Análisis InstrumentalCromatografía de Líquidos Marisela García Angeles Peralta INVESTIGACION TEORICA La cromatografía de líquidos es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica. También se la denomina a veces Cromatografía líquida de alta presión o Cromatografía Líquida de Alta Resolución (High pressure liquid chromatography) (HPLC), aunque esta terminología se considera antigua y está en desuso. El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica. La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija. La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual está rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas. Las características de las columnas son: Relleno de fase normal Se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de absorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención. Relleno de fase inversa La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía es la silica tratada con RMe 2SiCl, dónde la R es una cadena alquil tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente. El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicos. La cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificación adicional. La cromatografía de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unión del compuesto a la fase estacionaria es la disminución del área del segmento apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto hidrofóbico está dominado por la disminución de la energía libre de la entropía asociada con la minimización de la interfase compuesto-disolvente polar. El efecto hidrofóbico disminuye con la adición de disolvente apolar a la fase móvil. Esto modifica el coeficiente de partición de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye. Elución isocrática Condiciones experimentales constantes, lo que significa composición constante de la fase móvil ( polaridad constante) lo que equivale a temperatura constante en cromatografía de gases (separación isoterma). Una separación que utiliza un solo disolvente de composición constante se denomina una elución isocrática. Elución con gradiente En este caso se utilizan dos (y a veces más) disolventes con una polaridad significativamente distinta. Una vez comienza la elución, se varía la relación de los disolventes de forma programada, a veces continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas. Tipos de dectores Detectores basados en una propiedad de la fase móvil . Ejemplo: Detector de Índice de Refracción Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar. Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector Ultravioleta. Los detectores más utilizados en HPLC son: Detector UV. Hay básicamente tres tipos: Detector de Longitud de Onda Fija Detector de Longitud de Onda Variable Detector de Arreglo de Diodos Detector de Índice de Refracción El detector de Absorbancia Ultravioleta Los detectores de absorbancia ultravioleta (también visible) son los más utilizados en HPLC. Su fundamento es la espectrofotometría de absorción. Para adaptar un espectrofotómetro convencional a medidas en HPLC, la modificación más importante es diseñar adecuadamente la célula de flujo. Esta deberá contener un volumen mínimo (entre 1 y 10 _L) y ser capaz de soportar presiones de varias atmósferas. La radiación emergente de la célula de flujo se dispersa por una red de difracción holográfica en radiaciones monocromáticas que se focalizan simultáneamente sobre un conjunto de fotodiodos constituido por varios centenares de elementos fotosensibles y dispuestos linealmente. Cuando la radiación transmitida incide sobre los fotodiodos, se genera una señal eléctrica que se procesa para dar datos de absorbancia, que representados en función de la longitud de onda detectada por cada uno de los fotodiodos origina el correspondiente espectro de absorción. Este proceso puede repetirse muchas veces por segundo, por lo que pueden generarse una gran cantidad de datos experimentales durante el tiempo que la muestra pasa por la célula. Aplicaciones de HPLC Para la separación de cationes, cuando se usa HCl como eluyente, la columna supresora es una resina aniónica en forma de hidróxido, con lo que el Cl– queda retenido por la resina y los H +, con los OH– forman H2O, H+ + Cl– + R–OH–(s) —> R–Cl(s) + H2O En la separación de aniones, muchas veces se utiliza carbonato o bicarbonato sódico como eluyente. En este caso, la columna supresora contiene la forma ácida de una resina catónica, con lo que se forma H2CO3 muy poco