INSTITUTO DE MACROMOLÉCULAS PROFESSORA ELOISA MANOUNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO IMA - UFRJ CROMATOGRAFIA DE PERMEAÇÃO EM GEL Ricardo Cunha Michel LAFIQ sala J-210 3938-7228 [email protected] IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 ou CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO POR TAMANHO O experimento de GPC / SEC O princípio da técnica Determinação relativa de Massa Molar Precisão e Exatidão da técnica O problema da relação entre massa molar e volume hidrodinâmico IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 Cromatografia Separar é Reduzir a entropia Métodos cromatográficos, de uma forma geral, - permitem a separação, quantificação e identificação de espécies químicas; - separam os componentes de uma mistura pela distribuição destes componentes em duas fases que se encontram em contato, uma fase móvel e outra fase estacionária; - durante a passagem da fase móvel pela estacionária, os componentes da mistura são seletivamente retidos pela fase estacionária, o que resulta em migrações diferenciais destes componentes. - a retenção seletiva pode operar por mecanismos entrópicos ou entálpicos. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 Cromatografia Permeação em Gel ou Exclusão por Tamanho A Cromatografia de Permeação em Gel é uma técnica na qual existe um suporte fixo, um gel, que NÃO É a fase estacionária, mas que a contém. Além disto, espera-se que não haja interações entre os componentes da amostra a separar e o suporte fixo, de modo que todo o processo cromatográfico deve se dar apenas devido ao tamanho dos componentes da mistura. Este aspecto desta técnica cromatográfica justifica seu outro nome: Cromatografia de Exclusão por Tamanho IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 cromatografia de permeação em gel. ou GFC. ou cromatografia em peneira molecular de difusão restrita. Permite obter a distribuição de Massa Molar. 2015 . bem como os valores relativos de Massa Molar Numérica Média (Mn) e de Massa Molar Ponderal Média (Mw). cromatografia de filtração em gel. Michel v.Cromatografia de Exclusão por Tamanho SEC Também conhecida por GPC. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Cromatografia de Exclusão por Tamanho Esquema Básico do Aparelho IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais . Michel v. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais injetor descarte ou reuso .Cromatografia de Exclusão por Tamanho Esquema Básico do Aparelho processamento de dados seringa garrafa contendo a fase móvel 'loop' detector coluna bomba isocrática ou de gradiente IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais injetor descarte ou reuso .Cromatografia de Exclusão por Tamanho Esquema Básico do Aparelho processamento de dados seringa garrafa contendo a fase móvel 'loop' detector coluna bomba isocrática ou de gradiente IMA – CT / UFRJ Ricardo C. imensamente maiores do que os poros reais. sendo. Obs. Michel v.: esta foto apenas representa os poros das partículas que recheiam a coluna.Cromatografia de Exclusão por Tamanho Como é a Coluna de Separação? A coluna consiste de um tubo metálico recheado de pequenas esferas de polímero reticulado. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais . IMA – CT / UFRJ Ricardo C. de fato. 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais . Michel v.Cromatografia de Exclusão por Tamanho Ação da Coluna de Separação IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Cromatografia de Exclusão por Tamanho Qual o princípio desta cromatografia? IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais . Michel v. necessitando de mais tempo para atravessar a coluna. são momentaneamente removidas do fluxo principal de solvente (exclusão). IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 . Michel v.Cromatografia de Exclusão por Tamanho Descrições do Princípio de Funcionamento Um dos modos de descrever como a separação ocorre: • as moléculas pequenas o bastante para entrarem nos poros da resina. Outro modo de descrever este processo é: • as moléculas que são pequenas o bastante para entrar nos poros da coluna têm acesso a um volume maior da mesma. ao longo da coluna. 