Cromatografía líquida de alto rendimiento determinación de aflatoxinas en chile maní y arroz utilizando columna basada en sílice monolítico ResumenUn simple y rápido cromatográfico de líquidos de alta eficiencia con detección de fluorescencia para la determinación de la aflatoxina B1, B2, G1 y G2 en cacahuetes, arroz y chile se desarrolló. La muestra se extrajo usando acetonitrilo: agua (90:10, v / v%) y después se purificó mediante el uso de ISOLUTE? multimodo extracción en fase sólida. Después de la derivatización pre-columna, los analitos se separaron dentro de 3,7 min utilizando Chromolith? rendimiento RP-18e (100 a 4,6 mm) columna monolítica. Para evaluar los posibles efectos de los componentes endógenos de los artículos alimenticios, con ajuste matricial de calibración se utilizó para la cuantificación y validación. Las recuperaciones de las aflatoxinas que fueron añadidos en muestras de alimentos fueron 86.38-104.5% y RSD fueron <4,4%. El método se aplicó para la determinación de aflatoxinas en maní (9), el arroz (5) y el chile (10) muestras. Cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem análisis utilizando el analizador de triple cuádruple y operado en los modos de monitorización múltiple de reacción en las muestras contaminadas se llevó a cabo para su confirmación. 1. Introducción Especies de hongos tales como Aspergillus (A) A. flavus y en particular A. parasiticus pueden crecer en los productos agrícolas, especialmente en regiones cálidas y húmedas y convertirse en objetivo potencial para la producción de aflatoxinas. Entre las aproximadamente 20 tipos diferentes de las aflatoxinas, sólo la aflatoxina B1 (AFB1), B2 (AFB2), G1 (AFG1) y G2 (AFG2) están asociados con el daño hepático agudo y cirrosis (Fig. 1). La aflatoxina M1 (AFM1) es un metabolito hidroxilado de AFB1which se puede encontrar en la leche. Sin embargo, la toxicidad de AFM1 es menor que la AFB1 y se clasificó como hepatotóxico y carcinogénico (Han et al., 2010). Debido a la, teratogénicos y mutagénicos efectos cancerígenos, hepatotóxicos de aflatoxinas, la Internacional Agencia para la Investigación sobre el Cáncer (IARC) han clasificado en para la tuerca y frutas secas a ser objeto de selección.0 ng g? 1 para AFB1 y el total de aflatoxinas. Spadaccino. el maní y especias especialmente chile por aflatoxinas está muy extendida. 2010. O'Riordan & Wilkinson. Serie de métodos analíticos han descrito para la determinación de aflatoxinas en los alimentos. Yan. 2008.Grupo 1 como carcinógeno humano (IARC. antes del consumo humano o su utilización como ingredientes de productos alimenticios (Comisión del Reglamento de 2010). El Reglamento de la Comisión (UE) ha establecido 5. Es uno de los menos susceptibles a los cultivos micotoxinas contaminación mientras chile y maní pueden ser afectados por aflatoxinas durante la etapa de pre-o post-cosecha (Cho et al. Palermo. 2010). 2009). y Anklam.0 ng g? 1 y 10.0 ng g? 1 para el total de aflatoxinas en el maní (Maní) y otras semillas oleaginosas y productos elaborados destinados para el consumo humano directo. 2009). fluorescencia detección es útil debido a su buena sensibilidad. El arroz es uno de los más ampliamente consumida alimentos en el mundo. Ríos. 2008. Salleh. 2. la cromatografía en capa fina (Stroka. Khayoon. y Min. 2002). 2009. Quinto.. y Centonze. Para la técnica de HPLC. 2010. Arce.0 ng g? 1 para AFB1 y 4. mientras que la espectrometría de masas . Khayoon. Saad. ultra-alto rendimiento de cromatografía líquida (UPLC) (Fu. Otterdijk.0 ng g 1 para el total de aflatoxinas en las especias?. la Los principales son enzima ensayo inmunoenzimático (O'Riordan y Wilkinson. 