UN IVERSI DAD AUTONOMA DE TLAXCALAUNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE TLAXCALA POR LA CULTURA L A LA J US A CI TI CIA S O POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS CENTRO TLAXCALA DE BIOLOGÍA DE LA CONDUCTA Degradación de hexadecano a partir del crecimiento de Fusarium oxysporum y Neurospora sitophila en fermentación líquida. PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN PRESENTA FERNANDO EFRÉN PALACIOS GARCÍA DIRECTOR DRA. MA. CARMEN SANCHEZ HERNANDEZ ASESORES DRA. TANIA VOLKE SEPÚLVEDA DR. RUBÉN DÍAZ GODÍNEZ Enero 2014 000. el hexadecano. Se estima que de 0.INTRODUCCIÓN Más de 2. de un 70 a un 97% de los hidrocarburos del petróleo es degradable (la fracción de hidrocarburos saturados y aromáticos) y el resto representa los asfaltenos y las resinas esencialmente inertes (Prince y col. las fugas y derrames son frecuentes durante el proceso de exploración. 1997). Los daños causados por la contaminación por HC son varios como: la reducción o destrucción de la vida marina. Estas moléculas pueden estar formadas de cadenas de átomos de carbono largas o cortas y que pueden adoptar diferentes estructuras. 1994). volatilidad y toxicidad propias. El petróleo contamina el ambiente en las diferentes etapas de su explotación. Los HC del petróleo pueden dividirse en cuatro categorías de compuestos: I. 000. IV. el decano. xileno y naftaleno agrupados también bajo la apelación BTEX y los poliaromáticos o PAHs (Rittman. II. La liberación de los hidrocarburos (HC) en el medio ambiente es la principal causa de contaminación de suelos y aguas (Holliger y col. Desde un punto de vista de biodegradabilidad. 1998).983 millones barriles/día (CIA World Factbook. particularmente. 2011). destrucción del hábitat de toda forma de vida silvestre. III. refinación. azufre y oxígeno. 2000). la contaminación del suelo con hidrocarburos causa daños masivos a la flora y fauna existente. reducción total o parcial de las playas costeras y sus animales. . El petróleo es un combustible natural compuesto de varios tipos de hidrocarburos. Los asfáltenos: grandes moléculas polares coloidales sin disolver que son más resistentes a la biodegradación (Balba. de moléculas que contienen básicamente. Los saturados: los alcanos como el hexano. En términos generales. 1999). modificación de la vida microbiológica presente en el suelo y agua. En México se producen 2. transporte y almacenamiento del petróleo (Das y Chandran. el octano. transporte y refinado (Vasudevan. de la contaminación ambiental (Jacobucci y col. tolueno. bajo diversas formas. y col.46 % (más de tres millones de toneladas) de la producción total del petróleo termina formando parte. 1999. 1994). Al-Daher. extracción. carbono e hidrógeno. Los aromáticos: benceno. Harris. Al-Awadhi.08 % a 0. Las resinas: sólidos polares amorfos disueltos que contienen nitrógeno. 2001). producción. Sin embargo.000 de toneladas métricas de petróleo son producidas por año en todo el mundo. El petróleo y sus derivados son la principal fuente de energía para las industrias y la vida diaria del ser humano. El petróleo y sus derivados constituyen una importante fuente de contaminación. Rajaram. los hidrocarburos pueden ordenarse de mayor a menor biodegradabilidad en: alcanos lineales > alcanos ramificados > aromáticos ligeros > alcanos cíclicos > aromáticos pesados > compuestos polares (Olson. los isoalcanos y los cicloalcanos como el ciclohexano. 2010). es decir. Cada una de las categorías agrupa compuestos con características de solubilidad. Por lo tanto. 1998). Particularmente. 2009). Además de no implicar los costos de equipos. sus alcances y consecuencias. son degradados más lentamente y después de haberse degradado los lineales (Rittman. los hidrocarburos del petróleo difieren entre sí por su susceptibilidad al ataque microbiano. Los tratamientos biológicos representan usualmente la mejor alternativa. materiales. productos y maquinaria necesarios para los tratamientos físicos y químicos.Los alcanos son moléculas químicamente muy estables en las que el esqueleto carbonado se encuentra saturado de hidrógeno. los alcanos son hidrocarburos saturados y son los principales constituyentes del petróleo en un 20 a 25% (Ulrici.Awadhi. pueden aplicarse sobre el sitio mismo de la contaminación. El hexadecano (HXD) es considerado como un compuesto modelo representativo de los alcanos. siendo estos últimos más hidrofóbicos (Balba. 2002). Se ha aislado y reportado un gran número de microorganismos con la capacidad para degradar hidrocarburos. El HXD es un HC de la familia de los alcanos (sin anillos ni enlaces múltiples) cuya fórmula química es C16H34. Venosa. 