2015 n=1 : Mw .Como Calcular Massa Molar? Massa Molar e sua Distribuição n=0 : Mn ∑ Concentração (g/mL) Mx = i ∑ i Ci Mi Ci M i n n−1 n=2 : Mz n=3 : Mz+1 PD = Mw/Mn Massa Molar (g/mol) IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. Como Calcular Massa Molar? tensão elétrica (volts) Como é a curva obtida no experimento de GPC? tempo (minutos) ou volume (mL) IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 . Michel v. Michel v. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 . para cada fração eluída através da coluna.Como Calcular Massa Molar? tensão elétrica (volts) Como é a curva obtida no experimento de GPC? tempo (minutos) ou volume (mL) Precisamos obter da curva: valores relativos a Massa Molar e valores relativos a concentração. Michel v. para cada fração eluída através da coluna.Como Calcular Massa Molar? Como é a curva obtida no experimento de GPC? n=0 : Mn n Concentração (g/mL) tensão elétrica (volts) Mx = tempo (minutos) ou volume (mL) Precisamos obter da curva: valores relativos a Massa Molar e valores relativos a concentração. 2015 ∑ Ci M i i ∑ C i M i n−1 i n=1 : Mw n=2 : Mz n=3 : Mz+1 PD = Mw/Mn Massa Molar (g/mol) volume de eluição massa molar (curva de calibração) concentração em cada volume de eluição (detectores de concentração) . IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Os padrões de M. volume de eluição em ml volume de eluição em ml M3. maior o volume hidrodinâmico e mais cedo esta amostra deixa a coluna. coluna. quanto maior a massa molar. M2. cada qual com um diferente valor de massa molar.M. possuem a mesma relação entre massa molar e volume hidrodinâmico. conhecida são injetados para que se obtenha o volume de eluição de cada um deles neste equipamento. solvente e temperatura. V2 As diferentes amostras de padrão.Curva de Calibração Injeção de padrões M1. . V3 volume de eluição em ml M4. V1 Padrões para GPC são amostras poliméricas com distribuição estreita e conhecida de massa molar. 2015 Assim. Michel v. V4 volume de eluição em ml IMA – CT / UFRJ Ricardo C. V2 volume de eluição em ml M3. V3 volume de eluição em ml M4.x log M i =ab. V1 Com os pares de pontos log(Mi) e Vi traça-se um gráfico e calcula-se a melhor reta. V4 volume de eluição em ml IMA – CT / UFRJ Ricardo C. cujos parâmetros são “a” e “b”. Isto é.V e volume de eluição em ml log (Mw) M2.V e .Curva de Calibração Básica: volume de eluição versus massa M1. y = a + b. 2015 volume de eluição em ml A massa molar de qualquer amostra que tenha a mesma relação entre massa e volume hidrodinâmico que os padrões e que deixe a coluna após Ve é dada por: M i =10 ab. Michel v. por quê fazemos as contas usando o VOLUME de eluição? Porque a curva passa a ser independente da vazão empregada! Vei vazão. t ei IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. o TEMPO de eluição.Curva de Calibração Tempo de Eluição versus Volume de Eluição Se medimos. de fato. 2015 . Cálculo de Massa Molar Concentração (g/mL) O que falta? Falta obter Ci Volume de retenção massa molar OK! IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 . Michel v. esta quantidade é proporcional a concentração da amostra.Matriz de Foto-diodos) Detecta a quantidade de luz ultra violeta absorvida em um ou vários comprimentos de onda. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Esta diferença é função da concentração da amostra. Sendo conhecida a absorvância e os parâmetros da célula. Michel v.Como Calcular Massa Molar? Sensores de Concentração Os dois sensores principais utilizados para a medida da concentração das alíquotas fracionadas da amostra principal são: Detector de Índice de Refração (RI) Detecta a diferença de índice de refração entre a solução e o solvente empregado. Detector de UltraVioleta (UV) (Photodiode Array Detector . 2015 . Michel v. 2015 . PC ADC IMA – CT / UFRJ Ricardo C.Sensores de Concentração Matriz de Foto-diodos alíquota proveniente da coluna Célula de fluxo Grade de difração Fonte de UV O sinal em cada foto-diodo é função da absorção da amostra na faixa de Matriz de Foto-diodos comprimentos de onda detectados por este foto-diodo específico. 