CUANTIFICACIÓN DE ADN POR ESPECTROFOTOMETRÍA DE UV-VISIBLE YVISUALIZACIÓN POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA 1 Oscar Luis Gómez V. (20132150025); Miguel Ángel Fandiño. (20131150070); Manuel Andrés Prieto S. (20131150037). 2 Heidy Narváez 1,2 Universidad Distrital Francisco José de Caldas 1 Estudiantes-Bilologia Molecular 2 Profesora-Biologia Molecular Bogotá D.C 25-septimebre-2017 RESUMEN La técnica más común para cuantificar el ADN y evaluar su pureza es por medición de la densidad óptica o absorbancia, lo cual nos permite apreciar una longitud de onda a un máximo de absorción de luz, donde se puede cuantificar el ADN. Por otra parte la electroforesis en gel de agarosa es una técnica ampliamente utilizada para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Se reportan en este informe los datos cuantitativos de la cuantificación de 3 muestras de ADN (Genómico, plasmídico y problema) detectados a través de la técnica de espectrofotometría de UV-visible, condicionando particularmente la respuesta espectral de 260 nm de una fuente de radiación ultravioleta, y su posterior visualización y separación electroforética en gel de agarosa. Estos primeros resultados tanto espectrales como electroforéticos permitieron la cuantificación y visualización de los niveles de ADN en cada una de las muestras trabajadas, concluyéndose de esta manera las bajas concentraciones para el caso de ADN plasmídico y muestra problema y alta concentración para el ADN genómico. PALABRAS CALVES Ácidos nucleicos, electroforesis en gel de agarosa, cuantificación de ADN, espectrofotometría UV, concentración de ADN, Marcador de peso molecular. ABSTRACT The most common technique for evaluate the DNA and its purity is by measuring the optical density or absorbance, allowing us to appreciate a wave length to a maximum of absorption of light, where the DNA can be quantified. On the other hand the agarose gel electrophoresis is a technique widely used for analyzing and characterizing nucleic acids of different origins. Are reported in this report quantitative data of the quantification of 3 samples of DNA (Genomic, plasmid and problem) detected through the technique of spectrophotometers UV-visible, particularly conditioning the spectral response of 260 nm a source of ultraviolet radiation, and its subsequent visualization and separation in agarose gel electrophoretic. These first both spectral results as electrophoretic allowed the quantification and visualization of the levels of DNA in each of worked samples, concluded in this way low concentrations for the case of DNA plasmid and It shows problem and high concentration for Genomic DNA. KEY WORDS Nucleic acids, agarose gel electrophoresis, DNA, DNA, molecular weight marker concentration, UV spectrophotometry quantification [3] La electroforesis en geles de agarosa es una de las técnicas analíticas utilizadas en la caracterización de ácidos nucleicos en base a la forma y tamaño de las moléculas. producto de los grupos fosfatos en el ADN y el ARN. quedándose en la región superior del gel. De esta forma. Esta técnica se basa principalmente en una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN.1.es/tecnicas/elfo/inicio. las moléculas cuantificación de ADN es la reacción en de DNA o RNA sometidas a electroforesis se cadena de la polimerasa (PCR). sin embargo. fenol. y se ven las (electroforesis) por compuestos como el bandas correspondientes a las muestras de bromuro de etidio.