1996). es un sustrato selectivo ideal para aislar microorganismos capaces de degradar los alcanos (Wrenn. La biorremediación es definida como el proceso mediante el cual los microorganismos transforman o alteran (a través de reacciones de óxido-reducción) la estructura química de los contaminantes en el ambiente (EPA. Presentan estructuras lineales. Su estructura consiste en una cadena lineal de 16 átomos de carbono. La biodegradación de los hidrocarburos del petróleo es un proceso complejo que depende de la estructura molecular y de la concentración de los hidrocarburos en los sitios contaminados. ramificadas o cíclicas. en caso de una contaminación con petróleo. 2010). Los hidrocarburos provenientes de los productos petroleros pueden funcionar como fuente de carbono y de energía para el crecimiento de diferentes microorganismos que pueden de este modo. colonizar los sitios contaminados y degradar el agente contaminante (Thomassin-Lacroix y col. 1994). 2000). AlDaher. En la siguiente tabla se muestran los principales géneros microbianos que son capaces de utilizar alcanos como única fuente de carbono y energía. La biodisponibilidad es definida como el grado de interacción de los compuestos o contaminantes con los microorganismos (Harms y col. El hexadecano. El tratamiento biológico de descontaminación recibe también el nombre de biorremediación. de aquí la importancia de estudiar y entender la biodegradación. la susceptibilidad de los hidrocarburos a la degradación generalmente es considerada en el siguiente orden: alcanos lineales> alcanos ramificados> aromáticos pequeños> ciclo alcanos> hidrocarburos aromáticos policíclicos. Los ramificados conforman la mayor parte del petróleo. Se conocen varios factores que inciden en la degradación de los hidrocarburos pero uno de los más importantes es su baja biodisponibilidad para los microorganismos. . Los de cadena corta son más tóxicos que los de cadena larga. sin exigir el desplazamiento de los suelos contaminados. 1987). con tres hidrógenos unidos a cada uno de los dos carbonos extremos y dos hidrógenos unidos a los restantes 14 átomos de carbono (Morrison boyd. Al. hongos filamentosos u hongos dimórficos. con una tasa diaria cercana a un centímetro en medio papa. mientras que otros han evolucionado para ser patógenos obligados u oportunistas. Muchos de ellos viven como saprófitos descomponiendo materia muerta. 2007). Este hongo puede presentar dos tipos de morfología: una de tipo micelial caracterizada por la producción de abundante micelio aéreo. 2003. de blanco a rosado durazno. 1970) y una de tipo pionotal con la formación de poco o ningún micelio aéreo y abundantes microconidias. cosmopolita que existe en muchas formas patogénicas. destacando los géneros Acinetobacter y Pseudomonas como los más estudiados (van Beilen y col.dextrosa agar (PDA) a 25ºC. 2001). 2003. Es un microorganismo aerobio obligado. . Hongos Aspergillus Cladosporium Corollasporium Cunninghamella Dendryphiella Fusarium Gliocladium Lulworthia Penicilium Varicospora Verticilium Algas Prototheca Los hongos representan un reino que comprende una gran variedad de organismos eucariontes. hongos y levaduras. principalmente debido a sus sistemas enzimáticos de defensa que los protegen de compuestos exógenos tóxicos. Se caracteriza por crecer en gran variedad de mono y disacáridos como fuentes de carbono y digerir carbohidratos complejos como celulosa y almidón (Tatum 1961). Se caracteriza por producir colonias de rápido crecimiento. obteniendo nutrientes de sus huéspedes. Throne-Holst y col. parasitando más de 100 especies de plantas gimnospermas y angiospermas. El nombre del género. pero usualmente con un tinte púrpura o violeta más intenso en la superficie del agar y pocas microconidias (Booth. algodonoso. gracias a los diversos mecanismos que tiene el hongo para vencer las defensas de muchas plantas (Gottwald y col. que significa "esporas nervio" se refiere a las estrías características en las esporas que se asemejan a los axones. los alcanos son degradados principalmente por bacterias. con una coloración variable. Neurospora es un género de hongos ascomicetos. Bacterias Levaduras Achromobacter Candida Acinetobacter Cryptococcus Alcanivorax Debaryomyces Alcaligenes Hansenula Bacillus Pichia Brevibacterium Rhodotorula Burkholderia Saccharomyces Corynebacterium Sporobolomyces Flavobacterium Torulopsis Mycobacterium Trichosporon Nocardia Yarrowia Pseudomonas Rhodococcus