2015 . em alguns modelos) IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Detectores alíquota proveniente da coluna Fonte de luz de comprimento de onda conhecido (branca.Sensores de Concentração Refratômetro Diferencial A deflexão do feixe de luz é função da diferença entre o índice de refração da amostra e o índice de refração do solvente empregado. Michel v. s M i i i i n s M i i n 1 s M i i . 2015 n C M i i Ci M n 1 i n n . Michel v. s M i i i i Mx n 1 n 1 . Mx IMA – CT / UFRJ Ricardo C. as equações para cálculo de massa molar média podem ser descritas em termos do sinal elétrico gerado. s M .Sinal (V) C i = . cujo valor é proporcional à concentração da alíquota: Sinal (V) C ou seja: C = k.Concentração é necessária ou um valor proporcional a concentração Estes sensores de concentração geram um sinal elétrico. sem a necessidade de se calibrar os sensores de concentração para obter os valores das constantes . s M .si Assim. em Volts. 3) Da curva obtida de “sinal proporcional à concentração versus volume de eluição” converte-se os valores de volume de eluição em valores de Massa Molar. o qual gera um sinal de tensão proporcional a concentração da amostra. 2) A amostra separada passa pelo detector de concentração. 2015 .Medida em SEC Resumo 1) As colunas separam a amostra de acordo com os volumes hidrodinâmicos das moléculas presentes. utilizando a curva de calibração previamente obtida. Michel v. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Massa Molar Média Ponderal e dispersidade de acordo com as equações mostradas. 4) Com a nova curva de “sinal proporcional à concentração versus massa molar” são calculados os valores de Massa Molar Média Numérica. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 . Michel v. utiliza-se uma reta para fazer este ajuste.Cálculo dos Valores de Massa Molar Preparação da curva obtida Tipicamente. gerando os valores de Massa Molar. Michel v.Agora a curva está pronta para ser analisada. 2015 . massa molar IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Cálculo da Massa Molar e Polidispersão Concentração (g/mL) Mx = ∑ C i M in i ∑ C i M i n−1 i n=1 : Mw n=2 : Mz n=3 : Mz+1 PD = Mw/Mn Massa Molar (g/mol) IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 n=0 : Mn . R7 IF R7=-1 then GOTO INI PRINT : PRINT PRINT "Entre com os valores de Hi. Michel v.primeira parte INI: DEFDBL A-Z CLS rem A curva de calibracao INPUT "Entre com a inclinacao (b) ". 2015 .R9 PRINT INPUT "Entre com intervalo de volume ".os valores de volume de eluicao nao precisariam ser igualmente espacados PRINT PRINT VE: rem os valores da rotina estatistica sao calculados durante a leitura dos dados a partir do teclado Q=0:R3=0#:R5=0#:R6=0#:R7=0#:N=0 PRINT"Press. <ENTER>":LINE INPUT S$:CLS INPUT "Entre com o volume de eluicao Ve para o primeiro valor de intensidade Hi <-1 p/ novas incl e interc> ". seguidos de <RETURN>.nit rem nit eh constante para simplificar o trabalho do usuario .Cálculo Automatizado Exemplo em BASIC .R8 PRINT INPUT "Entre com a intersecao (a) ".<-1 indica fim dos dados>" rem os valores de hi ja tiveram a linha de base subtraida PRINT IMA – CT / UFRJ Ricardo C. INT((R5 / R3) / (R3 / R6) * 100) / 100 goto VE IMA – CT / UFRJ Ricardo C. INT(R3 / R6) PRINT "Mw/Mn = ". INT(R5 / R3) PRINT "Mn = ".Só funciona em DOS IF X = -1 THEN goto RES 'rotina estatistica Q = R7 * R8 + R9 R3 = R3 + X R5 = R5 + X * EXP(Q) R6 = R6 + X / EXP(Q) R7 = R7 + nit goto entr RES: PRINT : PRINT "Mw = ". CHR$(30). este do chr$30 . CHR$(167). 2015 .segunda parte entr: N = N + 1: INPUT X: PRINT " ". N. "<---"." Hi" rem truquezinho grafico meio ultrapassado. Michel v.Cálculo Automatizado Exemplo em BASIC . 2015 Programa desenvolvido no IMA para cálculo de M. Michel v.M. por GPC .IMA – CT / UFRJ Ricardo C. os valores de massa molar obtidos são ditos serem valores relativos. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Assim. obtida para amostras padrão.Massas Molares Médias obtidas por GPC São valores relativos e não absolutos! Os valores de massa molar obtidos para uma dada distribuição são calculados a partir de uma curva de calibração. Michel v. 2015 . Michel v.. 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais . precisão: (repetitividade) melhor do que 5% exatidão ou acurácia: (concordância com o valor verdadeiro) em torno de 10% IMA – CT / UFRJ Ricardo C.Precisão e Exatidão na técnica de GPC . O problema da calibração Relação entre massa molar e volume hidrodinâmico M1. V1 volume de eluição em ml Uma amostra com a mesma massa do padrão 2. De acordo com esta curva de calibração. será como se a amostra tivesse uma massa molar maior do que sua massa real. Michel v. V3 volume de eluição em ml M4. V2 ln (Mw) volume de eluição em ml M3. porém de um polímero mais rígido. isto é. V4 volume de eluição em ml IMA – CT / UFRJ Ricardo C. terá um volume hidrodinâmico maior e sairá mais cedo da coluna. M2. 2015 volume de eluição em ml . será mais aberta. MASSA MOLAR E VOLUME HIDRODINÂMICO Massa Molar versus Volume Hidrodinâmico Fatores que afetam o Volume Hidrodinâmico Conformação e Configuração (Rigidez. Ramificações etc. Michel v. 2015 .) IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Assim. mas de acordo com o volume hidrodinâmico que apresentam. a curva de calibração obtida só é válida para amostras que possuam a mesma relação entre massa molar e volume hidrodinâmico que aquela apresentada pelos padrões empregados. Michel v. 2015 . a técnica de SEC não separa as moléculas de acordo com suas massas molares.Volume Hidrodinâmico e Massa Molar Em SEC a separação se dá por Volume Hidrodinâmico De fato. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Volume Hidrodinâmico e Massa Molar O que é Volume Hidrodinâmico? O Volume Hidrodinâmico indica quão grande é o novelo em solução. O volume hidrodinâmico não informa sobre a distribuição de massa no interior do novelo. Para uma dada amostra, quanto maior for sua massa molar, maior será seu volume hidrodinâmico. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 Volume Hidrodinâmico e Massa Molar Fatores que afetam esta relação Os fatores que afetam a relação entre Vh e M.M. são: Configuração da cadeia polimérica Conformação da cadeia polimérica Interação entre o polímero e o solvente Temperatura IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 Volume Hidrodinâmico e Massa Molar exemplos Mesmo valor de massa molar, mas diferentes valores de volume hidrodinâmico cadeia mais aberta, maior Vh Mesmo valor de volume hidrodinâmico, mas massas molares distintas: IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 cadeia mais fechada, menor Vh Massa Molar Relativa... ...quer dizer mais do que se imagina! Quando se usa um padrão de massa molar que não possui a mesma relação entre Vh e MM que o polímero-problema, então a massa molar obtida será relativa também ao tipo de padrão usado: “relativa” por ter sido calculada com o uso de padrões de massa molar e “relativa” ao tipo de padrão usado! IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 ” .000 g/mol. 2015 .” IMA – CT / UFRJ Ricardo C.000 g/mol. obtendo-se o valor de 100.000 g/mol em relação a padrões de PS..O que realmente significa quando se diz que a amostra apresenta certo valor de Massa Molar? Quando se diz: “A massa do polímero-problema foi calculada usando padrões de PS.” ou: “A massa do polímero-problema foi calculada em 100. Michel v.na verdade o que se quer transmitir é: “O polímero-problema apresenta o mesmo volume hidrodinâmico que PS de massa molar igual a 100.. Michel v.Curvas de Calibração Calibração com Padrões de Distribuição Estreita de Massa Molar Calibração com Amostras de Distribuição Larga de Massa Molar Calibração Universal Quando cada tipo de calibração é mais eficaz Técnicas Absolutas em GPC IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 . 