[1] mientras que la espectrofotometría de la luz UV que se realiza principalmente en muestras puras (no contiene cantidades significativas de contaminantes como proteínas. resulta en una migración de las moléculas hacia el ánodo cuando se aplica un campo eléctrico. la estimación de los ácidos cuando se ilumina con luz ultravioleta. Las moléculas de mayor tamaño tendrán Otra técnica ampliamente usada es la dificultad para pasar por los poros de la espectrofotometría de luz UV en la cual se . agarosa Tomado de o incluso otros ácidos nucleicos). nucleicos se puede llevar a cabo por la Posterior a la electroforesis. una de las electroforesis.6-anhidrogalactosa altamente Figura 2. Tomado de ( https://askabiologist. La carga neta negativa.asu. Por el contrario. mientras que los fragmentos de menor TECNICAS DE CUANTIFICACION tamaño se movilizarán con facilidad. se le añade de ADN o ARN es muy pequeña.[2] DNA aplicado (imagen 2) y los marcadores de peso molecular. reproducibilidad y eficiencia.[3] que se puede llevar acabo en muy poco tiempo. presenta electrophoresis/ Moviendo a través de la matriz} una resistencia al movimiento (imagen 1). si la cantidad En el caso de los geles de agarosa.uah. negativa. o si la bromuro de etidio. sustancia que se intercala muestra contiene grandes cantidades de entre las bases del DNA y es fluorescente impurezas.[2] En la cuantificación de ADN se pueden utilizar diferentes técnicas como las Estos geles se colocan en la cubeta de espectrofotométricas.edu/agarose-gel- hidrofóbico) en la sal del tampón. su medición Figura 1-caja para electroforesis (http://biomodel. sin embargo. Introducción matriz. formada por la agarosa (un polisacárido ramificado de unidades de D-galactosa y 3. sumergidos en un tampón de técnicas más innovadoras para la pH entre 8 y 9. se visualiza el intensidad de fluorescencia emitida gel con una lámpara de luz UV. la cual se desplazarán al polo positivo esto debido a que caracteriza por ser una técnica de alta en pH superiores a 5 poseen carga sensibilidad. alcanzando la parte inferior del gel. la matriz.htm/Modos de disposición mediante espectrofotometría de luz UV del soporte) absorbida por las bases nitrogenadas es la más adecuada. O.O. µg. tiene su información genética en los proporciona un estimado de la pureza de la plásmidos su genoma tiene un total de 5000 muestra.260:D. regulan su propia La levadura de cerveza (Saccharomyces replicación a través de una proteína o RNA cerevisiae Meyen ex E.mL-1 de ADN cadena pocos elaboran macrocapsulas y no fabrican sencilla. Debido a su rapidez. decarboxilasa de linasa.) a LA ESCHERICHIA COLI longitudes de onda de 260 nm y 280 nm. En su sobrevivir como lo son la resistencia.280) de siguiente factor sigma. simplicidad la cuantificación de ADN por espectrofotometría ha sido ampliamente utilizada. la fertilidad haploide y otra diploide.toma lecturas de la Densidad Óptica (D. del cromosoma de ADN y está separada de este mismo.O. a 33 µg.8 a 2 valores por debajo de este rango son un indicativo de contaminación con proteínas o fenol. tienen un solo origen de replicación.O. presentan las siguientes características esenciales: es SACCHAROMYCES CEREVISIAE bicatenario y de forma circular. Por otro segmentos de ADN.0.Hansen. con una sola lectura a 260 nm permite calcular la cadena espiral de DNA móvil. [2] Los plásmidos son fragmentos extracromosómicos de ADN que se presentan en el citoplasma de los procariotas. a 20-30 µg-mL-1 de esporas. y muy doble cadena.260:D. una capacidad de degradar sustancias.mL-1 de RNA. esta técnica es poco sensible.O. cerveza y vino. un tipo de siempre los mismos puesto que codifican para levadura utilizado industrialmente en la enzimas que les dan ventaja para poder fabricación de pan. cerevisiae es uno de los modelos más y para combinarse con otros segmentos de adecuados para el estudio de problemas ADN para formar ADN recombinante que biológicos. Es un sistema eucariota. de represor. La Es un bacilo gramnegativo. [5] 1. sin embargo. Las preparaciones puras de ADN genes y su transcripción se encuentra el deben tener un valor (D.O.C. muchas cepas aproximadamente a 50 µg-mL-1 de ADN producen una pequeña microcapsula. Su facilidad para la reproducción S. Una aerobio facultativo. pueden aparecer uno o varios en una Saccharo azúcar. los genes no son cerveza) es un hongo unicelular.280) 27 