Sphingomonas Streptomyces Adaptada de Van Beilen y col. morfológicamente clasificados como levaduras.Como se aprecia. Fusarium oxysporum es un hongo del género ascomycota. xenobióticos. Los hongos filamentosos han desarrollado una habilidad extraordinaria para adaptarse a los cambios ambientales. animales o plantas. En la ruta de degradación de alcanos Fig. así como en la catálisis de reacciones importantes para la producción biotecnológica de hormonas de plantas y humanas. Esta oxidación es realizada por lo general por aquellas cepas que co-oxidan los alcanos durante su crecimiento sobre otros sustratos por co-metabolismo. los hongos filamentosos juegan un papel crucial en la degradación y mineralización de una amplia gama de contaminantes ambientales. Ruta de degradación de los alcanos . Fig. Se han reportado varias rutas de oxidación de hidrocarburos de cadena larga. 2002).Consecuentemente. Posteriormente.1. El consumo de hidrocarburos se lleva a cabo mediante una serie de reacciones enzimáticas que comienzan gracias a un grupo de enzimas conocidas como oxigenasas o hidroxilasas. 1. Puede ocurrir también que los microorganismos degraden los hidrocarburos mediante una oxidación del grupo metilo subterminal para producir un alcohol secundario en vez del alcohol primario producido por la oxidación del grupo metilo terminal. la alcano monooxigenasa es la enzima clave que cataliza la oxidación inicial del metilo terminal del sustrato produciendo un alcohol primario: el 1-alcanol. el alcohol primario es oxidado hasta la obtención del ácido graso correspondiente y metabolizado siguiendo la β-oxidación (Whyte y col. Llanos y Kjoller. Radwan y col. Una vez biodisponible. aislaron cepas de suelos agrícolas contaminados en Francia y evaluaron su capacidad de degradar crudo (179 mg de crudo en 150 ml de medio de cultivo) en 30 días mediante cromatografía de gases (CG). concentración del surfactante y la biodisponibilidad (Perez y col. 2005) como en cultivos mixtos como los consorcios microbianos (Medina-Moreno col. alcanos ramificados (C2 metil undecano) y alcanos cíclicos (ciclohexano y ciclohexeno) (Parbery. La adición de agentes de superficie (surfactantes o emulsificantes) permite mejorar esta disponibilidad (Harris.0009 mg/L a 25°C) que puede presentarse en formas libres (gotas macroscópicas y soluble) y/o en formas emulsificadas (microgotas) (Mehrnia y col. (1999). La respuesta de los microorganismos degradadores de hidrocarburos a un agente surfactante dependerá de una serie de factores tales como la ultraestructura celular. Los surfactantes actúan logrando incrementar la biodisponibilidad mediante la acción paralela de la desorción y solubilización del contaminante (Jiménez y col. 2007. Graphium fruticolum. Antecedentes La mayor cantidad de reportes de hongos aislados de crudos han sido realizados en suelos contaminados.La biodisponibilidad de los hidrocarburos es esencial para su descomposición. los cuales están estrechamente relacionados (Helmy y col. Fusarium. El HXD es un sustrato de baja solubilidad en agua (0. de crecer en alcanos más grandes de C 10-C16 (Lowery y col. el cual fue aislado de un sistema de gasolina de avión (Jet fuel). con lo que aumenta su concentración en la fase acuosa (62 mg/L) (Quijano col. Aspergillus (17%) y Fusarium (6%). 2010. 1971. Penicillium. 1997). 1976). 2010) y con esto su biodisponibilidad. encontrando que las especies de los géneros Aspergillus. Graphium rubrum. Cladosporium y Gongronella poseían dicha habilidad. Cofone y col. . la capacidad de biodegradación o flujo de salida. Durante la biodegradación ocurren dos eventos principales: el consumo del sustrato y el crecimiento microbiano. Chaineau y col. Penicillium lilacinus y Petriella sp. Los géneros de mayor frecuencia de aislamiento en hidrocarburos fueron Penicillium (18%). Sin embargo la toxicidad e inhibición puede reducir el potencial de las aplicaciones en la biorremediación (Makkar y Rockne 2003). 2009). demostraron que este hongo es capaz de utilizar como única fuente de carbono y energía alcanos lineales de C 6 a C19. (1995) aislaron los géneros Aspergillus y Penicillium de muestras de suelos desérticos contaminados en Kuwait. Estudios realizados con el hongo Cladosporium resinae. Helmy y col. los hongos Scedosporium y Graphium fueron capaces de crecer en n-alcanos en el rango de gasolina (C5-C9) y gas natural (C1-C4) y los hongos Fusarium oxysporum. 1968. Acremonium. el HXD es una fuente de carbono y energía para muchos microorganismos tanto en cultivos puros (Pepi col. Trichoderma. Beauveria. 