2015 .Calibração com Padrões de Distribuição Estreita IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. solvente e temperatura. V2 As diferentes amostras de padrão.Calibração com Padrões de Distribuição Estreita Injeção de padrões M1. Os padrões de M. V3 volume de eluição em ml M4. V1 Padrões para GPC são amostras poliméricas com distribuição estreita e conhecida de massa molar.M. coluna. quanto maior a massa molar. maior o volume hidrodinâmico e mais cedo esta amostra deixa a coluna. V4 volume de eluição em ml IMA – CT / UFRJ Ricardo C. volume de eluição em ml volume de eluição em ml M3. cada qual com um diferente valor de massa molar. 2015 Assim. Michel v. M2. possuem a mesma relação entre massa molar e volume hidrodinâmico. . conhecida são injetados para que se obtenha o volume de eluição de cada um deles neste equipamento. Curva de Calibração Básica: volume de eluição versus massa M1. cujos parâmetros são “a” e “b”.x log M i =ab. V3 volume de eluição em ml M4. Michel v. 2015 volume de eluição em ml A massa molar de qualquer amostra que tenha a mesma relação entre massa e volume hidrodinâmico que os padrões e que deixe a coluna após Ve é dada por: M i =10 ab. V4 volume de eluição em ml IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Isto é. y = a + b. V2 volume de eluição em ml M3.V e volume de eluição em ml log (Mw) M2. V1 Com os pares de pontos log(Mi) e Vi traça-se um gráfico e calcula-se a melhor reta.V e . Curva de Calibração Relação entre Massa Molar e Volume de Eluição Ajuste Polinomial log (Mi) linear log M i =ab.V e d. 2015 .V e quadrático (2a ordem) 2 log M i =ab.V e Alguns fabricantes de colunas sugerem que se use polinomiais de 5 a ordem!!! Isto por quê a distribuição de volume dos poros no recheio da coluna não é linear! IMA – CT / UFRJ Ricardo C.V e c.V e c. Michel v.V e Volume de Eluição cúbico (3a ordem) 2 3 log M i =ab. Curva de Calibração Limites de Exclusão Ve V0 KVP Ve = volume de eluição V0 = volume intersticial Vp = volume dos poros K = coeficiente de distribuição do soluto O pico em (A) indica algum tipo de repulsão entre as moléculas do polímero (exclusão iônica). . Michel v. 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais VP V0+VP -O pico em (C) indica adsorção do polímero pelo material da coluna. V0 IMA – CT / UFRJ Ricardo C. -O modo como este polímero elui poderia ser representado pela curva indicada em (B) (interações hidrofóbicas ou hidrofílicas). 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais . Michel v.Curva de Calibração Alguns Exemplos IMA – CT / UFRJ Ricardo C. O mesmo tipo de problema pode ocorrer com moléculas menores do que o limite da coluna. parecendo constituir um pico. não? Mas não é! Vejam: Todas as moléculas maiores do que o limite de exclusão sairão juntas da coluna. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. serão acumuladas no volume de eluição V o. 2015 . as quais sairão em torno de Vo+Vp. isto é.Curva de Calibração Atenção aos limites da curva! Não extrapolar! Sempre observar com atenção os picos em torno de Vo e de Vo+Vp ! Uma amostra com moléculas que ultrapassem os limites de eluição da coluna poderá se apresentar da seguinte forma: Parece bimodal. Michel v. Michel v. 2015 .Curva de Calibração Padrões Comuns Padrões para GPC orgânico: poli(metaacrilato de metila) poli(isoprenos) polibutadienos poli(THF) Padrões para GPC aquoso: poli(etileno glicol) poli(óxido de etileno) pululanas Polidispersão usual: < 1.1 IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 .Calibração com Amostras de Distribuição Larga IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. Os pontos da curva de calibração correspondem a M n e a Mw de cada um dos padrões empregados. Este padrão pode ser comercial ou. se possível.Calibração com Amostras de Distribuição Larga Injeção de padrões Nesta técnica. calcula-se por um método iterativo a curva de calibração que será empregada para a análise das amostras-problema. injeta-se na coluna um padrão de distribuição larga e de massa molar conhecida. É conveniente empregar pelo menos dois padrões ao usar esta técnica. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. De posse desta curva de distribuição e dos valores conhecidos de M w e de Mn para o padrão. do mesmo polímero sendo analisado. Michel v. na mesma coluna e condições na qual se analisará a amostra-problema. para se realizar a análise de uma dada amostra-problema. A curva de distribuição é obtida para este padrão. 