glucosa.260 de 1. Ambas formas se y virulencia. con una puede generar varias copias de esta misma complejidad sólo ligeramente superior a la de son una característica muy importante para la bacteria pero que comparte con ella que se usen como medios de clonación para muchas de sus ventajas técnicas. aerobio y concentración del ADN en la muestra. co flagelos peritricos. myces hongo y cerevisiae sola célula procariota. la ciclo de vida alternan dos formas. La D. y para la mayoría de los espectrofotómetros se requiere una concentración de ADN de al menos 1 µg-mL- 1 en la muestra para poder realizar estimaciones válidas. La relación entre las fermentación de manitol y gas a partir de la medidas a 260 y 280 (D. En las pruebas bioquímicas es oligonucleótidos entre 20 a 40 bases y a 40 positiva al indol. corresponde mayoría forma fimbrias y pilis. esta molécula es independiente reproducen de forma asexual por gemación.[4] . La escalera se disuelve FABRICANTES en tampón TE.03% xylene cyanol FF. aproximada de de amplio espectro de doble cadena de ADN en gel de agarosa. 1000. el marcador y el map de vectores 10 mM Tris-HCl (pH 7.5%) 36 ° C ± 1. análisis rutinario de ácidos nucleicos mediante electroforesis en gel y transferencia. Note that the electroforética.coli pET23 GeneRuler ™ de 1 kb es diseñado para el .com/content/sfs/manuals/MAN0013004_Ge materiales que pueden cambiar según su neRuler_1kb_DNALadder_250ug_UG.03% SeaKem LE AGAROSE 500G de Lonza bromophenol blue. 500. la escalera La fase haploide permite generar. del e. The f1 origin is oriented so that Especificaciones analíticas Temperatura de infection with helperphage will produce gelificación (1. 2016. 3000. 250.200 g / cm². haploide contiene 16 cromosomas que varían 750. 1 mM EDTA.pdf> [accessed 2 October 2017]) fabricante y tipo. so the T7 expression regionis proteínas en aplicaciones tales como reversed on the circular map.snapgene.lado. single-stranded sequencing should be performed using the T7 terminator primer (http://www.com/9569-Agarose-Low-EEO/1893717- (Cat. 6000. 5000. purificada fragmentos individuales de ADN mientras que en la diploide se pueden realizar (en pares de bases): 10000. por lo que a continuación se puede encontrar la información de la Storage Buffer sacarosa. estudios de complementación. 2000.(Thermo Fisher Scientific. 2500.5 ° C virions containing single-stranded DNA that Temperatura de fusión (1. 0.Therefore. SeaKem® LE Agarose es ideal para el 60% glycerol and 60mM EDTA. 1500.com/resources/plasmid__files/pet_and_duet_vect ors_(novagen)/pET-23b(+)) GeneRuler 1 kb DNA Ladder La Escala de ADN Thermo Scientific ™ Map general de e.coli (pET 23ª).6). Una levadura 4000. 1–2 En técnicas como la electroforesis se utilizan <https://tools. Contiene tres bandas de en tamaño de 200 a 2200 kilobases (kb). aislar y se compone de catorce cromatografía caracterizar mutantes con mucha facilidad. Debido a su by the absence of the lacI gene. SeaKem® LE también se sequence is numbered by the pBR322 recomienda para la electroforesis en gel de convention. del gel (1%)> 1. tinción promoter insteadof the T7 lac promoter and SYBR® Green o GelStarTM.6). el ADN tendrá una alta movilidad are shown on the circlemap. [6] referencia de (6000. 3000 y 1000 pb) para ESPECIFICACIONES DE LOS una fácil orientación.5%)> 90 ° C Fuerza corresponds to the coding strand. la ausencia de patogenicidad permite su dimensionamiento y la cuantificación manipulación con las mínimas precauciones. 3500.thermofisher. The Ouchterlony e inmunodifusión radial (RID) cloning/expression region of the coding strand transcribedby T7 RNA polymerase is Especificaciones / Características shown below.biocompare. 0. 6X DNA Loading Dye 10 mM Tris-HCl (pH 7. 8000. Man0013004. 