2009. et al. respectivamente. 2002). y Razzazi-Fazeli. El límite fue de 5. et al. Alcaraz.. Reiter. Saad. BHM. 2008) y la electroforesis capilar (Peña. u otro tratamiento físico.0 ng g 1 para AFB1 y 10. La contaminación de los alimentos como el arroz. Vouk. y Valcárcel.. 2000) de alto rendimiento de cromatografía líquida (HPLC) (Herzallah. Huang. El tiempo de análisis se redujo significativamente de 20 min (utilizando una columna C18 de partícula convencional) a aproximadamente 4 min (Khayoon et al. el uso de columnas monolíticas está aumentando constantemente. o discos).. HPLC de fase inversa utilizando una columna C18 de partícula es la método más comúnmente utilizado (Herzallah de 2009. muestras que se encontró que contienen las aflatoxinas se confirmaron por líquido cromatografía acoplada a espectrometría de masas de ionización electrospary. Estos resultados nos motivó a explorar su utilidad para el determinación de aflatoxinas. y Tanaka. Soga. 2009). la reducción en el tiempo de análisis sin comprometer el funcionamiento analítico es de esperar que se dio cuenta. 2010. Hasta la fecha. Khayoon et al. En combinación con un solo paso ISOLUTE? multimodo extracción en fase sólida (SPE) para la limpieza de los extractos. Saad..(MS) es excelente para la confirmación (Frenich. barras delgadas membranas porosas. 2010). Las columnas se componen de una varilla porosa continua que proporcionan Recientemente. se informó de un nuevo método de HPLC para la determinación de fumonisinas en muestras de alimentos utilizando monolítico basado en sílice columna. Khayoon. et al. RomeroGonzález. y Aguilera-Luiz. Quinto et al. 2009). Columnas monolíticas. Yan.. se preparan como una sola pieza porosa hecha de polímero reticulado o sílice porosa en diferentes formatos (por ejemplo. 1996). Las identidades de los analitos separados se confirmó por colisiones de baja energía de disociación espectrometría de masas tándem (CID-MS/MS) usando un instrumento de triple cuádruple y operado . Sin embargo. 2010. descrita por primera vez por Tanaka y colaboradores (Minakuchi. Ishizuka.. Vidal. Reino Unido). Nueva Jersey.). G1 y G2 estándares (1. Baker (Phillipsburg. Las soluciones estándar Soluciones de aflatoxinas B1.). Las muestras de alimentos Veinticuatro muestras incluyendo el arroz (5).2 cm MX? 1) fue producido por una Milli-Q sistema de Thermo Scientific Barnstead (Milford.UU. B2. 2. ISOLUTE? columnas multimodo SPE (1 ml de capacidad.1. Productos químicos y materiales Normas de AFB1. AFG2 y ácido trifluoroacético (TFA) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St.). T. Agua ultrapura (resistividad.2. MA. maní (9) y chile (10) se recogieron al azar de los supermercados y mercados nocturnos desde diferentes lugares en Penang. AFB2. Todas las muestras fueron mantenido en contenedores adecuados y almacenado a temperatura ambiente antes de el análisis. mientras que acetonitrilo (Calidad HPLC) se obtuvo de J. Leicestershire. 2. EE. Malasia. Suecia).3. Louis.n-hexano y metanol (calidad HPLC) fueron adquiridos de Fisher Científicas (Loughborough.0 mg) fueron preparado mediante la inyección de 1 ml de acetonitrilo (grado HPLC) en cada uno .UU. EE. 100 mg) se obtuvieron de Biotage (Kungsgatan. AFG1. EE. experimental 2.UU. MO. 18.en el monitoreo múltiple de reacción (MRM). Normas de aflatoxinas y soluciones de trabajo fueron protegidos de la luz. 1996). La descontaminación de las aflatoxinas posibles a partir de material de vidrio.25%) solución durante 72 h antes de lavar y volver a utilizar. 