2015 . 2015 .Calibração Universal IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. corrigido. obtém-se M da amostra-problema em relação a uma curva construída com padrões de distribuição estreita. um mesmo valor para o produto []. Caso o equipamento não disponha de um viscosímetro em linha. Neste caso. basta medir a [] da amostra problema em cada alíquota e calcular seu valor de M. para a qual se utiliza um viscosímetro em linha com o sistema de GPC. Michel v. Esta forma combina os princípios da calibração universal com a equação de Mark-Houwink-Sakurada.M. portanto. 2015 . usando-se para tal os valores de K e de a da amostra problema e do padrão. as amostras problema e padrão apresentarão um mesmo volume hidrodinâmico e. pode ser usada a segunda forma de construção da calibração universal. então. IMA – CT / UFRJ Ricardo C.Calibração Universal em duas formas diferentes Existem duas formas de realizar a Calibração Universal: A primeira delas é a calibração universal clássica. Uma vez dispondo deste produto para o padrão. Este valor de M é. Em um mesmo volume de eluição. []1.Calibração Universal Para sistemas com viscosímetro em linha .A interação do polímero com o solvente irá se refletir no valor de viscosidade intrínseca. e verificando seus volumes de eluição.M) versus volume de eluição” a qual consistirá na curva de calibração para este polímero.M2 . IMA – CT / UFRJ Ricardo C.M1 = []2. por isto o nome “Calibração Universal”.Polímeros com o mesmo volume hidrodinâmico (VH) eluirão no mesmo volume de eluição. Divide-se este valor por [] medido no viscosímetro para esta alíquota e obtém-se M da alíquota.Segundo Einstein VH .As curvas de calibração para uma grande variedade de polímeros orgânicos são sobreponíveis. []. Michel v. 2015 . .Mede-se Ve para cada alíquota da amostra-problema e obtém-se da curva de calibração seu valor de []. .M. pode-se traçar a curva “log([].Medindo o valor de [] para padrões de massa molar conhecida. . . M V Assim. M) curvas para vários polímeros em uma mesma coluna volume de eluição IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais .Calibração Universal log([]. Michel v. M 1 1a 2 =K 2 . M 2 1 2 1 a1 K M 1i = K1 .M a Desta forma se obtém: Isolando M1 nesta equação: 1a1 K1 . Michel v.Calibração Universal Para sistemas sem viscosímetro em linha Do princípio de calibração universal: [ 1 ]. obtém-se M1. Se forem conhecidos 'K' e 'a' para as amostras padrão e problema. o valor corrigido de massa. IMA – CT / UFRJ Ricardo C.M 1 a 2 1 a 1 2i M2 é obtido para a amostra-problema a partir do Ve e de uma curva de calibração com padrões de distribuição estreita. 2015 . M 2 Substitui-se [] pelo valor da equação de Mark-Houwink-Sakurada: [ ]=K. M 1=[ 2 ]. Curva de Calibração Universal e a equação de Mark-Houwink-Sakurada log([].M) versus Ve volume de eluição log([]) Mark-Houwink log k IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v.M) Curva de Calibração Universal log([]. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais log [] versus log M [] = KMa a log (M) a é a inclinação e log(K) é a interseção da curva mostrada . 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais Mi RTci i . Michel v.Técnicas Absolutas em GPC Descrição sucinta Espalhamento de Luz Estático SLS Osmometria de Membrana IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Cromatografia de Exclusão por Tamanho Esquema Básico do Aparelho IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais . Michel v. 2015 . Michel v.Cromatografia de Exclusão por Tamanho Esquema Básico do Aparelho IMA – CT / UFRJ Ricardo C. seletividade e resolução Contribuições para o alargamento dos picos Condições ótimas de análise Contaminação. entupimento. Michel v. controle de pressão Proteção das colunas IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 .As Colunas Recheios Definição de termos Escolha das colunas Eficiência. : Bio-Gel da Bio-Rad) Glicose-Divinilbenzeno Géis de