizados sobre fosfotriesterasas su función biológica continua desconocida. Más pruebas de la correlación entre niveles de fosfotriesterasas y susceptibilidad a efectos tóxicos Universidad Miguel Hernández. También se ha descrito el efecto inhibidor de determinadas cetonas como la 2. Así. Este compuesto aumentó la Vmax sin alterar la Km de la reacción. La actividad paraoxonasa de ambas poblaciones resultaron estimuladas por fosfatidilcolina. La actividad paraoxonasa ha sido detectada en mamíferos asociada a la fracción de lipoproteínas de alta densidad. La actividad tipo A resultó poco estimulada por NaCl 1 M mientras que la actividad tipo B fue fuertemente estimulada por esta alta concentración de sal. Papel de las fosfotriesterasas en la destoxificación de organofosforados Existe una correlación entre los niveles de actividad fosfotriesterasa y la resistencia a los efectos tóxicos de los OPs. División de Toxicología. Edificio Vinalopó Avenida de la Universidad s/n 03202. El OP mipafox resultó poseer un efecto inhibidor (70-90%) en algunas fosfotriesterasas bacterianas. la de tipo A (baja actividad) y la de tipo B (alta actividad). 3. 4 OBJETIVOS 4. SPAIN Tel: (+34)965222157. A pesar de ello.. el hecho de que se pudo alcanzar altas concentraciones de enzima disponible aumentando la superficie de nailon permitió que se pudieran hidrolizar altas cantidades de substratos. agentes quelantes y reactivos bloqueantes de grupos tioles sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo. División de Toxicología.. La siguiente figura muestra la reacción catalizada por la paraoxonasa. Estudiar el efecto de la incubación con EDTA. 4.__________________________________________________________________ División Toxicología de OPs es el hecho de que en estudios morfológicos con ovejas tratadas con haloxon se observó que aquellos animales con alta actividad fosfotriesterasa no mostraban ningún signo de polineuropatía retardada.1 Objetivo general El alumno estudiará la biodegradación enzimática de insecticidas organofosforados en un sistema biológico modelo caracterizando los efectos de cationes divalentes. para la detección de la presencia de éstos. Cu2+ y p-hidroximercuriobenzoato sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo. FOSFOTRIESTERASA OBJETO DE ESTUDIO Se estudiará la actividad hidrolizante de paraoxon en suero de conejo.2 Objetivos específicos El alumno deberá ser capaz de. Se han realizado estudios sobre la posible aplicación biotecnológica de fosfotriesterasas purificadas e inmovilizadas en trietil agarosa para la eliminación de residuos de OPs en agua. Calcular la actividad enzimática a partir de las mediciones de absorbancia. Fax: (+34)966658511 6 . e incluso para la destrucción de arsenales de armas químicas. 5 Aprender la técnica de determinación colorimétrica de la actividad paraoxonasa. ELCHE (ALICANTE). Aplicando este sistema a la fosfotriesterasa de Pseudomonas diminuta se consiguió que la enzima inmovilizada presentara unos parámetros cinéticos comparables a los de la enzima en estado soluble aunque la efectividad de la hidrólisis fue menor en la enzima inmovilizada. Además estas enzimas han sido utilizadas con éxito en el laboratorio para la profilaxis de intoxicaciones por OPs. Edificio Vinalopó Avenida de la Universidad s/n 03202. En la siguiente figura se observa cómo la fosfotriesterasa hidroliza el paraoxon liberando p-nitrofenol y ácido dietilfosfórico: O O (C 2H5O)2 P O NO2 Paraoxonasa (C 2H5O)2 P OH + HO NO2 PARAOXON Universidad Miguel Hernández. Ca 2+. Comprender la necesidad de realizar una recta patrón para el cálculo de la actividad enzimática. Preparación de los patrones de la curva de calibrado a partir de una disolución 100 µM de pnitrofenol en Tris 50 mM pH 8. SPAIN Tel: (+34)965222157.