disociado, Na+ + HCO3– + R–H+(s) —> R–Na+ + H2CO3 En la industria farmacéutica sus aplicaciones se centran, entre otras, en el análisis de vitaminas, β-bloqueantes, alcaloides, esteroides, tetraciclinas, prostaglandinas, etc. Así-mismo, es utilizada para el análisis de especies biológicamente activas, como aminoácidos, proteínas y ácidos nucleicos. Análisis de muestras medioambientales, como pesticidas y herbicidas, incluyendo paracuat, dicuat, carbamato y compuestos organofosforados, así como distintos polutantes, tales como hidrocarburos poliaromáticos fenolicos y aldehidos/cetonas. Diagrama descriptivo de un Cromatógrafo de líquidos de alta eficiencia. * Depósitos para la fase móvil. Los recipientes que se utilicen para almacenar la fase móvil (y las tuberías que la conduzcan) tienen que ser inertes, esto es, el disolvente no deberá extraer especie alguna del material con que estén construidos. Generalmente se usan botellas de vidrio y tubos de teflón, provistos éstos últimos de un sistema de filtros para eliminar cualquier partícula que pueda contener la fase móvil. * Sistema de bombeo para proporcionar presión a la fase móvil. El papel esencial de las bombas es impulsar a la fase movil con presión y flujo constante, el proceso de inyeccion de la muestra en la actualidad es automatica, las columnas que se utilizan normalmente son de acero inoxidable y los detectores su papel fundamentalmente es de indicar el momento de aparicion de los diferentes componentes que constituyen la muestra, calificarlo cuantitativamente como cualitativamente. * Dispositivo para la introducción de la muestra. La forma más simple de inyectar la muestra es utilizar un diafragma ("septum") análogo al utilizado en cromatografía de gases (ver la figura 11.3.a.), si bien este sistema está limitado a una presión máxima de operación de 1500 psi. El método más utilizado en HPLC consiste en usar válvulas de inyección con bucles de volumen conocido, como el representado en la figura 10.17 (Capítulo 10) y, más esquemáticamente, en la figura 12.11. En la posición de llenado (figura 12.11.a.), la fase móvil pasa directamente a la columna, y la muestra se introduce en el bucle mediante una microjeringa. Una vez lleno el bucle, se gira la válvula a la posición de inyección (figura 12.11.b.) en la que la fase móvil impulsa la muestra hasta la columna. Un inconveniente que presenta este sistema es que la precisión de la inyección varía con el tamaño del bucle. * Columna cromatográfica. La mayoría de las columnas para cromatografía de líquidos tienen una longitud entre 5 y 30 cm. Por lo común, las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o más columnas. El diámetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaños de las partículas de los rellenos más comunes son 3, 5 y 10 μm. Tal vez la columna más frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud y 4.6 mm de diámetro interno, y empaquetada con partículas de 5 μm. Estas columnas tienen de 40 000 a 60 000 platos/metro. También, se han empezado a fabricar columnas de alta resolución más rápidas, las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente descritas. Estas columnas pueden tener diámetros internos que oscilan entre 1 y 4.6 mm y se rellenan con partículas de 3 o 5 μm. A menudo su longitud es de 3 a 7.5 cm. Estas columnas tienen hasta 100 000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mínimo consumo de disolvente. La última propiedad es de considerable importancia, puesto que los disolventes de alta pureza que se requieren en cromatografía de líquidos son muy caros. * Detector. En HPLC no existen detectores de uso tan general como lo son el de conductividad térmica o el de ionización de llama para cromatografía de gases. Los detectores basados en una propiedad del soluto responden a una propiedad física o físico-química del soluto, y que generalmente no la presenta la fase móvil. Estos detectores suelen ser bastante selectivos y muy sensibles. Por su parte, los detectores basados en una propiedad de la disolución comparan el cambio global de alguna propiedad física de la fase móvil con y sin soluto eluido. BILBIOGRAFIA http://labquimica.wordpress.com/2008/02/07/cromatografia-liquida-de-altaeficiencia-hplc/ http://www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r67059.PDF http://ocw.usal.es/ciencias-experimentales/analisis-aplicado-a-la-ingenieriaquimica/contenidos/course_files/Tema_12.pdf http://tesis.uson.mx/digital/tesis/docs/19630/Capitulo2.pdf