2009). Singh y col. siempre y cuando se encuentre en presencia de agentes surfactantes. 1973). 2005). 2005). 2008). De igual forma. Trichoderma sp. niger (YX/S) fue ligeramente mayor con 180 mg HXD/g PUF y se mantuvo prácticamente constante con 360. el hongo Cladosporium y por un consorcio utilizando los dos microorganismos anteriores. Los valores de biodegradación obtenidos son al menos 3 veces mayores que los obtenidos con limitación de N. pero con concentraciones de HXD 3 veces menores. P y K. es posible biodegradarlo. inmovilizado en un soporte inerte. Sugieren que el hongo Cladosporium es capaz de degradar tanto los hidrocarburos alifáticos como los aromáticos en el diésel. eicosanos (C19) (Hadibaratata y Tachibana. 2009). . en un cultivo sólido. además. 75 y Brii. Volke-Sepúlveda y cols. (2003) observaron que la utilización de HXD como HC alifático modelo. determinaron que hubo una degradación de 21% empleando de M. FI-70. su capacidad consumidora de HXD es mucho mayor que en un medio líquido (Volke-Sepúlveda y col. (2008) reportaron que hongos filamentosos como Aspergillus niger era capaz de degradar HXD en un medio sólido y líquido. Sin embargo. observaron una degradación de un 99% al utilizar el consorcio microbiano (Mycobacterium-Cladosporium). es capaz de degradar hasta 717 mg HXD/l en 15 días (VolkeSepúlveda y col. Mancera-López y col. estimulan el crecimiento de Pseudomonas eruginosa en HXD ya que puede mejorar su dispersión y pseudosolubilización en el medio. La velocidad de producción de biomasa (BM) se incrementó (hasta 3 veces) al aumentar la concentración inicial de HXD. hyalinum y de 34% para Cladosporium. Harris 1997 menciona que debido a la baja solubilidad de los hidrocarburos se necesita la acción de surfactantes para incrementar su biodisponibilidad y su metabolización por los microorganismos.La degradación de alcanos se ha demostrado para Aspergillus niger. permitió demostrar que. 540 y 717 mg HXD/g PUF. se ha observado que. El rendimiento en el crecimiento de A. 2006). y hasta 12 veces mayores que los encontrados en cultivo sumergido bajo las mismas condiciones de cultivo. 2007). 2003). Aspergillus ochraceus y Penicillium chrysogenum capaces de degradar n-alcanos (C13-C18) (Elshafie y col. en cultivo sólido. Breuil y Kushner señalan que los ácidos grasos C16 y C18 y los surfactantes Triton X-100. Este resultado demuestra que con relaciones C/N bajas se favorece la completa degradación de HXD y que la velocidad de degradación aumenta en función de la concentración del sustrato hidrofóbico. En un medio sólido. a concentraciones tan elevadas como 717 mg/g de espuma de poliuretano (PUF) y que la velocidad de biodegradación es proporcional a la concentración inicial de HXD. Li y col. (2008) estudiaron la degradación de hidrocarburos por Mycobacterium hyalinum. oxysporum y N. sitophila crecidos sobre 500. oxysporum y N. 1000 y 1500 mg de HXD/l. Aspergillus flavus. Trichoderma spp. 1989). Cuantificar la degradación y los productos generados después del crecimiento de F. Fueron identificados Aspergillus versicolor. 1000 y 1500 mg de HXD/L y cuantificar la degradación de este compuesto a través del tiempo de fermentación. (1989) encontraron que la adición de glucosa favoreció la degradación de 2.. Syncephalastrum spp. Neurospora sitophila. sitophila en una fermentación liquida con un medio que contenga hexadecano a concentraciones de 500. Uzoamaka y col. . sitophila crecerán en una fermentación líquida que contenga diferentes concentraciones de HXD (500. oxysporum y N.4-diclorofenoxiacetato y del metil-paratión mientras que la anilina favoreció la mineralización de dicloroanilina.1000 y 1500 mg de HXD/L) utilizándolo como única fuente de carbono. Objetivo general Evaluar el crecimiento de F. 2000. Rhizopus arrhizus and Mucor spp. sitophila crecidos sobre 500. Oudot y col. 2009 identificaron y aislaron un total de 12 hongos provenientes de tres sitios de suelos contaminados por crudo en Nigeria. Específicos: Determinar la tasa especifica de crecimiento de F. Sitophila crecidos en medio líquido.. 1000 y 1500 mg de HXD/l en fermentación líquida. Merkel y Perry (1977) reportan un aumento en la degradación del malatión en presencia de n. oxysporum y N. oxysporum y N. Determinar la concentración de azúcares reductores de los sobrenadantes del crecimiento de F.hexadecano.Se ha reportado que la adición de fuentes de carbono más fácilmente asimilables altera substancialmente la cinética de degradación de contaminantes orgánicos (Scow y cols. 1000 y 1500 mg de HXD/L. Scow y col. de los cuales 8 mostraron potencial para la biodegradación de hidrocarburos. Algunos de estos microorganismos ya han sido reportados como biodegradadores de hidrocarburos (April y col. Aspergillus niger. 