__________________________________________________________________ División Toxicología 6 PRECAUCIONES Deben respetarse las normas generales de seguridad aplicables en cualquier laboratorio y puestos de trabajo y las normas específicas indicadas en el laboratorio en donde se realiza la actividad.0 Concentración de p-nitrofenol (µM) Volumen (µL) 0 p-nitrofenol 100 µM (en H2O) Tris 50 mM pH 8.1 Determinación del p-nitrofenol liberado Como se muestra en la figura anterior. La cantidad de p-nitrofenol liberado se utilizará para monitorizar y cuantificar la hidrólisis del paraoxon. División de Toxicología.406 1. absorbe a una longitud de onda en torno a 400 nm. Edificio Vinalopó Avenida de la Universidad s/n 03202. tras restar el valor del blanco.208 Y=0. por lo tanto. En casos de duda debe siempre consultar al profesor o responsable del laboratorio.9941 1. A partir de ésta y de las absorbancias de las muestras.248 Pendiente del modelo lineal (y = ax) Coeficiente regresión de lineal (R2) Medida Nº 20 µM 30 µM 40 µM 50 µM 60 µM 70 µM 0.0235X R2 = 0. Se representará la media de la absorbancia de los patrones de p-nitrofenol. se calculará la concentración de pnitrofenol generado durante la hidrólisis (ANEXO I).515 0. Universidad Miguel Hernández. frente a la concentración conocida de dichos patrones. Debe informar de cualquier anomalía que observe. la hidrólisis enzimática de paraoxon genera p-nitrofenol.978 1.754 0. Cuando el p-nitrofenol se desprotona forma el ion p-nitrofenolato.569 Determina la absorbancia a 400 nm de las disoluciones patrón de p-nitrofenol (0 – 70 µM). ELCHE (ALICANTE). que es un compuesto de color amarillo y que.0 10 20 30 40 50 60 70 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 Resultados experimentales Absorbancia de los Patrones 0 µM 10 µM (Blanco) 1 0 0. 7 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 7. para construir una curva de calibrado. rotura de material o situaciones de peligro para los demás usuarios. Fax: (+34)966658511 7 . __________________________________________________________________ División Toxicología Universidad Miguel Hernández. Edificio Vinalopó Avenida de la Universidad s/n 03202. SPAIN Tel: (+34)965222157. ELCHE (ALICANTE). División de Toxicología. Fax: (+34)966658511 8 . Tras ello. Edificio Vinalopó Avenida de la Universidad s/n 03202. = 400 nm Tiempo (min) Tubo Acción 1.0) Pxn 10 17 44 Medida de Absorbancia 1 2 11 26 18 33 45 60 Absorbancia 400 nm.936 0.743 0. 2 y 3) manteniéndolos a 37ºC. se tratará de reactivar la enzima adicionando Ca 2+ suficiente para neutralizar el EDTA. T = 37ºC 2+ Tubo 1: 0 min EDTA + Reactivación Ca Tubo 2: 5 min EDTA + Reactivación Ca2+ Tubo 3: 30 min EDTA + Reactivación Ca2+ 1 0. Inicie el programa de tiempos que se muestra a continuación en tres tubos (tubo 1. ELCHE (ALICANTE).728 2 0.0 Ion cambia de color a pH=8 0 1 Añadir 100 µL EDTA 5 mM 0+ 1 Añadir 800 µL Ca2+ 5 mM 2 2 Añadir 100 µL EDTA 5 mM 4 3 Añadir 100 µL EDTA 5 mM 7 2 Añadir 800 µL Ca2+ 5 mM 10 1 Añadir 1000 µL paraoxon 4 mM Sustrato 11 1 Medir Absorbancia 1 17 2 Añadir 1000 µL paraoxon 4 mM 18 2 Medir Absorbancia 1 26 1 Medir Absorbancia 2 33 2 Medir Absorbancia 2 34 3 Añadir 800 µL Ca2+ 5 mM 44 3 Añadir 1000 µL paraoxon 4 mM 45 3 Medir Absorbancia 1 60 3 Medir Absorbancia 2 Resumen de Tiempos Tiempo (min) Tubo 1 2 3 EDTA 0 2 4 Adición Ca2+ 0+ 7 34 Datos Experimentales Muestra (Tris 50 mM pH 8. 5 y 30 min). División de Toxicología. 2 y 3 Añadir 100 µL suero conejo (1:10) Contiene la enzima 1. 