69337-3) (novagen/ SeaKem-LE-AGAROSE-500G/#detallesdelproducto) http://www. ‘Product Information GeneRuler 1 Kb DNA Ladder’. The pET-23a-d(+) Cada gel resuelve agudamente el ADN y proporciona una resolución consistente de un vectors carry an N-terminal T7•Tag lote a otro.No. These vectors DNasa o RNasa y forma geles fuertes con differ from pET-21a-d(+) by the “plain” T7 bajo fondo sobre bromuro de etidio. Unique sites baja EEO. Esta agarosa de grado de biología ®sequence plus an optional C- molecular no tiene actividad detectable de terminalHis•Tag ®sequence. 440 2.com/resources/plasmid__files/pet_and_duet_vect agorose Lonza 50009 ors_(novagen)/pET-23b(+)/ 2. como evidencia la ecuación 1. ----.Dimensiones de la caja para electroforesis µg\mL Pureza 100.8 𝑔𝑟 𝑔𝑟 𝑎𝑔𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 = 100 𝑐𝑚3 ∗ 99 𝑐𝑚3 (1) 𝑔𝑟 𝑎𝑔𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 = 0.583 λ = 260 nm 2.637 λ = 280 nm 1. ----- Conc 90.111 λ = 320 nm 0. y agarosa de tipo seaKem le http://www. utilizada 𝑉 = 𝐴∗ℎ∗𝑏 𝑉 = 9𝑐𝑚 ∗ 1𝑐𝑚 ∗ 11𝑐𝑚 𝑉 = 99 𝑐𝑚3 0.768 0.792 𝑔𝑟 Se implementó como marcador de peso molecular GeneRuler 1 kb DNA Ladder tomado de (figura 2).612 Figura 3-caja para electroforesis empleada.898 2.474 2. Figura 4-Marcador de peso molecular de thermo scientific Los datos de absorbancia para cada muestra se evidencian en la tabla 2 Tabla 2-Medidas de densidad óptica para la concentración de ADN A ADNplas ADNgeno Muestraprob λ = 230 nm 1. λ = 330 nm ----.50 101.30 106. [5].snapgene.7 75.634 0. 3.874 2.636 1.1 103. Metodología Tomado de la GUÍA 2 DE CUANTIFICACIÓN Y VISUALIZACIÓN DE VARIOS TIPOS DE ADN POR ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA de la profesora Heidy Narváez. Resultados Se preparó la solución de gel de agarosa teniendo en cuenta el volumen de la caja electroforética.909 2.1 Dimensiones Ancho Alto Largo 9 cm 1 cm 11cm .25 Tabla 1. Los factores de diluciones para cada Tabla 6-pureza de la relación de absorbancias muestra de ADN se encuentran consignados en la tabla 3 pureza ADN ADNplas ADNgeno Muestraprob 1.350 A260/A280 para cada muestra de ADN Tabla 3-factores de diluciones para cada una de las muestras empleadas Factor de ADNplas ADNgeno Muestraprob dilución µL Tabla 7-pureza de la relación de absorbancias 2/90 2/90 2/90 A260/A230 para cada muestra de ADN La concentración de ADN puede ser pureza ADNplas ADNgeno Muestraprob estimada ajustando la absorbancia de λ = ADN 1.866 1. ecuación 4 𝑨𝟐𝟔𝟎 𝐴260 − 𝐴320 𝑷𝒖𝒓𝒆𝒛𝒂 𝑨𝑫𝑵 ( )= 𝑨𝟐𝟖𝟎 𝐴280 − 𝐴320 𝑨 𝐴 −𝐴 𝑷𝒖𝒓𝒆𝒛𝒂 𝑨𝑫𝑵 (𝑨𝟐𝟔𝟎 ) = 𝐴260 −𝐴320 (4) 𝟐𝟑𝟎 230 320 . ecuación 2.006 2.366 2. después de ajustar el valor de turbidez.0 = 50 Para realizar la electroforesis se contó con µg\mL de ADN puro.027 260 nm con la medición de turbidez.456 1.180 0. multiplicándolo por el factor de dilución y la relación de λ = 260 de 1. [5]. 6 grupos donde se dividió el proceso electroforético de la siguiente manera 𝑪𝒐𝒏𝒄 𝑨𝑫𝑵 (µ𝐠\𝐦𝐋) = (𝑨𝟐𝟔𝟎 − 𝑨𝟑𝟐𝟎 ) ∗ (𝒇𝒅) ∗ 𝟓𝟎 (2) Tabla 4-concentraciones de ADN para cada una de las muestras Ubicación de las Concentración ADNplas ADNgeno Muestraprob muestras ADN 2.802 1.248 1.212 0. grupo 6 po6 𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝒅𝒆 𝑨𝑫𝑵 (µ𝒈) = 𝑪𝒐𝒏𝒄 𝑨𝑫𝑵 ∗ 𝑽𝒐𝒍 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 (3) Tabla 5-Rendimiento de ADN para cada una de las muestras Rendimiento ADNplas ADNgeno Muestraprob ADN 0.25 de ADN trabajadas Para determinar el rendimiento tola de por el ADN se implementa la ecuación 3.202 Figura 2-Ubicacion de las muestras de ADN La pureza de la muestra se obtiene trabajadas por cada grupo de laboratorio mediante la relación A260/A280. 