1993) Hipótesis: Las cepas de F. Monitorear el consumo de oxígeno y producción de CO 2 a partir de la fermentación líquida en concentraciones de 500. El pH inicial de crecimiento se ajustara a 7. 10. KH2PO4. seguido de la retención de la biomasa a través de papel filtro Whatman No.05 ZnSO4. 0. 0. depositadas en el cepario del Centro de Investigaciones en Ciencias Biológicas (CICB) de la Universidad Autónoma de Tlaxcala. El progreso de la biomasa en función del tiempo X = X (t) se ajustará mediante la ecuación logística de Velhurst-Pearl: dX / dt = µ (1-X / Xmax) X La solución a la ecuación será la siguiente: X = Xmax / (1 + C*e-µ*t) Donde: µ = Máxima velocidad específica de crecimiento (h-1) Xmax = Valor de la biomasa máxima o de equilibrio (g/L) cuando dX / dt = 0 para X > 0. sitophila.05. Posteriormente se obtendrá el extracto crudo enzimático (ECE) que corresponde al sobrenadante de los cultivos cada 12h para la cepa de N. crecido a 25ªC durante 15 días en una incubadora orbital a 120 rpm. extracto de levadura. 2009). oxysporum por filtración.002. sitophila y cada 24 h para la cepa de F. conteniendo 50 ml de cada medio de cultivo a utilizar y 3 inóculos de 4 mm de diámetro tomados de la periferia de la colonia de la cepa previamente reactivada (F. oxysporum y N. Medios de cultivo Se prepararan cuatro medios de cultivo enriquecidos con glucosa y extracto de levadura (MGEL). t = Tiempo transcurrido en la fermentación (h) . Con tres replicas. K2HPO4. 0. CuSO4. 4. FeSO4. 2) MGEL + 500 mg de HXD/l. (Sánchez y Cols. 0.7H2O.H2O. 3) MGEL + 1000 mg de HXD/l y 4) MGEL + 1500 mg de HXD/l.4.7H2O.5. Se reactivará el inoculo de una colonia crecida sobre agar extracto de papa (PDA) a 20°C durante 7 días. Las condiciones de cultivo serán matraces Erlenmeyer de 150 ml. 0. Evaluación de la tasa especifica de crecimiento.Metodología Microorganismos Las cepas a utilizar serán F.7H2O. biomasa y obtención del extracto crudo enzimático Los hongos van a desarrollarse en el medio antes mencionado. 5. 1) Medio de cultivo MGEL conteniendo en (g/l): glucosa.25. MnSO4. 0. MgSO4.5 con HCl 1M. sitophila respectivamente). una vez que se encuentre retenida la biomasa sobre el papel Whatman se secará hasta obtener un peso constante y así poder realizar la cuantificación por diferencia de peso seco (AOAC 1990).6. 0. oxysporum y N. se detendrá la reacción cambiando el agua caliente por agua fría. La mezcla de reacción se llevara a ebullición en baño maría durante 5 min. J & W Scientific de 30 m x 0.0 . Varian. A 50 NL de EE se le adicionaran 2 ml de DNS y 950 nL de agua destilada. Determinación de la degradación de hexadecano e identificación de los productos generados después del crecimiento de los hongos. 2003). Consumo de O2 y producción de CO2 La producción de CO2 y consumo de O2 se cuantificara por respirometría. USA empleando un detector FID a 300 °C.X0 = Valor de la biomasa inicial (g/L) C = Valor que representa la relación entre la diferencia de X max y X0 (g/L): C = (Xmax – X0) / X0 Los parámetros cinéticos de evaluaran utilizando el programa Solver de Microsoft Excel (Viniegra-González y cols. La fase orgánica se analizara por cromatografía de gases previa correlación con una curva estándar. 1959). Determinación de azúcares reductores Se determinara la concentración de azúcares reductores en el EE mediante el método de DNS (acido 3. Para la determinación de la concentración residual de HXD en el medio de cultivo y para cada tiempo se llevara a cabo una extracción líquido-líquido (1:1 v/v) con una mezcla hexano acetona (1:1 v/v). columna DB-Petronarrow bore. Se leerá la absorbencia a 575 nm.25 mm y helio como gas acarreador. utilizando un cromatógrafo Modelo 3900. Posteriormente. Análisis estadístico El análisis se llevara a cabo aplicando un Análisis de varianza (ANOVA) utilizando el programa Graph pad Prism® version 6. (Velasco-Álvarez 2011).5 dinitrosalicílico) (Miller. Para finalizar se realizará una curva de calibración con concentraciones conocidas de glucosa. 0749 .0328 0.4 g/L de (NH4)2 SO4. 0. y una relación C/N del 5 donde la fuente de carbono es HXD y la fuente de N es (NH4)2 SO4. 