2 y 3 Añadir 2000 µL Tris 50 mM pH 8. Programa de Tiempos 1 (Temperatura = 37 ºC).932 0.__________________________________________________________________ División Toxicología 7. Fax: (+34)966658511 9 .721 0. SPAIN Tel: (+34)965222157.2 Reactivación por Ca2+ de la actividad paraoxonasa de suero de conejo inhibida por EDTA Se inhibirá la actividad paraoxonasa de suero de conejo incubando la enzima con EDTA a diferentes tiempos (0.876 Universidad Miguel Hernández. T = 37ºC 1 0. División de Toxicología. SPAIN Tel: (+34)965222157.939 Efecto de agentes quelantes sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo Se determinará cómo afecta a la actividad paraoxonasa la incubación a 37 °C de suero de conejo con EDTA 1 mM durante 10 minutos.0) MB C (Ca2+ 0.0) 7.767 Universidad Miguel Hernández.4 Efecto de reactivos bloqueantes de grupos tioles sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo Se determinará cómo afecta a la actividad paraoxonasa la incubación a 37 °C de suero de conejo con p-hidroximercuriobenzoato 1 mM durante 60 minutos.5 mM en Tris 50 mM pH 8.061 0.5 mM Tris 50 mM pH 8.0) EDTA T (EDTA 1 mM en Tris 50 mM pH 8.0) MB T (p-OHMB 1 mM en Ca2+ 0.5 mM Tris 50 mM pH 8.110 0. Edificio Vinalopó Avenida de la Universidad s/n 03202.914 7. T = 37ºC 1 0.745 2+ Cu C (Ca 0.5 mM en Tris 50 mM pH 8.5 Absorbancia 400 nm. T = 37ºC 1 2 0. Datos Experimentales Muestra (Tris 50 mM pH 8.__________________________________________________________________ División Toxicología 7.780 2 1.0) EDTA C (Tris 50 mM pH 8.0) Absorbancia 400 nm.0) 2 1.781 0.764 1.767 0.113 0. Datos Experimentales Muestra (Tris 50 mM pH 8. ELCHE (ALICANTE).0) 2+ Absorbancia 400 nm.3 Efecto del Cu2+ sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo Se determinará cómo afecta a la actividad paraoxonasa la incubación a 37 °C de suero de conejo con Cu2+ 1 mM durante 60 minutos. Datos Experimentales Muestra (Tris 50 mM pH 8. Fax: (+34)966658511 10 .0) Cu2+ T (Cu2+ 1 mM en Ca2+ 0.821 0. 0 Añadir 600 µL Tris 50 mM pH 8. División de Toxicología.0 Añadir 600 µL Tris 50 mM pH 8. Edificio Vinalopó Avenida de la Universidad s/n 03202. Fax: (+34)966658511 11 .0 Añadir 300 µL Ca2+ 5 mM Añadir 300 µL Ca2+ 5 mM Añadir 600 µL EDTA 5 mM Añadir 1000 µL de paraoxon 4 mM Medir Absorbancia 1 Añadir 1000 µL de paraoxon 4 mM Medir Absorbancia 1 Medir Absorbancia 2 Medir Absorbancia 2 60 61 62 63 76 78 Cu2+ C Cu2+ C Cu2+ T Cu2+ T Cu2+ C Cu2+ T Añadir 1000 µL de paraoxon 4 mM Medir Absorbancia 1 Añadir 1000 µL de paraoxon 4 mM Medir Absorbancia 1 Medir Absorbancia 2 Medir Absorbancia 2 80 81 82 83 96 98 MB C MB C MB T MB T MB C MB T Añadir 1000 µL de paraoxon 4 mM Medir Absorbancia 1 Añadir 1000 µL de paraoxon 4 mM Medir Absorbancia 1 Medir Absorbancia 2 Medir Absorbancia 2 Universidad Miguel Hernández.0 Añadir 300 µL Ca2+ 5 mM Añadir 300 µL Ca2+ 5 mM Añadir 600 µL p-OHMB 5 mM 30 30+ 32 32 + 40 41 42 43 56 58 EDTA C y T EDTA C y T EDTA C EDTA C EDTA T EDTA T EDTA C EDTA C EDTA T EDTA T EDTA C EDTA T Añadir 100 µL suero conejo (1:10) Añadir 2000 µL Tris 50 mM pH 8. = 400 nm Tiempo (min) Tubo Acción Cu2+ C y T Añadir 100 µL suero conejo (1:10) Cu2+ C y T Añadir 2000 µL Tris 50 mM pH 8.0 0+ Cu2+ C Añadir 300 µL Ca2+ 5 mM 2+ 2 Cu T Añadir 300 µL Ca2+ 5 mM 2+ 2+ Cu T Añadir 600 µL Cu2+ 5 mM 20 20+ 22 22+ MB C y T MB C y T MB C MB C MB T MB T Añadir 100 µL suero conejo (1:10) Añadir 2000 µL Tris 50 mM pH 8. ELCHE (ALICANTE). SPAIN Tel: (+34)965222157.0 2+ 0 Cu C Añadir 600 µL Tris 50 mM pH 8.__________________________________________________________________ División Toxicología Programa de Tiempos 2 (Temperatura = 37 ºC). 