INSITITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICASCamacho Bravo Dulce Argelia Sección 5, 5QM2 SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS DE JUGOS DE FRUTOS POR CORMATOGRAFÍA BIDIMENSIONAL EN CAPA FINA INTRODUCCIÓN Cuando se desean separar los componentes de una mezcla compleja generalmente no se logra con una cromatografía unidimensional, ya que con ésta no se separarían totalmente los componentes y sería necesario realizar varios cromatogramas; esto se soluciona realizando una cromatografía bidimensional en placa. En esta técnica, se realiza el cromatograma como en el unidimensional, es decir, se coloca la mezcla a separar sobre la placa, luego de secar, ese borde del papel se sumerge en una mezcla de solventes que contiene componentes acuosos y orgánicos. Además el papel debe estar en contacto con los vapores del solvente en equilibrio. El solvente moja al papel por capilaridad debido a su naturaleza fibrosa. El componente acuoso del solvente se une a la celulosa del papel y forma con éste una fase estacionaria de tipo gel. El componente orgánico del solvente continúa migrando, lo que constituye la fase móvil. Las velocidades de migración de las distintas sustancias que se quieren separar están gobernadas por sus solubilidades relativas en la fase estacionaria polar y la fase móvil no polar. En un solo paso del proceso de separación cada soluto se distribuye entre ambas fases de acuerdo con su coeficiente de partición, una constante de equilibrio definida como: Por lo tanto, las moléculas se separan de acuerdo con sus polaridades, de manera que las no polares se mueven más rápido que las polares. Luego de que el solvente migró a una distancia adecuada, se retira el cromatograma del solvente y se seca. En caso de ser incoloros, los materiales separados pueden detectarse por características como su radiactividad, fluorescencia etc. o puede rociarse el cromatograma con una solución que forme un producto coloreado al reaccionar con la sustancia investigada. Pero a diferencia de la unidimensional en la cromatografía bidimensional la muestra se aplica en una esquina de la placa y el cromatograma se corre en forma paralela a uno de los bordes del papel. Luego de que el cromatograma está completo y el papel se secó, la placa se rota 90° y se realiza una cromatografía paralela al segundo borde utilizando otro sistema de solventes. Dado que cada compuesto migra a una velocidad característica en un sistema de solventes determinado, la segunda cromatografía debería incrementar en grado sustancial la separación de la mezcla en sus componentes. OBJETIVOS Cromatograma unidimensional 1°fase Figura 2.. Cromatograma bidimensional problema . Comparar el grado de resolución de la cromatografía bidimensional. Cromatograma unidimensional 2°fase Figura 3. con la de la unidimensional. Identificar los aminoácidos separados por comparación de sus valores de Rf con los de soluciones tipo de aminoácidos. Separar los aminoácidos presentes en jugo de jitomate por cromatografía bidimensional en capa fina.Representación esquemática de los cromatogramas. Figura 1. Cromatograma bidimensional tipo Figura 4. DIAGRAMA DE FLUJO (anexado en la siguiente página) RESULTADOS 1. .3 7.3 7.2 7.3 5.71 0.72 0.3 4.9 1.09 0.67 Tabla 3.2 7.Calculo de los valores de Rf Tabla 1. Cromatogramas unidimensionales tipo desarrollados en las dos fases móviles.66 0.7 2 2 2.19 0.23 0.7 Rf 0.57 0.2.2 7.3 7.7 0.9 7.3 7.4 4.glutámico Histidina Treonina Tirosina Metionina Fenilalanina Frente del soluto 1 0.48 0.3 7.63 Tabla 2.3 7.75 0.58 0.7 7. glutámico Treonina Tirosina Metionina Fenilalanina Frente del soluto 1.2 7.7 6 6.1 2.87 Arginina Lisina Glicina Prolina Ác.9 7.5 6.6 Rf 0.5 4.2 Frente del soluto 1.67 0.7 7.3 7.3 7.4 4.7 7.9 7.6 5.7 3.2 7.3 7.7 0.71 0.4 2.34 0.3 7.34 0.9 2.6 5.82 0.6 Rf 0.27 0.7 7.3 6.26 0.37 0.56 0.11 0.6 3.3 7.9 Rf 0.7 1° fase móvil Frente del disolvente 7.7 7.7 2° fase móvil Frente del disolvente 7.7 4.8 5.3 5.3 4.9 4.9 4. Cromatograma bidimensional problema desarrollado en las dos fases móviles.32 0.5 2.45 0.54 0.7 7.6 5.2 4.76 0.75 0.7 Rf 0.81 0.65 .23 0.53 0.34 0.7 7.9 4.9 2° fase móvil Frente del disolvente 7.24 0.83 Frente del soluto 1.34 0.3 6 6.7 7.2 7.9 6. Aminoácido Frente del soluto 1.5 5. No.3 7.9 3.3 7. No.6 0.27 0.6 0.12 0.9 7.6 1.3 7.3 3.1 4. de mancha 1 2 3 4 5 6 7 1° fase móvil Frente del disolvente 7.2 0.68 0.7 7.9 7.57 0.8 2.5 0.83 Frente del soluto 0.5 3.3 Aminoácido correspondiente Arginina Lisina Glicina Prolina Histidina Ác.11 0. Cromatograma bidimensional tipo desarrollado en las 2 fases móviles.25 0.5 1.8 1.5 5.13 0.3 7.3 7.45 0.21 0.45 0.62 0.32 0. de mancha 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1° fase móvil Frente del disolvente 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 2° fase móvil Frente del disolvente 7.3 7.3 7.5 2.8 2.9 7.28 0.3 Rf 0. o incluso un desarrollo no adecuado. Entonces se comparan los valores del cromatograma bidimensional tipo y del problema.23 y de 2° fase 0.. CONCLUSIONES Separamos los aminoácidos del jitomate utilizando las técnicas de cromatografía unidimensional y cromatografía bidimensional en capa fina.25 0. que es el predominante en el jitomate maduro aumenta. tal vez para esto es necesario hacer mínimo 2 réplicas de la cromatografía bidimensional o hacer otras pruebas. lisina. tirosina. ya con nuestro cromatograma bidimensional tipo establecido pasamos a la identificación de los aminoácidos del jitomate. al comparar las tablas 1 y 2 nos muestra que algunos valores fueron bastante cercanos y por tanto la identificación fue sencilla. Así mismo concluyo que la mejor opción tanto para la separación. 