0.0642 0.04% (400 µL/L).Resultados preliminares Para este trabajo se comenzó por realizar una prueba piloto. oxysporum utilizaría HXD como fuente única de carbono y energía.002. en la cual se pretendía comprobar que la cepa de F.25. El progreso de la biomasa en función del tiempo se ajustará mediante la ecuación logística de Velhurst-Pearl. Como surfactante se utilizó Tween 80 al 0. esto durante 15 días de fermentación y bajo dos diferentes concentraciones de HXD. Tiempo 0 24 48 72 96 120 144 X experimental g/L 0 0. 0. oxysporum previamente crecidas en cajas Petri con agar PDA. Para la concentración de 1500 mg/L de HXD se agregó 75 µL de HXD utilizando 1.05. ajustando el pH a 7. 0. FeSO4.7H2O.5. 0. que es el incremento de la población a lo largo del tiempo obtenido a través de la producción de biomasa por el método del peso seco constante. CuSO4.2 g/L de (NH4)2 SO4 como fuente de N y para la concentración de 500 mg/L de HXD se agregó 25 µL de HXD y 0. Por último la fermentación se realizó a través de 15 días por duplicado en una incubadora orbital a 120 rpm a 26°C. MnSO4.4. K2HPO4.0568 0. y por lo tanto no podrá ajustarse a la ecuación logística. Resultados Para la concentración de 1500 mg de HXD/L se obtuvieron los siguientes datos de biomasa producida respecto al tiempo.7H2O. 0.5 con HCL 1M. MgSO4. Las condiciones de cultivo fueron en matraces Erlenmeyer de 150 ml adicionando 50 ml de medio líquido y tres inóculos de 4 mm obtenidos de la periferia de la colonia de F. Se cuantificara el perfil de pH a través del tiempo de fermentación cada 24 h utilizando un potenciómetro.H2O. No se utilizó otra fuente de carbono como la glucosa.0586 0. Para esto se preparó un medio líquido que contiene (g/L) sales minerales.6. Los parámetros a evaluar en esta prueba fueron: La tasa específica de crecimiento.0618 0. KH2PO4. 0. Estos datos al ser muy bajos no pueden ajustarse a la ecuación de la línea recta ya que arroja valores negativos el Ln de la fase exponencial.05 ZnSO4.7H2O. 1123 0.425 6.1281 0. 0 24 48 72 96 pH promedio 7.2 7 pH Tiempo 6.4 7.575 6.168 192 216 240 264 288 312 336 0. 400 .45 6.44 6. Otro indicador de crecimiento fue el pH que se modificó al paso de la fermentación acidificando el medio de cultivo.0938 0.0765 0.2 0 50 100 150 200 250 300 350 Tiempo (h) Perfil de pH a través del tiempo de fermentación.0775 Esto puede deberse a que el microorganismo necesita de otra fuente de carbono más asimilable para poderse adaptarse al medio y posteriormente utilizar al HXD como fuente de carbono.885 6.79 6. Si este es el caso.0962 0.0922 0.6 6.345 6. el pH del medio disminuye.265 6. ya que se ha reportado que la adición de fuentes de carbono más fácilmente asimilables altera substancialmente la cinética de degradación de contaminantes orgánicos (Scow y cols.415 6.725 6.5 6. 1989).4 6.1012 0. La oxidación de los hidrocarburos produce ácidos grasos que son utilizados por los microorganismos o liberadas en el medio.6 7.42 7.45 6.495 6.8 6.675 120 144 168 192 216 240 264 288 312 336 6. 0436 0.052 0.6 7.635 288 6.Lo mismo sucedió para el medio con 500 mg de HXD/L tiempo X experimental g/l 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288 312 336 0 0.4 6.4 6.63 264 6.04369 0.0474 0.0564 0.0341 0.66 192 6. De igual forma se presentaron cambios en el pH inicial a través del tiempo de fermentación.051 0.0421 No produjo biomasa significativa a través del tiempo de fermentación.55 168 6.62 240 6.6 6.0485 0.78 96 6.47 336 6.77 72 6.5 24 6.865 48 6.0479 0.4 7.99 120 6.2 -50 0 50 100 150 200 Tiempo (h) 250 300 350 400 .725 216 6.0269 0. 7.52 144 6.0403 0.045 0.0413 0.8 6.535 312 6.2 7 pH Perfil de pH Tiempo pH promedio 0 7. No.. Johnstone.J. 32: 155-164.. M. Physiology molecular plant pathology. Canadian Journal of Microbiology. J. Fusarium oxysporum a pathogen of many plant species. 2004.. Journal of microbiological methods.289. P.. 38-49. 281. Das. N. Hydrocarbon-degrading filamentous fungi isolated from flare pit soils in Northern and Western Canada. 1999. K. 1970. T.. 6. Cabranes 2005. Utilization of hydrocarbons by Cladosporium resinae. 2000. N. 1988. Microbial degradation of petroleum hydrocarbon contaminants: an overview. S. Arlington. P.S. Foster.. Universidad de la Habana. Chaineau. M. A. Cuba. 57. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Sci Total Environ 227: 237–247. y Chandran. Cooney. E. 2000. oxysporum necesita de una fuente de carbono primaria más asimilable para adaptarse al medio y después poder metabolizar el HXD. Li. A.. April. H. 211. Ashby. Lorono. Booth. Bury. Balba.. J.. Va. Chaillan. L. .. J. Cofone. P. Walker J...4. F.2010. 1973. 1-13. Referencias AOAC. C.D. Tesis de Maestría.. Morel. El perfil de pH nos demuestra que existe un crecimiento debido a la acidificación del medio de cultivo en el cual al ajustar el pH inicial a 7. J. J Gen Microbiol 76: 243-246. 