658 28 0. Edificio Vinalopó Avenida de la Universidad s/n 03202.638 0.468 1. 814 34. Universidad Miguel Hernández. = 400 nm Tiempo (min) Tubo Acción Pollo Añadir 100 µL suero pollo (1:10) Pollo Añadir 300 µL Ca 5 mM Pollo Añadir 2600 µL Tris 50 mM pH 8.590 67.383 1.670 28.683 29.288 54.711 30.419 60. se calculará la concentración de p-nitrofenol generado durante la reacción de biotransformación (ANEXO I).809 1.691 29.515 64.0235) y de las absorbancias de las muestras.936 0.574 1.6 Efecto de la especie sobre la actividad paraoxonasa Se comparará la actividad paraoxonasa en suero de conejo y de pollo.645 70 A partir de la curva de calibrado (C = Abs/0.740 31. División de Toxicología.681 28.675 28.511 0. ELCHE (ALICANTE).489 0.0 Conejo Añadir 100 µL suero conejo (1:10) Conejo Añadir 300 µL Ca 5 mM Conejo Añadir 2600 µL Tris 50 mM pH 8.055 44.673 28.__________________________________________________________________ División Toxicología 7.894 1.659 1.165 49.638 0. SPAIN Tel: (+34)965222157.532 1.723 0. Fax: (+34)966658511 12 .658 28 0.404 0. Programa de Tiempos 3 (Temperatura = 37 ºC).064 0.255 0.976 41.979 Tiempo 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 Conejo [p-nitrofenol] Absorbancia C (µM) 0.0 0 Pollo Añadir 1000 µL de paraoxon 4 mM 1 Pollo Medir Absorbancia 2 Conejo Añadir 1000 µL de paraoxon 4 mM 3 Conejo Medir Absorbancia 6 Pollo Medir Absorbancia 8 Conejo Medir Absorbancia 11 Pollo Medir Absorbancia 13 Conejo Medir Absorbancia 16 Pollo Medir Absorbancia 18 Conejo Medir Absorbancia 21 Pollo Medir Absorbancia 23 Conejo Medir Absorbancia 26 Pollo Medir Absorbancia 28 Conejo Medir Absorbancia 31 Pollo Medir Absorbancia 33 Conejo Medir Absorbancia 36 Pollo Medir Absorbancia 38 Conejo Medir Absorbancia 41 Pollo Medir Absorbancia 43 Conejo Medir Absorbancia 46 Pollo Medir Absorbancia 48 Conejo Medir Absorbancia Resultados Tiempo 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 Pollo [p-nitrofenol] Absorbancia C (µM) 0.680 28. 234 47. deduciendo que hay una cisteina SH.723 3.939 Act enzimática C2-C1 ∆C*4/15 14. No debería producirse actividad.957 Act.192 1.0235) 1 2 33.787 El Cu+2 es un inhibidor competitivo . Fax: (+34)966658511 13 .926 7. (C = Abs/0.128 3. Relativa Act.894 Act.enz/ 10-2 392. ELCHE (ALICANTE).__________________________________________________________________ División Toxicología 8 INFORME FINAL Elabore un informe final sobre el trabajo realizado. ¿Qué se observa? ¿Cómo podría justificar estos resultados? Ca / EDTA = ((800*5)/4)/((100*5)/4) = 1000/125 = 8 =8/1 (2) Represente en una gráfica de barras las actividades enzimáticas de las muestras control y ensayadas en presencia de Cu2+ 1 mM. (C = Abs/0.917 C.613 195.767 7.enz/ 10-2 376. Añada cualquier otro comentario que considere pertinente.0235) 1 2 32. produciendo una menor actividad. Relativa Act.173 El Mg +2 se une al grupo tiol de la enzima e impide la actividad .110 0.914 Act enzimática C2-C1 ∆C*4/15 14. Edificio Vinalopó Avenida de la Universidad s/n 03202. ¿Cuál es el efecto del phidroximercuriobenzoato? ¿Cómo podría justificar estos resultados? Muestra MB C MB T Muestra MB C MB T Absorbancia 1 2 0. (3) Represente en una gráfica de barras las actividades enzimáticas de las muestras control y ensayadas en presencia de p-hidroximercuriobenzoato 1 mM. ¿Cuál es la razón concentración de calcio / concentración de EDTA en el volumen de reacción enzimática? Representar en una figura de barras la actividad enzimática en función del tiempo de incubación en presencia de EDTA.638 39.7 191.362 31. Universidad Miguel Hernández.511 47. (1) En el experimento de reactivación por Ca2+.702 38.234 32. División de Toxicología. SPAIN Tel: (+34)965222157. incluyendo las respuestas a las cuestiones que se plantean a continuación. ¿Cuál es el efecto del Cu2+? ¿Cómo podría justificar estos resultados? Muestra Cu2+ C Cu2+ T Muestra Cu2+ C Cu2+ T Absorbancia 1 2 0.113 0.764 1.952 C.781 1.767 0.745 0.319 1. 