8 mejor para el análisis electroforético de %. poros de este gel serán más grandes por lo reciclaje y la recuperación del ADN. menores serán los poros por donde migrara el ADN y si este se encuentra en menor tamaño se le facilitara migrar por Al igual que similitudes. deseado e nucleasas presentes de esta. son el buffer TBE y buffer TAE.Comparación entre los dos buffer utilizados Tris (Tris. cuya 4. Acético. la capacidad de taponamiento. estas dos el gel. este buffer proporciona el medio para la migración a través de la corriente eléctrica y mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza la corrida. ácido bórico y ácido acético respectivamente. corren más rápido y tiene mayor Determinando la concentración de capacidad de discriminación en gel de agarosa que se debe usar. Los diferentes componentes de estos buffers se describen a continuación: Tabla 8. Ácido más estable y tiene una capacidad de . tanto se debe usar un ADN que contenga una considerable concentración. la agarosa más concentrada. EDTA). los migración. con lo que se En la preparación del gel de agarosa hay responsable del ajustar el pH evita que las posibles que tener en cuenta que la concentración taponamiento. depende del tamaño del ADN que Regulación del igual que el degraden el ADN de se encuentre en la muestra. anterior. la cual tiene un estimado de pesos fragmentos grandes de ADN (900 – molecular de 500 pb a 15 kb debido a la 2000bp y el TBE para fragmentos concentración de ADN contenido. En la solubilización de la agarosa se realiza con capacidad de taponamiento El TBE es una solución buffer TAE (Tris. para electroforesis. pequeños de ADN (100 – 500bp) ya que. Bórico/Ácido EDTA Figura 3-electroforesis de ADN para cada muestra de Acético: ADN aminometano) Quelante de cationes divalentes. Para solubilizar la agarosa hay dos soluciones tampón muy usadas para separación de fragmentos de ADN mediante electroforesis. a la muestra mayor concentración en el gel de agarosa TAE mantenerlo. que sólo se diferencian en un compuesto. En este En la migración se tiene que El TAE es caso se realizó una concentración de 0. y de manera análoga si la soluciones puedes ser distinguibles por. Ácido (hidroximetil). Análisis de Resultados Buffer función es secuestrar TBE Molécula Contribuye a Mg2+. ya que a Buffer pH. la concentración de agarosa es menor. hace en 3 corridas electroforéticas. esté llevando a cabo perfectamente. lo que provoca una recuperación baja del ADN. si esto ocurre las muestras pueden salir del gel y perderse el corrido. que es un agente mutagénico y su función se limita a indicar la presencia del ADN. se emplea un buffer de carga. lo que influye bastante en la capacidad de reciclaje de estos dos buffers. Otra de las sustancias que ayuda a solubilizar la agarosa. densidad y color a la muestra lo que facilita la deposición en el pozo y evita la salida del gel. Y por último se tiene la facilidad con que el ADN puede ser recuperado del gel. La visualización del corrimiento del azul de bromofenol Figura 6. hay que tener en cuenta que el marcados de . el cual tiene como finalidad brindar peso. o más bien que se adiciona en este gel es el Bromuro de etidio. GENO: ADN genómico. Para la siembra. MUE P.taponamiento más alta que el TAE. y al estar intercalándose en las bases de la doble hélice del ADN por su estructura plana puede indicar la presencia del ADN. mientras que el TAE lo este con las muestras de ADN.Electroforesis después de media hora corrida. Muestra problema. Ya se empieza la electroforesis asegurando un voltaje de 100 voltios durante una hora. azul de bromofenol o azul de xileno y glicerol. lo que peso se debe sembrar en lugares hace que pierda sus propiedades después estratégicos para después poder comparar de 3 o 4 dias. el TBE tiene una interacción pegajosa con la agarosa. de pH 8. esto se debe realizar con mucho cuidado ya que no se debe pinchar el gel. asegura que en efecto la electroforesis se PLAS:ADN plasmídico. Figura 5.Electroforesis. A la hora de tener listo el gel de agarosa se procede a sembrar las muestras de ADN en los pozos determinados. este buffer de carga o loading buffer contiene Tris-HCl. Mp: marcador de peso. Este compuesto emite una fluorescencia cuando se expone a radiación UV. que por su bajo plasmidico. que se reportan en la tabla 6. logrando que este relajada (open circle). carbohidratos y entre 1000bp