1990. Currah. Foght. Facultad de Biología.. D. 1998. Al-daher.. 63-75. Al-awadhi.M.W.. Cinética de Degradación de Bacillus alcalophilus cepa CBM-225 en hidrocarburos de petróleo. R.5 al final de la fermentación se determinó un pH de 6. Bioremediation of oil-contaminated soil: Microbiological methods for feasibility assessment and field evaluation. BOSLAND. 46(1). Bury. Davies. Oudot..Conclusión preliminar A partir de esta prueba podemos decir que la cepa de F. Fusarium oxysporum CMI descriptions of plant pathogenic fungi and bacteria. C. Evidence for a role of cutinase in pathogenicity of Pyrenopeziza brassicae on brassicas. Flèche.. K.. Association of official analytical chemists.. Phantavong. Oudot. 15th edition.L. Saliot. Biotechnology Research International. Comparison of the fuel oil biodegradation potential of hydrocarbon-assimilating microorganisms isolated from a temperate agricultural soil. Commonwealth Agricultural Bureaux. Res Microbiol 155: 587–595. 2011. A.. London. Dupont. E. J. Grimont. Advances in plant pathology. Y. R. J. I.. . 2010. Hadibaratata.. Springer. J. A. Smith. L. Jacobucci. Ambient. Ruhmann W. Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa. Gottwald S. Wisjnuprapto. Matsuura.. H. Reductive dechlorination in the energy metabolism of anaerobic bacteria. S. Rev. 1976.. of Applied Sciences in Environ. 181-187. A.E. P. U. Harris.W.Elshafie. pp. Li. Material proporcionado por Marc Gesnot en el lugar de realización de la práctica. Wohlfarth g. 1999.. Holliger c. Medina S. Y.L.H. Hydrocarbon bioremediation. Contribución al estudio de la hidrodinámica y transferencia simultánea de masa en biorreactores airlift de tres fases: producción de un consorcio microbiano degradador de petróleo. Jiménez D. Int.. H.Q.N. Diesel pollution biodegradation: Synergetic effect of mycobacterium and filamentous fungi.N. I. Bioremediation Environmental Science.. A.F. A. Tachibana. Degradation of diesel oil by biosurfactants producing bacterial strains. J. K. 22:383-398.. Y. 2010.. Jurtshuk. Diekert g. 2001. Biodegradation of crude oil and n-alkanes by fungi isolated from Oman. No se encontró más información. Albahry. 4 (3): 207-218. Gracida J.Q. Arch Microbiol 60: 246-254.. Microbial degradation of n-eicosane by filamentous fungi. Lizardi-Jiménez M. Al-Busaidi. Llanos. Tian. Contam. Kjoller. Bakheit. C.. A. Z.. . Changes in the flora of soil fungi following waste application. 1997. Computerized image analysis in Fusarium taxonomy. Helmy Q. Kardena E. Falconi.. 2009. Wick. Mycol. Vasconcelos.). Wu. Association of environmental health and sciences. 2000. Chapter 42: problems of hydrophobicity/bioavailability. C. A.. 26 (1) 65-84. 1968. N.E.. Yahya. Liu. C. L. S. 1439-1450.. 1999. F. Propiedades. FEMS Microbiol Rev. J. Harms. Tang. H... Durrant. aplicaciones y producción de biotensoactivos. Interdiscipl Studies Environ Chem 323–329. Foster. Lowery. Zhu. Sanitation. S. D.. 2008.. T. Contaminated soil sediment and water.H. 2007. The growth of various filamentous fungi and yeasts on n-alkanes and ketones I Studies on substrate specificity.. 103. Oikos 27: 377-382.. In: Handbook of hydrocarbon and lipid microbiology (Timmis K. Germeier C.. 21.C. Berlin... Performance of petrofilic consortia and effect of surfactant tween 80 addition in the oil sludge removal process. 206-214. 2011. S. Res. Ed. Mar Pollut Bull 54: 1692-1696. 2009. C. Applied Microbiological Biotechnology... Oudot. S.. Chávez-Gómez B. Loubière K. M. 2280–2292. No. Ábalos A. M. produces a new emulsifying glycolipid. G.. ANT-3b.. Soil management enhancing hydrocarbon biodegradation in the polluted Kuwaiti desert. Duport. 1995.. pp. Effect of surfactants on liquid-side mass transfer coefficients. Hasan. Pepi M... . Viñas M. R. 1.. P.. 2003. 51: 231-239.. Painmanakul P.. 151–160.. R. Morris. Camacho M.. R. R... I. Esparza-García F. Vol. E. 2005.. J. 1167-1173.. 60: 6480–6491. 2008. 2006. 265-270. Olson. Mietton-Peuchot M. 1999. F. 61. Baldi F. Varadaraj. Biological problems in jet aviation fuel and the biology of Amorphotheca resinae. Fiocco. 22. Rockne K. International Biodeterioration & Biodegradation. Aislamiento y selección de una cepa bacteriana degradadora de hidrocarburos a partir de suelos contaminados con petróleo. FEMS. Mills. 20:891-896. Revista CENIC Ciencias Biológicas. Fardoun. 44. Evaluación de los coeficientes de transferencia masa y cinéticos en un biorreactor de tres fases para la degradación de hexadecano. Liut G. 1993.. Gutiérrez-Rojas M.Makkar R. Lessard. 