2. Las consideraciones de seguridad Debido a la toxicidad potencial y la naturaleza cancerígena de las aflatoxinas.K.0 g) y se agitó vigorosamente durante 30 min. Miyahara. Chen. Toyoda. una porción del filtrado (1 ml) fue Pasó a través de la ISOLUTE? Multimodo SPE limpieza en columna una velocidad de flujo de 2 mL min? 1 que había Beens Anteriormente preacondicionado . & Saito. viales y tubos se efectúa por inmersión de todo el material de vidrio en estos de hipoclorito de sodio (5. las precauciones de seguridad se han tenido en cuenta durante la manipulación por el uso de guantes. Rs. factor de retención. gafas de seguridad y la cara desechable máscara. pico resolución (calculado entre picos vecinos). N número de platos teóricos. Las aflatoxinas se obtuvieron mediante la mezcla de 40 ml de acetonitrilo: agua (90:10. 4 papel de filtro. v / v%) con las muestras de alimentos (10. Después de la filtración usando un Whatman No. Preparación de las muestras y el procedimiento de limpieza El método como se describe por Akiyama y compañeros de trabajo utilizado fue con modificaciones menores (Akiyama.5. EE. Las dos capas se permitió que se separaron. MA. v / v%) y la muestra derivatizada se agita en vórtex durante 30 s.) con auto muestreador años utilizando un detector de fluorescencia (fluorescencia del detector de múltiples k En 2475). EE. La columna analítica fue un Chromolith? rendimiento RP-18e (100 a 4. PA.) (250 mm? 4. HPLC aparato y las condiciones cromatográficas El análisis cromatográfico se llevó a cabo mediante el uso de un equipo Waters Alianza sistema de HPLC (Milford. v / v%). Alemania). maní y arroz) Las cantidades de aflatoxinas con las soluciones de trabajo y Siguiendo el procedimiento de limpieza y derivatización. y la capa inferior introdujo en viales de HPLC. la Supelco C18 (Bellefonte.con metanol (5 ml) y 5 ml de acetonitrilo: agua (90:10. 5 lm tamaño de partículas) columna se utilizó como comparación aussi.6 mm de diámetro. La mezcla se diluyó con 900 lL siguiente de acetonitrilo: agua (10:90. v / v%) con flujo tasa de 1 ml por minuto a? 1 bajo condición isocrática. El móvil etapa fue acetonitrilo: metanol: agua (15:25:60. era de auto-inyección Preparación de la matriz correspondió calibración Soluciones para la matriz calibraciones emparejados fueron preparados por al spiking de extracto blanco de muestra de alimentos (ají.UU.6 mm) de Merck (Darmstadt. El eluato se evaporó a sequedad bajo nitrógeno en ámbar botellas (5 ml) y los residuos secos derivatizados mediante la adición Fueron TFA (100 Fl) y n-hexano (300 LL).UU. Quince litros micro . se agitó durante 30 s y era dejó en reposo (15 min) en un lugar oscuro a temperatura ambiente. 1 a 7. temperatura y flujo de gas. MA. Waldbronn. termostatizado de columna y compartimiento. la Las longitudes de onda de detección se fijó en 360nm and 440 nm for the excitation and emission. Alemania) equipado con Agilent LC 1200 series inyector automático. EE.1 mm ID. LC separación se llevó a cabo en 50 mm? 2.UU. B era hasta un 45% mayor en 6 min. Bajo el electrospray ionización (ESI +) modo. luego a 100% controladas 6. Un gradiente de elución de acetato de amonio (10 mM) y metanol (100%) como fases móviles A y B. Resultados y discusión 3.) a 35? C. Gas nitrógeno (99. después paso años isocrático a 10% de B durante 2 min. Condiciones LC-MS/MS Agilent 6410A triple cuadrupolo Agilent (LC-MS/MS años Technologies. El volumen de inyección fue de 20 l.99% de pureza) se utiliza para el secado y colisiones Ambos. 3. se utilizó respectivement. 1.1.7 lm columna de tamaño de partícula Comprado de Waters (Milford. 