723 -0. SPAIN Tel: (+34)965222157. (C = Abs/0.149 33.enz/ 10-2 272. Relativa Act. ¿Cuál es el efecto del EDTA sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo? ¿Cómo se justifican estos resultados? Muestra EDTA C EDTA T Muestra EDTA C EDTA T (5) Absorbancia 1 0. Representa en una misma gráfica la concentración de p-nitrofenol producido como consecuencia de la actividad paraoxonasa cuando se utiliza suero de pollo y conejo. necesario para unir el sustrato a la enzima. Edificio Vinalopó Avenida de la Universidad s/n 03202. si es secuestrado por el EDTA . División de Toxicología. Hay dos tipos de calcio uno de alta afinidad y que facilita la cantividad en el centro activo y que es secuestrado por el EDTA y otro que mantiene la estructura tridimensional de la enzima.767 Act enzimática C2-C1 ∆C*4/15 10. Fax: (+34)966658511 14 .147 C.213 2. la enzima se desnaturaliza. ELCHE (ALICANTE). En el pollo no se produce tanta hidrolisis del paroxon porque no tiene enzima .780 2 1. ¿Cómo podría justificar estos resultados? ¿Qué especie será más susceptible a la exposición al organofosforado paraoxon? Explica por qué.638 Act.__________________________________________________________________ División Toxicología (4) Represente en una gráfica de barras las actividades enzimáticas de las muestras control y ensayadas en presencia de EDTA 1 mM.553 -0.746 El EDTA inhibe la enzima.821 0.936 45. por lo que será más sensible Universidad Miguel Hernández.346 -14.0235) 1 2 34. debido a que se une al Ca+2.061 0.191 32. En la presente práctica el producto coloreado que se forma es p-nitrofenol que se cuantifica midiendo la absorbancia a 400 nm. 5b) para calcular la concentración. 1) Donde n es el incremento en el número de moles p-nitrofenol entre el tiempo inicial (t0) y el tiempo i (ti). Por lo que se desprende que: c n V (Exp. División de Toxicología. 5b) Donde Abs es la absorbancia. obteniendo un modelo lineal (Exp. Edificio Vinalopó Avenida de la Universidad s/n 03202. 5a) (Exp. 1 UNIDAD = 1 U = 1 mol / min La actividad enzimática se define mediante la siguiente expresión: Act n n t ti t0 (Exp. ELCHE (ALICANTE). 5ab). emplearemos la definición de concentración y la ley de Lambert-Beer con el fin de obtener una expresión que permita calcular la actividad enzimática. Unidad Internacional (UI o U): cantidad de enzima que transforma 1 micromol (µmol) de sustrato por minuto de reacción en las condiciones de ensayo. y tanto a como b dos constantes obtenidas mediante el ajuste lineal. Teniendo en cuenta que los datos obtenidos en la práctica son medidas de absorbancia de p-nitrofenoly tiempo. Fax: (+34)966658511 15 . se representará la absorbancia de los patrones de p-nitrofenol frente a la concentración conocida de dichos patrones. La absorbancia medida para cada muestra se introducirá en el modelo lineal (Exp. SPAIN Tel: (+34)965222157. la concentración se define con la expresión que se muestra a continuación: c n V (Exp. n el número de moles de p-nitrofenol y V es el volumen de la disolución. Abs aC b ( Abs b) C a (Exp. 2) Donde c es la concentración. 3) Despejando n de la definición de concentración (Exp. En primer lugar. Universidad Miguel Hernández. 1) obtenemos: Act V c V c t ti t0 (Exp. y a continuación se calculará el incremento de concentración (C = C2 – C1) para cada muestra. 