1971. oil-contaminated soil. 2005. Gómez J.F. M. 2005. Radwan.. Hydrocarbon biodegradation in oxygen-limited sequential batch reactors by consortium from weathered. R. and Cantero D. Environmental technology. Tesis de Maestría Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa.. G. B. Rodríguez-Vázquez R. Medina-Moreno S... 25. Environmental toxicology and chemistry 18(11): 2448-2453. Hébrard G. 1999. Biodegradation rates of separated diesel components. Bioremediation of an aged hydrocarboncontaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi.S. Canadian Journal of Microbiology. N. Roquebert. D.H. growing on n-hexadecane. Pérez R. Biodegradation potential of hydrocarbonassimilating tropiocal fungi. Comparison of synthetic surfactants and biosurfactants in enhancing degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Bioremediation as an oil spill response tool. Soil Biology and Biochemistry. Chemical. An antartic psychrotrophic bacterium Halomonas sp.. Parbery. Huerta-Ochoa S. S. J.. Prince... 53: 157-166. Microbiology Ecology. Saucedo-Castañeda G.. 10.... Engineering science. Sorkhoh. Herbert. Govantes G. Material and Organismen 6: 1161-1208. Environ Toxicol Chem Vol. Cesàro A. J. 2008. 39. No. Mancera-López M. Barrera Cortés J. Haloui.A. Roustan M.A.. C.S... K. strain DSM 17874. González.. K. 822-827. M. Damian-Matsumura. S.B. Australia. D. Eriksson. Scow. Cairns. 21-25. Velasco-Alvarez. 2 ed.. canadá. New Jersey. Smits. 21. T. I. P. N. Reimer. Hydrocarbon degradation potentials of indigenous fungal isolates from petroleum contaminated soils. K. Environmental Protection Agency. Biotechnology Advances 25: 99 – 121.. Environmental Protection Agency. B.E.B. M. 2002. Van Beilen...Rittman.O. Uzoamaka. Bioresource Technology. 59:551-556. Enhanced hexadecane degradation and low biomass production by Aspergillus niger exposed to an electric current in a model system. K. access date July 21... Quebec. 26: 409-411...H. Throne-Holst. M. International Mycological Congress.. Mohn.. 2009. Thomassin-lacroix. G. Diversity of alkane hydroxylase systems in the environment.. Oil and Gas Science and Technology. 2010. Applied microbiology biotechnology. Surfactants in microbiology and biotechnology: Part 2. Li. 2007. Applied Microbiological Biotechnology. Kotlar. 1989.S. W. H-K. T.. J Nat & Phys Sc 31: 16. M.. Glossary of technical terms: U. Biostimulation for on site treatment of weathered diesel fuel in arctic soil. Schmidt. Schmidt. A. 15091515. Gutiérrez-Rojas. O.. In situ bioremediation. Ward O. Applied and Environmental Microbiology. Ellingsen. M. 255 p. Effects of dissolved organic carbon and second substrates on the biodegradation of organic compounds at low concentrations. U. Duetz. and Alexander. Kinetics of biodegradation of mixtures of substrates in soil. Florence. 73 (10): 3327-3332. Noyes publication. 58 (4): 427-440. E. S. Bioremediation of oil sludgecontaminated soil. M. Identification of novel genes involved in long-chain n-alkane degradation by Acinetobacter sp... Sanchez. 2001. Floretta. Kertesz. T. 1985. J. 102. 49. Robson.. 2011. . D. Estados Unidos.A. Insolation and identification of dioctyl phthalate degrading fungi by enrichment cultures from soil. 2009. B.. Wentzel. M. Rajaram. Z. 703-708 Singh A. Witholt. M. 2007. S.. 2003. Soil Biol. P. 1994. Environment international.M. W. 2009. G. Van Hamme J. y Alexander. Zotchev. Biochem. FEMS Microbiology and Ecology. C. Favela-Torres E. 81-86 Volke-Sepúlveda.. T. Gutiérrez-Rojas. E. A. Pellizari. Favela Torres E. Gutiérrez Rojas M. A.W. Microbiol. 2002. 1583-1591. 97. Advantages of fungal enzyme production in solid state over liquid fermentation systems. M. V. Canadá.N.. Rómero-Gómez. Greer. 2006. A. Favela-Torres.. 1996. 2003. Wrenn. Aguilar.. Labbé.. 2003.. J. Bioresource Technology 87. C. Bioresource Technology. Biodegradation of hexadecane in liquid and solid-state fermentations by Aspergillus niger. 41 (2): 141-150. Can.J. Augur. J. Biodegradation of high concentrations of hexadecane by Aspergillus niger in a solid-state system: kinetic analysis.P. 13.L... Prevalence of alkane monooxygenase genes in Arctic and Antarctic hydrocarboncontaminated and pristine soils.157-167. DíazGodínez. Volke Sepúlveda T. B. Schultz. C. L....G.. van Beilen..B.. G. Luz. Whyte. Selective enumeration of aromatic and aliphatic hydrocarbon degrading bacteria by a most-probable-number procedure. Venosa. Biochemical engineering journal.. S.Viniegra-González G. .
Report "Degradación de hexadecano por hongos filamentosos"