y 1500bp. Para durante parte del gel. Por lo muy baja lo que se asocia a la presencia anterior este no puede ser comparado con de proteína y fenol (si este se usó para la el marcador de peso para estimar su extracción). coli de 1000bp y de 1500bp. Por otra parte. muestra problema a partir de presenta una barra tenue y continua espectrofotometría y electroforesis. Lo anterior que si el procedimiento no realiza con los nos brinda una nueva idea de que la cuidados necesarios. determinar que se encuentra en la región Con frecuencia se utilizan cepas de E. que la muestra problema se encuentra ácidos hidroxamicos. donde se tuvo en cuenta la confirmar el vector bacteriano. lo que evidencia que el primer caso se partió de las su extracción no se realizó correctamente. Sino al contrario se observa Implicadas en este proceso.8 y comparándolos con los datos como lo vemos en la figura 8.8 lo que se características de dicho ADN. Sin embargo. lo que nos péptidos . esto porque hasta por las facilidades que esta presenta aun ahí llega el desplazamiento. absorbancias a diferentes longitudes de (se recomienda repetir este proceso) onda de muestra de ADN genómico y mencionando también. nivel de brillo su concentración de ADN Para obtener DNA plasmídico este debe fue mínima. Edta y fenol Se observa una muestra un estimado en su concentración. es posible Por otro lado en la figura 8 también observar una pureza óptima del ADN podemos ver que el ADN plasmidico no plasmidico y genómico. este ADN también se puede ser replicado en una célula anfitriona. mínima y con posibles contaminantes. pues muestran se pueden observar las tres bandas valores cercanos al 1. pureza más baja en comparación a la que al igual que en las demás muestras no se se obtuvo teniendo presenta la presentan más líneas lo que determinaría absorbancia a 280 Siendo nuevamente la un nivel de pureza alto junto con una alta muestra problema la que menor pureza selectividad en su PCR. estructura lineal y quede libre de proteínas asociadas y sales supercorled.Terminada la electroforesis el gel es Teniendo en cuenta que de acuerdo al revelado por medio de una cámara de UV método Molecular Cloning y Maniatis los la cual excita las moléculas que emiten la valores esperados en la pureza del ADN fluorescencia para así poder observarlas es de 1.8). las cuales demuestra una correcta extracción y corresponden a plásmidos en estructura purificación de ADN. con base en la concentración en pares de bases ni tabla 7. . una única banda con una intensidad la muestra problema presenta una pureza considerable estancada en el poso. pero al tenía compararlo con el nivel de pureza CONCLUSIONES obtenido por el espectro se encuentra que es bajo con relación al punto de referencia Fue posible determinar tanto la (1. su extracción será muestra problema es un DNA plasmidico. También se puede observar en la concentración como la pureza de la imagen como el ADN plasmidico. absorbancia a 230 hace referencia a la Mediante la figura 8 se puede determinar presencia de compuestos aromáticos. & Uruena. Madrid: Editorial Médica Panamericana. E. M. J.. J.-Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa.. P. C.02392. E. “Manual de Laboratorio. “7. D. E. DRUMMOND. México: Médica Panamericana.1365- apreció en la electroforesis. (2004)..org/10. ALDHOUS. (2007). Alicia Padilla Peña. (2005). García Alfonso. R. H.2003. [5] Romero. L. J. R. J. Bogotá: Pontificia Universidad Javeriana. [2] D. Practicas de biologia molecular. B. D. Anti- Saccharomyces cerevisiae antibodies (ASCA) in Crohn’s disease are associated with disease severity but .” [4] Watson. B. R. Clinical and Experimental debido al poco contenido genético que se Immunology. C. (2005). and C. [6] WALKER. 135(3). J. Aislamiento y caracterización electroforética de DNA plasmídico. 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Report "Cuantificación de Adn Por Espectrofotometría de Uv 1"