4) Con el fin de conocer C para cada muestra. C la concentración. 3) y sustituyendo en la definición de actividad enzimática (Exp.__________________________________________________________________ División Toxicología ANEXO I CÁLCULO DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA La actividad enzimática se expresará utilizando la unidad internacional. Fax: (+34)966658511 16 . 7) Universidad Miguel Hernández. SPAIN Tel: (+34)965222157. 4 y sustituyendo el valor del volumen total de reacción obtenemos la actividad enzimática a partir de los datos de absorbancia y tiempo obtenidos en el laboratorio. Sustituyendo la actividad enzimática (Act) de la Exp. 4 en la Exp. 6 obtenemos: Actrel V C V C Vs t Vs (ti t0 ) (Exp. ELCHE (ALICANTE).__________________________________________________________________ División Toxicología Introduciendo el valor calculado c en la Exp. 6) Donde Vs es el volumen de suero utilizado inicialmente. División de Toxicología. Edificio Vinalopó Avenida de la Universidad s/n 03202. Con el objeto de calcular la actividad enzimática relativa al volumen de suero utilizado (medido en mL) emplearemos la expresión: Act rel Act Vs (Exp. Incremento de concentración de p-nitrofenol producido por paroxonasa (µM)* Volumen de suero inicial (10µL = 10-2 mL)** Tiempo de medida en el momento i (medida de laboratorio)*** Tiempo de medida inicial (medida de laboratorio)*** Vs ti T0 Actividad enzimática relativa (Exp.110 32.968 214.932 31.234 14. PATRONES Absorbancia de los Patrones Medida Nº 1 Media-Bl.085 41. Enz.061 34.553 MUESTRAS PROBLEMA Tubo Absorbancia 1 2 30 µM 40 µM [p-nitrofenol] C1 (µM) C2 (µM) C (µM) Reactivación por Ca2+ de la actividad paraoxonasa de suero de conejo inhibida por EDTA 0 min 0.721 0.702 47.042553191 30 min 0.9787234 37.4680851 167.764 1.362 38. y en consecuencia el valor del volumen de suero inicial que se introduce en la Exp.515 0.27659574 6.767 33.319 392.61702128 39.936 45. 0 µM (Blanco) 0 0 µM 0 10 µM 20 µM 50 µM 60 µM 70 µM 0.876 30.7 191.781 1.29787234 Efecto del Cu2+ sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo Cu2+ C 0.681 39. ELCHE (ALICANTE). División de Toxicología.148 5 min 0.569 60 µM 59.191 32.553 Universidad Miguel Hernández.914 32.821 1.__________________________________________________________________ División Toxicología RESUMEN: Determinación de la actividad enzimática relativa al volumen de suero utilizado V Volumen de reacción enzimática.638 39.746 10. 7 la medida de tiempo en minutos.113 33.613 195.617 51.149 EDTA T 0.787 Efecto de reactivos bloqueantes de grupos tioles sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo MB C 0.404 1.173 Efecto de agentes quelantes sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo EDTA C 0. Fax: (+34)966658511 17 .936 30.914 31. (4 mL = 410-3 L) C Concentración (µM) calculada a partir de la absorbancia de la muestra (Abs) y del modelo lineal obtenido con los patrones (Exp. ** Las unidades de la actividad enzimática relativa son µmolmin-1mL-1. *** Introducir en la Exp.406 1.192 Act. 5ab): Abs aC b C C ( Abs b) a C = C2 – C1.128 7.745 0.978 1.754 0.208 Pendiente del modelo lineal (y = ax) 20 µM 30 µM 40 µM 50 µM 21.829 70 µM 66. 7) Act rel V C V C Vs t Vs (ti t0 ) * C calculada mediante la curva de calibrado (µM).743 0.9432624 376. Edificio Vinalopó Avenida de la Universidad s/n 03202.723 MB T 0.829 9.957 7. Rel.248 0.939 32.766 10 µM 10.767 0.65957447 8.213 -0.894 14.780 0.234 Cu2+ T 0. (µmol·min-1·mL1 ) 243.638 272.728 0.511 47. 7 tiene como unidades el mL.346 -14. SPAIN Tel: (+34)965222157.
Report "Degradación Enzimática de OPs Por Paraoxonasa"