2 Aunque estos datos no son de tanta utilidad puesto que no cuantificamos concentración de aminoácidos. pero la concentración de ácido glutámico. esto se pudo dar por una mala preparación del cromatograma al agregar los µl de ese aminoácido.82 0. en la Tabla 3 podemos observar los valores de Rf obtenidos de las manchas que se desarrollaron de la muestra en ambas fases.34 0. pero esta opción se descarta porque los demás valores no están tan alejados.54 0.65 Aminoácido correspondiente Lisina Glicina Prolina Ácido glutámico Treonina Metionina Fenilalanina DISCUSIÓN Lo primero que se realizó después de la parte experimental. de mancha 1 2 3 4 5 6 7 Rf creciente en la 1° fase móvil 0.83 Rf en la 2° fase móvil 0. podemos hacer una identificación aproximada de los aminoácidos. al comparar esta tabla con la tabla 2. se sabe que durante la maduración.11 en la tabla tipo y en el problema 1° fase 0.34 0. así que estos valores los tomamos como referencia para determinar de qué aminoácido se trata en el cromatograma bidimensional tipo ( Figura 3). No.Tabla 4. Cromatograma bidimensional problema (IV) desarrollado en las 2 fases móviles.34 en la tabla problema. ya que en realidad con estos resultados no podemos decir con certeza los componentes.45 0. como la . que fue la fruta que elegimos. Por otra parte. pero si observamos el caso de la histidina. mientras el ácido glutámico disminuye.28 en la tabla tipo. tenemos por ejemplo los casos de la arginina. que a su vez es dependiente de la maduración del mismo y de la especie. ahora 1° fase 0.12. es el cálculo del Rf en los cromatogramas unidimensionales de ambas fases( Figuras 1 y 2).45 y 2° fase 0. en los cuales el aminoácido es conocido.21 y 2° fase 0.45 0. los Rf no son muy parecidos. los aminoácidos libres totales permanecen relativamente constantes.12 0. se observa que en la mayoría de los casos los valores son cercanos como por ejemplo el de la lisina que tiene un Rf 1° fase de 0.75 0. Cabe destacar que los valores de la muestra van a depender del contenido de los aminoácidos del jitomate. a pesar de esto siguen siendo los valores más aproximados para prolina.21 0. en cuanto a la serina y treonina éstos alcanzan un máximo antes de la completa madurez y los aminoácidos restantantes disminuyen. de hecho son cercanos en todos a excepción de la Prolina que son los valores más alejados 1° fase 0. así que este aminoácido se determinó así por descarte. metionina etc.53 y 2° fase 0. los cuales nos proporcionan los valores de Rf que al compararlos entre sí nos permiten la identificación de los aminoácidos.67 0.45 0. J. Al desarrollar la cromatografía es importante la dirección en la que se colocará el cromatograma. o en menor como la Metionina. Ninhidrina Aminoácido Aldehído 3.es/aminoacidos-tomate . 2005. BIBLIOGRAFIA 1. El cultivo del tomate. Grupo Mundi Prensa. Voet.identificación es el método de la cromatografía bidimensional ya que tiene una mayor resolución y confiabilidad al ser desarrollado el mismo cromatograma en ambas fases. todas éstas están presentes en el jitomate según lo reportado en la literatura. Bioquímica.. metionina y fenilalanina. págs.. 2. págs. prolina. Voet.Indique las posibles fuentes de erro de esta técnica Mala preparación del cromatograma al colocar las muestras. Preparación deficiente de las fases móviles. entre otros aminoácidos que no utilizamos en la práctica.. ác.Escriba la reacción completa y con nombres. 150-151. http://alimentos. 2. 2006. glutámico..org.. F. lisina etc. 80-82 3. treonina. 3° edición. debido a que sea cual sea la primera.Investigar en la literatura los aminoácidos que contiene el jugo empleado como problema Aminoácido Ácido glutámico Ácido aspártico Leucina Lisina Alanina Fenilalanina Treonina Cantidad 314 mg 113 mg 28 mg 27 mg 24 mg 22 mg 21 mg Aminoácido Prolina Glicina Metionina Tirosina Serina Cantidad 15mg 17 mg 7 mg 11 mg 26 mg En nuestros resultados experimentales observamos la presencia de los siguientes aminoácidos: lisina. sino no habrá una separación real de los componentes. glicina.. D. ya sea en mayor proporción como el ácido glutámico. Nuez. las moléculas se separan por su solubilidad de acuerdo a la mezcla de la fase móvil y en la dirección que se desarrolle el cromatograma. Editorial Médica Panamericana. 4. PREGUNTAS EXTRA 1. de la ninhidrina con un aminoácido.¿Es posible cambiar el orden de las fases móviles? Si es posible. sobre todo para no repetir la dirección ya desarrollada.