ágar. Sepharose etc. (para GPC em baixa pressão) Recheios comuns de colunas para solventes orgânicos: Divinilbenzeno Divinilbenzeno sulfonado Poliestireno-Divinil benzeno Poli(meta acrilato de metila) Os recheios podem ser melhor escolhidos se for conhecida a aplicação específica que se deseja para o equipamento. IMA – CT / UFRJ Ricardo C.: Sephadex da Pharmacia) Géis de poliacrilamida (ex. Recheios comuns de colunas para água: Géis de dextrana (ex. agarose. estabilidade nas condições desejadas de pH e temperatura. reduzida interação com a amostra etc. 2015 . Michel v.Colunas de GPC Recheios Características desejadas: Inércia química. Michel v. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais .Curva de Calibração Alguns Exemplos IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Escolha da Coluna de Separação IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais . 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais . Deseja-se que pequenas variações de VH nas amostras levem a grandes variações no volume de eluição de seus picos. a coluna 2 separa melhor as amostras A. Assim. B e C.Escolha da Coluna de Separação de acordo com sua Curva de Calibração Neste exemplo. Michel v. deve-se escolher sempre as colunas de separação cuja curva de calibração apresente a MENOR inclinação na faixa de massa molar das amostras de interesse. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais .Escolha da Coluna de Separação IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais .Escolha da Coluna de Separação observar as sugestões dos fabricantes IMA – CT / UFRJ Ricardo C. pequeno W).RESOLUÇÃO O que é? do que depende? Alta resolução significa boa seletividade (grande mudança em Ve para pequenas mudanças em R H) e grande eficiência (pequeno alargamento de bandas . Michel v.Qualidade da Separação . IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais . 2015 . Michel v. Em GPC uma boa seletividade significa que a coluna é capaz de levar a uma grande mudança no volume de eluição para pequenas mudanças no raio hidrodinâmico das amostras. baixa seletividade grande seletividade IMA – CT / UFRJ Ricardo C.Seletividade O que é? Seletividade é a habilidade de separar os picos entre si. Michel v. 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais .Seletividade Como medir? A seletividade pode ser medida pela separação relativa entre os picos de interesse: t R1 t 0 t R 2 t0 A seletividade pode ser melhorada alterando-se o coeficiente de distribuição. Isto justifica o uso de bombas-gradiente. Para uma dada coluna. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. isto se consegue através de mudanças no solvente. alta eficiência baixa eficiência IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. .Eficiência O que é? Eficiência está relacionada com a faixa de valores de volume de eluição que correspondem a um mesmo valor de volume hidrodinâmico. isto é. 2015 A eficiência pode ser controlada alterando-se a vazão da fase móvel e evitando irregularidades na mesma. eficiência está relacionada ao alargamento dos picos. que relaciona a largura do pico com o tempo que a amostra ficou retida na coluna. Grande eficiência significa que os picos são estreitos. Uma medida de eficiência é o número de pratos teóricos de uma dada coluna. . 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais Para indicar a eficiência em uma dada coluna.54 .Verificando a Eficiência Número de Pratos Teóricos 2 t R1 N =5. mas maior será a pressão. Altura Equivalente a um prato teórico (HETP) HETP = comprimento da coluna / N IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. indica-se a altura equivalente de um prato teórico. HETP. maior é o número de pratos teóricos. de forma independente de seu comprimento. w 1 /2 Quanto maior o comprimento da coluna. * as frações coletadas devem ser de volume reduzido. * usar conectores sem volume morto.Eficiência de Separação Alargamento de Bandas Fora da Coluna Todos os tubos. células de fluxo e conectores pelos quais as frações eluídas passarão contribuem para o alargamento das bandas! Para reduzir este efeito de alargamento: * usar tubos com diâmetro interno reduzido. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 . para preservar a separação obtida. Michel v. * usar células dos detectores que não diluam ou misturem zonas separadas. 2015 . Seletividade e Resolução Relação entre os termos Resolução OK ? eficiência boa eficiência ruim OK! OK! OK! NÃO! seletividade boa seletividade ruim IMA – CT / UFRJ Ricardo C.Eficiência. Michel v. Alargamento da Curva Difusão Difusão ao longo do comprimento da coluna. Michel v. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais . IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Alargamento da Curva em função da Vazão Transferência de massa para dentro e para fora dos poros do recheio. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais . IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais .Alargamento da Curva Os Efeitos Principais IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais .Condições ótimas de análise IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v.Alargamento da Curva Efeitos Combinados . 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais .em função do tamanho molecular IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v.Alargamento da Curva Efeitos Combinados . porém as informações básicas são: IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Serão análises de rotina (sempre os mesmos polímeros). melhor. 2015 . Michel v. é necessário conhecer o tipo de polímero que será analisado.Como escolher uma coluna (ou conjunto de colunas) para GPC ? Para a seleção de uma coluna de GPC. como em controle de qualidade? ou Serão análises variadas. como em um centro de pesquisas? Quanto mais informações. 2015 . temperatura. os passos para a escolha da coluna são: IMA – CT / UFRJ Ricardo C. concentração salina. presença de etanol ou DMSO etc.) Qual é a faixa de massa molar esperada para estas análises? Existem informações sobre quais colunas. solventes e temperaturas outros laboratórios utilizam para realizar estas análises? (ou sugestões dos próprios fabricantes das colunas?) A partir destas informações. Michel v.Como escolher uma coluna (ou conjunto de colunas) para GPC ? Qual é o polímero? Em quais solventes é solúvel? Em quais condições ocorre esta solubilização? (pH. selecionar as colunas com o maior número de pratos teóricos. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. isto é. Michel v. * Do subconjunto já selecionado. com a melhor resolução e eficiência. * Dentre estas colunas. * Comparar a lista de colunas selecionadas com aquelas indicadas na literatura. necessidade e disponibilidade de pré-colunas etc. * Entre as colunas sobrantes. apresentado uma inclinação o mais próxima possível de 45 graus. rejeitar aquelas colunas cujo recheio possa interagir com a amostra-problema. procurar por aquelas que suportem as condições de análise (pH. concentração salina. * Dentre estas. temperatura.Como escolher uma coluna (ou conjunto de colunas) para GPC ? * Procurar colunas que operem com a 'classe' de solventes necessários para as análises de interesse: solventes orgânicos ou aquosos. 2015 . prazos de entrega. presença de outros solventes). * Verificar preços. selecionar aquelas que apresentem a melhor separação das amostras-problema na faixa de valores de massa molar de interesse. isto é. colunas cuja curva de calibração nominal cubra toda a faixa desejada. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Instituto de Macromoléculas Professora Eloisa Mano. 2015 . 2015. usando a seguinte forma de citação: Ricardo Cunha Michel. sendo usadas aqui de acordo com as condições de "fair use".É importante notar que algumas das figuras ou tabelas utilizadas neste material podem ter restrições para uso não acadêmico. por questões de copyright. de decisão de seus proprietários. IMA/UFRJ. Anotações de aula. “Métodos Físicos Aplicados a Polímeros (MMP-712)”. Rio de Janeiro. O material. Michel v. figuras e tabelas de minha autoria podem ser usados para finalidades didáticas. FIM IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 .