350 ° C min y 10 l? Respectivement 1.04 del software se utilizó. La velocidad de flujo fue 200 min lL? 1.volumen de inyección y 30? C temperatura de la columna se utilizaron. los parámetros del espectrómetro de masas fueron: voltaje capilar de 4000 V. respectively. operado por Mass Hunter versión B.01.1 min. metanol (0-40%) y agua (50-75%) como fase móvil en la separación . bomba binaria. Condiciones cromatográficas El efecto de diferentes proporciones de acetonitrilo (8-29%). 0 mL min? 1) fueron investigados aussi. La retención horas punta y Áreas Especialmente efectivo disminuyó gradualmente 1 ml min? 1. y la presión de la columna de vuelta era aceptable. temperatura de la columna.7 min (columna monolítica). 1 ml por minuto a? 1 y el volumen de inyección. 32? C. Fase móvil diferente caudales (0.de las aflatoxinas mediante la columna monolítica fueron examinados. Sin embargo. 2A y B en comparación del cromatograma de aflatoxinas estándar utilizando la columna C18 convencional y la partícula columna monolítica bajo las condiciones óptimas.5 min) se produjo por todo el Cuando las aflatoxinas acetonitrilo se incrementó hasta 29% de metanol y hasta el 40% el objetivo de la resolución era pobre. La retención Se redujeron significativamente desde los tiempos 17 min (columna convencional) a alrededor de 3.5 a 3. una composición de acetonitrilo: metanol: agua (15:25:60.7 min) con buena resolución. Un poco cambio en los tiempos de retención Cuando el temperatura se elevó a más de 32? C mientras que se encontró la Áreas de los picos no fueron significativamente afectados. La figura. Se encontró Que le tiempo de retención no aumentar el área de mayor vigencia mientras que el pico 15 SD de la muestra se inyectó. El efecto de volumen de inyección (5-25 LL) en los tiempos de retención y pico Áreas de aflatoxinas fueron investigados aussi. Las condiciones óptimas para la separación de las aflatoxinas utilizando la columna monolítica fueron: composición de la fase móvil de acetonitrilo: metanol: agua (15:25:60. velocidad de flujo. El efecto de la temperatura de la columna (25-38 ° C) en la separación se estudió. v / v%) dio separación rápida veces (aproximadamente 3. v / v%). Lo Se encontró que la separación rápida (? 2. El cromatográfica . 15 LL. El tiempo de separación es casi similar a la informó sobre el método UPLC (Fu. precisión y exactitud se realizaron utilizando estándares ajustados a la matriz y métodos. AFB2. arroz y chile. El Rs Conclusiones El uso de una columna monolítica para la separación por HPLC de aflatoxinas es por primera vez informado. Los parámetros de validación del alimento es decir. muestras. límites de detección y límite de cuantificación. respectivement. precisa y reproducible. El método es rápido adelantados.7 min (columna monolítica). AFG1 y AFG2) en el maní. linealidad. y Min. Huang. . la separación de las aflatoxinas se redujo de 17 min (columna C18 de partícula convencional) a aproximadamente 3. La limpieza de las muestras se vio afectada por el uso de un solo paso ISOLUTE? multimodo sólido fase de extracción. La resolución y rangos teóricos de la plataforma 2.optimizar el uso de los requisitos de datos se muestra en la Tabla 1. Separación Ambos parámetros de las columnas puede ser obtenues desde el pico resolución (Rs) y el número de platos teóricos (N).03 y 5039-9361. El uso del análisis LC-MS/MS usando el QqQ y operación en el método MRM permite la monitorización de un número seleccionado de transiciones.70 a 6. En el marco del optimizada condiciones. El método fue desarrollado aplicado a la determinación de las aflatoxinas (AFB1. proporcionar la identificación positiva de la aflatoxinas en las muestras contaminadas. 2008).
Report "Cromatografía líquida de alto rendimiento determinación de aflatoxinas en chile"